CN101533023A - 一种新的检测血清样本中禽流感抗体的方法和产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的检测血清样本中禽流感抗体的定量检测方法和产品及其制备方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以禽流感抗体为代表的病毒抗体蛋白质悬浮芯片检测的开放性检测模式化平台。

Description

一种新的检测血清样本中禽流感抗体的方法和产品

技术领域

本发明涉及一种新的检测血清样本中禽流感抗体的定量检测方法和产品及其制备方法。

背景技术

禽流感病毒属甲型流感病毒，甲型流感病毒多发于禽类，一般来说，禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异，禽流感病毒是不容易感染给人的。个别造成人感染发病的禽流感病毒可能是发生了变异的病毒，但1997年香港禽流感病毒首次突破种间障碍直接感染人共有18位香港居民感染了H5N1亚型流感病毒，其中6人死亡事件的发生，打破了人们对禽流感病毒的传统认识模式，研究表明，感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。

免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。

目前发展的悬浮芯片主要是针对细胞因子的检测。悬浮芯片是否能够检测人血清中的禽流感抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明涉及一种新的检测血清中禽流感菌抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括：编码微球，作为包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素标记的羊抗兔IgG和羊抗人IgG作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的缓冲溶液，所述编码微球可选择任意编号的编码微球。

本发明提供上述检测禽流感抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于，在相关缓冲溶液中，编码微球用禽流感H5蛋白抗原包被、用生物素标记的检测抗体为羊抗兔IgG和羊抗人IgG、用链亲和素-藻红蛋白作为信号检测物。

本发明提供一种禽流感抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，该方法采用间接法检测抗体的免疫学检测原理，其特征在于，在检测过程中所有反应可在96孔滤板上或在微量离心管中进行，其中包括下列步骤：(1)每孔或管中加入含有已包被捕获抗原，即禽流感H5蛋白抗原的编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待测血清样品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入检测缓冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取MFI数值(即平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。

本发明还提供一种检测血清样品中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(1)加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比系列稀释，(2)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)可根据剂量-反应曲线判定方法动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程计算出检测样品的浓度。

悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

本发明人经过大量和深入的研究，对禽流感抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：

1、抗原包被量的改进

禽流感H5蛋白的包被量是成功检测的关键，本发明对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本发明的抗原包被量为3-9μg/1.25×10⁶个微球，即6-24ng/2500-5000个微球/测试，一般的ELISA方法抗原包被量为5μg/测试。

2、生物素标记的改进

通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μL。

3、检测的灵敏度及动态范围

本发明的血清样品禽流感抗体的定量检测方法和芯片与经典的免疫学ELISA检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R²＝0.9863)。同时，悬浮芯片方法灵敏度为检测滴度4.767×10^-6，高于ELISA方法的检测滴度10^-5，灵敏度提高10倍以上；并且悬浮芯片方法动态检测范围为2×10^-7～2×10^-2，高于ELISA方法动态检测范围10^-5～10^-2达1个数量级。

4、方法的特异性

本发明通过选用禽流感H5蛋白为包被抗原，以兔抗禽流感H5N1抗体为待测抗体，以生物素化的羊抗兔为检测抗体。本研究试验证明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗结核血清、兔抗鼠疫菌F1抗原多克隆抗体、兔抗SARS IgG干扰抗体存在条件下本方法具有良好的特异性。

5、样品的检测能力

本发明评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中禽流感抗体的实用性。

附图说明：

图1：032号微球包被禽流感H5蛋白检测禽流感抗体示意图；

图2：蛋白悬浮芯片方法检测兔抗禽流感H5N1抗体的剂量-反应标准曲线图；

图3：ELISA方法检测兔抗禽流感H5N1血清标准曲线图；

图4：蛋白质悬浮芯片与ELISA方法检测兔抗禽流感H5N1血清的相关性。

具体实施方式

本发明涉及的检测禽流感抗体的蛋白悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限定。

一、材料

1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液：

(1)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm²)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(2)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％ TWEEN-20。

(3)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH6.2。

(4)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH 0.15mL，定容于250mL。

(5)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN，0.05％叠氮化物，pH 7.4。

(6)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(7)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(8)抗体稀释液PBS，pH7.4。

