CN101511990B - 对温度变化快速响应的轻质样品板 - Google Patents

Abstract

通过在紧邻孔的附近包含被设置以减少板质量的板内中空，改进了一种经接触板底面的加热或冷却元件进行温度控制的用于聚合酶链反应、DNA测序以及涉及进行多样品同时反应的其他操作的样品板。

Description

对温度变化快速响应的轻质样品板

相关申请的交叉参考

本申请是2006年6月29日提交的序号为11/479,426的共同未决申请的部分继续申请，其内容在此整体并入本文中。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及用于执行需要对以几何阵列布置的大量小试样同时进行温度控制的操作的实验仪器领域。本发明尤其涉及使用结合有用于调控整个板(block)或者板的一部分温度的热电模块的单元形的多样品支持物的系统，所述多样品支持物通常称作“样品板”。

2.现有技术描述

聚合酶链反应(PCR)是需要在操作的不同阶段之间随着快速的温度变化而进行精密的温度控制的化学过程的众多实例之一。PCR扩增DNA，即其从单拷贝产生DNA序列的多个拷贝。通常使用在大量反应容器例如孔、试管或毛细管中提供试剂转移、温度控制和光学探测的仪器，以并行方式同时对大量样品进行PCR。过程中的每一样品都要经过一系列的对温度敏感的过程阶段，随着在不同温度下执行不同阶段并保持指定的一段时间，由此序列得以循环复制。通常，首先将样品加热到约95℃以“熔解”(分离)双链，然后冷却至约55℃，使引物退火(杂交)至分离的链上，接着再加热包含核苷酸碱基和DNA聚合酶的反应混合物到约72℃以获得引物延伸。复制序列得到倍增的DNA产物，取决于设备、反应规模以及自动化程度，每一循环所消耗的时间可在零点几分钟到两分钟之间变化。

核酸测序是涉及温度变化和高度控制的化学过程的另一个例子，对于诸如核酸变性和复性以及基于酶的反应的步骤需要不同的温度。

PCR、核酸测序和任何其他涉及不同温度下连续阶段的过程的成功进行需要精确的温度控制和快速的温度变化。如上所述，许多这些反应涉及同时处理大量具有相对小体积(通常在微升范围内)的样品。有时，操作需要某些样品保持在某一温度下，而其他样品保持在另一温度下，因此需要将板的不同区域保持在不同的温度(有时是温度梯度)下。已知在PCR和核酸测序中，控制温度的自动化实验室设备为热循环仪，如上所述，很多自动化系统使用具有以几何阵列布置在板中的多个孔的样品板。通过将样品直接放置于孔中，这些孔用作用于每个样品的单独反应容器，或作为自身含有与样品板的孔的形状一致的孔阵列的一次性塑料盘的支持物。当使用一次性塑料盘时，将盘直接放在与之轮廓相合的样品板上并与其完全接触。由于紧密的表面接触，因此当位于下方的样品板对塑料盘提供刚性支持并精密控制温度时，该塑料盘中的孔就作为反应容器。

虽然也可使用电加热、空气冷却、液体冷却和制冷来改变温度，但大多数系统中样品板的温度，以及因此单个样品的温度通常通过利用热电模块来改变。热电模块是基于半导体的电子元件，其通过珀尔帖效应(Peltier effect)象小型热泵一样起作用，使得热量沿着通过元件的电流方向所决定的方向流动。由于热电模块能够提供快速响应的局部温度控制，并基于它们是提供高度控制的电驱动的事实，因此热电模块是特别有用的。一般将该模块的传热面与样品板的平底面以完全接触的方式边靠边地放置。

