CN100588759C

CN100588759C - 原位合成制备化合物芯片的方法、制备载体及发光基底

Info

Publication number: CN100588759C
Application number: CN200710021024A
Authority: CN
Inventors: 李炯
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2007-03-20
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2027-03-20
Also published as: CN101104954A

Abstract

本发明公开了一种原位合成制备化合物芯片的方法，首先在基底上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位一致；然后对紫外LED发光阵列或者其它芯片材料进行表面修饰，在其上表面形成一层活性基团，并连接带有光脱保护基团的化合物单体；再根据待合成的化合物中同种单体的分布情况，控制相应的紫外LED发光，脱去对应表面连接单体的光脱保护基团，停止发光，使需要连接的带有光脱保护基团的单体与芯片表面接触，和已脱去保护的单体反应连接；重复上述步骤，合成出所需长度的化合物，获得化合物芯片。本发明不需要光掩膜板，也不需要在超净间中操作，大幅度地降低了成本；适合于光刻法或光致酸技术的原位反应。

Description

原位合成制备化合物芯片的方法、制备载体及发光基底

技术领域

本发明涉及一种原位合成制备化合物芯片的方法，以及这种方法中所采用的载体及发光基底。

背景技术

近几年来，随着组合化学的长足发展，短时间合成大量化合物已成为可能，同时新的遗传学研究如人类基因组计划等也以几何级数增加了新的靶蛋白的数量，由此对化合物的筛选速度提出了新的要求。采用通常的筛选方法，难以在短时间内处理如此大量的化合物分子，因而所谓的高通量筛选技术(HTS，High Throughput Screening)开始快速发展。根据合成路线的不同，可以将HTS分为液相筛选和固相筛选，其中利用固相载体在固体平面的不同位置上合成出所需的化合物是一种非常有前途的方法，由此获得的产物被称为化合物芯片。根据合成的化合物种类的不同，化合物芯片可被分为：DNA芯片(DNA chip)、RNA芯片、iRNA芯片、PNA(肽核酸)芯片、LNA(Locked Nucleic Acids)芯片、蛋白质芯片(protein chip)、糖分子芯片等，它们在生物分析和药物开发等领域具有广泛的发展前景。

要制备这样的化合物芯片，通常有两种方法，一种是先分别合成好所需的化合物，然后用将它们分别固定到芯片的相应位置。该方法只适合于通量低、密度要求不高的情况。另一种是原位合成的方法，它是在芯片表面的不同位置直接合成出不同的分子来，借助成熟的光刻技术(photolithography)，可一次性做出高密度、高通量的化合物芯片。

原位合成的芯片，通常由硅片、玻璃、聚合物薄膜等作为衬底，对衬底表面进行处理，如氨基化处理、醛基化处理、多聚赖氨酸处理、聚合物表面包被改性等，以便与合成的化合物实现共价连接。原位合成的方法，包括光刻法、点样法、喷墨法、电致酸技术、光致酸技术、无掩膜板的微镜投射技术等，其中，光刻法是一种已投入实际应用的较好的原位合成的方法。

以光刻法原位合成DNA芯片为例，适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用光刻技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合制造大规模集成的基因芯片，该技术可以在玻片表面预设位点按照预定的序列合成大量不同种类的寡核苷酸或多肽分子，原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它采用有特殊的光脱保护基团修饰的4种碱基单体，在合成时，用紫外光透过光掩膜板将玻片表面需要反应部分的光脱保护基团脱去，然后反应连接上所需碱基单体；接着在需要连接另一种碱基单体的地方用紫外光脱去保护基团，反应连接上相应的单体；这样通过4个循环就可以在玻片表面的相应位置合成上所需的单层碱基。根据设计的DNA长度，重复上述循环就可以制备出相应的DNA芯片来。这种方法的缺点在于每个循环都需要不同的掩膜板，对于25个碱基的芯片来说就需要大约100块掩膜板，而每块掩膜板需要数百美元，因而，合成成本非常高。

在上述方法的基础上，有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，将每步合成产率提高到99％，但制造工艺的复杂程度增加了许多，并且，也没有解决大量使用掩膜板造所的成本大幅度增加的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种新的原位合成的方法，以简化化合物芯片的制备工艺，降低制备成本。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种原位合成制备化合物芯片的方法，包括下列步骤：

