CN101522702A

CN101522702A - 人T2R受体hT2R50的新单体型及其在鉴定人苦味调节剂的测定法中的用途

Info

Publication number: CN101522702A
Application number: CNA2007800382150A
Authority: CN
Inventors: 李晓东; A·普洛宁; 徐宏
Original assignee: Senomyx Inc
Current assignee: Firmenich Inc
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2007-09-05
Publication date: 2009-09-02
Also published as: JP2010514411A; US20110053184A1; US7811788B2; WO2008030429A2; EP2064226A4; EP2064226A2; WO2008030429A3; US20090117547A1; US8221987B2

Abstract

本发明涉及T2R味觉受体家族中响应特定苦味配体即2－乙酰吡嗪和乙基吡嗪的人味觉受体hT2R50的新单体型的发现。本发明还涉及此新单体型在用于鉴定调节hT2R50味觉受体活化的配体的测定中的用途。这些化合物潜在地可用作食品、饮料和药品中的添加剂，以改变(阻断)hT2R50相关的苦味。

Description

人T2R受体hT2R50的新单体型及其在鉴定人苦味调节剂的测定法中的用途

相关申请

[0001]本申请要求2006年9月5日提交的美国临时申请No.60/842,016的优先权。本申请还涉及现代理机构Senomyx公司于2001年3月5日提交的美国专利申请No.09/825,882。这两个专利申请文献均通过引用整体并入本文。这些申请涉及hT2R50苦味受体及其他人T2R味觉受体及它们在味觉调节分子的鉴定和潜在的治疗学中的用途。

技术领域

[0002]本发明涉及阐明特异性人味觉受体hT2R50(在本领域中也被称为hT2R45或hTas2R45)的新单体型，及阐明调节此新单体型的配体。

[0003]可基于此发现将此新单体型及其变体用于鉴定调节(优选阻断)与此hT2R50单体型相关的苦味的化合物的测定法，优选高通量的基于细胞的测定法。可将用这些测定法鉴定的化合物用作食品、饮料或药品中的添加剂以改善其味道。

[0004]本发明还涉及题述T2R基因及相应多肽及表达它们的细胞在治疗筛选(例如用于鉴定可用于调节胃肠功能(如食物感觉(foodsensing)，吸收，胃肠激素和肽分泌、转运和吸收的调控，对舌和胃肠系统中的毒素的响应，胃肠和代谢病症(如进食障碍(eating disorder)、糖尿病、肥胖症等的治疗)的化合物)中的用途。

背景技术

[0005]人可识别的基本味觉型之一是苦味。而时至近先仍对产生苦味的生理学原理知之甚少。最近的研究才开始揭示产生味觉的生物学原理(Lindemann，Nature(2001))。现已知许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互作用而产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白相互作用的七种跨膜结构域受体家族。已在人和啮齿动物中鉴定出GPCR的新家族，称为T2R(Adler et al.，Cell 100(6)：693-702(2000)；Chandrashekar et al.，Cell 100(6)：703-711(2000)；Matsunami H，Montmayeur J P，Buck LB.Nature 404(6778)：601-4(2000))。本发明之前的几条证据提示T2R介导对苦味化合物的响应。首先，T2R基因在舌和腭上皮味觉受体细胞亚群中特异性表达。第二，人T2R之一(hT2R1)的基因位于与人对苦味化合物6-正丙基-2-硫尿嘧啶的敏感性连锁的染色体位点(Adler等人，(Id.)(2000))。第三，小鼠T2R之一(mT2R5)位于与小鼠对苦味化合物环己酰亚胺的敏感性连锁的染色体位点。还显示mT2R5可活化在味觉细胞中特异性表达并与苦味刺激转导关联的味转导素、G蛋白(Wong et al.，Nature 381：796-800(1996))。仅在响应环己酰亚胺时发生由mT2R5的味转导素活化(Chandrashekar等人，(Id.)(2000))。因此，有人已提出mT2R家族介导小鼠的苦味响应，而hT2R家族介导人的苦味响应。仅有一种人T2R被认为具有已鉴定的苦味配体-hT2R4，其显示被地那铵(denatonium)活化(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。但所述研究中使用的有效地那铵浓度(1.5mM)异常高，即比已报道的地那铵对人的苦味阈值(Saroli，Naturwissenschaften 71：428-429(1984))高105倍。因此，没有特异性的苦味配体有说服力地匹配任何hT2R。也已提示每个hT2R能够结合多个苦味配体。此假设基于hT2R家族仅由25个已鉴定的成员组成，而人可将数百种不同的化合物识别为苦味的事实。Zuker等人(WO01/18050A2，(2001))和Adler等人(WO01/77676A1(2001))已于之前报道并在公开的PCT申请中公开了hT2R的序列，将两个文献均通过引用整体并入本文。

[0006]研究T2R功能的困难之一在于这些受体不易在培养的哺乳动物细胞系中表达。为改善T2R的表达，将来自良好表达的GPCR(视紫质)的N-末端序列连接到T2R序列(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。还因有可利用的抗体，使此N-末端标签易监控蛋白表达。尽管所述视紫质标签的掺入改善了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但其中许多仍不能良好表达以满足功能研究。在不同的方法中，mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功表达，并用于使用生化GTPγS结合测定法进行功能研究(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。

[0007]申请人在更早提交的美国专利申请No.09/825,882(现已授权)中鉴定和提供了许多当时新颖的人味觉受体(包括hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R63、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71和hT2R75)的核酸序列和多肽序列。申请人还在2003年7月29日提交的美国专利申请No.10/628,464中提供了另一个经鉴定新人味觉受体(在其中被称为hT2R76)的多肽和DNA序列。

[0008]申请人还在通过引用整体并入本文的美国专利申请No.10/191,058中发现了特异性活化三种不同的人T2R的配体。申请人还在最近提交了美国专利申请No.11/455,693中进一步鉴定了特异性结合其他人T2R的苦味配体，并提供了相关测定法。

[0009]有关本发明的实际应用也已报道T2R和T1R味觉受体均在胃肠系统中表达。例如，Wu et al.，Proc，Natl.Acad.Sci，USA99(4)：2392-7(2002)报道T2R及味转导素和转导蛋白亚基在肠内分泌细胞(enterendocrine cell)(STC1细胞)中表达，且这些细胞可能响应胃肠道中的苦味配体。Chen et al.，Amer J.Physiol.CeU Physiol.291(4)：C726-39(2006)也已报道苦味刺激诱导肠内分泌(enterendocrine)STC-1细胞中的Ca++信号转导和胆囊收缩素(CCK)释放。而Rozengurt，A J Physiol Gastrointest Liver Physiol 291(2)：G171-7(2006)也报道肠中的味觉受体可能在消化功能和激素和/或神经途径的控制指令的分子发送中起作用，且它们可在有害药物和生存响应的检测中起作用。此外，Sternini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.292(2)：G457-61(2007)也报道肠中的味觉受体可参与胃肠功能(如分子感受(molecularsensing)、营养吸收、防御有害物质)，还提示对这些机制的理解可与疾病状态和病情(如喂食障碍和炎症)有关。此外，Mace et al.，J Physiol.2007[Epub}最近也提示T2R和T1R活化磷脂酶Cβ2、PLCβ2，且肠中可能存在类似于存在于舌细胞中的系统的分子肠感受系统，且表达味觉受体的胃肠细胞(如刷细胞或孤立化学感受细胞(solitary chemosensorycell))可导致GLUT2增加，且可在营养感受及治疗肥胖症和糖尿病的营养过程中起作用。另外，Cui et al，Curr Pharm Des.12(35)：4591-600(2006)提示可将肠中表达的T1R用于测定治疗肥胖症和糖尿病中的化合物及人工甜味剂。

[0010]然而，尽管已有报道并理解T2R成员调控苦味，且它们可能在胃肠功能中的起作用，但有需要鉴定活化人苦味T2R味觉受体的特异性配体。更好地理解不同T2R(特别是人T2R)的结合特性将非常有益，因为其将更好地促进其在选择具有预期味觉调节特性(即阻断或抑制特异性苦味化合物的味道)的化合物中的用途。另外，它也将提供用于治疗和调节胃肠功能和相关疾病(如肥胖症、糖尿病、食物吸收、食物感受、进食障碍)，并调控相关激素和肽(如GLUT2、胆囊收缩素等)的化合物的鉴定。

发明内容

[0011]为此，本发明涉及人T2R的新单体型的发现，及其在味觉调节剂测定中的用途。

[0012]本发明更具体提供编码hT2R50的新单体型及相应味觉受体多肽的核酸序列。

[0013]本发明还提供表达此新hT2R50单体型及其变体的重组细胞。

[0014]本发明还鉴定特异性识别此hT2R单体型及hT2R50的先前鉴定的形式的配体。

[0015]本发明还提供用于鉴定所述单体型是否响应与hT2R50的先前鉴定形式的配体不同的苦味配体的基于细胞的测定法。

[0016]这些发现是使用基于细胞的测定法获得的，所述测定法在存在和不存在特异性苦味配体的情况下使用表达特定T2R的细胞测量T2R(包括本文公开的新hT2R50单体型)的活性。如下文将更详细描述，尤其将表面表达特异性T2R(包括题述hT2R50单体型和最初鉴定的hT2R50等位基因(报道于上文引用的Adler PCT和美国专利申请))，且还表达与所述T2R偶联的G蛋白的HEK细胞系用于基于细胞的测定法，所述测定法基于胞内钙浓度的变化检测推定的苦味配体。发现题述新hT2R50单体型及先前鉴定的hT2R50等位基因均特异性识别和响应结构上相关的苦味化合物(2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪)，而其它hT2R在相似条件下则不被活化。

[0017]因此，本发明包括此hT2R单体型在为鉴定阻断这些苦味化合物和其它潜在苦味化合物对此受体的活化的化合物的测定法(优选高通量测定法)中的用途。

[0018]本发明还涉及题述T2R单体型及相应多肽和表达它们的细胞在治疗性筛选测定法中的用途，所述测定法例如用于鉴定调控或调节胃肠功能(如食物和营养感受、食物吸收、消化性激素和肽的调控、对毒素的响应)的化合物，及用于治疗胃肠或代谢疾病(如肥胖症、糖尿病和炎症或自体免疫胃肠疾病(如IBD、乳糜泻、Crohn病等))。

[0019]本发明还包括包括附加步骤的测定法，所述附加步骤评估人中或其它味觉试验中经鉴定调节化合物的作用，并评估经鉴定化合物对苦味和/或在进一步的体外或体内临床试验中的作用，以评估经鉴定化合物对特定的胃肠、消化或代谢功能或疾病的作用。本发明还包括经鉴定化合物在食品、饮料和药物中作为风味或味道调节剂(即抑制苦味(例如与特定饮料和食品或药物相关的苦味))的用途。

[0020]此外，本发明还含已经处理以去除特异性活化苦味受体的化合物的食品、饮料和药品的生产，例如已经加工以去除或降低其中包含的苦味化合物的量的食品和饮料。

[0021]本发明又包括含适用于治疗或预防涉及T2R的代谢病症、消化功能和胃肠疾病的经鉴定化合物的药物。本发明尤其涉及用于治疗或调节如Crohn病、乳糜泻、肥胖症、糖尿病、食物感受、食物吸收、消化性激素或肽分泌等病情的药物。

