CN101512340A - 用于在表面上形成分子序列的方法 - Google Patents

Abstract

用于形成分子序列(10)的方法包括用包含受保护的反应基团(P_L)的至少一个接头(14)衍生无限制基质(12)表面。使基质(12)与包含光生成试剂前体(18)和缓冲液和/或中和剂(20)的溶液(16)接触。光生成试剂(22)在至少部分溶液(16)中产生。设定光生成试剂(22)以起始基质(12)表面上的至少一个活性区域的形成。使单体(24)与活性区域偶联。

Description

用于在表面上形成分子序列的方法

与相关申请的交叉参考

本申请要求于2006年3月24日提交的美国临时专利申请系列号60/785,938的利益，所述申请整体引入本文作为参考。

关于联邦政府赞助研发的声明

本发明在由来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)拨款部分支持的研究过程中进行，拨款号为1R01RR018625-01和1R21HG003725-01。美国政府在本发明中享有一定权利。

背景

总的来说，本公开内容涉及用于在表面上形成分子序列的方法。

在固体表面上的生物聚合物的高密度微阵列，或用于诊断和研究目的的生物芯片已显示具有巨大的潜力。包含原位合成的微阵列的生物芯片(包括DNA生物芯片、蛋白质生物芯片、肽生物芯片等)已在多种应用中使用，包括指导患者护理、通过基因表达变化监控疾病进展、鉴定单核苷酸多态性(SNPs)、鉴定关于许多癌症的遗传原因、检测感染中枢神经系统的病毒、检测和鉴定病原体、了解鸣禽基因组学与学习模式之间的关系、开发药物、和响应环境改变植物遗传学。

生物芯片制作包括涉及墨水喷射的直接芯片上合成(每次制备几个序列)；涉及光刻法和包含UV敏感性保护基团的特别制备分子的直接芯片上平行合成(同时制备整个序列阵列)；涉及光生成酸和碱以及基质中的预制作反应孔的阵列的直接芯片上平行合成；以及采用电化学生成酸以及涉及自动点样的预合成分子文库的固定的直接芯片合成。

点样和墨水喷射技术可以包括在某些情况下可能稍微无效、复杂和相对劳动密集的另外步骤。例如，点样和墨水喷射技术可以包括在将其置于基质上之前分别预合成每个分子序列、样品的重复微量移液、以及需要微型机制室或者专门的疏水表面处理用于反应的物理限制的基质。

光指导的芯片上平行合成可以包括下述局限性：化学过程通常要求使用的接头和单体上专门的、昂贵的和难以合成、光可切割的保护基；和合成可能具有低序列保真度。

用于形成生物芯片的许多技术包括通过物理屏障、聚合物矩阵或表面张力屏障来限制合成区域。此种屏障的添加可能需要使用半导体制造技术或疏水表面图案形成(patterning)在两种基质之间制作三维合成室。

同样，希望提供相对简单、通用、节省成本、且能产生具有改善纯度的高密度分子阵列的合成方法。

概述

公开了用于形成分子序列的方法。该方法包括用包含保护反应基团的至少一个接头衍生无限制基质表面。使基质与包含光生成试剂前体和缓冲液和/或中和剂的溶液接触。光生成试剂在至少部分溶液中产生。设定光生成试剂以起始基质表面上的至少一个活性区域的形成。使单体与活性区域结合。

附图简述

通过参考下述详细说明书和附图，本公开内容的实施方案的特征和优点将是显而易见的，其中相似的参考数字对应相似尽管不一定相同的组分。为了简洁起见，具有前述功能的参考数字或部件不必与它们在其中出现的其他附图结合描述。

图1是形成分子序列的实施方案的示意图(SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5显示为非限制性示例序列)；

图2是光生成试剂的化学限制的数字模拟；

图3是使用光生成酸前体形成分子序列的实施方案的示意图(SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8显示为非限制性示例序列)；

图4是使寡核苷酸合成中的基于常规溶液的酸脱保护反应与基于光生成酸的寡核苷酸合成的实施方案比较的示意图；

图5是使用光生成碱前体形成分子序列的实施方案的示意图(SEQID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11显示为非限制性示例序列)；

