CN101511360A - 用于毛霉病和其它真菌疾病治疗的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了组合物，其包括至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。该组合物可以包括铁螯合化合物去铁酮或地拉罗司。该组合物中包含的抗真菌剂可以包括多烯抗真菌剂，吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂。本发明也提供了治疗或预防真菌病症的方法。该方法包括给予患有或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物充足的时间，以降低真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包含与该真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。由本发明提供的治疗或预防真菌病症的方法也可以包括给予患有或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。本发明进一步提供了一种方法，其包括在真菌病症发作之前，预防性给予至少一种铁螯合化合物，或至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。

Description

用于毛霉病和其它真菌疾病治疗的组合物及方法

发明描述

发明领域

[0001]本发明一般地涉及感染性疾病的治疗，并且更特别地，涉及机会性真菌疾病的有效治疗。

发明背景

[0002]毛霉病(Mucormycosis)是由接合菌纲(Zygomycetes)，毛霉目(Mucorales)的真菌引起的威胁生命的感染。属于毛霉目的真菌被分为六个科，它们全部都能够引起毛霉病(Ibrahim等，Zygomycosis，p.241-251，In W.E.Dismukes，P.G.Pappas，和J.D.Sobel(ed.)，Clinical Mycology，Oxford University Press，NewYork(2003)；Kwon-Chung，K.J.和J.E.Bennett，Mucormycosis，p.524-559，MedicalMycology，Lea & Febiger，Philadelphia(1992)和Ribes等，Zygomycetes in HumanDisease，Clin Microbiol Rev 13：236-301(2000))。然而，属于毛霉科(Mucoraceae)的真菌，和特别地米根霉(Rhizopus oryzae)(少根根霉(Rhizopus arrhizus))种，是目前最常见的感染病因(Ribes等，上文)。由于小克银汉霉科中的小克银汉霉属某些种(Cunninghamellaceae spp.)的感染，不断增加的毛霉病病例也已经被报道(Cohen-Abbo等，Clinical Infectious Diseases17：173-77(1993)；Kontoyianis等，Clinical Infectious Diseases 18：925-28(1994)；Kwon-Chung等，American Journal ofClinical Pathology 64：544-48(1975)和Ventura等，Cancer58：1534-36(1986))。毛霉目剩下的四个科是较不常见的疾病病因(Bearer等，Journal of Clinical Microbiology32：1823-24(1994)；Kamalam和Thambiah，Sabouraudia 18：19-20(1980)；Kemna等，Journal of Clinical Microbiology 32：843-45(1994)；Lye等，Pathology 28：364-65(1996)，和Ribes等，(上文))。

[0003]毛霉病的媒介物是机会病原体，它们几乎一致地影响免疫受损的宿主(Spellberg等，Clin.Microbiol.Rev.18：556-69(2005))。糖尿病性酮酸中毒的患者特异地对毛霉病易感，并且发生这些感染比其它真菌引起的感染更常见。相反，当碰到使患者容易发生毛霉病的其它免疫损害——包括中性白细胞减少症和皮质激素疗法——的情况时，毛霉病比其它机会性真菌感染，例如由假丝酵母(Candida)和曲霉属某些种(Aspergillus spp.)引起的那些真菌感染较不常见。总的来说，最近基于人群的研究估计：毛霉病的发生率为每年每百万人1.7例，这表示在美国每年约500例(Rees等，Clinical Infectious Diseases 27：1138-47(1998))。但是，在高风险的患者中，例如进行异体骨髓移植的那些患者，毛霉病的患病率已经被描述为高达2-3％(Maertens等，Bone Marrow Transplantation 24：307-12(1999)；Marty等，N Engl J Med 350：950-52(2004))。此外，一篇最近的综述发现在过去的20年间毛霉病发病率有显著增加(Gleissner等，Leuk Lymphoma45：1351-60(2004))。相似的增长已经被主要的干细胞移植中心报告。例如，报告描述了在过去的20年间，毛霉病发生率高于两倍(Marr等，Clin Infect Dis 34：909-17(2002)；Kontoyianis等，Clin Infect Dis 30：851-56(2000))。考虑到糖尿病、癌症和器官移植在美国老年人群中增高的发生率，预期毛霉病发病率在可预见的将来会持续上升。

[0004]侵袭性毛霉病的可用疗法包括逆转潜在易感因素的尝试，被感染区域紧急且广泛的手术清创术，和辅助抗真菌疗法(Edwards，J.，Jr.，Zygomycosis，p.1192-1199.P.Hoeprich和M.Jordan(ed.)，Infectious Disease，第4版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia(1989)；Ibrahim等，(2003)，上文；Kwon-Chung和Bennett，上文；Sugar，A.M.，Agent of Mucormycosis and Related Species，p.2311-2321.G.Mandell，J.Bennett，和R.Dolin(ed.)，Principles and Practices of Infectious Diseases，第4版，Churchill Livingstone，New York(1995))。两性霉素B(AmB)仍是被批准用于侵袭性毛霉病治疗的唯一抗真菌剂(Id.)。因为真菌对AmB相对抵抗，需要高剂量，这经常引起肾毒性和其它不良效果(Sugar，上文)。并且，在不进行手术去除感染病灶的情况下(例如切除鼻脑型毛霉病患者的眼睛)，单独的抗真菌疗法很少有疗效(Edwards，J.(1989)，上文；Ibrahim等，(2003)，上文)。即使当手术清创术与高剂量AmB结合时，与毛霉病相关的死亡率超过50％(Sugar，上文)。在患有弥散性疾病的患者中，死亡率接近100％(Husain等，Clin Infect Dis 37：221-29(2003))。由于不可接受的高死亡率，和高度毁容的手术疗法的极端发病率，开发治疗和预防入侵性毛霉病的新策略是迫在眉睫的。

[0005]AmB的肾毒性促使医生在实践中采用AmB的脂质制剂，其比AmB的肾毒性低，并能够以更高的剂量在更长的时期内给药(Ibrahim等，(2003)，上文)。患有毛霉病患者的若干病例报告已经记载了用高达15mg/kg/d的两性霉素脂质制剂成功的治疗(Cagatay等，BMC Infect Dis 1：22(2001)；Ericsson等，ClinicalInfectious Diseases 16：585-56(1993)；Walsh等，Antimicrob Agents Chemother45：3487-96(2001))。但是，用两性霉素的脂质制剂治疗患者的死亡率仍然高，这强调了用于这些致死性疾病的新治疗剂的需要。

[0006]铁本质上被所有微生物病原体需要，用以生长和毒性(Howard，D.H.，ClinMicrobiol Rev 12：394-404(1999))。在哺乳动物宿主中，非常少量的血清铁可被微生物利用，因为其高度结合于载体蛋白，如转铁蛋白(Artis等，Diabetes31：1109-14.(1982))。特别地，血清铁的螯合是对抗米根霉(R.oryzae)的主要宿主防御机理(Artis等，上文)。生物体在血清中生长较差，并且当加入外源铁时，该生长抑制被逆转(Artis等，上文；Boelaert等，Journal of Clinical Investigation91：1979-86(1993))。