发明目标

[0022]本发明旨在鉴定hT2R50的新单体型。

[0023]本发明还旨在确定此单体型是否与所筛选个体苦味感知的遗传差异相关。

[0024]本发明具体旨在鉴定调节(优选阻断)此hT2R50单体型或其片段、变体、直向同源物或嵌合体被苦味配体(包括2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪)或其它苦味配体(包括与其在结构上相关的化合物)的活化的化合物。

[0025]本发明还具体旨在测定法中使用包含或表达(稳定或瞬时)题述hT2R50单体型或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜，以鉴定调节(优选阻断)此苦味受体的活化的化合物。

[0026]本发明更具体旨在于检测胞内钙变化以检测调节此新单体型的活化的化合物的基于细胞的测定法中使用表达偶联于例如G_α15、G_α16、味转导素、转导蛋白或其嵌合体的G蛋白的细胞(优选哺乳动物、两栖动物或昆虫细胞(例如HEK293T细胞))。

[0027]本发明还旨在提供题述T2R单体型及相应多肽和表达它们的细胞在治疗性筛选测定法中的用途，例如，用于鉴定调控或调节胃肠功能(如食物和营养感受、食物吸收、消化性激素和肽的调控、对毒素的响应)的化合物，及用于治疗胃肠或代谢疾病(如肥胖症、糖尿病和炎症或自体免疫胃肠疾病(如IBD、乳糜泻、Crohn病等))。

[0028]本发明还旨在提供包括附加步骤的测定法，所述附加步骤评估人中或其它味觉试验中经鉴定调节化合物的作用，并评估经鉴定化合物对苦味和/或在进一步的体外或体内临床试验中的作用，以评估经鉴定化合物对特定的胃肠、消化或代谢功能或疾病的作用。

[0029]本发明还旨在提供经鉴定化合物在食品、饮料和药物中作为风味或味道调节剂(即抑制苦味(例如与特定饮料和食品或药物相关的苦味))的用途。

[0030]本发明还旨在提供已经处理以去除特异性活化苦味受体的化合物的食品、饮料和药品的生产，例如已经加工以去除或降低其中包含的苦味化合物的量的食品和饮料。

[0031]本发明又旨在提供含适用于治疗或预防涉及T2R的代谢病症、消化功能和胃肠疾病的经鉴定化合物的药物。本发明尤其涉及用于治疗或调节如Crohn病、乳糜泻、肥胖症、糖尿病、食物感受、食物吸收、消化性激素或肽分泌等病情的药物。

[0032]本发明还旨在于味觉试验(优选人味觉试验)中确认经鉴定化合物调节(优选阻断)苦味(例如由吡嗪化合物引起的苦味)。

[0033]本发明还旨在将本文所述测定法中鉴定的化合物用作组合物中的添加剂，以调节(优选阻断)由特异性活化此味觉受体的化合物诱导的苦味。

附图简述

[0034]图1含题述hT2R50单体型的核酸序列和蛋白序列，其不同于先前鉴定的hT2R50在于其羧基末端多出10个氨基酸。

[0035]图2比对了题述hT2R50单体型、先前鉴定的hT2R50、hT2R61、hT2R64和hT2R75的羧基末端。可看出，除先前的(较短形式)hT2R50外，这些hT2R在它们的C-末端含相同的10个羧基末端氨基酸，且所述hT2R75在其C-末端含相同的10个氨基酸中的9个氨基酸(hT2R75的最后一个氨基酸是丝氨酸，而非脯氨酸)。

[0036]图3含2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪的结构，它们是与题述hT2R50单体型和先前的较短形式特异性相互作用的苦味配体。

[0037]图4显示题述hT2R50单体型和先前鉴定的较短形式对10mM2-乙酰吡嗪的剂量响应。

具体实施方式

[0038]在具体描述本发明之前，提供下列定义。

[0039]术语“T2R”家族包括具有下列特征的多态性变体、等位基因、突变体和同系物：(1)在约25个氨基酸、最佳50-100个氨基酸的窗口上与下文和在Zuker(Id)(2001)和Adler(Id.)PCT和美国专利申请(通过引用并入本文)中公开的T2R具有约30-40％氨基酸序列同一性、更特异约40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％氨基酸序列同一性；(2)与抗包含选自下文公开的T2R序列及其保守修饰变体的氨基酸序列的免疫原的抗体特异性结合；(3)在严格杂交条件下与选自下文公开的T2R DNA序列及其保守修饰变体的序列特异性杂交(大小为至少约100，任选至少约500-1000个核苷酸)；(4)包含与选自下文公开的T2R氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约40％同一性的序列，或(5)被在严格杂交条件下与所述T2R序列特异性杂交的引物扩增。

[0040]这些“T2R”尤其包括在本文称作hT2R50的人苦味受体GPCR及其具有图1所含DNA和氨基酸序列的单体型hT2R50及其特异性结合苦味配体(例如如吡嗪(包括2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪))的变体、等位基因、突变体、直向同源物和嵌合体。

[0041]“T2R单体型”指见于不同个体的hT2R多肽的天然存在的等位基因变体，如图1所含hT2R50单体型及相应DNA。此类T2R单体型可与早先报道的最初鉴定的hT2R多肽响应相同或不同的苦味配体。例如，一些单体型可参与一些个体品尝不同的苦味配体或与其它个体不同地感知此类配体的能力。

[0042]虽然T2R基因在蛋白和DNA水平均表现出实质性序列差异，但发现迄今分离的所有T2R均在特定区域含某些共有序列，其与Adler等人(WO 01/77676A1(2001)和Zuker等人WO 01/18050A2(均通过引用整体并入本文)先前鉴定的T2R共有序列相同或与之具有至少70-75％序列同一性。

[0043]某些化学感受GPCR在拓扑学上具有“N-末端结构域”、“胞外结构域”、包含七个跨膜区及相应胞质和胞外环的“跨膜结构域”、“胞质区”和“C-末端区”(参见，例如Hoon等人，Cell，96：541-51(1999)；Buck & Axel，Cell，65：175-87(1991))。使用本领域技术人员已知的方法，如鉴定疏水性和亲水性结构域的序列分析程序(参见，例如Stryer，Biochemistry(生物化学)(第三版，1988)；另请参见许多基于互联网的序列分析程序，如见于dot.imgen.bcm.tmc.edu的那些中的任何一个)，可在结构上鉴定这些区域。可将这些区域用于制备嵌合蛋白，并用于本发明的体外测定法(例如配体结合测定法)。

[0044]因此“胞外结构域”指突出细胞膜并暴露于细胞的胞外面的T2R多肽结构域。此类区域将包括暴露于细胞的胞外面的“N-末端结构域”，及跨膜结构域的暴露于细胞的胞外面的胞外环(即跨膜区2和3、跨膜区4和5及跨膜区6和7之间的胞外环)。“N-末端结构域”从N-末端开始，并延伸至接近跨膜区起点的区域。可将这些胞外区用于可溶和固相的体外配体结合测定法。此外，下文描述的跨膜区还可与胞外区组合或单独参与配体结合，并因此还可用于体外配体结合测定法。

[0045]包含七个跨膜“区”的“跨膜结构域”指位于质膜内的T2R多肽结构域，且还可包括相应的胞质(胞内)环和胞外环，也被称为跨膜“区”。可使用Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-32(1982))或上述Stryer描述的标准方法鉴定所述七个跨膜区及胞外环和胞质环。

[0046]“胞质结构域”指面向细胞内部的T2R蛋白结构域，例如，“C-末端结构域”和跨膜结构域的胞内环，例如跨膜区1和2、跨膜区3和4及跨膜区5和6之间的胞内环。“C-末端结构域”指跨越最后一个跨膜区末端至蛋白的C-末端的区域，且其正常情况下位于细胞质内。

[0047]术语“7-跨膜受体”指属于具有跨越质膜七次(因此，所述七个区域被称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)的七个区域的跨膜蛋白超家族的多肽。嗅觉受体和某些味觉受体家族各自属于此超家族。如下文详述，7-跨膜受体多肽具有相似及特征性的一级、二级和三级结构。

[0048]术语“配体结合区”指源于基本并入跨膜结构域II至VII(TM II至VII)的化学感受或味觉受体的序列。所述区域可能够结合配体，尤其是引起味觉的化合物。

[0049]术语“质膜转位结构域”或简称“转位结构域”指能够将多肽(如T2R多肽)转运至细胞表面的多肽结构域。示例性转位结构域可源自视紫质如

[0050](5′-MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV；SEQ ID NO：1)。当把这些肽结构域并入多肽编码序列的氨基末端时，可以极大效率将所述杂种(“融合”)蛋白“陪伴”或“转位”至细胞质膜。此特殊“转位结构域”初始源自人视紫质受体多肽(7-跨膜受体)的氨基末端。另一个转位结构域源自牛视紫质序列，且也可用于促进转位。源于视紫质的序列在将7-跨膜融合蛋白转位至质膜方面特别有效。

[0051]“功能等效性(Functional equivalency)”指结构域在相似条件下将新翻译出的蛋白转位至质膜的能力和效率与另一个转位结构域(如示例性SEQ ID NO：1)一样有效；可如本文所述测量(以量化形式)并比较相对效率。可根据同于二十个氨基酸长的转位结构域SEQ IDNO：1的效率的细胞(哺乳动物、爪蟾(Xenopus)等的细胞)中属本发明范围内的结构域将新合成的多肽转位至质膜的效率，通过常规筛选测定所述属本发明范围内的结构域。

[0052]术语“功能效应”在检测调节T2R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定法中，并包括间接或直接处于所述受体影响下的任何参数的测定，例如功能的、物理的和化学的效应。它包括体外、体内和离体配体结合、离子流变化、膜电位、电流量、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cAMP、cGMP、IP3或胞内Ca²⁺)，且还包括其它生理效应(如神经递质或激素释放的升高或降低)。

[0053]“测定功能效应”指对升高或降低间接或直接处于T2R家族成员影响下的参数的化合物测定，例如功能的、物理的和化学的效应。可通过本领域技术人员已知的任何方法测量此类功能效应，所述方法例如光谱特性(例如荧光、吸光度、折射率)、流体(例如形状)、色谱或溶解度性质的变化、膜片钳、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素外排、诱导型标记物、卵母细胞T2R基因表达；组织培养细胞T2R表达；T2R基因的转录活化；配体结合测定；电压、膜电位和电导变化；离子流测定；胞内第二信使(如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3))的变化；胞内钙水平的变化；神经递质释放等。

[0054]T2R蛋白受体的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”可互换使用，指使用体外和体内味觉转导测定法鉴定的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及它们的同系物和模拟物。抑制剂是例如通过结合，部分或完全阻断刺激，降低、阻止、延迟活化、灭活、脱敏或下调味觉转导的化合物，例如拮抗剂。激活剂是例如通过结合，刺激、增加、打开、活化、促进、增强活化、敏化或上调味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与下列物质的相互作用的化合物：结合激活剂或抑制剂的胞外蛋白(例如舌腺蛋白(ebnerin)和疏水性载体家族的其它成员)；G蛋白；激酶(例如视紫质激酶的同系物和参与受体失活和脱敏的β肾上腺素能受体激酶)；和也失活和脱敏受体的抑制蛋白。调节剂包括T2R家族成员的基因修饰形式(例如具有改变的活性)，及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。