当紧压在样品板上时，用作换热装置的热电模块和任何组件都会最有效地行使其功能。为了使热响应达到最佳，样品板必须是刚性的且由具有高传热系数和低热质量的材料制成。刚性通过保持孔在平面上对齐并在响应所施加的机械压力时阻止样品板弯曲或变形，从而也有益于反应本身。孔内样品加热或冷却的速度会随着样品板质量的改变而变化。样品板的质量越低，传输给样品的温度变化就越快。因此，当金属如铝尤其是在样品板的底面附近提供必要的刚性时，它们的质量阻碍了传热给样品。这对无论是存在于样品板孔中还是存在于与样品板接触的一次性盘中的样品都有影响。本发明解决了这些和其它相关的问题。

发明概述

本发明涉及一种具有减少质量以使通过传热元件加热或冷却板的速度达到最大的样品板。在本说明书和所附的权利要求书中，样品板也称为“多样品支持物”，该术语意在包括其孔被直接用作为用于单个样品的反应容器的样品板以及被用作为用于一次性反应盘(plate)的支持物底座的样品板，该一次性反应盘具有配合入该样品板孔中的孔。在后一种情况下，当样品板提供给一次性盘刚性和温度控制时，覆盖在其上的一次性盘的孔用作反应容器。

通过板内一系列的中空实现样品板质量的减少，在保持样品孔完整但会减少那些紧邻样品孔的板的质量的位置上将中空排列在样品孔的周围。在某些实施方案中，中空形成与样品板的顶面和底面平行的平行非相交通道，与此同时在其他实施方案中，中空形成皆平行于板的顶面和底面的相交通道网络，顶面，以在板内提供更大的开放空间。在更进一步的实施方案中，中空是位于样品孔之间的倒置孔，其开口在样品板的底面，并且具有与样品板的顶面和底面垂直(即与样品孔的中心线平行)的中心线样品孔。在所有这些实施方案和整个本发明中，优选这样排列通道，以至于它们与样品孔不相交。因此该板能够提供与一次性样品盘接触的最大表面，或当板自身直接加样品时，开口朝上的板顶面的孔能够保留样品。在其中中空是与板的顶面和底面平行的延伸通道的优选实施方案中，板是刚性的且通道优选位于或接近板的中性面，即当无论从板的上方还是下方施加弯曲应力时，既不承受压力也不承受张力的板中的平面。当施加这样的弯曲应力时，其提供给这些实施方案中的板以最大刚性。效果类似于建筑工程中工形梁所提供的作用。在中空为开口在板的底面的倒置孔的实施方案中，与平行于板的顶面和底面的这些通道相比，其所具有优势在于以更快的速度传播给更大范围的板体积。例如，这些实施方案在理论上适合于具有中心孔距4.5mm的384孔(16×24)板。

为使混淆减少到最小，在此使用的术语“样品孔”表示那些在样品板的顶面开口的孔并意在用作样品自身的容器，或当使用一次性样品盘时用作凹口以容纳一次性样品盘孔底面。在包括“倒置孔”的那些实施方案中，术语“样品孔”也被用于与“倒置孔”相区分，也区分于在样品板顶面开口的以及包括目的不是保留样品或容纳一次性盘的孔的其他孔。所述倒置孔以及倒置的用于减少样品板质量的任何其他孔也称为“倒置的质量减少孔”。

当为了更大的表面接触及高的热响应，将多样品支持物与经成形以形成在外形上与样品盘的孔相配的孔的一次性样品板组合使用时，本发明的某些多样品支持物(即样品板)的附加且独立的新特征就体现出来了。当为了减少质量在板的上表面中还包含凹口时，除了设计来容纳样品盘孔的孔之外，如果用户没有将样品盘与相应的板对准并放置该样品盘，则该样品盘的孔插入(顶面开口的)质量减少的凹口中，而非容纳样品盘孔的那些样品板的孔中，由此带来危险。在本发明的某些方面中，通过以与一次性样品盘中样品孔阵列不完全相配的方式以阵列形式排列板中质量减少的凹口，从而避免了未对准的危险。因此，当两组孔皆为具有相同中心间距的矩形阵列时，可省去板中一个或多个顶面开口的质量减少的凹口，留下的位置是不接受一次性盘的孔的平台或外形。这样，如果将一次性盘的孔放置在质量减少的凹口而非相配合的孔上，则一次性样品盘的至少一个孔会与板顶面上的平台或非容纳外形相邻接。