[0007]有提高的可用血清铁水平的患者特别容易被米根霉和其它接合菌感染，但是对其它病原真菌，如假丝酵母和曲霉的易感性程度较低(Ibrahim等，(2003)，上文；Sugar，上文)。例如，用铁螯合剂，去铁敏(deferoxamine)治疗的患者具有显著增高的侵袭性毛霉病的发病率，这与这些病人中>80％的致死率相关(Boelaert等，Kidney International 45：667-71(1994))。尽管去铁敏对于人宿主发挥铁螯合剂的作用，其对米根霉的影响似乎是恰好相反。去铁敏通过发挥铁载体(siderophore)的作用使病人易受根霉感染，其向真菌提供了先前不可用的铁(Boelaert等，(1993)，上文)。根霉通过细胞内运输还原铁从铁-去铁敏复合体中获得铁，而不发生去铁敏的内化(de Locht等，Biochemical Pharmacology 47：1843-50(1994))。这一运输可能由高亲和性铁通透酶介导。因此，提高的可用血清铁是毛霉病发病机理的风险因素。然而，铁螯合化合物可以发挥病原体的铁载体的功能，并且因此可能无法被普遍地应用于治疗处理。

[0008]因此，存在对能够降低毛霉病发病机理的风险并提供有效治疗处理的化合物和方法的需求。本发明满足这些需求，并且也提供了相关的优点。

发明概述

[0009]本发明提供了组合物，其包括至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。该组合物可以包括铁螯合化合物去铁酮(deferiprone)或地拉罗司(deferasirox)。该组合物中包含的抗真菌剂可以包括多烯抗真菌剂，吡咯抗真菌剂或棘白菌素(echinocandin antifungal agent)抗真菌剂。本发明也提供了治疗或预防真菌病症的方法。该方法包括给予患有或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物一段足够的时间，以降低真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包含与该真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体(non-xenosiderophore)。由本发明提供的治疗或预防真菌病症的方法也可以包括给予患有或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。本发明进一步提供了一种方法，其包括在真菌病症发作之前，预防性给予至少一种铁螯合化合物，或至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。

附图简述

[0010]图1显示了Def和铁与用米根霉感染的DKA小鼠存活之间的关系。小鼠(在每个治疗中n≥20)用去铁酮(Def)或Def+FeCl₃(60mg/kg)处理，以逆转铁螯合的作用。LAmB处理的臂被包括作为对照。治疗在感染后24小时开始。^*p<0.003，与感染未处理或未感染未处理+FeCl₃比较。

[0011]图2显示了Exjade^Tm(地拉罗司)提高了用米根霉感染的糖尿病酮症酸中毒小鼠的存活率。小鼠(安慰剂n＝6，

n＝7)通过尾静脉注射2.2×10⁴个米根霉99-892(从感染患者肺部获得的临床分离物)孢子被感染。感染后24小时，小鼠用安慰剂，1、3或10mg/kg的

通过口腔管饲法一日两次连续治疗7天。与安慰剂相比，^*p<0.05。

[0012]图3显示了用米根霉感染并用不同的Def治疗方案处理的DKA小鼠的存活率。小鼠(每组n＝6)在感染后24小时用Def以50、100或200mg/kg每日一次(qd)或隔日一次(qod)的剂量治疗，总共4个剂量。与感染未治疗相比，^*p<0.05。

[0013]图4显示了用Def和LAmB的组合治疗实验性的毛霉病。小鼠(对于感染未处理和Def，n＝11，对LAmB和Def+LAmB，n＝6)用米根霉感染，24小时后，接着用Def、LAmB或两种药物的组合治疗，共4个剂量。与感染未治疗的小鼠相比，^*p<0.005。

[0014]图5显示了用米根霉感染并用Def、LAmB或两者预防的嗜中性白血球减少症的小鼠的存活率。小鼠(n＝9)在第-1天用Def隔日一次、LAmB每日一次和两者治疗，共四个剂量。相对感染未处理，对于LAmB或LAmB+Def，^*p<0.05。

[0015]图6显示了用去铁酮、LAmB或安慰剂处理的DKA小鼠(n＝6)的脑部米根霉负荷。小鼠用3.8×10³个孢子感染，并且在用任一药物治疗两剂后54小时收集脑。数据被显示为中位数+四分位数间距(medians+interquartile range)。y轴表示试验检测的下限。相对安慰剂，*P<0.036，通过用于多重比较的Steel检验。

图7显示了用银甲烷铵(silver methanamine)染色的坏死鼻粘膜的冷冻切片，其显示了具有与毛霉菌一致的宽的、带状无隔膜菌丝的真菌。840×放大倍数。

[0016]图8显示了地拉罗司在米根霉中诱导rFTR1基因表达。特别地，图8(a)显示了从在铁充足、铁螯合(地拉罗司)或铁螯合逆转(用氯化铁饱和地拉罗司)的条件下温育的米根霉菌丝中rFTR1基因的RT PCR检测到的表达。18s rDNA的表达被包括，以证实RNA提取物的量。图8(b)示出图表，其显示了用于构建米根霉GFP表达载体的策略。启动子表示rFtr1p或ACT1p。图8(c)显示了由米根霉rFtr1p或ACT1p驱动的米根霉中GFP的表达(通过共聚焦显微镜和流式细胞仪确定)，所述米根霉生长在铁充足、含地拉罗司或含用氯化铁饱和的地拉罗司的培养基中。GFP表达通过绿色荧光细胞由共聚焦显微镜揭示，并且通过通道FL1(y轴)中荧光细胞的百分数由流式细胞仪揭示。

[0017]图9(a)显示了用米根霉99-892(2.2×10⁴)感染并用不同剂量的地拉罗司治疗的糖尿病酮症酸中毒小鼠(每组n>7)的存活率。小鼠用安慰剂(羟丙基纤维素载体)、地拉罗司或地拉罗司加铁(FeCl₃，10mg/kg)治疗，以逆转铁螯合的作用。对于存活率，*P<0.05。图9(b)显示了用米根霉99-880(平均接种1.3×10³个孢子)感染，并在感染24小时后，用10mg/kg的地拉罗司一日两次(bid)治疗7天的糖尿病酮症酸中毒小鼠(n＝24，来自具有相似结果的三次独立实验)的存活率。与安慰剂相比，*P<0.003。

[0018]图10(a)显示了用米根霉99-892(4.2×10⁴个孢子)感染，并用安慰剂、地拉罗司(10mg/kg，一日两次)或地拉罗司加铁治疗的糖尿病酮症酸中毒小鼠(每组n＝11)的脑和肾脏中的真菌负荷。接受3天的每日治疗后，在第4天收集器官。数据被显示为中位数+四分位数间距。y轴表示试验检测的下限。图10(b)显示了如10(a)中提到的，用米根霉99-892感染，并用地拉罗司、地拉罗司加氯化铁或安慰剂治疗的糖尿病酮症酸中毒小鼠的苏木精(hematoxylin)和伊红染色的肾脏切片。箭头表示组织中的米根霉菌丝。放大倍数X 400。与安慰剂或地拉罗司加氯化铁比较，对于组织真菌负荷，*P<0.002。