[0055]此类测定抑制剂和激活剂的测定法包括，例如在细胞或细胞膜中表达T2R家族成员、在有无调节例如苦味化合物的化合物的情况下应用推定的调节剂化合物，然后如上所述测定对味觉转导的功能效应。比较包含用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的T2R家族成员的样品或测定法与不含抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品，以检查调节的程度。将对照样品(未用调节剂处理)的相对T2R活性值指定为100％。当相对于对照的T2R活性值是约80％、任选50％或25-0％时，即实现T2R的抑制。当相对于对照的T2R活性值是110％、任选150％、任选200-500％或1000-3000％以上时，即实现T2R的活化。

[0056]本文所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”指不含天然状态下一般与本发明的化合物结合的其它、不相似的化合物的状态。“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”优选指所述组合物以重量计包含至少0.5％、1％、5％、10％或20％，且最优选至少50％或75％重的给定样品。在一个优选实施方案中，这些术语指以重量计包含至少95％重的给定样品的本发明的化合物。当指核酸或蛋白时，本文所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”核酸或蛋白也指不同于哺乳动物(尤其是人)身体中天然存在的纯化或浓缩状态。任何大于所述哺乳动物(尤其是人)身体中天然存在的纯化或浓缩程度，包括(1)从其它结合的结构或化合物中纯化，或(2)与在哺乳动物(尤其是人)身体中一般不结合的结构或化合物结合亦在“分离的”的含义内。可根据本领域技术人员已知的多种方法和程序分离本文所述核酸或蛋白或所述类别的核酸或蛋白，或将它们与天然状态下一般不与它们结合的结构或化合物结合。

[0057]当指核酸或多肽时，本文所用术语“分离的”指不同于哺乳动物(尤其是人)身体中天然存在的纯化或浓缩状态。任何大于所述身体中天然存在的纯化或浓缩程度包括：(1)从其它天然存在的结合的结构或化合物中纯化，或(2)与在身体中一般不结合的结构或化合物结合亦在本文所用“分离的”的含义内。可根据本领域技术人员已知的多种方法和程序分离本文所述核酸或多肽，或将它们与天然状态下一般不与它们结合的结构或化合物结合。

[0058]本文所用术语“扩增”指使用下文详述任何合适的扩增方法产生或检测重组或天然表达的核酸。例如，本发明提供用于在体内或体外扩增(例如通过聚合酶链式反应，PCR)天然表达(例如基因组或mRNA)或本发明的重组(例如cDNA)核酸(例如本发明的引起味觉的化合物结合序列)的方法和试剂(例如特异性寡核苷酸引物对)。

[0059]术语“表达载体”指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中体外或体内、组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的任何重组的表达系统。所述术语包括线状或环状表达系统。所述术语包括保持游离或整合至宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有或不具有自我复制能力，即仅在细胞中驱动瞬时表达。所述术语包括仅含转录重组核酸所需最少元件的重组表达盒。

[0060]术语“文库”指为不同核酸或多肽分子的混合物的制品，如用简并引物对扩增核酸或包括扩增的配体结合区的载体的分离收集而产生的重组产生的感觉(特别是味觉)受体配体结合区的文库，或用至少一种编码味觉受体的载体各自随机转染的细胞的混合物。

[0061]术语“核酸”或“核酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语涵盖含已知天然核苷酸的类似物的核酸(即寡核苷酸)。所述术语还涵盖具有合成的主链的核酸样结构。

[0062]除非另有说明，特定的核酸序列还应涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子置换)和互补序列，及明确指出的序列。尤其可通过产生例如其中一个或多个选定密码子的第三个位置被置换为混合碱基和/或脱氧次黄苷残基的序列实现简并密码子置换(Batzer等人，NucleicAcid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260：2605-08(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

[0063]术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

[0064]本文所述“转位结构域”、“配体结合区”和嵌合受体组合物还包括具有基本对应于所述示例性序列的结构和活性的“类似物”或“保守变体”和“模拟物”(“肽模拟物”)。因此，所述术语“保守变体”或“类似物”或“模拟物”指具有如本文所定义的修饰的氨基酸序列，而所述变化不实质性改变所述多肽的(所述保守变体的)结构和/或活性的多肽。这些包括氨基酸序列的保守修饰变化，即那些对蛋白活性不至关重要的残基的氨基酸置换、添加或缺失，或用具有相似性质(例如酸性、碱性、带正电或负电、极性或非极性等)的残基置换氨基酸，而即便至关重要的氨基酸的置换也不实质性改变结构和/或活性。

[0065]“保守修饰变体”更尤其适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指那些编码同一或基本同一的氨基酸序列的核酸，或指基本同一的序列(如果所述核酸不编码氨基酸序列)。由于遗传密码的简并性，大量功能上同一的核酸编码任何给定蛋白。

[0066]例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在被密码子定义为丙氨酸的每个位置，可将所述密码子改变为所述相应密码子中的任何一个，而不改变所编码的多肽。

[0067]此类核酸变化是“沉默变化”，其是一种保守修饰变化。本文的每个编码多肽的核酸序列还描述了所述核酸的每种可能的沉默变化。本领域技术人员应理解，可对核酸中的每个密码子(除AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)进行修饰，以产生功能上同一的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变化应在每个描述的序列中。

[0068]本领域公知提供功能上相似的氨基酸的保守置换表。例如，选择保守置换的一个示例性指导原则包括(“/”前是原残基，“/”后是示例性置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gin/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gin；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gin或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。一个替代性示例性指导原则使用以下六个组，各含为彼此的保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(另请参见，例如Creighton，Proteins(蛋白)，W.H.Freeman和Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员应理解，上述置换并非唯一可能的保守置换。例如，有些情况下，本领域技术人员可把所有带电荷的氨基酸看作彼此的保守置换，无论它们是带正电的还是带负电的。此外，改变、添加或缺失编码的序列的单个氨基酸或小部分氨基酸的个别置换、缺失或添加也可被认为是“保守修饰变化”。

[0069]术语“模拟物”和“肽模拟物”指具有与多肽基本相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物，例如，本发明的转位结构域、配体结合区或嵌合受体。所述模拟物可完全由氨基酸的合成的、非天然类似物构成，或是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。所述模拟物还可包括任意量的天然氨基酸保守置换，只要此类置换也不实质性改变所述模拟物的结构和/或活性。

[0070]对于是保守变体的本发明的多肽，常规实验即确定模拟物是否在本发明范围内，即其结构和/或功能未被实质性改变。多肽模拟物组合物可含非天然结构组件的任意组合，其一般来自三个结构组：a)不是天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接组；b)非天然残基取代天然存在的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟(即诱导或稳定二级结构(例如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象等))的残基。当多肽的所有或一些残基通过不是天然肽键的化学方式连接时，可将其表征为模拟物。个别的肽模拟物残基可通过肽键、其它化学键或偶联方式(如，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC))连接。可替代传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如--C(.＝.O)--CH₂替代—C(.＝O)--NH--)、氨亚甲基(CH₂NH)、乙烯、烯烃(CH.dbd.CH)、醚(CH₂O)、硫醚(CH₂--S)、四唑(CN₄)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见，例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357，Marcell Dekker，PeptideBackbone Modifications，NY(1983))。还可将含取代了所有或一些天然存在的氨基酸残基的被非天然残基的多肽表征为模拟物；非天然残基在科学和专利文献中已有详细描述。

[0071]“标记物”或“可检测部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组成。例如，有用的标记物包括³²P、荧光染料、密电子剂、酶(例如ELISA中通常使用的酶)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原，及制成可检测形式的(例如通过将放射标记物掺入所述肽)或用于检测与所述肽特异性反应的抗体的蛋白。

[0072]“经标记的核酸探针或寡核苷酸”是通过连接体或化学键共价结合，或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价结合标记物，从而可通过检测出结合到所述探针的标记物的存在情况来检测所述探针的存在情况的核酸探针或寡核苷酸。

[0073]本文所用“核酸探针或寡核苷酸”的定义是能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成，结合具有互补序列的靶核酸的核酸。本文所用探针可包括天然(即A、G、C或T)或经修饰碱基(7-脱氮鸟苷、次黄苷等)。此外，探针中的碱基可通过不是磷酸二酯键的连接而连接，只要其不干扰杂交。因此，例如，探针可为肽核酸，其中作为组成的碱基通过肽键，而非磷酸二酯连接连接。本领域技术人员应理解，探针可依赖于杂交条件的严格性而与所述探针序列缺乏完全互补性的靶序列结合。所述探针任选用同位素、发色团、发光团、色原进行直接标记，或用如生物素进行间接标记(随后可将链霉亲和素复合体结合至所述生物素)。本领域技术人员可通过测定所述探针的有无来检测所选序列或子序列的有无。

[0074]当用于指核酸的部分时，术语“异源(的)”表示所述核酸包含两个或多个未发现在自然界中彼此处于相同关系中的子序列。例如，所述核酸一般通过重组产生，排列两个或多个来自不相关的基因的序列而产生具有新功能的核酸，例如，一种来源的启动子和另一种来源的编码区。异源蛋白也类似指所述蛋白包含两个或多个未发现在自然界中彼此处于相同关系中的子序列(例如融合蛋白)。

[0075]将“启动子”定义为指导核酸转录的一列核酸序列。本文所用启动子包括接近转录起始位点的必需的核酸序列，如在聚合酶11型启动子的情况下为TATA元件。启动子还任选包括远端增强子或阻遏子(repressor)元件，其可位于距转录起始位点远达数千碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“操纵性连接”指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点序列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。

[0076]本文所用“重组子”、“重组”和“重组物”指在体外合成或经其它操作的多核苷酸(例如＂重组多核苷酸＂)，指使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组方法”还涵盖将具有来自不同来源的各种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到表达盒或载体，以表达(例如诱导型或组成型表达)包含本发明的转位结构域的融合蛋白和使用本发明的引物扩增的核酸序列。

[0077]术语“与...选择性(或特异性)杂交”指当特定的核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞DNA或RNA，或文库DNA或RNA)中时，分子在严格杂交条件下仅与所述序列结合、形成双螺旋或杂交。

[0078]术语“严格杂交条件”指探针与一般在核酸的复杂混合物中的其靶子序列杂交，但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境下不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指南参见Tijsseu，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridisation with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般而言，严格条件选择为在确定的离子强度pH下的热解链温度(thermal meltingpoint，Tm)比所述特异性序列低约5-10℃。Tm是(在确定的离子强度、pH和核浓度下)50％的与靶互补的探针与靶序列杂交平衡时的温度(因为靶序列过量存在，在Tm下，平衡时50％的探针被占据)。严格条件将是其中盐浓度低于约1.0M钠离子，一般约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3，且对于短探针(例如10至50个核苷酸)的温度是至少约30℃，而对于长探针(例如大于50个核苷酸)的温度是至少约60℃的那些条件。严格条件还可用添加去稳定剂(如甲酰胺)实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景杂交的至少两倍，任选背景杂交的10倍。示例性严格杂交条件可为如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、在42℃温育，或5×SSC、1％SDS、在65℃温育，在0.2×SSC和0.1％SDS中于65℃下洗涤。此类杂交和洗涤步骤可进行例如1、2、5、10、15、30、60，或更多分钟。

[0079]在严格条件下彼此不杂交的核酸，如果它们编码的多肽基本相关，则它们仍基本相关。这发生于例如当核酸的一个拷贝是使用遗传密码允许的最大密码子简并性生成时。在这类情况下，所述核酸一般在中等严格杂交条件下杂交。示例性“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中于37℃下杂交，且在1×SSC中于45℃下洗涤。此类杂交和洗涤步骤可进行例如1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。阳性杂交是背景的至少两倍。本领域普通技术人员应很容易认识到可利用替代性杂交和洗涤条件来提供相似的严格性条件。