本发明还涉及一种通过PCR在多孔样品盘的孔中扩增多个DNA样品的方法，该方法包括样品盘的孔中热循环样品以将DNA双链分离成单链，使寡核苷酸引物退火至单链靶序列上，并且在DNA聚合酶存在的情况下延伸引物，所有步骤均在常规PCR条件下进行，同时样品盘为上述实施方案中的多样品支持物所支撑。

根据下列描述，本发明的这些和其他特征、实施方案、目的以及优点将显而易见。

附图简述

图1是根据本发明的样品板的从上方观察的透视图。

图2是被倒置以显示板底面的图1样品板的透视图。

图3是图1样品板的顶视图。

图4是沿着图3的线4-4划截取的前述图样品板的横截面。

图5是沿着图3的线5-5划截取的前述图样品板的横截面。

图6是图3横截面的另一视图。

图7是图4横截面的另一视图。

图8是根据本发明的另一种样品板的顶视图。

图9是图8样品板的底视图。

图10是沿图8和9的线10-10截取的图8和9的板的横截面。

发明详述及优选的实施方案

本发明的样品板或多样品支持物优选为单体结构，这意味着该板优选是例如通过机械加工或模制所成形的而非将通过机械或化学方法所分别成形的部件连接在一起成形的单件。所述板还是刚性的，且优选由具有高刚性和高导热性材料制成。合适的金属的实例为铝、铜、铁、镁、银以及这些金属的合金。还可使用非金属材料，例如氧化铝、氮化铝和碳，以及特别是这些材料的复合材料。目前优选的是铝材。现有技术中样品板中的样品孔最通常以矩形阵列的方式排列，即以均匀间隔的行列方式排列，本发明中优选的样品板同样为孔在一个平面中，优选矩形阵列。样品孔的数量可广泛改变且对于本发明不起关键作用。少至4个样品孔的样品板亦能从本发明中受益，样品孔数量数千的的样品板同样也能受益。样品孔数量的优选范围是4-4,000，更优选的范围是12-400，还更优选16-400，并且最常用的应当是具有12×8阵列的96样品孔的板，和具有6×8阵列的48样品孔的板。样品孔之间的间距同样可以改变，但在大多数情况下，中心间距大概在4mm(0.15英寸)-12mm(0.45英寸)范围内。

在中空伸长并延伸与样品板的顶面和底面平行的实施方案中，中空可以为闭合空腔或开放通道。为便于制造以及所赋予的更大质量减少，优选开放通道。通道可开口在样品板边缘，并延伸至板的全长或全宽。它们可以是在毗邻的每两行样品孔之间沿板纵向延伸或在毗邻的每两列样品孔之间沿板横向延伸的直通道。为减少更多的质量，可包括双向通道延伸，在每一接合点处相交，以在板内形成开空间的网络。为更进一步减少质量，可包括通向通道或网络的位于板顶面的开口。

在一目前考虑的实施方案中，整个板的厚度为约9.5mm(0.375英寸)，中空为平行于顶面和底面、具有4.5mm(0.18英寸)直径的圆形截面的伸长的通道，并且通道的中心距离板底面6mm(0.24英寸)。

在中空是中心线平行于样品孔的那些中心线并开口在样品板底面的倒置的质量减少孔的实施方案中，样品孔和中空都可越过样品板的中平面，特别是如果中空位于连接样品孔中心的对角线的交叉处点的话。同样在这些实施方案中，样品孔和倒置的质量减少孔或者是圆形截面，并且样品孔优选为锥形使得它们每个孔的开口较底部更宽。倒置的质量减少孔还可是向着相反方向的锥形，它们的开口宽于倒置的底部，样品孔的开口位于板的顶面，而质量减少孔的开口则位于板的底面。这两组孔的锥形可以为光滑的或分阶段的锥形。分阶段的锥形可由接连的两个或更多个依次递减直径的非锥形部分组成，或是由锥形部分和非锥形部分结合而成。此外在这些实施方案中，优选在样品板的顶面没有其他孔或者其他开口。