[0019]图11显示，与铁过负荷的小鼠相比，铁螯合提高了脾脏Th1和Th2淋巴细胞的频率，并且提高了促炎性细胞因子的水平。特别地，图11(a)显示了用米根霉99-892的3.1×10⁴个孢子感染，并在24小时后，用安慰剂、地拉罗司或地拉罗司加氯化铁治疗的糖尿病酮症酸中毒小鼠(n＝11)中脾脏Th1和Th2淋巴细胞的频率。图11(b)显示了11(a)中提到相同的小鼠(n＝11)，在感染4天后杀死并收集脾脏和肾脏，通过Cytometric Bead Array^TM得到的全器官细胞因子分析的结果。11(a)和11(b)中的数据都被显示为中位数+四分位数间距(interquartile range)。与安慰剂或地拉罗司加氯化铁相比，*P<0.02；与地拉罗司加氯化铁相比，**P<0.05且

P<0.07。

[0020]图12显示了仅地拉罗司、仅LAmB和地拉罗司与LAmB组合对抗毛霉病的效力。该图特别显示了用米根霉99-880(平均接种1.5×10³个孢子)感染，并用单一的地拉罗司、单一的LAmB和地拉罗司(10mg/kg一日两次进行7天)与LAmB(15mg/kg，进行4天)组合治疗的糖尿病酮症酸中毒小鼠(n>16，来自具有相似结果的两次独立实验)的存活率。

[0021]图13显示了仅地拉罗司、仅LAmB和地拉罗司与LAmB组合降低靶器官感染的效力。更特别地，该图示出了用米根霉99-880感染的小鼠(n>7)的脑和肾脏中的组织米根霉负荷。在这些小鼠中，治疗在感染24小时后开始，并且包括安慰剂、地拉罗司(10mg/kg，一日两次)、LAmB(15mg/kg/d)或两种药物的组合。接受2天的每日治疗后，在第3天收集器官。数据被显示为中位数+四分位数间距(interquartile range)。y轴表示试验检测的下限。与安慰剂相比，*P<0.003；与安慰剂、地拉罗司或LAmB相比，**P<0.003；与安慰剂或地拉罗司相比，

P<0.01。

[0022]图14示出了地拉罗司在嗜中性白细胞减少症小鼠中治疗米根霉感染的效力。环磷酰胺(Cyclophosphamide)治疗的小鼠(n＝19，来自具有相似结果的两次独立实验)用米根霉99-892的2.7×10³个孢子感染。小鼠在感染24小时后，用安慰剂或地拉罗司(10mg/kg)每天(qd)或每隔一天(qod)给药治疗，共5个剂量。与安慰剂相比，*P＝0.037。

发明详述

[0023]本发明涉及铁螯合化合物的使用，其用于治疗或减轻真菌病状的严重程度。铁螯合化合物被选择为，相对于靶向的真菌病状具有低的铁载体或异铁载体(xenosiderophore)活性。在一些实施方式中，铁螯合化合物被选择为，相对于靶向的真菌病状基本没有铁载体或异铁载体活性。与充当铁载体或异铁载体的铁螯合剂相反——它们向真菌提供先前不可用的铁，非铁载体和非异铁载体铁螯合化合物化合物缺少这样的辅助或运输活性。因此，本发明所述的铁螯合剂可以被用于铁从周围环境的去除。用于抗真菌疗法的铁螯合作用的一个好处在于：其降低了重要矿物质的可用性，该矿物质被多种微生物病原体需要，用以生长和/或毒性。

[0024]在一种实施方式中，本发明涉及含有铁螯合化合物和抗真菌剂的治疗组合物。所述铁螯合化合物可以是去铁酮(1，2二甲基-3-羟基吡啶-4-1)或地拉罗司(4-[3，5-双(2-羟基苯基)-1H-1，2，4-三唑-1-基]-苯甲酸)。去铁酮和地拉罗司已经被用在治疗铁过量状况的治疗情况中，并且因此对于治疗或预防真菌病症是安全且有效的铁螯合疗法。本领域已知的抗真菌剂可被选择用于与本发明的铁螯合剂组合。该组合对于治疗或预防真菌病症的应用是有益的。

[0025]在另一实施方式中，本发明也涉及治疗或预防真菌病症的方法。该方法包括给予个体一种或多种铁螯合化合物，该化合物对靶向的真菌种显示出非铁载体或非异铁载体的铁螯合活性。该方法也可以包括共同给予抗真菌剂，以达到与单一铁螯合剂相比增强的效力。铁螯合化合物可以是去铁酮、地拉罗司或选自本领域已知的其它铁螯合化合物。本发明所述的方法对治疗和预防性处理特别有益，因为铁螯合的目标是去除对真菌病原性重要的矿物质。

[0026]本发明提供了一种组合物，其包括至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。

[0027]铁被大多数真菌系统需要，用以生长、存活和/或毒性。真菌已经发展了多种用于获得、摄取的机理以及储存的方法，以确保这一重要金属的充足供应。本发明的组合物靶向这一重要的矿物质从宿主环境中的去除，以抑制真菌病原体。本发明的组合物包括铁螯合化合物，用以耗尽真菌病原体可用的铁并抑制其生长、存活和/或毒性。

[0028]本发明的组合物包括至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂的组合。对铁螯合化合物和抗真菌剂两者的包含结合了靶向两条不同途径的抗真菌活性，这两条途径被真菌用于生长、存活或毒性。由于两条被靶向途径的病原躲避(pathogenic evasion)的可能性低，靶向两条或多条不同的真菌途径提供了针对真菌病症有效的治疗处理。

[0029]用在这里，术语“铁螯合化合物”或“铁螯合剂”意欲表示在两个或多个独立的结合位点之间结合铁，以便形成螯合环(chelate ring)或多个环(rings)的化合物。铁螯合化合物与铁结合或络合在本文中称为铁螯合。铁螯合化合物可以是二配位基(bidentate)(或双配位基(didentate))，它们用两个独立的结合位点结合铁。本发明的铁螯合化合物也可以是三配位基(tridentate)、四配位基(tetradentate)或更高数量级的多配位基铁螯合化合物，它们分别用三个、四个或更多个独立的结合位点结合铁。本发明的铁螯合化合物包括可以结合所有氧化态铁的螯合化合物，所述氧化态的铁包括，例如铁(-II)态、铁(-I)态、铁(O)态、铁(I)态、铁(II)态(亚铁)、铁(III)态(三价铁)、铁(IV)态(高铁(ferryl))和/或铁(V)。铁螯合疗法指的是使用铁螯合剂与体内的铁结合形成铁螯合物，以便铁失去其毒性作用或逆转生理活性。可选地，螯合的铁对感染的生物体不可用。

[0030]用在本发明组合物中的铁螯合化合物可以包括任何螯合剂或能够结合并防止铁被靶向的真菌或多种真菌使用的其它分子。本发明的组合物中包含的铁螯合化合物的具体实例包括，例如去铁酮和地拉罗司。这些示例性的铁螯合化合物特别有用，因为它们已经在多个国家被批准用作与真菌病症不相关的治疗适应症，并且因此被良好表征，在人类中是安全且无毒的。

[0031]术语“去铁酮”，用在本文意欲表示具有1，2二甲基-3-羟基吡啶-4-1(1，2dimethyl-3-hydroxypyrid-4-1)结构的螯合化合物。去铁酮(Def)在本领域内也为称为L1、CP20、Ferriprox或Kelfer。去铁酮是α-酮羟基吡啶类铁螯合剂的成员，并且可从例如，Apotex，Inc.(Weston，Ontario，加拿大)商业获得。