[0080]“抗体”指特异性结合和识别抗原的包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，及无数个免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为K或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，而其又分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

[0081]示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的N-末端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

[0082]“嵌合抗体”是如下的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，以至抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变的类别、效应功能和/或种的恒定区或赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。

[0083]“抗T2R”抗体是特异性结合由T2R基因、cDNA或其子序列编码的多肽的抗体或抗体片段。

[0084]术语“免疫测定”是使用抗体特异性结合抗原的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质分离、靶向和/或定量抗原。

[0085]当指蛋白或肽时，术语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“与...特异性(或选择性)免疫反应”指确定所述蛋白存在于蛋白及其它生物产品的异源群中的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，所述指定的抗体与特定蛋白的结合至少两倍于背景，且不以显著的量与所述样品中存在的其它蛋白显著地结合。在此类条件下与抗体的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白的特异性选择的抗体。

[0086]例如，可选择针对来自特定物种(如大鼠、小鼠或人)的T2R家族成员的多克隆抗体，以仅获得那些与所述T2R多肽或其免疫原性部分特异性免疫反应，而不与其它蛋白(所述T2R多肽的直向同源物或多态性变体和等位基因除外)反应的多克隆抗体。此选择可通过扣除与来自其它物种的T2R分子或其它T2R分子交叉反应的抗体实现。还可选择仅识别T2R GPCR家族成员而非来自其它家族的GPCR的抗体。可使用多种免疫测定形式，以选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定经常被用于选择与蛋白特异性免疫反应的抗体(有关可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见，例如Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验手册)，(1988))。特异性或选择性反应一般是背景信号或噪音的至少两倍，更一般是背景的10至100倍以上。

[0087]术语“与...选择性缔合”指核酸与另一个核酸“选择性杂交”(如上文所定义)的能力，或抗体与蛋白“选择性(或特异性)结合”(如上文所定义)的能力。

[0088]术语“表达载体”指用于在体外或体内、组成型或诱导型、在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。所述术语包括线形或环形表达系统。所述术语包括保持游离或整合至宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我复制的能力或不具有所述能力，即仅在细胞中驱动瞬时表达。所述术语包括仅含转录重组核酸所需的最少元件的重组表达盒。

[0089]“宿主细胞”指含表达载体并支持所述表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可为原核细胞(如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞(如CHO、HeLa、HEK-293等(例如培养的细胞、外植体和体内的细胞)))。

[0090]基于前述内容，本发明提供用于鉴定调节(优选阻断)hT2R50的新单体型和先前鉴定的人苦味受体hT2R50被苦味化合物(即吡嗪和结构上相关的化合物)的特异性活化的化合物的测定法。本发明尤其提供用于鉴定调节(例如阻断)hT2R50及其单体型被苦味配体的活化的化合物的基于细胞的测定法。预期这些化合物将在人受验者中调节与hT2R50和其它潜在T2R味觉受体相关的苦味。这可在味觉试验中确认。

[0091]题述hT2R50单体型和原始的hT2R序列特异性响应苦味配体(即特定的吡嗪化合物)是使用HEK293表达系统和钙成像法确定的，其报道于其它出版物及现代理机构提交的专利申请例如美国专利申请No.10/191,058和No.09/825,882(均通过引用整体并入本文)。本发明人更特别用hT2R和嵌合G蛋白(G16gust 44)共转染HEK293细胞，所述嵌合G蛋白包含通过用味转导素的相应残基替换羧基-44个氨基酸残基修饰的G_α14G蛋白序列，并通过钙成像法记录这些细胞对特异性苦味配体的响应。

[0092]如图4所示，发现hT2R50及其单体型均响应2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪，而hT2R75和hT2R61则不在相同浓度下响应这些化合物。因此，这些细胞或功能上表达这些hT2R50受体序列的其它细胞可用于鉴定调节这些受体活化的化合物的测定法，所述化合物例如阻断此受体及其新单体型被吡嗪及其它苦味配体的活化、优选阻断这些受体被苦味配体的活化的化合物。

[0093]可将这些经鉴定阻断与hT2R50相关的苦味的化合物潜在用作改善含苦味味元的食物或药物的适口性并由此改善其性质的添加剂。

[0094]优选，题述T2R测定法将优选利用表达编码具有经下文鉴定氨基酸序列的hT2R的DNA的检测细胞。但预期保留着所述苦味受体的功能性质(即响应一些苦味化合物)的此受体多肽的片段、直向同源物、变体或嵌合体，且其也可用于这些测定法。此类变体的例子包括剪接变体、单核苷酸多态性、等位基因变体和通过重组或化学方法产生的或天然发生的突变。被用于本发明的测定法和预期被用于本发明的测定法以鉴定抑制这些受体活化的化合物的T2R的分离和表达方法如下文所述。

[0095]T2R的分离和表达

[0096]本发明的T2R或其片段或变体的分离和表达可通过使用根据本申请公开的T2R核酸序列构建的探针或引物的成熟的克隆程序实现。还可使用本文公开的序列和已知的基于计算机的搜索技术(例如BLAST序列搜索)从人或其它物种基因组数据库中鉴定相关的T2R序列。在一个特定实施方案中，本文公开的假基因可用于鉴定功能等位基因或相关的基因。

[0097]然后可使用表达载体感染或转染宿主细胞，以功能性表达这些序列。可在体外或体内制备和表达这些基因和载体。本领域技术人员应理解，可通过调节本发明的载体内的基因和核酸(例如启动子、增强子等)的表达或活性而获得改变和控制核酸表达的期望表型。可使用所描述的增加或降低表达或活性的任何已知的方法。本发明可与本领域已知的任何方法或方案联合实施，所述方法或方案在科学和专利文献中已有详细描述。

[0098]另外，这些核酸也可通过公知的化学合成技术在体外合成，参见，例如Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-18(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.，105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利No.4,458,066。然后可通过合成互补链并在适当的条件下将所述链退火在一起，或通过使用DNA聚合酶和适当的引物序列添加互补链来获得双链DNA片段。

[0099]核酸操作技术如(例如在序列中产生突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交等)在科学和专利文献中已有详细描述。参见，例如Sambrook编，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Ausubel编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons、Inc.，New York(1997)；Tijssen编，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.(1993)。

[0100]可通过本领域技术人员公知的许多通用方法中的任何一个分析和定量核酸、载体、病毒壳体、多肽等。这些方法包括例如：分析生化方法(如NMR、分光光度法、放射显影法、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和超扩散(hyperdiffusion)色谱)，各种免疫学方法(例如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、DNA印记分析、RNA印记分析、斑点印记分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR)，其它核酸或靶或信号扩增方法、放射性标记、闪烁计数和亲和色谱。

[0101]可使用寡核苷酸引物扩增编码T2R配体结合区的核酸。还可使用扩增技术克隆或定量测量本文所述核酸。扩增方法也是本领域公知的，并包括，例如聚合酶链式反应(PCR)(Innis编，PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis编，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；连接酶链式反应(LCR)(Wu，Genomics，4：560(1989)；Landegren，Science，241：1077(1988)；Barringer，Gene，89：117(1990))；转录扩增(Kwoh，PNAS，86：1173(1989))；自动维持序列复制(Guatelli，PNAS，87：1874(1990))；Qβ复制酶扩增(Smith，J.Clin.Microbiol.，35：1477-91(1997))；自动化Q-β复制酶扩增测定法(Burg，Mol.Cell.Probes，10：257-71(1996))；及其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)。另请参见，Berger，Methods Enzymol.，152：307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利No.4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology，13：563-64(1995)。

[0102]扩增后，如果需要，可根据本领域已知的方法，使用常规分子生物学方法将所述核酸(无论是单个的或作为文库)克隆至多种载体中的任一种；用于体外克隆扩增核酸的方法参见，例如，美国专利No.5,426,039。为促进扩增序列的克隆，可将限制酶位点“构建入”PCR引物对。例如，将Pst I和Bsp E1位点设计入本发明的示例性引物对中。这些特定的限制位点具有在连接时对于它们剪接的7-膜受体“供体”编码序列是“框内”的序列(配体结合区编码序列位于所述7-膜多肽内部，因此，如果需要所述构建体在限制酶剪接位点下游翻译，应避免框外(out offrame)的结果；如果插入的配体结合区包含跨膜VII区的绝大部分，则无需如此)。所述引物可设计为保留“供体”7-膜受体的原始序列。另外，所述引物也可编码是保守置换(例如疏水性置换疏水性残基，参见上文的讨论)或功能上有利的置换(例如不阻止质膜插入、引起肽酶所致的裂解、引起受体异常折叠等)的氨基酸残基。

[0103]引物对可设计为选择性扩增T2R蛋白的配体结合区。这些结合区可随不同的配体而不同；因此，一个配体的最小结合区可能对于第二个潜在的配体来说太小。因此，可扩增包含不同的结构域结构的不同大小的结合区；例如7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II至VII、III至VII、III至VI或II至VI或它们的变化(例如仅特定结构域的子序列、混合结构域的顺序等)。

[0104]由于许多7-膜T2R蛋白的结构域结构和序列是已知的，因此熟练的技术人员可容易地选择结构域侧翼和内部结构域序列作为设计简并扩增引物对的模式序列。例如，编码结构域区II至VII的核酸序列可用通过使用引物对进行PCR扩增产生。为扩增包含跨膜结构域I(TMI)序列的核酸，可从编码上述T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计简并引物。此简并引物可用于产生包括TM I至TM III、TM I至TM IV、TM I至TM V、TM I至TM VI或TM I至TM VII的结合区。其它简并引物可根据本文提供的其它T2R家族的共有序列设计。此简并引物可用于产生包括TM III至TM IV、TM III至TM V、TM III至TMVI或TM III至TM VII的结合区。

[0105]设计简并引物对的范例是本领域公知的。例如，共有-简并杂种寡核苷酸引物(COnsensus-DEgenerate Hybrid OligonucleotidePrimer，CODEHOP)策略计算机程序是可访问的，并直接链接在从一组相关蛋白序列(如已知的味觉受体配体结合区)开始杂种引物预测的BlockMaker多序列比对站点上(参见，例如Rose，Nucleic Acids Res.，26：1628-35(1998)；Singh，Biotechniques，24：318-19(1998))。

[0106]合成寡核苷酸引物对的方法是本领域公知的。可使用“天然的”碱基对或合成的碱基对。例如，使用人工核碱基提供了操作引物序列和产生更复杂的扩增产物混合物的通用方法。各种家族的人工核碱基能够通过内部键旋转推定多个氢键键合方向，以提供简并分子识别的方法。将这些类似物并入PCR引物的单个位置允许产生复杂的扩增产物文库。参见，例如Hoops，Nucleic Acids Res.，25：4866-71(1997)。还可使用非极性分子模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键键合形状模拟物可有效并选择性针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物进行复制(参见，例如Morales，Nat.Struct.Biol.，5：950-54(1998))。例如，两个简并碱基可为嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N-6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(参见，例如，Hill，PNAS，95：4258-63(1998))。本发明的示例性简并引物包括核碱基类似物5′-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2′-脱氧-胞苷、3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(序列中的术语“p”，参见上文)。此嘧啶类似物与嘌呤形成包括A和G残基的氢键。