(9)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)样品稀释液PVX：PBS，0.5％ PVA，0.8％ PVP；

(11)生物素化抗体稀释液：PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN-20，0.05％NaN3，pH7.4)。

(12)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

2.抗原与抗体

本发明所使用抗原重组禽流感病毒H5蛋白作为检测抗原。

本发明所使用待测抗体为兔抗禽流感H5N1血清，检测抗体可为生物素化羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG。

二、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为兔抗禽流感H5N1 IgG，干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括兔抗结核血清、兔抗SARSIgG、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液中，4℃保存。兔抗禽流感H5N1 IgG的储备液浓度为0.2mg/mL。比较实验中，相同样品用于ELISA和悬浮芯片的检测。

将待分析的兔抗禽流感H5N1 IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。

2、人血清样本的处理

将人血清样本用样品稀释1:10稀释，例如人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

实施例1、检测禽流感抗体的蛋白质悬浮芯片的制备

1、捕获抗原包被编码微球

本发明采用的032号编码微球购自美国BIO-RAD公司，编码微球用于标记可以捕获禽流感抗体的禽流感H5蛋白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球。

A、编码微球的活化

取100μL(1.25×10⁶个)编码微球到1.5mL离心管中，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡后，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。

B、用抗原包被编码微球

取捕获抗原禽流感H5蛋白抗原4-50μg加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000×g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数×10⁴×稀释倍数×体积(mL))计算微球数量。

2、检测抗体标记生物素

A、生物素的标记

分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

B、抗体的用量

以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μl。

实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化

1、微球包被抗原包被量的选择

分别以1μg、3μg、6μg、9μg、12μg、15μg、20μg的量包被100μL编码为027号的微球。经检测效果比较，以6μg/1.25×10⁶个微球即12-24ng/2500-5000个微球/测试包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被禽流感H5蛋白抗原的032号微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于禽流感抗体的检测。

2、生物素化抗体的优化

本发明分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中羧基活性的生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。

本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的羊抗兔抗体以1：250稀释作为检测抗体进行检测兔血清中禽流感抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗兔抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化的抗体羊抗人以1：2500稀释作为检测人血清中禽流感抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗人抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果。

实施例3、样品的制备、检测及结果判定

1、待测样品制备

用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。

2、样品的检测及结果判定

检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下：

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。

3、检测结果判定

根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白悬浮芯片方法检测禽流感抗体的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为＝MFI(空白对照)+3倍标准差。若检测结果高于Cutoff对应荧光强度值则判定为禽流感抗体检测结果阳性；若检测结果低于Cutoff对应荧光强度值则判定为禽流感抗体检测结果阴性。

实施例4、悬浮芯片对禽流感H5蛋白抗原的特异性试验

应用悬浮芯片检测方法分别对兔抗结核IgG、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARSIgG、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅兔抗禽流感H5N1IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说明本发明所建立的禽流感抗体的悬浮芯片检测方法与其它测试抗体均不发生交叉反应或非特异反应。

实施例5、对血清样品中禽流感抗体的悬浮芯片定量检测

1、兔抗禽流感H5N1 IgG标准曲线样品制备

用样品稀释液将兔抗禽流感H5N1 IgG标准品由20μg/mL以4倍倍比梯度稀释至191pg/mL成系列浓度样品。

2、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗体的浓度(ng/mL)，Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2中鼠抗禽流感H5N1血清的浓度(ng/mL)分别为：S1：0.191，S2：0.763，S3：3.052，S4：12.207，S5：48.828，S6：195.312，S7：781.25，S8：3125.0，S9：12500.0，S10：50000.0。

悬浮芯片系统根据检测结果拟合兔抗禽流感H5N1IgG剂量-反应标准曲线方程为：

FI＝-1.31918+(13360.5+1.31918)/[1+(Conc/3.93328)^-0.957367]^0.953689

3、本发明悬浮芯片法检测血清中兔抗禽流感H5N1IgG的灵敏度和动态范围

根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白质悬浮芯片方法检测兔抗禽流感H5N1IgG的灵敏度为：0.0015ng/mL(Cutoff＝8.6213，MFI(空白对照)＝6.5，标准差＝0.7071)。