[0032]术语“地拉罗司”，用在本文意欲表示具有4-[3，5-双(2-羟基苯基)-1H-1，2，4-三唑-1-基]-苯甲酸结构并具有373.4道尔顿分子量的铁螯合化合物。地拉罗司，在本领域内也为称为

或ICL 670，是三配位基铁螯合剂类别的成员，所述三配位基铁螯合剂类别称为N-取代的双-羟基苯基-三唑。地拉罗司可从，例如Novartis，Corp.(Basel，瑞士)，以例如

的商标商业获得。依据本发明，术语“地拉罗司”、“ICL670”、“

”意欲表示活性成分4-[3，5-双(2-羟基苯基)-1H-1，2，4-三唑-1-基]-苯甲酸，例如4-[3，5-双(2-羟基苯基)-1H-1，2，4-三唑-1-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐。地拉罗司，其生产方法及其用途在，例如美国专利号6,465，504B1和6,595,750 B2中，并在欧洲专利号EP0914118中描述。含有4-[3，5-双(2-羟基苯基)-1H-1，2，4-三唑-1-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐的药物制剂在例如，国际专利申请WO2004/035026中描述。

[0033]其它铁螯合化合物也可以被包含在本发明的组合物中。这些其它铁螯合化合物在本领域内被公知并且包括，例如，天然存在的铁载体和异铁载体，例如下文所述的那些，以及非天然存在的化合物，如去铁酮和地拉罗司。

[0034]非天然存在的铁螯合化合物由羟基吡啶-4-酮(HPO)类螯合剂的成员，如去铁酮；N-取代的双羟基苯基-三唑类螯合剂的成员，如地拉罗司；二(-1，2)亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和去铁胺示例。去铁酮、地拉罗司和任意上述示例性的铁螯合化合物，以及本领域公知的其它螯合剂可以被包括在本发明的包含铁螯合化合物的组合物中。

[0035]铁载体和异铁载体包括，例如，异羟肟酸酯(hydroxamate)和聚羧酸酯(polycarboxylate)。异羟肟酸酯包含N-δ-羟基鸟氨酸(hydroxyornithine)部分，并且一般地被分为四个示例性的家族。一个类别包括红酵母酸，它是N-δ-乙酰基-L-N δ-羟基鸟氨酸的二酮哌嗪。包括在本类别中的有衍生物，如被称为dimerumacid的二异羟肟酸(dihydroxamate)。第二类包括粪生素，其包含N-δ-酰基-N-δ-羟基-L-鸟氨酸部分。粪生素也可以被认为是具有线性结构的红酵母酸的三异羟肟酸衍生物。第三类包括铁色素，其包括含有N-δ-酰基-N-δ-羟基鸟氨酸和甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸组合的三肽的环肽。第四个示例性的类别包括镰刀霉氨酸，也被称为梭原素(fusigen)，其可以是线性或环状异羟肟酸酯。镰刀霉氨酸是由被甲羟戊酸酐(anhydromevalonic acid)N-酰化的N-羟基鸟氨酸表征的化合物。

[0036]聚羧酸酯包括含有柠檬酸的聚羧酸酯，被称为rhizoferrin。该分子含有两个连接到二氨基丁烷上的柠檬酸单元。Rhizoferrin广泛分布在接合菌门(Zygomycota)的成员中，已经在毛霉目和虫霉目(Entomophthorales)中观察到。用作本发明组合物中的铁螯合化合物的其它类的铁载体包括，例如，酚盐-儿茶酚盐(catecholate)类铁载体、氯高铁血红素和β-酮醛植物毒素。

[0037]本发明组合物中包含的铁螯合化合物的量可以变化，但是一般地为治疗有效量或可以被重构或稀释到治疗有效量的量。例如，有效量的本发明所述铁螯合化合物在下文针对本发明的方法进一步描述。一定量的一种、一些或所有铁螯合化合物可以被配制在本发明的组合物中，以对应这些示例性的有效量。

[0038]铁螯合化合物也可以以高于治疗有效量的量被配制在本发明的组合物中，用于短期或长期储存，并且终端用户可以在使用前稀释该制剂到期望的治疗有效量。可选地，本发明组合物中包含的铁螯合化合物可以被冻干或以粉末或其它固体形式生产，并且终端用户可以在使用前将该干燥制剂重构到期望的治疗有效量。

[0039]干燥或浓缩的制剂或含有有效量成分的制剂可以仅包含铁螯合化合物和抗真菌剂，或包含铁螯合化合物和抗真菌剂与任何期望的赋形剂、表面活性剂、张力剂(tonicifier)、盐或缓冲剂。稀释或重构可以在药学上可接受的介质中进行，所述介质调节该制剂为期望治疗有效量的至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂，并且包括任何其它赋形剂、表面活性剂、张力剂、盐或缓冲剂。药物制剂被公知并且在药学中实施。任何这样的公知制剂和药物制剂组分可与本发明的组合物一起使用。药物制剂、赋形剂、它们的用途、制剂和性质在本领域中是公知的，并且可以发现在，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，上文；Williams等，Foye′s Principles of Medicinal Chemistry，5th Ed.，LippincottWilliams & Wilkins(2002)；Allen等，Ansels Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems，8th Ed.，Lippincott Williams & Wilkins(2004)中描述。相似地，表面活性剂、它们的用途、制剂和性质在本领域中是公知的，并且可以发现在，例如，Holmberg等，Surfactants and Polymers in Aqueous Solution，上文；Surfactants：APractical Handbook，K.Robert Lange，ed.，上文和Vogel，A.I.，Vogel′s Textbook ofPractical Organic Chemistry，上文中描述。

[0040]本发明所述的组合物也包括至少一种抗真菌剂。术语“抗真菌剂”或“抗真菌”，用在本文意欲表示杀死真菌，或抑制或预防真菌生长、存活和/或毒性的药剂。抗真菌剂示例性的类别包括多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂和棘白菌素(echinocandin)抗真菌剂。多烯抗真菌剂的具体实例包括两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体和两性霉素B硫酸胆甾醇酯(amphotec)。吡咯抗真菌剂的具体实例包括泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、氟康唑(fluconazole)和伊曲康唑(itraconazole)。棘白菌素抗真菌剂的具体实例包括醋酸卡泊芬净(caspofungin acetate)和米卡芬净(micafungin)。大量的其它抗真菌剂在本领域内被公知，并且被包括在如本文所用的术语的含义中。

[0041]至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂的组合依赖于待靶向的真菌病症被选择。例如，两性霉素B脂质复合体可以是对抗，例如接合菌病(zygomycosis)、毛霉病、曲霉病(aspergillosis)和/或念珠菌病(candidiasis)的良好的抗真菌剂，并且可以与诸如去铁酮或地拉罗司的铁螯合化合物组合。相似地，上文示例的抗真菌剂之一或本领域公知的另一种药剂在对抗另一目标病症方面可以是有效的或治疗上理想的，并且这些其它抗真菌剂之一可以与铁螯合化合物组合，以产生本发明的组合物。因此，本发明所述的组合物在它们铁螯合化合物成分和抗真菌剂成分方面都是灵活的，并且允许至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂的任意或全部组合及改变被合并为，例如，单一制剂。