[0107]可使用上述核酸探针分离与本文公开的味觉受体基本同一的多态性变体、等位基因和种间同系物。另外，也可使用表达文库，通过用针对T2R多肽制备的抗血清或纯化的抗体免疫学地检测表达的同系物，克隆T2R多肽及其多态性变体、等位基因和种间同系物，所述抗体还识别和选择性结合T2R同系物。

[0108]编码味觉受体的配体结合区的核酸可通过使用适当的(完美或简并)引物对扩增(例如PCR)适当的核酸序列而产生。扩增的核酸可为来自任何细胞或组织的基因组DNA，或源自味觉受体表达细胞的mRNA或cDNA。

[0109]在一个实施方案中，可构建杂种蛋白编码序列，所述序列包含编码融合至转位序列的T2R的核酸。还提供了包含转位基序及其它化学感受受体(特别是味觉受体)家族的味觉引起的化合物结合区的杂种T2R。可将这些核酸序列操纵性连接到转录或翻译控制元件，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、多腺苷酸化序列及其他对将DNA转录成RNA有用的序列。在构建重组表达盒、载体和转基因子时，可利用启动子片段指导所需的核酸在所有所需细胞或组织中表达。

[0110]在另一个实施方案中，融合蛋白可包括C-末端或N-末端转位序列。此外，融合蛋白也可包含例如用于蛋白检测、纯化或其它应用的附加元件。有助于检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽(如多组氨酸束(tracts)、组氨酸-色氨酸模块或其他允许在固定的金属上纯化的结构域)；麦芽糖结合蛋白；允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；或FLAG延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle Wash.)中利用的结构域。

[0111]含于转位结构域(用于有效的质膜表达)和其余新翻译多肽之间的可切割的连接体序列(如因子Xa(参见，例如Ottavi，Biochimie，80：289-93(1998))、枯草杆菌蛋白酶蛋白酶识别基序(参见，例如Polyak，Protein Eng.，10：615-19(1997))；肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)等可用于促进纯化。例如，一个构建体可包括连接到六组氨酸残基的编码多肽的核酸序列，接着是硫氧还蛋白、肠激酶切割位点(参见，例如，Williams，Biochemistry，34：1787-97(1995))和C-末端转位结构域。所述组氨酸残基促进检测和纯化，而所述肠激酶切割位点提供从所述融合蛋白的剩余部分纯化所需蛋白的手段。关于编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用在科学和专利文献中已有详细描述(参见，例如，Kroll、DNA Cell.Biol，.12：441-53(1993))。

[0112]包含配体结合区编码序列的表达载体(无论是作为单个表达载体还是作为表达载体的文库)可被导入基因组或导入细胞质或细胞的核，并可通过科学和专利文献中已有详细描述的多种常规技术进行表达。参见，例如Roberts，Nature，328：731(1987)；Berger，见上；Schneider，Protein Exper.Purif.，6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供有关已知的生物学方法的信息。所述载体可为从天然来源分离的，从如ATCC或GenBank文库的来源获得或通过合成或重组方法制备的。

[0113]核酸可为在细胞中稳定或瞬时表达(例如游离表达系统)的表达盒、载体或病毒中进行表达。可将筛选标记物并入表达盒和载体中，以赋予转化细胞和序列可选择的表型。例如，筛选标记物可编码游离维持和复制，从而无需整合至宿主基因组。例如所述标记物可编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如绿磺隆(chlorosulfuron)或草丁膦(Basta))，以允许选择那些经所需DNA序列转化的细胞(参见，例如Blondelet-Rouault，Gene，190：315-17(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：992-97(1997))。因为赋予底物(如新霉素或潮霉素)抗性的可选择标记物基因仅可用于组织培养，所以也将化学抗性基因用作体外和体内的选择标记物。

[0114]嵌合核酸序列可编码任何7-跨膜多肽内的T2R配体结合区。因为7-跨膜受体多肽具有相似的一级序列和二级和三级结构，所以可通过序列分析容易地鉴定结构结构域(例如胞外结构域、TM结构域、胞质结构域等)。例如同源建模、傅立叶分析和螺旋周期性检测可鉴定和表征具有7-跨膜受体序列的七个结构域。快速傅立叶变换(FFT)算法可用于评估鉴定所分析的序列的疏水性和变化性特征的显性周期。可按例如Donnelly，Protein Sci.，2：55-70(1993)所述进行周期检测增强和α螺旋周期指数。其它比对和建模算法是本领域公知的(参见，例如Peitsch，Receptors Channels，4：161-64(1996)；Kyte & Doolittle，J.Md.Biol.，157：105-32(1982)，和Cronet，Protein Eng.，6：59-64(1993)。

[0115]本发明还不但包括具有指定的核序列和氨基酸序列的核酸分子和多肽，而且还包括其片段，特别是例如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸或更多的片段，及例如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多的多肽片段。所述核酸片段可任选编码能够与针对T2R家族成员的抗体结合的抗原性多肽。此外，本发明的蛋白片段可任选是能够与针对T2R家族成员的抗体结合的抗原性片段。

[0116]还涉及包含本文所述至少一种T2R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多，偶联到代表另一种GPCR的全部或部分的附加氨基酸的嵌合蛋白，所述另一种GPCR优选是7跨膜超家族的成员。这些嵌合体可从即时(instant)受体和另一个GPCR制备，或它们可通过组合两个或多个当前受体制备。在一个实施方案中，所述嵌合体的一个部分对应于或源自本发明的T2R多肽的跨膜结构域。在另一个实施方案中，所述嵌合体的一个部分对应于或源自本文所述T2R多肽的一个或多个跨膜区，且剩余的一个或多个部分可来自另一种GPCR。嵌合受体是本领域公知的，且创建它们的技术和掺入其中的G蛋白偶联受体结构域或片段的选择和划界(boundaries)也是公知的。因此，本领域技术人员在这方面的知识可容易地用于创建此类嵌合受体。使用此类嵌合受体可提供，例如，本文特意公开的受体之一的味觉选择性特征，及另一个受体(例如现有技术测定系统中使用的公知受体)的信号转导特征。

[0117]例如，可将区域如配体结合区、胞外结构域、跨膜结构域、跨膜结构域、胞质结构域、N-末端结构域、C-末端结构域或它们的任意组合共价连接到异源蛋白。例如，可将T2R跨膜区连接到异源GPCR跨膜结构域，或可将异源GPCR胞外结构域连接到T2R跨膜区。可选择的其它异源蛋白可包括例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶(beta-gal)、谷氨酸受体和视紫质N-末端。

[0118]本发明的范围还包括用于表达本发明的T2R、片段或变体的宿主细胞。为获得克隆的基因或核酸(如编码本发明的T2R、片段或变体的cDNA)的高水平表达，技术人员通常将感兴趣的核酸序列亚克隆至表达载体，所述表达载体含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，和用于翻译起始的核糖体结合位点(如果是编码蛋白的核酸)。合适的细菌启动子是本领域公知的，参见例如Sambrook等人。但可使用细菌或真核表达系统。

[0119]可使用将外源核苷酸序列导入宿主细胞的任何公知的方法。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、血浆载体(plasma vector)、病毒载体和任何其它将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源的遗传物质导入宿主细胞的公知方法(参见，例如Sambrook等人)。唯一必需的是使用的特定的基因工程程序能够成功地将至少一种核酸分子导入能够表达感兴趣的T2R、片段或变体的宿主细胞。

[0120]将表达载体导入所述细胞之后，在有利于表达所述感兴趣的受体、片段或变体的条件下培养所述转染的细胞，然后使用标准技术从培养物中回收所述受体、片段或变体。此类技术的例子是本领域公知的。参见，例如WO00/06593，其通过引用以与本公开一致的方式并入。

用于检测调节本发明的T2R单体型的活性的化合物的测定法

[0121]以下描述了用于测定被测化合物是否与本发明的T2R单体型多肽在体外和体内特异性结合的方法和组合物。可监控细胞生理学的许多方面以评估与天然存在的或嵌合T2R结合的配体的效应。这些测定可在表达T2R多肽的完整细胞上、在透过性细胞上或在通过标准方法产生的膜组分上进行。

[0122]味觉受体与味觉引起化合物结合，并启动化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白又将改变靶酶、通道及其它效应蛋白的性质。一些例子是cGMP磷酸二酯酶被视觉系统中的转导蛋白活化、腺苷酸环化酶被刺激性G蛋白活化、磷脂酶C被Gq及其它同类G蛋白活化，及不同的通道被Gi及其它G蛋白调节。还可检查下游结果，如由磷脂酶C产生二酰甘油和IP3，而由IP3又产生钙动员。

[0123]所述测定中的所述hT2R50蛋白或多肽一般选自具有SEQID NO：3所含序列或其片段或保守修饰变体的多肽。

[0124]另外，所述测定中的所述T2R蛋白或多肽也可源自真核宿主细胞，并可包括与SEQ ID NO：3具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其保守修饰变体。一般而言，所述氨基酸序列同一性将是至少30％，优选30-40％，更特异50-60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。所述测定中的所述T2R蛋白或多肽可任选包含T2R多肽的区域，如胞外结构域、跨膜区、胞质结构域、配体-结合结构域等。所述T2R多肽或其部分可任选共价连接到异源蛋白，以产生本文所述测定中使用的嵌合蛋白。

[0125]T2R活性的调节剂可使用上述T2R蛋白或多肽(无论重组的还是天然存在的)进行检测。所述T2R蛋白或多肽(无论重组的还是天然存在的)可为分离的，在细胞中表达的，在源自细胞的膜中表达的，在组织中或在动物中表达的。例如，可使用舌切片(tongue slice)、从舌分离的细胞、经转化细胞或膜。可使用本文所述体外或体内测定法之一检测调节情况。

调节剂的检测

[0126]以下描述了用于测定被测化合物是否与本发明的hT2R50受体在体外和体内特异性结合的组合物和方法。可监控细胞生理学的许多方面以评估与本发明的T2R多肽结合的配体的效应。这些测定可在表达化学感受受体的完整细胞上、在透过性细胞上或在通过标准方法产生的膜组分上进行，或在体外使用从头合成的蛋白进行。

[0127]在体内，味觉受体与味觉调节化合物结合，并启动化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白又将改变靶酶、通道及其它效应蛋白的性质。一些例子是cGMP磷酸二酯酶被视觉系统中的转导蛋白、腺苷酸环化酶被刺激性G蛋白、磷脂酶C被Gq及其它同类G蛋白活化，及不同的通道被Gi及其它G蛋白调节。还可检查下游结果，如由磷脂酶C产生二酰甘油和IP3，而由IP3又产生钙动员。

[0128]另外，所述测定中的T2R蛋白或多肽可源自真核宿主细胞，并可包括与本文公开的T2R多肽具有氨基酸序列同一性的氨基酸子序列或其片段或保守修饰变体。一般而言，所述氨基酸序列同一性将是至少35至50％，或任选75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。所述测定中的T2R蛋白或多肽可任选包含T2R蛋白的结构域，如胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞质结构域、配体-结合结构域等。此外，如上所述，所述T2R蛋白或其结构域可共价连接到异源蛋白，以产生本文所述测定中使用的嵌合蛋白。