考虑到上述各种可能性，在孔和中空的结构和排列方面本发明容许进行改变。例如中空可以是任何截面形状或任何形状的组合。然而，详细评论一特定实施方案会提供给每个本发明实施方案之对本发明功能和操作的理解。附图描述了两个这样的实施方案。

图1是具有标准间隔的12×8阵列的孔的样品板11的透视图。该板是单块机械加工的金属，具有与形成凸缘13的板的剩余部分相比稍长和稍宽的相对厚的底部12。环绕底部的边缘是容纳O形密封圈的凹槽14。以凸缘为界的板的中心部分上升到板的顶面15。顶面15是平坦的，并且被样品孔16的开口所间断。中空(其在图3-7中显示更清楚)是在顶面15下的通道网络。这些通道的中心线或纵轴(未显示)与顶面15平行，并且沿上升的中心部分可以看到通道的开口端17，18(图1中只能看到两个这样的边缘)。此外，位于样品孔16之间的开口19使中空开口于向板的顶面15。中心平台20占据了本应为类似于开口19的质量减少孔所占据的空间。当板11被用作具有与该板的每一个孔16对应的塑料孔的一次性塑料孔盘(未显示)的支持物时，平台20会阻止该一次性塑料盘的孔错误地放置在质量减少孔19而非孔16内。以下结合图6和7更加详细地说明该特征。

图1所示中空的变型之一是一系列不连在一起的平行中空，并且中空没有朝向板的顶面15的开口19。包括或省略相交的中空和朝向顶面的开口取决于在刚性和降低质量之间期望的平衡，这种平衡可随结构材料、板尺寸以及使用板的方式而变化。

图2中所示是图1的样品板11的底部。板的底面21是与图1的顶面15平行的平坦表面，虽然没有显示热电模块或者其他加热或冷却元件，但它们被压在底面21上。该底面包含一系列的凹陷22以容纳温度传感器和连接该传感器的电路。热敏电阻或能在这种结构的样品板中有效起作用的其它类型的传感器对于那些在温度测量或实验室设备常规使用领域内的技术人员来说是显而易见的。每一凹陷22均包括用于以朝向表面中心放置传感器本身的内侧孔23，容纳通向传感器的电路的狭槽24，用于将电路连接到外部电路的邻近板边界的外侧孔25。

样品板11的顶视图提供于图3中。凸缘13、样品孔16以及中空的向上开口19在这张图里是全部可以看到的。为了最大化质量减少，通向中空的开口19的直径比孔16的开口的直径要大，但要在孔之间提供足够的连接壁以保留孔的完整性和刚性。每个孔16朝底部31逐渐变尖，与孔开口相比直径更小且可为锥形。虽然通向中空的开口19不是锥形的，但在每一开口下方的底部是平的或锥形的，是取决于开口是怎样形成的。

图4是沿图3的线4-4的前述图的样品板的横截面。该横截面穿过样品孔16的中心并且显示孔的底部31是自身逐渐变尖的。锥形孔，特别是孔的底部是锥形的，利于在这样的去除是必需的情况下在反应过程中从孔内去除流体。该横截面还显示了形成减少板质量的中空一部分的第一组通道41。这些通道41与板11的顶面15和底面21平行并且延伸至板的全长，在孔16的行与行之间通过。通道41的中心尽可能地接近板的中性面42。在本文中使用的术语“中性面(neutral plane)”指当从板的上面或下面施加弯曲力时，承受最小应力的板的平面。具体来说，当从箭头43方向从上方向板中心施加力同时在板边缘保持固定的反抗力时，在中性面42上面的板的部分将被向内水平压缩，而中性面之下的部分则被向外水平施压。同样地，当从箭头44方向从下方向板施加力同时在板边缘保持固定的反抗力时，在中性面42下面的板的部分将被向内水平压缩，而中性面之上的部分则被向外水平施压。在这两种情况下，中性面42本身将承受很小或不承受向内的(压缩)或向外的(扩张)水平压力。中性面一般位于板的厚度的中间点之上或附近，但是其位置可随板的质量分布的改变而变化。通过标准压力分析能容易地确定中性面的位置。