[0042]因此，在一种实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包括至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。所述铁螯合化合物可以选自，例如，由羟基吡啶-4-酮(HPO)类螯合剂的成员，如去铁酮；N-取代双羟基苯基-三唑类螯合剂的成员，如地拉罗司；二(-1，2)亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和去铁胺示例的前述非天然存在的铁螯合化合物。铁螯合化合物也可以选自，例如，由例如前述异羟肟酸酯、聚羧酸酯、酚盐-儿茶酚盐类铁载体、氯高铁血红素或β-酮醛植物毒素示例的铁载体和/或异铁载体。

[0043]所述抗真菌剂可以选自，例如，多烯抗真菌剂，如两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体或两性霉素B硫酸胆甾醇酯(amphotec)。所述抗真菌剂也可以选自，例如，吡咯抗真菌剂，如泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑或伊曲康唑。所述抗真菌剂也可以另外地选自，例如，棘白菌素抗真菌剂，如醋酸卡泊芬净或米卡芬净。示例性的本发明的组合物可以是地拉罗司和两性霉素B脂质复合体，该组合物对于至少一种铁螯合化合物具有一种铁螯合化合物，并且对于至少一种抗真菌剂具有一种抗真菌剂。

[0044]对于本发明组合物中包含的铁螯合化合物的量，该组合物中包含的抗真菌剂的量也可以变化，但是一般地为治疗有效量或可以被重构或稀释到治疗有效量的量。例如，本发明所述抗真菌剂的有效量在下文进一步描述，并且参考多烯抗真菌剂示例。一定量的一种、一些或所有抗真菌剂可以被配制进本发明的组合物中，以对应于多烯抗真菌剂的这些示例性的有效量，或对应于其它抗真菌剂，如吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂公知的有效量。相似地，并且如前文关于本发明组合物中包含的铁螯合化合物所述，抗真菌剂也可以以用于短期或长期储存的浓缩形式被配制进本发明的组合物中，并且终端用户可以在使用前稀释该制剂到期望的治疗有效量。此外，本发明组合物中包含的抗真菌剂可以以冻干、粉末或其它固体的形式被生产，并且终端用户可以在使用前重构该干燥制剂到期望的治疗有效量。

[0045]干燥或浓缩的制剂或含有有效量成分的制剂可以仅包含铁螯合化合物和抗真菌剂，或包含铁螯合化合物和抗真菌剂与任何期望的赋形剂、表面活性剂、张力剂(tonicifier)、盐或缓冲剂。稀释或重构可以按前文所述进行，并且在，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，上文；Williams等，Foye′sPrinciples of Medicinal Chemistry，第5版，Lippincott Williams & Wilkins(2002)；Allen等，Ansels Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第8版，Lippincott Williams & Wilkins(2004)；Holmberg等，Surfactants and Polymers inAqueous Solution，上文；Surfactants：A Practical Handbook，K.Robert Lange，ed.，上文和Vogel，A.I.，Vogel′s Textbook of Practical Organic Chemistry，上文，中被示例。

[0046]本发明的组合物可以额外地包含两种或更多种铁螯合化合物。两种或更多种铁螯合化合物的包含允许靶向多种真菌病症和/或在该组合物的铁螯合组分中提供包含一系列铁亲和性。具有不同铁亲和性的铁螯合化合物的包含可以是治疗有益的，以进一步预防真菌病原体的逃避。

[0047]本发明的组合物一般地包含约1-8种之间，特别地约2-7种之间，更特别地约3-6种之间，或甚至更特别地约4-5种之间的铁螯合化合物。超出这些范围或在这些范围之间中的铁螯合化合物也可以用在本发明的组合物中。例如，本发明的组合物可以被生产为含有基本上任意期望数量的不同种铁螯合化合物，包括，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多种。

[0048]本发明所述的组合物可以额外地包含两种或更多种抗真菌剂。与包含两种或更多种铁螯合化合物一样，包含两种或更多种抗真菌剂也允许靶向多种真菌病症和/或提供靶向用于生长、存活或毒性的不同真菌机理。多种抗真菌剂的包含可以相似地是治疗上有益的，以进一步防止真菌病原体的逃避。

[0049]相似地，本发明的组合物一般地包含约1-8种之间，特别地约2-7种之间，更特别地约3-6种之间，或甚至更特别地约4-5种之间的抗真菌剂。超出这些范围或在这些范围之间中的抗真菌剂也可以用在本发明的组合物中。因此，本发明的组合物可以被生产为含有基本上任意期望数量的不同抗真菌剂，包括，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多种。

[0050]示例性的组合物包括地拉罗司；和两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体、两性霉素B硫酸胆甾醇酯(amphotec)、泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、醋酸卡泊芬净或米卡芬净中任意的一种或多种。地拉罗司和去铁酮，以及两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体、两性霉素B硫酸胆甾醇酯、泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、醋酸卡泊芬净或米卡芬净中任意的一种或多种。特别有用的组合物包括，例如地拉罗司和/或去铁酮，和一种、两种或三种或更多种抗真菌剂，其选自对应于多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂和棘白菌素抗真菌剂的每一类别。因此，本发明提供了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多种铁螯合化合物的任意组合与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多种抗真菌剂的任意组合。含有多种铁螯合化合物和/或多种抗真菌剂的这些组合物可以按前文所述配制。

[0051]本发明的组合物也包括药学上可接受的介质。用在这里，术语“药学上可接受的介质”意欲表示与本发明的铁螯合化合物混合的介质的纯度和质量足以用于人体。药学上可接受的介质包括基本不含污染颗粒和生物体的制剂。因此，该术语意欲包含与本发明的铁螯合化合物相容，并且在给予人体时安全且无毒的介质。这样的药学上可接受的介质在本领域内被公知。

[0052]本发明也提供了治疗或预防真菌病症的方法。该方法包括给予患有或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物充足的时间，以降低真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包含与该真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

[0053]本发明额外地提供了治疗或预防真菌病症的方法，其包括给予患有或易患真菌病症的个体，治疗有效量的至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂充足的时间，以降低真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包含与该真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

[0054]本发明的方法包括仅使用铁螯合疗法或使用铁螯合疗法与抗真菌疗法组合。在前者的方法中，包含至少一种铁螯合化合物的制剂被施用。在后者的方法中，包含至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂的制剂被施用。这样的制剂按前文关于本发明组合物所述进行选择和制备。因此，本发明的组合物可以在没有至少一种抗真菌剂的情况下被制备，用于仅使用铁螯合疗法的用途中；或其可以与至少一种抗真菌剂一起制备，用在铁螯合与抗真菌疗法组合的用途中。本发明的第一种组合物可以在没有至少一种抗真菌剂的情况下被制备，并且本发明的第二种组合物可以在没有铁螯合化合物的情况下被制备。第一种和第二种制剂可以随后被同时、顺序使用，或可选地用于铁螯合和抗真菌疗法的组合。因此，前文关于本发明组合物的教导和指导可以被相似地采用，用于选择和制备仅含有至少一种铁螯合化合物的制剂，含有至少一种抗真菌剂的制剂，或含有两者的制剂。