[0129]T2R受体活性的调节剂使用上述T2R蛋白或多肽(无论重组的还是天然存在的)进行检测。所述T2R蛋白或多肽(无论重组的还是天然存在的)可为分离的，在细胞中表达的，在源自细胞的膜中表达的，在组织中或在动物中表达的。例如，可使用舌切片、从舌分离的细胞、经转化细胞或膜。可使用本文所述体外或体内测定法之一检测调节情况。

[0130]1.体外结合测定法

[0131]还可使用本发明的T2R多肽用溶态或固态反应在体外检查味觉转导。在一个特定实施方案中，可在体外于溶态或固态反应中使用T2R配体结合结构域，以测定配体结合。

[0132]以下情况是可能的：可由N-末端结构域和胞外结构域的额外部分(如跨膜结构域的胞外环)一起形成配体结合结构域。

[0133]已将体外结合测定法用于其它GPCR，如代谢型谷氨酸受体(参见，例如Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))。这些测定法可能包括替换经放射性或荧光标记的配体，测量内在荧光的变化或蛋白水解易感性的变化等。

[0134]可在溶液中、在双层膜中(任选附着在固相上)、在脂单层中或在小泡中检测配体与本发明的T2R多肽的结合。可使用例如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解度性质的变化来检测调节剂的结合。

[0135]在本发明的优选实施方案中，使用^[35S]GTPγS结合测定法。如上所述，GPCR活化后，刺激了G蛋白复合体的Gα亚基，以将结合的GDP交换为GTP。可在生化测定法中测量配体介导的G蛋白交换活性的刺激，所述测定测量加入的经放射性标记的^[35S]GTPγS与G蛋白在推定的配体存在的情况下的结合。一般，将含感兴趣的化学感受受体的膜与G蛋白混合。向所述测定中加入潜在的抑制剂和/或激活剂和^[35S]GTPγS，并测量^[35S]GTPγS与G蛋白的结合。可通过液体闪烁计数或通过本领域已知的任何其它方法(包括闪烁迫近测定法)测量结合。在其它测定形式中，可利用经荧光标记的GTPγS。

[0136]2.荧光偏振测定法

[0137]在另一个实施方案中，可使用基于荧光偏振(“FP”)的测定法检测和监控配体结合。荧光偏振是测量平衡结合、核酸杂交和酶活性的通用实验室技术。荧光偏振测定法的相同之处在于它们不需要分离步骤，如离心、过滤、色谱、沉淀或电泳。这些测定是实时、直接在溶液中进行的，且不需要固定相。偏振值可重复测量，且可在加入试剂后测量，因为测量偏振很快，且不损坏样品。一般而言，此技术可用于测量从低的皮摩尔至微摩尔水平的荧光团的偏振值。此节描述了如何可使用荧光偏振以简单和定量的方式测量配体与本发明的T2R多肽的结合。

[0138]当用平面偏振光激发经荧光标记的分子时，它发射偏振度与其分子旋转成反比的光。大的经荧光标记的分子在激发态(在荧光素的情况下为4纳秒)保持相对静止，在激发和发射之间光的偏振保持相对恒定。小的经荧光标记的分子在激发态期间快速旋转，激发和发射之间的偏振显著变化。因此，小分子具有低偏振值，而大分子具有高偏振值。例如单链的经荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值，但当其与互补链杂交时，它具有较高的偏振值。当使用FP检测和监控可活化或抑制本发明的化学感受受体的味觉引起化合物的结合时，可使用经荧光标记的味觉引起化合物或自体荧光的(auto-fluorescent)味觉引起化合物。

[0139]荧光偏振(P)定义为：1P＝Int-Int Int+Int

[0140]其中.PI.是与激发光平面平行的发射光的强度，Int perp.是与激发光平面垂直的发射光的强度。光强度比值P是无量纲数字。例如Beacon和Beacon 2000 System可与这些测定法连同使用。此类系统一般用毫偏振单位(1偏振单位＝1000mP单位)来表示偏振。

[0141]分子旋转和尺寸之间的关系用帕灵方程(Perrin equation)描述，读者可参考Jolley，M.E.(1991)，Journal of Analytical Toxicology，第236-240页，其透彻地解释了此方程。概括而言，帕灵方程提示偏振与旋转弛豫时间直接成比例，所述时间是分子旋转通过大约68.5度的角所用的时间。旋转弛豫时间与粘度(η)、绝对温度(T)、摩尔体积(V)和气体常数(R)的关系如下列方程所示：2旋转弛豫时间＝3V RT

[0142]旋转弛豫时间对小分子(例如荧光素)小(大约等于1纳秒)，而对大分子(例如免疫球蛋白)大(大约等于100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，则旋转弛豫时间和由此偏振与分子体积直接相关。分子体积的改变可能是由于与其它分子的相互作用、离解、聚合、降解、杂交或经荧光标记的分子的构象变化。例如荧光偏振已被用于测量蛋白酶、DNA酶和RNA酶对大的经荧光素标记的聚合物的酶切。它还被用于测量蛋白/蛋白相互作用、抗体/抗原结合和蛋白/DNA结合的平衡结合。

[0143]A.固态和溶态高通量测定法

[0144]在又一个实施方案中，本发明提供使用T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织的溶态测定法。在另一个实施方案中，本发明提供基于固相的高通量形式的体外测定，其中所述T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织附着于固相基质或味觉刺激化合物，并与T2R受体接触，和使用适当的标签或针对T2R受体的抗体检测结合。

[0145]在本发明的高通量测定法中，可在一天内筛选多达数千种不同的调节剂或配体。特别地，微滴定板的每个孔均可用于运行针对所选择的潜在调节剂的单独的测定，或，如果要观察浓度或温育时间效应，每5-10个孔可检测一种调节剂。因此，一个标准微滴定板可测定约100(例如96)种调节剂。如果使用1536孔板，则一个板可轻松测定约1000至约1500种不同的化合物。也可在每个板孔中测定多个化合物。每天可测定几个不同的平板；使用本发明的集成系统可进行筛选多达约6,000-20,000种不同化合物的测定。最近已开发了试剂操作的微流体方法。

[0146]感兴趣的分子可通过共价或非共价连接(例如通过标签)直接或间接结合至固态组分。所述标签可为多种组分中的任一种。一般而言，结合标签的分子(标签结合物)被固定至固体支持物，标签化的感兴趣的分子(例如感兴趣的味觉转导分子)通过标签和标签结合物的相互作用附着于所述固体支持物。

[0147]根据文献中详细描述的已知的分子相互作用，可使用许多标签和标签结合物。例如，如果标签具有天然结合物(例如生物素、A蛋白或G蛋白)，则它可与适当的标签结合物(抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)联合使用。针对具有天然结合物的分子(如生物素)的抗体也已广泛可用，且是适当的标签结合物(参见，SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue，SIGMA，St.LouisMo.)。

[0148]相似地，任何半抗原性或抗原性化合物可与适当的抗体组合使用以形成标签/标签结合物对。数千种特异性抗体可商业获得，且许多其它抗体在文献中已有描述。例如，在一个普遍的配置中，所述标签是第一抗体，而所述标签结合物是识别所述第一抗体的第二抗体。除抗体-抗原相互作用之外，受体-配体相互作用也是适当的标签和标签-结合物对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用(如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体)、钙粘蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族等；参见，例如Pigott & Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片剂、类固醇等)、胞内受体(例如其介导各种小配体(包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D；肽)的效应)、药物、凝集素、糖、核酸(线状和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗体均可类似与各种细胞受体相互作用。

[0149]合成的聚合物(如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳硫醚(polyarylene sulfides)、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯(polyacetate))也可形成适当的标签或标签结合物。本领域技术人员可通过阅读本公开明晰，许多其它标签/标签结合物对也用于本文所述测定系统。

[0150]常用连接体(如肽、聚醚等)也可充当标签，并包括多肽序列(如约5-约200个氨基酸的聚甘氨酸序列)。此类柔性连接体是本领域技术人员已知的。例如聚(乙二醇)连接体可从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Ala获得。这些连接体任选具有酰胺连接、巯基连接或异功能连接。

[0151]使用现有的多种方法中的任一种将标签结合物固定至固相基质。固相基质通常通过将全部或部分所述基质接触化学试剂进行衍生或功能化，所述化学试剂将化学基团固定至与所述标签结合物的部分反应的表面。例如适合附着到较长的链部分的基团包括胺、羟基、巯基和羧基基团。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可用于功能化多种表面，如玻璃表面。此类固相生物聚合物阵列的构建在文献中已有详细描述。参见，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述在针上合成固相组分)；Frank & Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述在纤维素皿上合成各种肽序列)；Fodor等人，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等人，Clinical Chemistry，39(4)：718-719(1993)；和Kozal等人，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(均描述固定至固相基质的生物聚合物阵列)。将标签结合物固定至基质的非化学方法包括其它常用方法，如加热、通过紫外辐射交联等。

[0152]3.基于细胞的测定法

[0153]在一个优选实施方案中，T2R蛋白以未修饰的形式或作为嵌合的、变体的或截短的受体在真核细胞中表达，所述受体具有或优选不具有异源的、通过分泌途径促进其成熟和靶向的伴侣序列。此类T2R多肽可在任何真核细胞(如HEK-293细胞)中表达。所述细胞优选包含能够将嵌合受体偶联至胞内信号转导途径或信号转导蛋白(如磷脂酶C)的功能性G蛋白(例如G._α15)。可使用任何标准方法检测此类细胞中的T2R受体活化，如通过检测细胞中FURA-2依赖性荧光来检测胞内钙变化。此测定是本申请中提出的实验发现的基础。

[0154]活化的GPCR受体通常是磷酸化受体的C-末端尾(及可能的其它位点)的激酶的底物。因此，激活剂将促进32P从经放射性标记的ATP转移至所述受体，其可使用闪烁计数器测定。所述C-末端尾的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白的结合，并干扰G蛋白的结合。有关GPCR信号转导和测定信号转导的方法的综述，参见，例如Methods inEnzymology，第237和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等人，Nature，10：349：117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348：125-32(1990)；Pitcher等人，Annu.Rev.Biochem.，67：653-92(1998)。

[0155]可通过比较用推定的T2R调节剂处理的T2R多肽的响应与未处理的对照样品或含已知的“阳性”对照的样品的响应来测定T2R调节。此类推定的T2R调节剂可包括抑制或活化T2R多肽活性的分子。在一个实施方案中，用活化T2R的化合物处理的对照样品的相对T2R活性值指定为100。当相对于所述对照样品的T2R活性值是约90％、任选50％、任选25-0％时，即达到T2R多肽的抑制。当相对于对照的T2R活性值是110％、任选150％、200-500％或1000-2000％时，即达到T2R多肽的活化。

[0156]离子流的变化可通过测定表达T2R多肽的细胞或膜的离子极化(即电位)的变化进行评估。测定细胞极化的变化的一个方法是通过用电压钳和膜片钳技术(参见，例如“细胞附着”模式、“内面向外”模式和“全细胞”模式，例如Ackerman等人，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))测量电流的变化(进而测量极化的变化)。可使用标准物方便地测定全细胞电流。其它已知的测定包括：经放射性标记的离子流测定法和使用电压敏感染料的荧光测定法(参见，例如Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，88：67-75(1988)；Gonzales& Tsien，Chem.Biol.，4：269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。