图6是用于合成分子序列的实施方案的装置的示意图；

图7A描述在未成形玻璃基质上形成的寡核苷酸序列；

图7B描述在玻璃显微镜载玻片上形成的寡核苷酸序列；

图7C描述在200微米硅球上形成的寡核苷酸序列；和

图7D描述在毛细管内壁上形成的寡核苷酸序列。

详述

本文公开的方法的实施方案有利地允许在无物理分隔、多孔凝胶/聚合物矩阵图案形成、或表面化学处理(例如，疏水性或者亲水性图案形成)的基质表面上的预定位置处制备不同的化学序列。此外，可以应用本文公开的方法以在固体基质上制备DNA、RNA寡核苷酸、肽、寡糖、糖脂及其他有机和生物聚合物的大规模阵列。本文形成的阵列的实施方案可用于多种化学、生物和/或医学应用。此种应用的例子包括但不限于，生物活性筛选(例如，药物、抗体)、药物开发、临床诊断、基因表达分析、基因型分型、生物基因突变的发现、后续测序、单核苷酸多态性的检测、通过杂交测序、启动子结合位点的测定、聚合酶链反应、表位结合、配体-肽相互作用、重金属检测、基因合成、蛋白质DNA相互作用、聚合分子组合文库的制备等，和/或其组合。

现在参考图1，描述了形成分子序列10的实施方案的示意图。应当理解序列10可以在基质表面的预定区域形成，无需使用光不稳定性保护基团、光掩蔽、或其他物理限制方式，例如表面张力、疏水性或亲水性屏障、微制作壁等。经由该方法的实施方案形成的序列10包括但不限于寡核苷酸、寡肽、聚酯、尼龙、聚氨基甲酸脂、聚酰胺、聚碳酸酯、寡糖等，和/或其组合。在图1中显示的实施方案中，形成寡核苷酸序列。

在实施方案中，无限制基质12表面用至少一个接头分子14进行衍生化。基质12一般是任何固体或半固体材料、或表面包被的固体材料。在实施方案中，基质12的表面是由微珠层、具有任意形状的微粒和/或纳米颗粒表面、或其组合组成的基本上平的、圆形的(例如，毛细管的内部)。合适的基质材料的非限制性例子包括玻璃、石英、硅、硅球、多孔玻璃、尼龙片或膜、TENTAGEL(从德国Tübingen的RappPolymere GmbH商购可得的TentaGel树脂是接枝共聚物，包括在其上接枝聚乙二醇(PEG或POE)的低交联聚苯乙烯矩阵)等，和/或其组合。

应当理解接头分子14可以是任何分子，其具有能够与基质12表面结合/键合的末端，且具有包含受保护的反应基团的另一个末端。在实施方案中，分子14经由共价键、多价效应、静电吸引、络合(例如，与金表面结合的硫醇基)等或其组合与基质12表面结合/键合。接头分子14的非限制性例子包括3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-羧丙基硅烷、核亚磷酰胺(nucleophosphoramidites)、核膦酸酯(nucleophosphonate)(其的非限制性例子包括5′-二甲氧三苯甲基-2′-脱氧胸苷、3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、氨基酸(其的非限制性例子包括叔丁氧羰基(t-BOC)丙氨酸)等，和/或其组合。

在一个实施方案中，接头分子14的反应基团受酸或者碱不稳定性保护基团P_L保护。不稳定性保护基团P_L的非限制性例子包括二甲氧三苯甲基(DMT)、单甲氧三苯甲基(MMT)、二酯、芴基甲氧羰基(Fmoc)、t-BOC、苄氧羰基(CBZ)、甲氧亚乙基(MED)、乙酰基、三氟乙酰基、酯及其衍生物等，和/或其组合。

衍生基质12可以与包含光生成试剂前体18和缓冲液或中和剂20的溶液16接触。溶液16可以包含敏化剂、稳定剂、粘度添加剂、和/或其组合。

认为敏化剂(例如，光敏剂)可以增加光生成试剂22(下文进一步描述)的产生效率和/或改变光生成试剂22在其上产生的波长。合适的光敏剂的非限制性例子是蒽、蒽衍生物、二氰基蒽、噻吨酮、氯噻吨、芘、二苯酮、苯乙酮、苯偶姻基(benzoinyl)C1-C12烷基醚、氧化苯甲酰三苯基膦、Ru²⁺络合物、Ru²⁺络合物衍生物、任何生色(chromophogenic)化合物、其衍生物等、和/或其组合。包括敏化剂的溶液16的实施方案还可以包括激发分子收集器(trapper)，其基本上阻止敏化剂分子远离照明位点的扩散(下文进一步描述)。此种分子的非限制性例子包括分子氧、甘露糖醇、叠氮离子、GRP Carotenal(β-阿朴胡萝卜素醛的Girards试剂P衍生物)、肌肽(B-丙氨酰-L-组氨酸)、十六烷基甲基紫精、三乙醇胺、金属卟啉(metallophorphyrins)、A-生育酚、B-胡萝卜素衍生物等、和/或其组合。