本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着兔抗禽流感H5N1IgG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当兔抗禽流感H5N1IgG浓度达到0.05mg/mL时，抗原抗体的免疫反应即将达到饱和状态，MFI值也将进入平台期，说明样品中的待检物浓度还可以更高，需要将高浓度样品再检测。

因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量检测兔抗禽流感H5N1IgG的动态范围为48.828～50000ng/mL。

实施例6、蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法检测禽流感抗体的比较

1、生物素-亲和素ELISA(BAS-ELISA)检测方法

作为对比，生物素-亲和素ELISA采用包括下列步骤：

1)向普通ELISA微孔板每孔加入50μL用PBS缓冲液稀释的禽流感H5蛋白5-50μg，4℃静止过夜；

2)加入封闭液，在37℃封闭2小时；

3)洗液洗3次，拍干；

4)加入检测样品，每孔50μL，室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；

5)加入适量生物素化检测抗体，每孔50μL，室温放置30分钟；洗液洗3次，拍干；

6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50μL/孔，室温放置3分钟；洗液洗3次，拍干；

7)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50μL/孔，室温放置10分钟；

8)用2M H₂SO₄终止反应；

9)应用酶标仪测读A450nm数值。

2、样品的悬浮芯片检测方法

采用间接法测抗体的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤2次；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤3次；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。

3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较

制备的相同一组兔抗禽流感H5N1血清样品用样品稀释液10倍比稀释同时应用悬浮芯片和ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测兔抗禽流感H5N1血清的标准曲线(图中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与悬浮芯片方法结果进行比较。

根据两种方法标准曲线：悬浮芯片方法如图2所示的灵敏度为4.767×10^-6(血清滴度)，线性检测范围2×10^-7～2×10^-2；ELISA方法如图3所示的灵敏度为10^-5(血清滴度)，线性检测范围10^-5～10^-2。可以得出结论：检测相同兔抗禽流感H5N1血清样品，蛋白悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即高10倍；并且具有更宽的动态检测范围，即高2个数量级。

另外，如图4所示，将两种方法检测结果在10^-5～10^-2范围内进行比较可以判定蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0.9863。

实施例7、人血清样品的检测

1、人血清样品的准备

将人血清样品用样品稀释液1:10稀释(人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀)后用于蛋白悬浮芯片检测。

2、人血清样品的检测

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中禽流感抗体的浓度。

经过多次重复试验，生物素化羊抗人IgG稀释比例优选用1:2500稀释，SA-PE稀释比例优选用1:300稀释，通过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之和为作为判断阴阳性的界值，即C utoff值为2286，换算为浓度值是0.68ng/mL，检测得到的MFI值如果大于2286，即血清中的禽流感抗体浓度超过0.68ng/mL可视为禽流感抗体阳性可能被禽流感病毒感染，如果MFI值小于2286，即血清中的禽流感抗体浓度低于0.68ng/mL可判断为禽流感抗体阴性，未感染禽流感病毒。

Claims (7)

1、一种采用蛋白悬浮芯片检测血清样品中禽流感抗体的间接免疫学定量检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：

(1)包被微球的捕获抗原为禽流感H5蛋白抗原，

(2)向孔入加入含已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(3)加入待测血清样品，孵育后清洗；

(4)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；

(5)加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；

(6)加入检测缓冲液后混匀；

(7)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(MFI)数值并分析数据判定检测结果。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素标记的羊抗人IgG作为检测抗体，并且其与抗原禽流感H5蛋白组合组成间接法检测体系。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗原禽流感H5蛋白抗原用量为3-9μg/1.25×10⁶个编码微球或6～24ng/2500-5000个微球/测试。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体羊抗人IgG的生物素为羧基活性的生物素。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-羊抗人IgG以1:2500稀释作为检测抗体进行检测。

6、一种定量检测血清样品中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为4倍；

(2)将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI)；

(3)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线；

(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

(5)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断未知样本中禽流感抗体的浓度其特征在于，加入的阳性检测样品为兔抗禽流感H5N1 IgG。

7、一种检测血清样品中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括：编码微球，作为包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素标记的羊抗人IgG作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的缓冲溶液。

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