[0157]可通过检查上述参数中的任一项来测量被测化合物对多肽功能的影响。任何影响GPCR活性的合适的生理变化均可用于评估被测化合物对本发明的多肽的影响。当使用完整细胞或动物测定功能结果时，技术人员还可测量多种效应(如递质释放、激素释放、已知和未表征的基因标记物的转录变化(例如RNA印记)、细胞代谢的变化(如细胞生长或pH变化)和胞内第二信使(如Ca.sup.2+、IP3、cGMP或cAMP)的变化。

[0158]用于GPCR的优选测定包括载有离子或电压敏感染料以报告受体活性的细胞。用于测定此类受体的活性的测定还可使用其它G蛋白偶联受体的已知激动剂和拮抗剂作为对照来评估被测化合物的活性。在鉴定调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定中，将分别使用离子敏感或膜电压荧光指示剂监控细胞质离子水平或膜电压的变化。可利用的离子敏感指示剂和电压探针包括Molecular Probes 1997 Catalog中公开的那些。对于G蛋白偶联受体，混栖(promiscuous)G蛋白如G_α15和G_α16可用于所选的测定(Wilkie等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.，88：10049-10053(1991))。

[0159]受体活化启动随后的胞内事件(例如第二信使升高)。一些G蛋白偶联受体的活化刺激通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇水解形成三磷酸肌醇(IP3)(Berridge & Irvine，Nature，312：315-21(1984))。IP3又刺激胞内钙离子库释放。因此，胞质钙离子水平的变化或第二信使(如IP3)水平的变化可用于评估G蛋白偶联受体功能。由于胞内存储的钙释放和通过质膜离子通道的胞外钙进入两方面的贡献，表达此类G蛋白偶联受体的细胞可表现出胞质钙水平升高。

[0160]在优选实施方案中，T2R多肽活性是通过用将受体与磷脂酶C信号转导途径关联的混栖G蛋白在异源细胞中表达T2R基因来测量的(参见Offermanns & Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。所述细胞系任选是HEK-293(其正常地不表达T2R基因)，且所述混栖G蛋白任选是G_α15(Offermanns & Simon，见上)。味觉转导的调节是通过测量胞内Ca²⁺水平的变化测定的，所述胞内Ca²⁺水平响应通过施用与所述T2R多肽缔合的分子的T2R信号转导途径的调节而变化。Ca²⁺水平的变化任选使用荧光Ca²⁺指示染料和荧光成像测量。

[0161]在另一个实施方案中，可根据美国专利No.5,436,128(通过引用并入本文)分析磷脂酰肌醇(PI)水解。简言之，所述测定包括用3H-肌醇标记细胞48个小时或以上。用被测化合物处理经标记的细胞一个小时。在氯仿-甲醇-水中裂解并提取经处理细胞，然后通过离子交换色谱分离肌醇磷酸，并通过闪烁计数进行定量。刺激倍数通过计算存在激动剂时的cpm与存在缓冲液对照时的cpm的比值确定。同样通过计算在存在拮抗剂时的cpm与存在缓冲液对照(其可含或不含激动剂)时的cpm的比值确定抑制倍数。

[0162]其它受体测定可包括测定胞内环核苷酸(例如cAMP或cGMP)的水平。在受体活化导致环核苷酸水平降低的情况下，可优选在向测定的细胞加入受体活化化合物之前，让所述细胞与升高胞内环核苷酸水平的试剂(例如毛喉素)接触。在一个实施方案中，胞内cAMP或cGMP的变化可使用免疫测定法测量。Offermanns & Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法可用于测定cAMP的水平。另外，Felley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11：159-164(1994)中描述的方法可用于测定cGMP的水平。此外，美国专利No.4,115,538(通过引用并入本文)中描述了用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒。

[0163]在另一个实施方案中，可测量转录水平以评估被测化合物对信号转导的效应。含感兴趣的T2R多肽的宿主细胞与被测化合物接触充分的时间，以实现任何相互作用，然后测量基因表达的水平。实现此类相互作用的时间量可根据经验确定，如通过运行时间过程并将转录水平作为时间函数进行测量。可通过使用本领域的技术人员已知合适的任何方法测量转录量。例如，可使用RNA印记法检测感兴趣的蛋白的mRNA表达，或可使用免疫测定法鉴定它们的多肽产物。可选地，可用使用报告基因的基于转录的测定法，参见美国专利No.5,436,128(通过引用并入本文)。所述报告基因可为例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，可通过将感兴趣的蛋白附着到第二报告分子(如绿色荧光蛋白)而用作间接报告分子(参见，例如Mistili & Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。

[0164]然后将所述转录量与不存在被测化合物的相同细胞中的转录量进行比较，或可将其与缺乏感兴趣的T2R多肽的基本同一的细胞中的转录量进行比较。基本同一的细胞可源自用来制备重组细胞，但尚未通过导入异源DNA进行修饰的相同细胞。转录量的任何差异均指示被测化合物已以某种方式改变了感兴趣的hT2R50多肽的活性。

[0165]4.表达化学感受受体的转基因非人动物

[0166]表达本发明的一种或多种味觉受体序列的非人动物也可用于受体测定。此表达可用于测定被测化合物是否在体内特异性结合哺乳动物味觉跨膜受体复合体，所述方法是将用编码化学感受受体或其配体结合区的核酸稳定或瞬时转染的非人动物与被测化合物接触，并测定所述动物是否通过特异性结合受体多肽复合体而与所述被测化合物反应。

[0167]用本发明的载体转染或感染的动物在用于鉴定和表征可结合特定受体或一系列受体的味觉刺激的测定法中特别有用。表达人味觉受体序列的此经载体感染的动物可用于味觉刺激和它们对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的效应的体内筛选。

[0168]感染/表达核酸和载体(无论是个别还是作为文库)的方法是本领域公知的。可通过多种方法测量多种个别细胞、器官或全动物的参数。本发明的T2R序列可例如用通过感染剂(例如腺病毒表达载体)递送而在动物味觉组织中表达。

[0169]内源味觉受体基因可保持功能，且野生型(天然)活性仍可存在。在其它情况下，如果需要，所有味觉受体活性均是导入的外源杂种受体的，则优选使用敲除系。构建非人转基因动物(特别是转基因小鼠)及筛选和制备用于产生转化细胞的重组构建体的方法是本领域公知的。

[0170]“敲除”细胞和动物的构建基于如下前提：通过向基因组导入新的DNA序列(其发挥中断待抑制基因的DNA序列的某个部分的作用)，特定基因在哺乳动物细胞中的表达水平可被降低或完全消除。另外，“基因包载插入(gene trap insertion)”可用于破坏宿主基因，且小鼠胚胎干(ES)细胞可用于产生敲除转基因动物(参见，例如Holzschu，Transgenic Res 6：97-106(1997))。一般通过互补核酸序列之间的同源重组插入外源物。所述外源序列是待修饰的靶基因的某个部分，如外显子、内含子或转录调控序列或能够影响靶基因的表达水平的任何基因组序列，或它们的组合。多能胚胎干细胞中通过同源重组的基因打靶允许技术人员精确修饰感兴趣的基因组序列。可使用任何技术以产生、筛选、繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53-62(1998)；Meredith，J.Mol.Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology19：161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321-328(1997)；美国专利No.5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。

[0171]本发明的核酸还可用作产生“敲除”人细胞及其后代的试剂。同样地，本发明的核酸还可用作在小鼠中产生“敲入”的试剂。人或大鼠T2R基因序列可替换小鼠基因组中的T2R直向同源物。这样就产生了表达人或大鼠T2R的小鼠。此小鼠然后可用于分析人或大鼠T2R的功能，并鉴定此类T2R的配体。

调节剂

[0172]检测为T2R家族成员的调节剂的化合物可为任何小化学化合物或生物实体(如蛋白、糖、核酸或脂质)。另外，调节剂也可为T2R家族成员的基因改变形式。被测化合物一般可为小化学分子和肽。任何化学化合物基本上都可用作本发明的测定法的潜在调节剂或配体，尽管使用可溶解于水溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液中的最常用的化合物。可通过使测定步骤自动化和从任何方便的来源向测定提供化合物(一般平行运行(例如以机器人测定中微滴定板上的微滴定形式))而将所述测定设计为可筛选大的化学文库。应理解，存在许多化学化合物供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)、Aldrich(St.Louis，Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。

[0173]在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含大量潜在的治疗性化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化合物或肽文库。然后如本文所述在一个或多个测定中筛选此“组合化学文库”或“配体文库”，以鉴定那些表现出所需特征性活性的文库成员(特定的化合物种类或亚类)。由此经鉴定化合物可充当常规的“先导化合物”或其自身可用作潜在的或实际的消费产品。

[0174]组合化学文库是通过化学合成或生物合成、通过组合许多化学“结构单元”(如试剂)而产生的多样的化学化合物的集合。例如线性组合化学文库(如多肽文库)是通过以给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数量)的各种可能方式组合一组化学结构单元(氨基酸)而形成的。可通过此化学结构单元的组合混合来合成数百万种化学化合物。

[0175]组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。此类组合化学文库包括但不限于：肽文库(参见，例如美国专利No.5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-93(1991)和Houghton等人，Nature，354：84-88(1991))。还可使用其它用于产生化学多样性文库的化学。此类化学包括但不限于：类肽(例如WO 91/19735)、编码的肽(例如WO 93/20242)、随机生物寡聚物(例如WO 92/00091)、苯二氮卓类(例如美国专利No.5,288,514)、多样聚合物类(diversomers)(如乙内酰脲类、苯二氮桌类和二肽类)(Hobbs等人，PNAS.、90：6909-13(1993))、联乙烯多肽类(vinylogous polypeptides)(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-18(1992))、小化合物文库的类似有机合成(analogous organic syntheses)(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.，116：2661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamate)(Cho等人，Science，261：1303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.，59：658(1994))、核酸文库(Ausubel、Berger和Sambrook，均见上)、肽核酸文库(美国专利No.5,539,083)、抗体文库(Vaughn等人，NatureBiotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(Liang等人，Science，274：1520-22(1996)和美国专利No.5,593,853)、小有机分子文库(苯二氮桌类，Baum，C&EN，1月18日，第33页(1993)；噻唑烷二酮类(thiazolidinones)和间噻嗪烷酮类(metathiazanones)，美国专利No.5,549,974；吡咯烷类(pyrollidines)，美国专利No.5,525,735和5,519,134；吗啉化合物，美国专利No.5,506,337；苯二氮桌类，5,288,514，等)。

[0176]制备组合文库的设备是可商业获得的(参见，例如357MPS、390MPS(Advanced Chem.Tech，Louisville Ky.)、Symphony(Rainin，Woburn，Mass.)、433A(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)、9050Plus(Millipore，Bedford，Mass.))。此外，许多组合文库本身是可商业获得的(参见，例如ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences；Columbia，Md.；等)。

[0177]在本发明的一个方面，所述T2R调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或它们的成分，以因此以期望的方式调节所述产品、组合物或成分的味道。例如，可加入增强苦味感受的T2R调节剂以向产品或组合物提供苦味，而且也可加入阻断苦味感受的T2R调节剂以阻断产品或组合物的苦味。

经本发明鉴定的化合物的用途

[0178]可将经本发明鉴定的化合物加入食品、饮料或药物组合物以调节(优选阻断)由题述hT2R50序列和其它潜在hT2R被苦味化合物(例如吡嗪化合物及其它苦味化合物)的活化触发的苦味。例如，阻断hT2R50活化的化合物或相关的化合物可用作药物中的添加剂，以阻断与活化hT2R50味觉受体的药物相关的苦味。例如，可将这些化合物加入含此类药物的儿科药物制品中，或以有效量加入这些化合物以抑制与其相关的苦味。