稳定剂的例子包括但不限于R-H稳定剂，其的非限制性例子包括碳酸异丙烯酯、丙二醇醚、叔丁烷、叔丁醇、硫醇、环己烷、其取代衍生物、或其组合。这些非限制性例子的取代衍生物包括下述取代基中的至少一种：卤素、NO₂、CN、OH、SH、CF₃、C(O)H、C(O)CH₃、C₁-C₃-酰基、SO₂CH₃、C₁-C₃-SO₂R₂、OCH₃、SCH₃、C₁-C₃-OR₂、C₁-C₃-SR₂、NH₂、C₁-C₃-NHR₂、C₁-C₃-N(R₂)₂，(其中R₂＝烷基，当在化合物中出现超过一次时，其可以是相同的或不同的基团)等。

粘度改性剂的非限制性例子包括丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚异丁烷、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、其衍生物、等、或其组合。

光生成试剂前体18是当暴露于具有足够能量以起始前体分解的电磁辐射时，形成酸或碱和副产品的前体分子。光生成试剂前体18可以是光酸产生剂(photoacid generator)(产生有机酸、路易斯酸、或无机酸形式的H⁺)或光碱(photobase)产生剂(产生有机碱、路易斯碱、或无机碱)。

光酸产生剂前体的非限制性例子包括重氮酮、三芳基锍盐、碘(iodinum)盐、萘二甲酰亚胺化合物、萘二甲酰亚胺-氧化合物、苄氧羰基化合物、苯乙氧基羰基化合物、苯丙氧基羰基化合物、等、和/或其组合。合适的光酸产生剂前体的具体例子包括但不限于二(4-叔丁基苯基)碘鎓全氟-1-丁磺酸盐；二(4-叔丁基苯基)碘鎓对甲苯磺酸盐；二(4-叔丁基苯基)碘鎓三氟甲磺酸盐；(4-溴苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(叔丁氧羰基甲氧基萘基)-二苯锍三氟甲磺酸盐；(叔丁氧羰基甲氧基苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-叔丁基苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-氯苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；二苯碘鎓-9，10-二甲氧基蒽-2-磺酸盐；二苯碘鎓六氟磷酸盐；二苯碘鎓硝酸盐；二苯碘鎓全氟-1-丁磺酸盐；二苯碘鎓对甲苯磺酸盐；二苯碘鎓三氟甲磺酸盐；(4-氟苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；N-羟基萘二甲酰亚胺三氟甲磺酸盐；N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺全氟-1-丁磺酸盐；N-羟基邻苯二甲酰亚胺三氟甲磺酸盐；[4-[(2-羟基十四烷基)氧]苯基]苯碘鎓六氟锑酸盐；(4-碘苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-甲氧基苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4，6-二(三氯甲基)-1，3，5-三嗪；(4-甲苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-甲硫基苯基)甲基苯基锍三氟甲磺酸盐；2-萘基二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-苯氧基苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；(4-苯硫基苯基)二苯锍三氟甲磺酸盐；硫代二(三苯锍六氟磷酸盐)溶液；三芳基锍六氟锑酸盐；三芳基锍六氟磷酸盐；三苯基锍全氟-1-丁磺酸盐；三苯基锍三氟甲磺酸盐；三(4-叔丁基苯基)锍全氟-1-丁磺酸盐；三(4-叔丁基苯基)锍三氟甲磺酸盐；和/或其组合。

光碱前体的例子包括但不限于o-苯并氨基甲酸酯、苯偶姻基氨基甲酸酯(benzoinlycarbamates)、肟氨基甲酸乙酯、N-甲酰苯胺、二甲基苄基-氧羰基胺、苄氧基胺衍生物、苯乙氧基羰基衍生物、包含受光不稳定性基团保护的氨基或胺基团的任何其他分子(所述光不稳定性基团在暴露于光后能够释放氨基或胺或路易斯碱)、等、和/或其组合。