(1)在基底上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位一致；

(2)对紫外LED发光阵列进行表面修饰，在其上表面形成一层活性基团，并连接带有光脱保护基团的化合物单体；

(3)根据待合成的化合物芯片中同种单体的分布情况，控制相应的紫外LED发光，脱去对应表面连接单体的光脱保护基团，停止发光，使需要连接的带有光脱保护基团的单体与芯片表面接触，和已脱去保护的单体反应连接；

(4)根据所需连接单体的分布情况，重复步骤(3)，实现该层各种单体的连接；

(5)根据待合成的化合物序列，重复步骤(3)、(4)，合成出所需长度的化合物，获得化合物芯片。

上述技术方案中，所述步骤(2)中的表面修饰是，紫外LED发光芯片上表面为二氧化硅层，采用带有活性基团的硅烷与所述二氧化硅反应使在其上表面形成一层活性基团；所述光脱保护基团选自2-硝基苯基异丙基氧基羰基(2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl，NPPOC)、甲烯二氧基六硝基苯基一乙基氯甲酸([R，S]-1-[3，4-[methylene-dioxy]-6-nitrophenyl]ethyl chloroformate)，MeNPoc)、或3，4硝基二甲氧苯甲基氧基羰基(o-nitroveratryloxycarbonyl，NVOC)。

其中，所述合成的化合物为DNA、RNA、iRNA、PNA、LNA、蛋白质或糖分子，由此可以制备DNA、RNA、iRNA、PNA、LNA、蛋白质、多肽或糖分子芯片。

实现上述方法时，所采用的一种用于原位合成制备化合物芯片的载体，包括以硅或蓝宝石制成的基底，在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层，挡光层顶面开有透光孔，透光孔内充填有二氧化硅层。

与上述方法同样构思的另一种方法是：

一种原位合成制备化合物芯片的方法，包括下列步骤：

(1)在基底上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位配合；

(2)对芯片材料进行表面修饰，在其上表面形成一层活性基团，并连接带有光脱保护基团的化合物单体；

(3)将基底与芯片材料平行布置，使每一紫外LED发光时照射位置对应芯片材料的一个待合成化合物预设点位；

(4)根据待合成的化合物芯片中同种单体的分布情况，控制相应的紫外LED发光，照射芯片材料的对应位置，脱去其上的光脱保护基团，停止发光，使需要连接的带有光脱保护基团的单体与芯片材料表面接触，和已脱去保护的单体反应连接；

(5)根据所需连接单体的分布情况，重复步骤(4)，实现该层各种单体的连接；

(6)根据待合成的化合物序列，重复步骤(4)、(5)，合成出所需长度的化合物，获得化合物芯片。

上述技术方案中，所述芯片材料采用玻璃、石英、硅片或聚合物膜中的一种制备。

实现上述方法所采用的一种用于原位合成制备化合物芯片的发光基底，包括以硅或蓝宝石制成的基底，在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层，挡光层顶面开有透光孔，所述紫外LED芯片的分布位置与待合成的化合物芯片上的预设点位配合。

使用时，在发光基底和芯片之间利用光学透镜将发光基底上各点的光聚到化合物芯片的相应位置上。

进一步的技术方案，在所述透光孔内设有聚光透镜结构。所述的聚光透镜结构可以是设有透光孔内的凸透镜或者是透镜组，其一侧焦点位于紫外LED芯片处，另一侧焦点位于使用时平行布置的化合物芯片处。

本发明是通过光刻技术制备高密度的发光半导体(LED)阵列作为合成化合物芯片的光源，在合成化合物芯片的过程中，有选择性地控制LED阵列中的某些单元发光来脱去其相应表面或者其投影在芯片表面位置的化合物的光脱保护基团，也可以利用这些发光来产生酸或者是碱来脱掉这些保护基团，使其活化。然后将所需反应单体输送到芯片表面与这些活化后的区域反应链接，未活化部分由于有保护基团保护活性位点就不会有反应发生。这样重复多次就可以在芯片表面的不同位置合成上一层不同的单体。再重复上述过程就可以合成出含多层单体的化合物芯片。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明设置了紫外LED发光阵列，在合成芯片过程中通过选择性的发光实现对应位置的光脱反应，从而不需要光掩膜板，也不需要在超净间中操作，因而大幅度地降低了成本；

2.本发明利用集成的发光器件来控制化合物在其表面或其他基底表面进行原位合成的方法来产生化合物库，适合于光刻法或光致酸技术的原位反应，可用于制备DNA、RNA、iRNA、PNA(肽核酸)、LNA(LockedNucleic Acids)、蛋白质(protein chip)或糖分子芯片。