[0055]对于本发明方法的使用，含有至少一种铁螯合化合物的制剂中的铁螯合化合物，含有至少一种铁螯合化合物的第一或第二种制剂和/或本发明的组合物被选择，以便包含与真菌病症或引起该病症的真菌试剂相关的非铁载体或非异铁载体。

[0056]术语“铁载体”，用在本文意欲表示促进铁被生物体聚集的铁螯合剂。例如，在铁缺乏的情况下，许多真菌合成铁载体，其通过铁结合和摄入在铁聚集中发挥作用。铁载体通常是低分子量的化合物(如，小于约2,000MW)，并且可以显示出细胞摄取和/或铁储存功能的一种或两种。铁载体由利用中的生物体合成。与通常在不提及生物或种特异性的情况下使用的术语“铁螯合剂”相比，术语“铁载体”用在本文表示与生成和利用铁载体的生物体或种相关或关联的铁螯合剂。因此，尽管铁螯合的铁载体结合并降低来自细胞外环境中的铁水平，因为它们促进铁摄取并被病原体使用，当用于铁螯合疗法中靶向由生成铁载体的生物体产生的病症时，它们具有减小的治疗价值。铁载体的合成和使用可以被在发现，例如，Howard，D.H.，Clinical Microbiology Reviews12：394-404(1999)中描述。

[0057]术语“异铁载体”，用在本文意欲表示并非由利用的真菌或生物体产生的铁载体。术语“异铁载体”表示与利用异铁载体的生物体或种关联或相关的铁螯合剂。与铁载体类似，当用于靶向由非利用生物体引起的病症的铁螯合疗法时，异铁载体显示出治疗价值。铁载体和异铁载体的合成和使用可以被发现在，例如，Howard，D.H.，FEMS Immunology and Medical Microbiology 40：95-100(2004)中描述。

[0058]因此，对应于与靶向的真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体的铁螯合化合物指的是并非由引起该真菌病症的真菌试剂产生或利用的铁载体，或指的是并非由引起该真菌病症的真菌试剂利用的异铁载体。

[0059]本发明所述的包含第一和第二成分制备物的铁螯合制剂、组合物和方法应用于治疗、降低严重性、防止或治愈真菌病症。本发明所述的铁螯合制剂、组合物和方法的特别有用的应用包括在真菌病症发病前预防性的给药。

[0060]术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”，用在本文意欲指表示真菌病症的临床症状的缓解。临床症状的缓解包括，例如，与治疗前水平相比或与患有真菌病症的个体相比，在治疗的个体中真菌病症的至少一种症状的减轻或降低。术语“治疗”也意欲包括病理状态、慢性并发症或与真菌病症相关的机会性真菌感染的严重程度的降低。这样的病理状态、慢性并发症或机会性感染在下文关于毛霉病示例。毛霉病和其它这样的病理状态、慢性并发症和机会性感染也可以被发现描述在，例如，Merck Manual，Sixteenth Edition，1992和Spellberg等，Clin.Microbio.Rev.18：556-69(2005)中。

[0061]可通过本发明的方法缓解的真菌病症的症状包括，例如，发热，寒战，盗汗，厌食症，体重减轻，不适，抑郁和肺部、皮肤或其它损害。其它症状或典型的表现包括，例如，从原发病灶的扩散、急性或亚急性发作(presentation)、进行性肺炎、真菌血症、肺外扩散的表现、慢性脑膜炎、广泛涉及网状内皮系统(肝脏、脾脏、骨髓)的进行性扩散的组织胞浆菌病，和单发或多发皮肤损伤的芽生菌病。患有真菌病症的个体的有效治疗，例如，将在被治疗的个体中产生一种或多种这些症状的减轻。真菌病症的多种其它临床症状在本领域内被公知，并且也可以用作使用本文所述的发明方法后，真菌病症严重性缓解或降低的量度。

[0062]真菌病症的诊断可以通过从，例如，唾液、尿液、血液、骨髓或来自被感染组织的样品中分离成因性真菌来证实。例如，真菌感染可以基于侵入真菌的独特形态特征和/或通过免疫组化和对识别抗原的相似选择，以高度可靠性通过组织病理学方法进行诊断。感染活性的评估也可以基于从多个不同位点采集的培养物、发热、白细胞数、与具体涉及器官相关的临床和实验室参数(如肝功能测试)和免疫血清学检测。阳性唾液培养的临床意义也可以通过组织侵染(tissueinvasion)的证实而确认。这样的确认对共生的生物，如白色念珠菌(Candidaalbicans)或对环境中普遍的那些生物体，如曲霉属某种(Aspergillus sp.)特别有益。

[0063]术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”，用在本文意欲指对表示真菌病症的临床症状的预先防止。这样的预防包括，例如，在该病症的明显症状发展之前或在该病症的诊断之前，在有被真菌或多种真菌感染风险的个体中维持正常的生理指征。因此，术语“预防”包括个体的预防性治疗，以预防他们发生真菌病症。在个体中预防真菌病症也意欲包括抑制或阻止真菌病症的发展。抑制或阻止该病症的发展包括，例如，抑制或阻止不正常生理指征或临床症状的发生，如上文所述和/或本领域公知的那些。因此，真菌病症的有效预防包括维持正常的体温、体重、生理状态，以及在对真菌病症易感的个体中缺少如上文所述的损伤或其它病理表现。对真菌病症易感的个体包括，例如，患有AIDS、氮质血症、糖尿病、支气管扩张症、肺气肿、TB、淋巴瘤、白血病或烧伤的个体，或有易感真菌病症史的个体。抑制或阻止病症的发展也包括，例如，抑制或阻止一种或多种病理状况、慢性并发症或对与真菌病症相关的机会性感染的易感性的发展。

[0064]本发明所述的方法用于多种真菌病症的治疗和/或预防。术语“真菌病症”，用在本文意欲表示由真菌感染引起的异常状况。人和动物的真菌感染或真菌病(mycoses)包括，例如，影响皮肤外层的表面真菌感染；包括口腔(真菌性口炎)、阴道和肛门区域的粘膜真菌感染，例如由白色假丝酵母引起的那些；和影响皮肤深层和内部器官、能够引起严重，通常是致死疾病的真菌感染。真菌感染在本领域内已知并包括，例如，接合菌病、曲霉病、隐球菌病(cryptococcosis)、念珠菌病(candidiasis)、组织胞浆菌病、球孢子菌病(coccidiomycosis)、副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、镰刀菌病(fusariosis)(透明丝孢菌病(hyalohyphomycoses))、芽生菌病(blastomycosis)、青霉病(penicilliosis)或孢子丝菌病(sporotrichosis)。这些和其它真菌感染可以在，例如，Merck Manual，Sixteenth Edition，1992和Spellberg等，Clin.Microbio.Rev.18：556-69(2005)中找到描述。上述示例性的真菌病症在下文进一步描述。

[0065]用在这里，术语“接合菌病”意欲表示由接合菌纲，包括毛霉目和虫霉目的真菌引起的真菌病症。虫霉目是已知为虫霉菌病的皮下和粘膜皮肤感染的病因，其严重地折磨发展中国家的免疫活性宿主。