[0179]阻断hT2R50活化的化合物可用于食品、饮料或药品以阻断活化这些受体的化合物(例如吡嗪和结构上相关的化合物)的苦味。

试剂盒

[0180]T2R基因和它们的同系物是用于鉴定味觉受体细胞、用于法医学和亲子鉴定和用于检查味觉转导的有用工具。使用与T2R核酸特异性杂交的T2R家族成员特异性试剂(如T2R探针和引物)和与T2R蛋白特异性结合的T2R特异性试剂(例如T2R抗体)检查味觉细胞表达和味觉转导调控。

[0181]测定样品中T2R家族成员的DNA和RNA存在与否的核酸测定法包括许多本领域技术人员已知的技术，如DNA印记分析、RNA印记分析、斑点印记、RNA酶保护、S1分析、扩增技术(如PCR)和原位杂交。在原位杂交中例如，靶核酸从其细胞环境中释放，以使之可在细胞内杂交，同时保存细胞形态用于随后的解释和分析。下列文章提供原位杂交技术的综述：Singer等人，Biotechniques，4：230250(1986)；Haase等人，Methods in Virology，第VII卷，189-226(1984)；和Names等人编，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(核酸杂交实用方法)(1987)。此外，可用上述各种免疫测定技术检测T2R蛋白。检测样品一般同时与阳性对照(例如表达重组T2R蛋白的样品)和阴性对照进行比较。

[0182]本发明还提供用于筛选T2R家族成员调节剂的试剂盒。此类试剂盒可从容易获得的材料和试剂制备。例如，此类试剂盒可包含下列任何材料中的一种或多种：T2R核酸或蛋白、反应管和检测T2R活性的说明书。所述试剂盒任选含功能性T2R多肽。可根据试剂盒的预期使用者和使用者的特定需要，由本发明制备多种试剂盒和组分。

[0183]现已概述本发明，参考下列实施例将更容易地理解本发明，提供实施例仅旨在示例，并非意在限制。应理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可对本文公开的示例性实施方案进行各种修饰和变化。

[0184]实施例

[0185]功能测定揭示题述hT2R50单体型是有功能的并和先前鉴定的hT2R50等位基因一样响应特异性苦味配体

[0186]hT2R50(在文献中也被称为hT2R45或hTas2R45)是人苦味受体家族的成员。先前的出版物和专利申请(包括上文引用的Adler专利申请)仅揭示了编码短形式的所述蛋白的单体型。本发明人在此报道了编码较长形式的所述蛋白的新单体型的鉴定。此外，我们在此实施例中显示所述长和短形式的所述蛋白在功能测定实验中均识别2种结构上相关的苦味分子，而对照hT2R则不识别，表明hT2R50是至少这2种苦味分子的味觉受体。

[0187]图1和权利要求书前的序列表中含本文鉴定的新hT2R50单体型的核苷酸和蛋白序列。从中可看出，图1所含较长(单体型)形式的hT2R50蛋白(称为hT2R50L)比最初鉴定的hT2R50等位基因(这些残基用加粗和下划线表示)多出10个氨基酸，如图2所示，与最初报道的单体型(hT2R50)相比，所述10个氨基酸被添加到其C-末端。

[0188]如图2所示，hT2R50L的延长的C-末端序列与其它近缘hT2R(如hT2R61、64，和75)高度同源或相同。迄今获得的遗传分析提示hT2R50L等位基因的相对频率估计是46％。这是基于发明人的来自24个体(其中约50％为欧洲血统和50％为亚洲血统)的测序数据。

[0189]使用下文描述的体外测定，我们发现hT2R50单体型识别并响应2种结构上相关的苦味分子(2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪)。这些结果显示于图3。在约5mM的浓度下，这两种吡嗪化合物均被人品尝为苦味。相同的体外测定显示短和长形式的hT2R50均可响应所述苦味分子，而近缘的hT2R75和61却显示无响应(图4)。

hT2R50测定条件

[0190]本文新hT2R50单体型及其它hT2R的活化是在检测胞内钙浓度的变化的基于细胞的测定中测量的。简言之，将人胚胎肾细胞接种于48孔组织培养板中。24小时后，用含hT2R50单体型或另一个hT2R核酸序列的质粒和含嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒瞬时转染所述细胞。再过24小时后，将所述细胞与钙特异性荧光染料(Fluo-4；MolecularProbes)温育，所述染料提供用于检测细胞内钙浓度的变化的快速、简单和可靠的基于荧光的方法。T2R活化引起信号级联，其导致PLC活化和随后的胞内钙浓度升高。此钙浓度升高改变了细胞内钙染料的荧光性质。使用荧光显微术监控这些变化。

序列表

视紫质转位结构域的蛋白序列(SEQ ID NO：1)

hT2R50L的DNA和蛋白序列(SEQ ID NO：2)

编码DNA序列：

hT2R50单体型蛋白序列：(SEQ ID NO：3)

hT2R C-末端序列的比对

hT2R50-KLKQTYLSVLWQMRY终止(SEQ ID NO：4)

hT2R50I-KLKQTYLSVLWQMTYWVKGEKPSSP终止(SEQ ID NO：5)

hT2R61-KLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP终止(SEQ IDNO：6)

hT2R64-KLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP终止(SEQ IDNO：7)

hT2R75-KLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS终止(SEQ IDNO：8)

虽然本说明书已描述了本发明的几个实施方案，但应理解，以上描述仅是例证性的，并不限制所公开的发明。本发明仅受下列权利要求的限制。

Claims

1.编码苦味受体hT2R50单体型的核酸序列或其变体，所述核酸序列编码具有SEQ ID NO：3所含序列的T2R多肽序列，所述变体编码与所述T2R多肽序列具有至少90％序列同一性且在其羧基末端含与SEQID NO：3所含hT2R50多肽相同的10个氨基酸的T2R多肽。

2.核酸序列，其编码SEQ ID NO：3所含多肽。

3.权利要求2的核酸序列，其包含SEQ ID NO：2所含核酸序列。

4.表达载体，其含权利要求1的核酸序列。

5.表达载体，其含权利要求2的核酸序列。

6.表达载体，其含权利要求3的核酸序列。

7.细胞，含权利要求1中任一项的表达载体。

8.权利要求7的细胞，其选自哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞和两栖动物卵母细胞。

9.权利要求8的哺乳动物细胞，其选自HEK-293细胞、HEK-293T细胞、CHO细胞、Cos细胞和BHK细胞。

10.权利要求9的哺乳动物细胞，其是HEK-293细胞。

11.权利要求8的细胞，其还表达与所述hT2R多肽功能相关的G蛋白。

12.权利要求11的细胞，其中所述G蛋白选自Gα16、Gα16、味转导素、转导蛋白或包含其部分的嵌合G蛋白。

13.包含hT2R50单体型的多肽或其变体，所述多肽具有SEQ IDNO：3所含多肽序列，所述变体与所述多肽具有至少90％序列同一性且特异性响应2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪。

14.权利要求13的多肽，其包含SEQ ID NO：3所含序列。

15.测定法，其用于鉴定调节特异性响应2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪的人hT2R50苦味受体的化合物，所述受体选自SEQ ID NO：3所含hT2R50单体型多肽、或与所述hT2R50单体型具有相同的氨基酸序列但缺乏最后10个羧基氨基酸的hT2R50多肽、或与所述序列具有至少90％序列同一性且特异性响应2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪的hT2R50多肽变体，所述测定法包括：

i.筛选作用于2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪或在结构上相关并诱导所述hT2R多肽的活化的化合物，和

ii.确定所述化合物是否基于其对所述受体被所述吡嗪或结构上相关的化合物活化的作用而调节hT2R50相关的苦味。

16.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在分离的细胞膜中表达。

17.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在完整的细胞中表达。

18.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在真核细胞中表达。

19.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体由两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

20.权利要求15的测定法，其中所述味觉受体在选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞中表达。

21.权利要求15的测定法，其是荧光测定法。

22.权利要求15的测定法，其是结合测定法。

23.权利要求15的测定法，其通过测定所述化合物对胞内离子浓度的作用来检测对所述化合物的作用。

24.权利要求23的测定法，其检测所述化合物对胞内钠或钙的作用。

25.权利要求15的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的作用。

26.权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体转录的作用。

27.权利要求15的测定法，其中所述化合物是根据其阻断所述吡嗪化合物对所述hT2R50味觉受体的活化或与其相互作用的能力筛选的。

28.权利要求15的测定法，其检测所述化合物对胞内cAMP、cGMP或IP3的作用。

29.权利要求15的测定法，其中所述hT2R味觉受体包含所述hT2R味觉受体的胞外结构域或跨膜区。

30.权利要求15的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

31.权利要求15的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的变化。

32.权利要求15的测定法，其中所述味觉受体是在溶液中。

33.权利要求15的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

34.权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述hT2R50味觉受体与G蛋白的复合的作用。

35.权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、味转导素、G_α15和G_α16的G蛋白的复合的作用。

36.权利要求15的测定法，其是荧光偏振测定法。

37.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体多肽附着于固相基质。

38.权利要求15的测定法，其是高通量测定法。

39.权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体多肽由HEK293细胞表达。

40.权利要求30的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的变化。

41.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体是在溶液中。

42.权利要求30的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

43.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白的复合的作用。

44.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、味转导素、G_α15和G_α16的G蛋白的复合的作用。

45.权利要求30的测定法，其是荧光偏振测定法。

46.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体附着于固相基质。

47.权利要求30的测定法，其是高通量测定法。

48.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体由HEK293细胞表达。

49.分离的味觉或胃肠细胞，其表达具有在严格杂交条件下与SEQID NO：2所含DNA序列特异性杂交的核酸序列的T2R单体型多肽，且所述T2R单体型多肽结合于特异性地与SEQ ID NO：3所含T2R50单体型肽相结合的苦味配体。

50.权利要求49的分离的味觉或胃肠细胞，其中所述细胞包含SEQID：NO：2所含DNA序列。

51.鉴定调节人T2R50单体型多肽的活性的化合物的方法，所述方法包括使权利要求49或50的味觉或胃肠细胞与潜在的T2R调节化合物接触，并检测所述化合物是否特异性结合其中表达的T2R和/或调节所述T2R的活性，和/或通过另一种化合物影响所述人T2R的特异性结合或活化。

52.筛选具有T2R50单体型的个体的方法，所述方法包括对个体进行基因检测，并测定所述个体是否包含SEQ ID NO：2所含hT2R50序列。

53.筛选测定法，其包括使表达如SEQ ID NO：3所示的hT2R50单体型多肽序列的细胞与推定的调节化合物接触，并检测调节所述T2R50单体型的活性的化合物。

54.检测与T2R50单体型表达相关的差异的方法，所述方法包括鉴定特异性结合和/或活化hT2R50但不特异性结合和/或活化其他hT2R50单体型的化合物。

55.T2R配体筛选测定法，所述测定法包括接触表达SEQ ID NO：3所含任一种hT2R50单体型多肽的细胞，并鉴定特异性活化所述hT2R50序列的化合物。

56.权利要求55的测定法，所述测定法进一步包括检验所述配体对涉及舌或胃肠系统中表达T2R的细胞的味觉和/或胃肠或消化功能的作用。