图5的横截面是沿图3的线5-5截取的。在该横截面中看不到孔。该横截面显示了图4中所显示的通道41以及垂直于第一组通道41并同时形成降低板质量的中空的一部分的第二组通道51。第二组通道51在孔毗邻的列之间而非行之间穿过并延伸至板11的宽度而非长度，与第一组通道41相交。在通道的每个交叉点都有朝向顶面15的开口19和与开口相反方向的凹孔52。像第一组通道41一样，第二组通道51与板11的顶面15和底面21平行并穿过孔之间，并像第一组一样相对于顶面15和底面21位于板中相同的水平面上。因此，两组通道的中心都位于或接近于中性面42。在该图中还可看到用于温度传感器的底面21中的凹陷，在所有情况下均包括传感器孔23、用于与对外部电路连接的电路的外侧孔25以及连接传感器孔与外侧孔的狭槽24。

虽然图4和5中的通道41以及图5中的通道51是圆形截面的，但非圆形截面的通道也具有同样的作用，并且在某些情况下由于在孔之间配合得更好从而可凸显其优势。因此，可使用梯形、三角形、正方形或者矩形的横截面。此外，当将通道41，51组分别以单层排列时，同样也可使用多层水平通道。在具有非圆形截面的通道的情况下，取决于板及其孔的几何形状，分层或堆积的通道可通过在孔(特别是锥形孔)的行或列之间更好的配合从而凸显其优势。

图6和7分别是结合有一次性样品盘61的图4和5中所示的相同横截面的另一视图。该盘由薄片塑料或者其他一次性材料成形并成形有样品孔62。这些孔具有与样品板11的孔16在外形(contour)上相配的底面63(在图7中看得更清楚)。因此，板内的孔提供了与样品盘内的孔的紧密的表面接触，能迅速传热给样品盘内的反应混合物。图6中显示了盘中的样品孔62与板11的孔正确对准。由于板11的质量减少开口19是足够大的以致于能容纳样品盘的样品孔62，因此使用者可能会将盘的样品孔62放置在质量减少开口19而非合适的孔16中从而无意间未对准盘和板。这样的错配会导致板的传热功能失效。平台20通过凸起中心样品孔的底面从而防止这样的错配发生。一般而言，通过利用在数量上稍少于样品盘中孔62的数量的质量减少开口可防止这种错配，同样质量减少开口的数量少于板内控温的样品孔16的数量也可防止这种情况发生。因此，在凹口以其他方式位于板表面上时在板表面上至少存在一个平台，该平台打乱这种连续的凹口模式。优选该平台位于凹口阵列的中心。

图8、9和10是根据本发明另一样品板101的视图。板101的顶面102示于图8中，底面103示于图9中，以及对角截面示于图10中。由于样品孔104朝向顶面102开口，因此在图8中可见。样品孔形成15×23矩形阵列，具有4.5mm(0.18英寸)的中心间距。由于质量减少孔105朝向底面开口，因此在图9中可见。质量减少孔105位于样品孔104之间的连接样品孔104中心的对角线106，107的交叉点(示于图8中)。这使得样品孔104和质量减少孔105的密度都达到了最大。