应当理解所选择的缓冲液或中和剂20可能至少部分依赖于溶液16中的光生成试剂前体18。用于与光酸前体一起使用的合适的缓冲液或中和剂20的非限制性例子包括吡啶，二甲基吡啶，哌啶，伯、仲或叔胺或其衍生物，在有机溶剂(例如，氨)中可溶的任何有机碱或路易斯碱，等，和/或其组合。在使用光碱前体的实施方案中，缓冲液或中和剂20选自弱酸、在有机溶剂中可溶的路易斯酸、等、和/或其组合。此种酸的非限制性例子包括二苯乙醇酸(benzillic acid)、氯化铝、氯化铁(III)、三氟化硼、三氟甲磺酸镱(III)、丁酸、丙酸、苯酚、等、和/或其组合。

使基质12和溶液16暴露于在预定区域处的电磁辐射(例如，光)，从而使得光生成试剂22在预定区域处的溶液16中产生。应当理解预定区域可以是由用于使区域暴露于光的光学器件部分确定的任何合适的大小和/或形状。

光生成试剂22在其下产生的条件一般是温和的(例如，室温、中性或温和溶剂)，且反应是相对快速的(例如，数秒或秒的分数)。

认为溶液16中存在的缓冲液和/或中和剂20与光生成试剂22反应，从而形成不能进一步反应的中性种类。中性种类的形成使光生成试剂22的作用限制且约束于基质12预定区域的基本紧邻区域。同样，光生成试剂22的化学活性可以导向在基质12表面上的预定位置，而无需使用屏障、光掩蔽、疏水性图案形成等。认为这种缓冲液-试剂相互作用增加其中小部分光生成试剂被激活的区域处的酸或碱脱保护的阈值。这导致接受光照射的区域和由于光散射而接受照射的区域之间改善的对比。

图2中显示了缓冲液和/或中和剂20和光生成试剂22反应的数字模拟。酸由前体18基本上持续生成最高达约0.6秒，在这个点上光暴露停止。通常，一旦光暴露停止，光生成试剂22浓度就快速下降，并且在相对短的时间段例如约两秒内基本上变成零。应当理解举例说明的浓度是在基质12的表面上的。如每个模拟中所示，虽然光暴露的形状为矩形，但在其中发生酸产生的基质12上的区域为圆形。认为这个变化至少部分是由于投射图像角落附近的中性种类的更高利用度而发生。

光生成试剂22可以是酸或碱，这至少部分依赖于所选择的光生成试剂前体18。光生成试剂22也进行设定以起始基质12上的至少一个活性区域的形成。暴露于照射后，光生成试剂22扩散至基质12表面，在其中它催化接头分子14的脱保护。去除不稳定性保护基团P_L，以暴露预定区域内的反应基团R且形成活性区域。

基质12可以进行洗涤，且随后与包含一种或多种单体24和活化剂的溶液接触。单体24能够与每一个反应基团R偶联，并且认为活化剂有利地促进这种偶联反应。单体24的非限制性例子包括核苷酸(DNA(例如，图1的分子序列10中显示的C、T、A和G)或RNA(例如，C、U、A和G))，锁定核酸(LNA)单体，氨基酸(肽或蛋白质(例如，Ala、Cys、Asp等))，单糖和二糖(例如，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等)，和/或其组合。应当理解任何单体24都可以是天然的，合成的，或两者的组合。活化剂的非限制性例子包括四唑；4，5，二氰基咪唑(DCI)；三氟乙酸吡啶鎓；5-乙硫基四唑(5-ethlythiotetrazole)；5(3，5-二硝基苯基(dintrophenyl))-1H-四唑；三甲基氯硅烷；活化剂42(5-(二-3，5-三氟甲基苯基)-1-H-四唑；其衍生物；等；和/或其组合。

应当理解单体24可以具有能够与反应基团R偶联的一个末端，和包括受保护基P(其可以与不稳定性保护基团P_L相同或不同)保护的反应基团的另一个末端。在一个实施方案中，受保护的单体24用于合成已知序列。然而，应进一步理解单体24可以不包括保护基团P。在一个实施方案中，未保护的单体24用于合成随机序列。