附图说明

附图1为本发明实施例一的反应过程示意图；

附图2为图1中的紫外LED结构示意图；

附图3为本发明实施例二的反应过程示意图；

附图4为本发明实施例三的反应过程示意图；

附图5为图4中的紫外LED结构示意图。

其中：1、基底；2、紫外LED芯片；3、挡光层；4、二氧化硅层；5、光脱保护基团；6、芯片材料；7、聚光透镜结构。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：参见附图1和附图2所示，一种原位合成制备DNA芯片的方法，包括下列步骤：

(1)在基底1上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位一致，基底采用硅或蓝宝石等材料制备；

由此，获得一种用于原位合成制备化合物芯片的载体，包括以硅或蓝宝石制成的基底1，在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片2，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层3，挡光层3顶面开有透光孔，透光孔内充填有二氧化硅层4。各紫外LED芯片分别电连接至一控制芯片，可由控制芯片控制其发光；其中，挡光层也可以由电连接的电极构成。

(2)对紫外LED发光阵列进行表面修饰，在其上表面形成一层活性基团，并连接带有光脱保护基团5的化合物单体；

所述活性基团可以是羟基、胺基等，所述表面修饰可以通过一些带有不同活性基团的硅烷的与基底表面的二氧化硅反应来实现。然后可以通过一些化学反应将标记有光脱保护基团的DNA单体直接连接到基底表面。这种光脱保护基团可以是2-硝基苯基异丙基氧基羰基(2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl，NPPOC)、甲烯二氧基六硝基苯基一乙基氯甲酸([R，S]-1-[3，4-[methylene-dioxy]-6-nitrophenyl]ethyl chloroformate)，MeNPoc)、或3，4硝基二甲氧苯甲基氧基羰基(o-nitroveratryloxycarbonyl，NVOC)等。连接标记有光脱保护基团的DNA单体的工艺过程可以采用任一现有技术实现。

(3)当第一层具有光脱保护基团的反应物连接到基底表面后，就可以控制需要连接某一单体(如A)的相关LED发光，脱去其相应表面的光脱保护基团，暴露出活性的羟基。然后把有光脱保护基团保护的单体A的液体通到整个芯片表面，经过一系列的标准DNA合成反应后就可以把有光脱保护基团保护的单体A连接到相应的芯片表面，没有脱保护基团的表面则不会有反应发生。这样重复刚才的过程，控制需要连接DNA单体G的相关LED发光，脱去其相应表面的光脱保护基团，就可以在这些LED的表面连接上单体G。以此类推，可以在芯片LED表面的相应位置分别合成上一层DNA单体A、G、C和T。

(4)重复上一步骤就可以在芯片表面根据需要合成出不同的DNA的序列出来。如要合成25个碱基长度的DNA序列，就重复25次步骤(3)就可以了。

实施例二：参见附图3所示，一种原位合成制备蛋白质芯片的方法，包括下列步骤：

(1)在基底上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位一致，基底采用硅或蓝宝石等材料制备；

所述活性基团可以是羟基、胺基等，这种修饰可以通过一些带有不同活性基团的硅烷的与基底表面的二氧化硅反应来实现。然后可以通过一些化学反应将标记有光脱保护基团的蛋白质单体直接连接到基底表面。这种光脱保护基团可以是NPPOC(2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl)、MeNPoc(5′-O-(a-methyl-6nitropiperonylox-ycarbonyl)-N-acyl-2′-deoxynucleosides)、NVOC(o-nitroveratryloxycarbonyl)等。

(3)当第一层具有光脱保护基团的反应物连接到基底表面后，就可以控制需要连接某一单体(如Gly)的相关LED发光，脱去其相应表面的光脱保护基团，暴露出活性的胺基。然后把有光脱保护基团保护的单体Gly的液体通到整个芯片表面，经过一系列的标准蛋白质合成反应后就可以把有光脱保护基团保护的单体A连接到相应的芯片表面，没有脱保护基团的表面则不会有反应发生。这样重复刚才的过程，控制需要连接蛋白质单体Ala的相关LED发光，脱去其相应表面的光脱保护基团，就可以在这些LED的表面连接上单体Ala。以此类推，可以在芯片LED表面的相应位置分别合成上一层蛋白质单体。