图10的横截面是沿图8和9的线10-10截取的，以显示样品孔104和质量减少孔105的相对位置以及它们的剖面图。两组孔中的每个孔都是围绕在中心轴111，112周围的空腔。通过具有邻近于样品板顶面102的孔的开口的截头圆锥体部分113和位于孔底的锥体部分114，从而使把每个样品孔104都逐渐变尖。每个质量减少孔105也是逐渐变尖的，但是因为其倒置所以是相反方向的变尖。质量减少孔的锥体由位于样品板底面103每个孔的开口的直圆柱部分115，依次连接的截头圆锥体部分116，较第一直圆柱部分直径更小的第二直圆柱部分117及在倒置孔的顶部的短锥体部分118形成。反向的样品孔和质量减少孔锥体使样品板的空间得到最大利用。

在于此所附的权利要求中，术语“一种(a)”或“一种(an)”意指“一种或多种”。术语“包含(comprise)”及其变型例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”当置于列举的步骤或元件之前时，意指任选地或不排除附加的额外步骤或元件。在本说明书中引用的所有专利、专利申请和其他的出版参考资料在此全文并入作为参考。在此引用的任何参考材料和本说明书中明确教导之间的任何不一致都明确为以有利于本说明书的教导而得以解决。这包括在单词或短语的本领域所理解的定义和该相同单词或短语在本说明书中所提供的明确定义之间的任何不一致。

在此强调附图中所显示的和以上详细描述的结构仅为本发明的实例，本发明的范围以所附的权利要求为准。对那些实验室设备设计、结构和使用领域的技术人员来说，结合本发明的基本要素表达于权利要求中的在实现本发明中所使用的形状、配置、尺寸和材料的进一步改变是显而易见的。

Claims (10)

1.一种用于在受控温度下同时进行多个化学反应的多样品支持物，所述多样品支持物包括： 

由定义为顶面和底面的两个平行的平面所限定的单体结构板，其中所述板是刚性的并具有长和宽，

以平面阵列排列在所述板中并在所述顶面具有开口的一系列样品孔，和

位于所述孔之间并周期性地间隔于所述板中但不与所述孔相交的位于所述板中的第一组沿该板纵向的直通道和第二组沿该板横向并与所述第一组相交形成平行于所述顶和底面的相交通道网络的直通道。

2.权利要求1的多样品支持物，进一步包括与所述相交通道网络相连的位于所述顶面中的开口。

3.权利要求2的多样品支持物，其中所述相交通道在交点处相交，每一所述开口对准交点，以及所述板在至少一个所述交点上方的所述顶面上进一步包括一个平台。

4.权利要求1的多样品支持物，其中所述一系列样品孔由4到4000个孔组成。

5.权利要求1的多样品支持物，其中所述一系列样品孔由12到400个孔组成。

6.权利要求1的多样品支持物，其中所述样品孔具有4 mm到12 mm的中心孔距。

7.权利要求1的多样品支持物，其中所述板由选自铝、铜、铁、镁、银、铝合金、铜合金、铁合金、镁合金、银合金和复合材料的金属或非金属材料构成，其中所述复合材料为氧化铝、氮化铝和碳的复合材料。

8.一种用于在多孔样品盘的样品孔阵列中扩增多个DNA样品的方法，所述方法包括

(a)将所述DNA的双链分离为单链，

(b)使寡核苷酸引物退火至所述单链靶序列上，和

(c)在DNA聚合酶存在的情况下使用核苷酸碱基延伸所述引物，

步骤(a)、(b)和(c)在所述多孔样品盘的样品孔内进行热循环，

其中改进为所述多孔样品盘由权利要求1的多样品支持物支撑。

9.权利要求8的方法，其中所述通道是与所述顶面和底面平行延伸的伸长的中空。

10.权利要求9的方法，其中所述刚性板具有一中性面，以及所述中空平行并相交于所述中性面，其中当从所述板的上或下方施加弯曲应力时所述中性面既不受到压缩力也不受到膨胀力。

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