需要时可以重复该过程，以使接头14、单体24、或其组合脱保护，且使另外的单体24与之选择性偶联，以形成所需序列10。在非限制性例子中，对于包含任何指定序列模式的阵列的寡核苷酸生物芯片，如果使用天然核苷酸，那么每个循环中的反应步骤的最大数目是4x1，且如果还使用包含非天然核碱基(nucleobase)的核苷酸，则是12x1。因此，如果使用天然DNA单体，那么用于合成“n个”核苷酸的寡核苷酸阵列的最大循环数目是4xn，且如果还使用非天然单体，则更多。

图3描述了合成寡核苷酸序列10的实施方案。与图1类似，预定的接头分子14在与溶液16接触且暴露于光后脱保护。各种单体24(例如，核亚磷酰胺单体、T、A、C和G)与脱保护的接头分子14的活性部位附着。

现在参考图4，描述了在寡核苷酸合成中基于溶液的酸脱保护反应。在光暴露后产生酸后，切割接头的保护基团(例如，DMT)以暴露反应性5’-OH基团。亚磷酸键能够在接头的-OH基团和单体的反应性磷原子之间形成。可以进行一般的亚磷酰胺或膦酸盐合成过程的洗涤、氧化和加帽步骤，这将完成第一种单体的添加。

在另一个实施方案中，可以使用包含受保护的3’-OH基团的单体代替5’-OH基团，以以3’至5’方向执行寡核苷酸的合成。这种类型的合成可以在合成PCR引物中使用。

现在参考图5，描述了使用F-moc法在开放基质12上以平行方式合成氨基酸聚合物(例如，寡肽)的非限制性例子。受保护的接头分子14与基质12的表面附着。在这个非限制性例子中，每个接头分子14包含受碱不稳定性保护基团P，P_L(在这个例子中为F-moc)保护的反应性官能团(例如，-NH₂)。

应当理解在本文公开的实施方案中，基质12可以与反应器筒(cartridge)在其底部或顶部附着，从而使得衍生的表面朝向筒的内部。

基质12随后与包含光生成试剂前体18的溶液16接触。在这个示例实施方案中，光生成试剂前体18是选自2-硝基苄氧(benzyoxy)羰基-哌啶、2-硝基苯基丙氧基羰基、5-苄基-1，5-二氮杂双环-壬烷、5-苄基-1，5-二氮杂双环-十一烷、5-苄基-1，4-二氮杂双环-咪唑及其组合的光碱产生剂。

随后将预定光模式投射到基质12和溶液16上。光生成试剂22是碱(例如，胺，包括例如哌啶、C₅H₁₁N(即六氢吡啶)、五亚甲基亚胺、氮杂环己烷、1，5-二氮杂双环-十一碳烯(DBU)、5-苄基-1，5-二氮杂双环-壬烯(DBN)、1，4-二氮杂双环-咪唑等)，并且在暴露于光的溶液16的部分中产生。光生成试剂22使保护基团P，P_L从接头分子14处去除。在这个非限制性例子中，保护基团P，P_L的去除导致反应性NH群的暴露。

应当理解光生成试剂22在未暴露于光的区域处的溶液16中不产生，并且光生成试剂22至非暴露位点的扩散通过与溶液16中存在的中和(在这个例子中为弱酸)或缓冲分子反应而被阻止。

基质表面进行洗涤且随后与第一种氨基酸单体24(其的非限制性例子包含反应性羧酸基团和受保护的胺基团)的溶液和偶联剂/活化剂(例如，碳二亚胺介导的偶联、苯并三唑-1-基氧-三(二甲氨基)磷鎓(BOP)、O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)等)接触。将氨基酸单体24加入脱保护的接头分子14中，以产生酰胺键。

在这个示例实施方案中，附着的氨基酸单体24包含受碱不稳定性基团(例如，F-moc)保护的反应性功能末端胺基团。基质12表面可与第二批溶液16接触，且暴露于第二种预定的光模式。暴露区域中的单体24或接头14进行脱保护，且洗涤基质12，随后供应第二种单体(F-moc-R，其中R可能是任何合适的氨基酸)。第二种单体与已通过光暴露脱保护的表面位点附着。

如前所述，合成可以进行重复，直至在所选择的表面位点上形成具有所需长度和化学序列的聚合物(例如，顺次连接的氨基酸AHVSK(SEQID NO：12)的序列)。应当理解如果使用天然存在的氨基酸和/或其衍生物，那么向基质12上的预定位点添加所需氨基酸单体24的循环数目通常少于或等于20x1，但如果还使用非天然氨基酸类似物，则可以显著超过20x1。