[0066]用在这里，术语“毛霉病”意欲表示由毛霉目真菌引起的真菌病症。毛霉病是威胁生命的真菌感染，其几乎一致地影响发展中或工业化国家中免疫受损的宿主。属于毛霉目的真菌被分为六个科，它们全部都能够引起皮肤和深部感染。属于毛霉科的种比任何其它科更经常从患有毛霉病的患者中分离。在毛霉科中，米根霉(少根根霉)是感染的常见病因。引起相似感染谱的毛霉科其它示例性的种包括，例如，小孢子根霉变体(hizopus microsporias var.rhizopodiformis)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)、毛霉属(Mucor)的种、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和小克银汉霉属某些种(Cunninghamella spp)(小克银汉霉科)。毛霉病在本领域内被公知并且包括，例如，鼻脑型(rinocerebral)毛霉病、肺部毛霉病、胃肠毛霉病、弥散性毛霉病、骨毛霉病、纵膈毛霉病、气管毛霉病、肾脏毛霉病、腹膜毛霉病、上腔静脉毛霉病或外耳炎毛霉病。

[0067]用在这里，术语“念珠菌病”意欲表示由假丝酵母属的真菌引起的真菌病症。念珠菌病可以发生在皮肤和口腔、呼吸道和/或阴道的粘膜中，并侵入血液，特别是在免疫受损的个体中。念珠菌病(Candidiasis)在本领域也被已知为念珠菌病(candidosis)或念珠菌病(moniliasis)。假丝酵母属的示例性种包括，例如，白色假丝酵母(白色念珠菌)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。

[0068]用在这里，术语“曲霉病”意欲表示由曲霉属引起的一组疾病。症状包括，例如，发热、咳嗽、胸部疼痛和/或呼吸急促。免疫系统被减弱的患者或患有肺部病症的患者对曲霉病特别易感。这些真菌病症的示例性形式包括：过敏性曲霉病，其影响哮喘、囊肿性纤维化和鼻窦炎的患者；急性侵袭性曲霉病，其在免疫力减弱的患者中，如癌症患者，进行化疗的患者和AIDS患者中显示出增高的发病率；弥散性侵袭性曲霉病，其遍布整个身体；和机会性曲霉感染，其由炎症和耳和其它器官的损伤表征。曲霉是约200种真菌的属。引起侵袭性疾病的曲霉种类包括，例如，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和黄曲霉(Aspergillus flavus)。引起过敏性疾病的曲霉种包括，例如，烟曲霉和棒曲霉(Aspergillus clavatus)。其它示例性的曲霉感染性种包括，例如，土曲霉(Aspergillus terreus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。

[0069]用在这里，术语“隐球菌病”意欲表示由隐球菌属引起的真菌病症。隐球菌病，也被称为布-布二氏病(Busse-Buschke disease)，通常表现为全身感染，其能够影响身体的任何器官包括，例如，肺脏、皮肤或其它身体器官，但是最通常发生在中枢神经系统，例如脑和脑膜。尽管患有霍奇金氏病或其它淋巴瘤或结节病的患者，或接受长期皮质甾类疗法的那些患者也有增高的风险，隐球菌病对于AIDS是机会性感染。症状包括，例如，胸部疼痛、干咳、腹部肿胀、头痛、视力模糊和混乱。该真菌病症的示例性形式包括：皮肤隐球菌病，例如发生在伤口的那些，肺部隐球菌病和隐球菌脑膜炎。隐球菌脑膜炎可能起因于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的扩散，所述新型隐球菌来自通常在免疫受损患者中观察到的或未意识到的肺部感染。格特隐球菌(C.gattii)通常在免疫活性人群中引起感染。通过CSF、唾液和尿液的培养物检测隐球菌抗原(荚膜物质)的提供了一种有用的诊断方法。在重度感染中，血液培养物也可以是阳性的。

[0070]用在这里，术语“组织胞浆菌病”意欲表示由组织胞浆菌属(Histoplasma)引起的真菌病症，包括吸入荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)孢子的引起的感染疾病。组织胞浆菌病在本领域也被已知为达林氏病(Darling′s disease)。该病症可以是无症状的，但是也可以发展为急性肺炎或流感样疾病，主要影响肺部。组织胞浆菌病也可以扩散到身体中的其它器官和系统。与其它弥散性形式的真菌病症一样，弥散性组织胞浆菌病可以是致死的。症状可以在暴露后3到17天之内发生。然而，在非弥散性的形式中，常见的是感染的个体不显示明显的疾病效应。急性呼吸疾病可以通过呼吸症状、普通病症感觉、发热、胸部疼痛和干咳或无痰干咳(nonproductive cough)表征。在胸部x光中也可以看到独特的形式。慢性肺部疾病与肺结核相似，并且可以在数月或数年中恶化。

[0071]用在这里，术语“球孢子菌病”意欲表示由球孢子菌(Coccidioides)属引起的真菌病症。该术语的含义中包括：由粗球孢子菌(Coccidioides immitis)或C.posadasii，特别是通过孢子的吸入引起的感染性呼吸疾病，其由发热和多种呼吸症状表征。球孢子菌病在本领域也被已知为球孢子菌病(coccidioidomycosis)和山谷热(valley fever)。全身性球孢子菌病可以从呼吸道传播到，例如，皮肤、骨骼和中枢神经系统。该病症的表现范围从完全没有症状到全身性感染和死亡。例如，症状性感染(约40％的病例)可以存在有发烧、咳嗽、头痛、皮疹和肌痛(肌肉痛)的流感样症状。一些患者会无法康复并且发展成慢性肺部感染或广泛弥散性感染(影响脑膜、软组织、关节和骨骼)。严重的肺部疾病可以发生在，例如，HIV感染和其它免疫受损的人中。

[0072]用在这里，术语“副球孢子菌病”意欲表示由副球孢子菌属引起的真菌病症，包括，例如由巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)引起的慢性真菌病。副球孢子菌病由肺部的原发损伤与扩散到多个内部器官来表征，由脸颊和鼻粘膜的明显溃疡性肉芽肿病(granulomas)与向皮肤的扩散表征，以及由泛发淋巴管炎表征。副球孢子菌病(Paracoccidiomycosis)在本领域内也被已知为副球孢子菌病(paracoccidioidomycosis)、阿耳梅达病、Lutz-Splendore-Almeida病、副球孢子菌性肉芽肿和南美芽生菌病。

[0073]用在这里，术语“镰刀菌病”或“透明丝状霉菌病”意欲表示由镰刀霉属引起的真菌病症。引起这些病症的镰刀霉属的种包括，例如，腐皮镰刀霉(F.solani)、尖孢镰刀霉(F.oxysporum)和串珠镰刀霉(F.moniliforme)。感染包括角膜炎、甲真菌病(onychomycosis)和偶发性腹膜炎和蜂窝组织炎。弥散性镰刀菌病的危险因子包括严重的免疫抑制(嗜中性白细胞减少症、淋巴细胞减少症、移植物抗宿主病、皮质激素)，群集(colonisation)和组织损伤。在免疫活性的患者中，组织损伤(由外伤、严重烧伤或外源物体引起)是镰刀菌病的危险因子。临床表现包括持续高热、皮肤损伤和窦肺(sino-pulmonary)感染。皮肤损伤在多数患者中可以诊断到，并在约5天的时间里发生真菌血症。弥散性镰刀菌病可以通过，例如，血液培养物及上文和下文所述的其它公知方法诊断。