(4)重复上一步骤就可以在芯片表面根据需要合成出不同的蛋白质的序列出来。如要合成25个单元长度的蛋白质序列，就重复25次步骤(3)就可以了。

实施例三：参见附图4和附图5所示，一种原位合成制备DNA芯片的方法，包括下列步骤：

(1)在基底上制备紫外LED发光阵列，所述发光阵列分布与待合成化合物的预设点位配合，所述基底采用硅或蓝宝石等相关材料制备。

由此获得一种用于原位合成制备化合物芯片的发光基底，包括以硅或蓝宝石制成的基底1，在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片2，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层3，挡光层顶面开有透光孔，所述紫外LED芯片的分布位置与待合成的化合物芯片上的预设点位配合；在所述透光孔内设有聚光透镜结构7。

另一种方法，不在每个透光孔内设聚光透镜结构，而是在使用时，在发光基底和芯片之间利用光学透镜将发光基底上各点的光聚到化合物芯片的相应位置上。

所述活性基团可以是羟基、胺基等，这种修饰可以通过一些带有不同活性基团的硅烷的与基底表面的二氧化硅反应来实现。这种芯片可以是玻璃、石英、硅片、聚合物膜等。然后可以通过一些化学反应将标记有光脱保护基团的DNA单体直接连接到芯片表面。这种光脱保护基团可以是2-硝基苯基异丙基氧基羰基(2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl，NPPOC)、甲烯二氧基六硝基苯基一乙基氯甲酸([R，S]-1-[3，4-[methylene-dioxy]-6-nitrophenyl]ethyl chloroformate)，MeNPoc)、或3，4硝基二甲氧苯甲基氧基羰基(o-nitroveratryloxycarbonyl，NVOC)等。

(3)将基底1与芯片材料6平行布置，使每一紫外LED发光时照射位置对应芯片材料的一个待合成化合物预设点位；

(4)当第一层具有光脱保护基团的反应物连接到基底表面后，就可以控制需要连接某一单体(如A)的相关LED发光，脱去其投射的芯片表面的光脱保护基团，暴露出活性的羟基。然后把有光脱保护基团保护的单体A的液体通到整个芯片表面，经过一系列的标准DNA合成反应后就可以把有光脱保护基团保护的单体A连接到相应的芯片表面，没有脱保护基团的表面则不会有反应发生。这样重复刚才的过程，控制需要连接DNA单体G的相关LED发光，脱去其投射的相应芯片表面的光脱保护基团，就可以在这些芯片的表面连接上单体G。以此类推，可以在芯片表面的相应位置分别合成上一层DNA单体A、G、C和T。

(5)重复步骤(4)就可以在芯片表面根据需要合成出不同的DNA的序列出来。如要合成25个碱基长度的DNA序列，就重复25次步骤(4)就可以了。

Claims

1.一种原位合成制备化合物芯片的方法，包括下列步骤：

(5)根据待合成的化合物序列，重复步骤(3)、(4)，合成出所需长度的化合物，获得化合物芯片；

所述步骤(2)中的表面修饰是，紫外LED发光芯片上表面为二氧化硅层，采用带有活性基团的硅烷与所述二氧化硅反应使在其上表面形成一层活性基团；所述光脱保护基团选自2-硝基苯基异丙基氧基羰基、甲烯二氧基六硝基苯基一乙基氯甲酸、或3，4硝基二甲氧苯甲基氧基羰基。

2.一种用于原位合成制备化合物芯片的载体，包括以硅或蓝宝石制成的基底，其特征在于：在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层，挡光层顶面开有透光孔，透光孔内充填有二氧化硅层。

3.一种原位合成制备化合物芯片的方法，包括下列步骤：

(4)根据待合成的化合物中同种单体的分布情况，控制相应的紫外LED发光，照射芯片材料的对应位置，脱去其上的光脱保护基团，停止发光，使需要连接的带有光脱保护基团的单体与芯片材料表面接触，和已脱去保护的单体反应连接；

4.一种用于原位合成制备化合物芯片的发光基底，包括以硅或蓝宝石制成的基底，其特征在于：在所述基底的一个表面分布有紫外LED芯片，所述紫外LED芯片的周围设置有挡光层，挡光层顶面开有透光孔，所述紫外LED芯片的分布位置与待合成的化合物芯片上的预设点位配合。

5.根据权利要求4所述的发光基底，其特征在于：在所述透光孔内设有聚光透镜结构。