图6举例说明了用于合成大规模序列10的装置100。通常，装置100包括化学反应器筒102、试剂歧管104、光学系统106、和计算机控制系统108。

化学反应器102包括具有歧管的壳(housing)，用于使液体试剂与基质12接触。在实施方案中，化学反应器102是用惰性材料(其的非限制性例子包括氟化聚合物、聚乙烯、PPEK、不锈钢和/或其他合适的材料)进行机械加工或铸造。反应器102具有供给试剂和洗涤溶液的进口和出口。在实施方案中，反应器102通过与加热和/或冷却源(例如，IR、微波、加热元件、冷却螺管等)接触进行加热和/或冷却。

可以至少部分使用两个或更多水平的分形歧管，以使试剂在基质12上均匀流动。反应器的顶部和/或底部由基质12覆盖，在其上将以预定模式合成所需聚合序列。通常，基质12与化学反应器筒102之间的连接用合适材料的O型环或者垫圈进行密封。在另一个实施方案中，流动引导歧管用硅、玻璃、或另一种惰性陶瓷材料蚀刻出来，且基质12通过阳极键合、扩散键合、或通过使用粘合剂(例如，环氧树脂)进行附着。

反应器102随后通过将反应器102固定到筒内与试剂歧管连接。

试剂歧管104执行试剂计量、递送、循环和处置。通常，歧管104包括试剂瓶、电磁(solenoid)或压力启动阀、计量泵、惰性气体处理系统、管道系统和/或过程控制器。应当理解试剂歧管104可以分开构建，或DNA/RNA、肽、或其他类型的自动化合成仪可以用作试剂歧管104。

光学系统106产生预定模式用于光指导的合成。光学系统106包括光源、空间光调节器、透镜、镜子和/或滤光器。在实施方案中，光源是汞UV灯、氙气灯、白炽灯、可见或UV激光器、发光二极管、或任何其他合适的光发射器。在非限制性例子中，光源是与带通滤波器一起使用的高压汞灯，以选择340nm-420nm的波长。在另一个非限制性例子中，光源是具有340nm-420nm的波长的UV激光器。通常，导向基质12表面的光强度范围为约1mW-约1000mW cm²。

在实施方案中，可编程的空间光调节器用于产生光模式用于所需合成模式。空间光调节器的非限制性例子是微镜阵列调节器(DMD，这从位于Dallas，TX的Texas Instruments商购可得)。用于投射光模式的其他合适工具是液晶显示器(LCD)、液晶光阀、声-光扫描光调节器(SLMs)、检流计激光扫描仪等。

本文公开的装置100和方法有利地允许同时合成超过一种基质。通常，这包括将超过一种基质12置入反应器102内，且具有透明基质作为反应器筒的顶部覆盖物。通过逐步和反复暴露方案或通过旋转转盘系统可以平行制作多个阵列。

应当理解这种多重合成系统可以同时加工少至2个和多至数十个基质12。在例子中，6-30种基质12可以以固定在基本上线形的X-Y平移台上的多重方式进行加工。

在另一个实施方案中，在其上进行合成的基质12是静止的，且投射光模式以编程方式从基质12移动到基质12。

现在参考图7A-7D，显示了在各种基质上的寡核苷酸序列10的合成。图7A和7B描述了在未成形的载玻片上的寡核苷酸序列10。使用光生成酸前体和本文公开的方法的实施方案，在显微镜载玻片上合成各种长度(n＝15-90)和各种序列(A、C、G和T)的寡核苷酸。图7A中显示的垂直条带是由于使用的投影。图7C描述了在200微米球体上以字母(左)和条纹(右)的形式合成的寡核苷酸，且图7D描述了在0.5mm毛细管的内部表面上以条形码形式的寡核苷酸合成。黑条为DNA序列。

虽然已详细描述了几个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，所公开的实施方案可以进行修改。因此，上述说明书应视为示例性而不是限制性的。

序列表

<110>Gulari，Erdogan

     Rouillard，Jean Marie

     Gao，Xiaolian

     Zhou，Xiaochuan

<120>用于在表面上形成分子序列的方法

<130>UMJ180BPCT(UM3127PCT)

<150>US11/690,368

<151>2007-03-23

<160>12

<210>1

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>OTHER INFORMATION：合成的

<400>1

<210>2

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>2

<210>3

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>3

<210>4

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>4

<210>5

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>5

<210>6

<211>4

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>6

<210>7

<211>4

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>7

<210>8

<211>4

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>8

<210>9

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>9

<210>10

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>10

<210>11

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>11

<210>12

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>12

Claims (21)

1.一种用于形成分子序列(10)的方法，其包括：

用包含受保护的反应基团(P_L)的至少一个接头(14)衍生无限制基质(12)表面；

使所述基质(12)与包含光生成试剂前体(18)和缓冲液或中和剂(20)中的至少一种的溶液(16)接触；

在至少部分溶液(16)中产生光生成试剂(22)，设定所述光生成试剂(22)以起始所述基质表面(12)上的至少一个活性区域的形成；和

使单体(24)与所述至少一个活性区域偶联。

2.如权利要求1中限定的方法，其中所述光生成试剂前体(18)选自光酸生成分子和光碱生成分子。

3.如权利要求1和2中任一项限定的方法，其中所述光生成试剂(22)选自酸和碱。

4.如权利要求1-3中任一项限定的方法，其中产生所述光生成试剂(22)经由使所述基质(12)的至少一个区域选择性暴露于电磁辐射来完成。

5.如权利要求中4限定的方法，其中所述光生成试剂(22)经由所述缓冲液或中和剂(20)中的至少一种基本上限制于所述至少一个暴露区域。

6.如权利要求1-5中任一项限定的方法，其中所述光生成试剂(22)扩散至所述基质(12)的表面，在其中它催化所述受保护的反应基团(PL)的脱保护，从而暴露反应基团(R)且形成至少一个活性区域。

7.如权利要求1-6中任一项限定的方法，其中在使所述单体(24)与所述至少一个活性区域偶联前，所述方法进一步包括从所述基质(12)处去除所述溶液(16)。

8.如权利要求1-7中任一项限定的方法，其中所述单体(24)具有2个末端，所述2个末端之一是未保护的，且所述2个末端中的另一个具有与之附着的受保护的反应基团(P)。

9.如权利要求1-8中任一项限定的方法，其中重复所述接触、所述产生、和所述偶联步骤以形成预定序列(10)。

10.如权利要求1-9中任一项限定的方法，其中所述溶液(16)进一步包含敏化剂、稳定剂、粘度添加剂或其组合中的至少一种。

11.如权利要求1-10中任一项限定的方法，其中所述光生成试剂(22)是酸，且其中所述缓冲液或中和剂(20)选自吡啶、二甲基吡啶、哌啶、伯胺、仲胺、叔胺、其衍生物及其组合。

12.如权利要求1-10中任一项限定的方法，其中所述光生成试剂(22)是碱，且其中所述缓冲液或中和剂(20)选自二苯乙醇酸、氯化铝、氯化铁(III)、三氟化硼、三氟甲磺酸镱(III)、丁酸、丙酸、苯酚及其组合。

13.如权利要求1-7或9-12中任一项限定的方法，其中所述单体(24)具有2个未保护的末端。

14.如权利要求1-13中任一项限定的方法，其中所述单体(24)是包含至少一种活化剂的溶液。

15.如权利要求14中限定的方法，其中所述至少一种活化剂选自四唑；4，5，二氰基咪唑(DCI)；三氟乙酸吡啶鎓；5-乙硫基四唑；5(3，5-二硝基苯基))-1H-四唑；三甲基氯硅烷；活化剂42(5-(二-3，5-三氟甲基苯基)1-H-四唑；其衍生物；及其组合。

16.一种分子序列(10)，其通过权利要求1中的方法形成。

17.一种装置，其包括：

无限制基质(12)表面；和

与所述无限制基质(12)表面偶联的分子序列(10)。

18.如权利要求17中限定的装置，其中所述分子序列(10)包括经由接头(14)的反应基团(R)与所述无限制基质(12)表面偶联的第一种单体(24)。

19.如权利要求18中限定的装置，其中所述反应基团(R)最初包含经由光生成试剂(22)去除的保护基团(P_L)。

20.如权利要求17-19中任一项限定的装置，其中所述分子序列(10)由偶联在一起的多种单体(24)形成。

21.如权利要求20中限定的装置，其中所述多种单体(24)中的每一种选自核苷酸、锁定核酸单体、氨基酸、单糖、二糖及其组合。

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