[0074]用在这里，术语“芽生菌病”意欲表示由芽生菌属引起的真菌病症，其一般开始于呼吸感染，并通常扩散到肺、骨骼和皮肤。芽生菌病通过皮肤、粘膜或内部器官的多处炎症性损伤表征。皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)是一种流行的致病性种。芽生菌病的症状包括，例如，有发热、寒战、肌肉痛、头痛和无痰干咳的感冒样病症；与细菌性肺炎相似的急性疾病，具有高热、寒战、排痰性咳嗽和胸膜炎性胸痛的症状；与肺结核或肺癌相似的慢性疾病，具有低热、排痰性咳嗽、盗汗和体重减轻的症状；表现为ARDS的快速、进行性且严重的疾病，具有发热、呼吸短促、呼吸急促、低氧血症和弥散性肺浸润；皮肤损伤；骨溶解损伤(bone lytic lesions)；前列腺炎，和/或涉及喉部的引起嘶哑。

[0075]用在这里，术语“青霉病”意欲表示由青霉属引起的真菌病症。示例性的种是马尔尼菲青霉菌(penicillium marneffei)，它是免疫受损个体中机会性真菌感染的主要病因。诊断可以通过鉴定来自临床样品的真菌进行。皮肤损伤、淋巴结和骨髓的活检可以在组织病理学中显示出生物体的存在。症状包括，例如，发热、皮肤损伤、贫血、泛发淋巴结病和肝肿大。

[0076]用在这里，术语“孢子丝菌病”意欲表示由孢子丝菌属(Sporothrix)，包括种申克孢子丝菌(S.schenckii)引起的真菌病症。该病症表现为由淋巴结和皮肤上的结节或溃疡表征的慢性感染。

[0077]孢子丝菌病感染可以通过血液传播到其它区域，包括，例如，关节、肺、眼，和泌尿生殖系统及中枢神经系统的感染。一般地，弥散的孢子丝菌病发生在免疫受损的个体中，例如患有AIDS、癌症的患者，进行化疗的患者，和免疫抑制疗法的移植受者。

[0078]用在这里，术语“有效量”或“治疗有效量”意欲表示当施用于个体时，导致真菌病症扩散程度、数量或速度降低所要求的铁螯合化合物、抗真菌剂或铁螯合化合物和抗真菌剂两者的量。因此，当用于指代铁螯合化合物时，有效量意欲表示足以缓解至少一种与目标真菌病症相关的症状的铁螯合化合物的量。

[0079]治疗有效所需要的本发明的铁螯合化合物、抗真菌剂、或铁螯合化合物和抗真菌剂两者的剂量取决于，例如，待治疗的真菌病症、铁螯合化合物对铁的亲和力、铁的丰度和浓度水平以及该个体的体重和状况以及先前或同时进行的治疗。对于该方法的特定应用，被认为是有效剂量的合适量可以通过本领域普通技术人员使用本文提供的指导确定。例如，这个量可以由下述的体外或体内试验进行预测。本领域普通技术人员将认识到：患者的状况需要在整个治疗的过程中被监控，并认识到施用的组合物的量可以根据对该治疗的反应进行调整。

[0080]铁螯合化合物示例性的有效量包括，例如从约0.3-3.0μg/ml的浓度范围，但是也可以包括低至0.01μg/ml或更低的浓度，以及高至10μg/ml或更高的浓度。要施用的抗真菌剂的量在本领域内被公知，并且被包括在本文术语“有效量”的含义中。

[0081]在地拉罗司的临床前研究中，例如，在剂量高达400mg/kg/d的铁过载绒猿中几乎没有观察到毒性(Nick等Adv.Exp.Med.Biol.509：185-203(2002))。然而，在以80mg/kg的剂量长期给予非铁过载绒猿后，观察到了严重的毒性，这证明了地拉罗司在铁不过载的宿主中(Id.)耐受较差。但是，即使在铁不过载的绒猿中，在用高达40mg/kg/d的剂量治疗39周后没有观察到毒性，并且在亚急性治疗(4周)期间，高达65mg/kg/d的剂量被良好地耐受，没有不利作用。在铁过载患者的临床研究中(Nisbet-Brown等Lancet 361：1597-1602(2003)；Galanello等J.Clin.Pharmacol.43：565-572(2003)；Cappellini等Blood 107：3455-3462(2006))，地拉罗司在高达40mg/kg/d的剂量下被良好地耐受达12天，并且在高达30mg/kg/d的剂量下，在长期给药中被良好耐受数月到数年。

[0082]一般地，铁螯合化合物以约0.01-10μg/ml、约0.1-8μg/ml、约0.2-6μg/ml、特别地0.3-3.0μg/ml、更特别地约0.6-2.0μg/ml、甚至更特别地约0.8-1.0μg/ml或约0.9μg/ml的浓度被包括在铁螯合疗法制剂、第一或第二成分制剂和/或本发明的组合物中。小于、大于或在这些范围内的铁螯合化合物的浓度和/或量也可以用在铁螯合疗法制剂、第一或第二成分制剂和/或本发明的组合物中。例如，一种或多种铁螯合化合物可以被包括在制剂和组合物中，其构成小于约0.1μg/ml。相似地，制剂或组合物可以含有一种或多种浓度大于约10μg/ml的铁螯合化合物，特别是当为储存而配制时。因此，用在本发明所述方法中的制剂或组合物可以被生产，其含有实质上任意期望浓度或量的一种或多种铁螯合化合物，包括，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μg/ml或更高。

[0083]抗真菌剂示例性的有效量包括，例如，下文关于多烯抗真菌剂中示例的那些。例如，两性霉素B脱氧胆酸盐一般地以，例如，低于约10mg/kg体重的剂量给药，并且可以包括约0.25-1.0mg/kg/天的速率，用于静脉给药。脂质体两性霉素B(L-AMB)通常以，例如1-5mg/kg的剂量给药。脂质体两性霉素B也可以以高达15mg/kg/天给药，特别是在脑疾病中。两性霉素B脂质复合体(ABLC)通常以5mg/kg的剂量给药，但是可以在约0.5-15mg/kg的范围内。两性霉素B硫酸胆甾醇酯(Amphotec)通常以约50-100mg的单一剂量给药。相似地，对于使用铁螯合化合物和抗真菌剂的组合疗法，上述量可以一同施用，或化合物量和/或抗真菌剂量的任一或两者可以被调高或调低。吡咯抗真菌剂和棘白菌素抗真菌剂的有效量相似地被本领域普通技术人员公知，并且通常包含上述范围内的剂量。

[0084]考虑到本文提供的教导和指导，本领域普通技术人员将理解：上文示例的有效量可以根据，例如，其它活性成分的类型和剂量被调整。例如，如果至少一种铁螯合化合物的剂量在上文示例的高范围中，如果希望，可以降低至少一种抗真菌剂中的一种或多种的量并同时仍获得有效量。相似地，如果至少一种抗真菌剂的剂量在上文示例的高范围中或高于它，如果希望，可以降低至少一种或多种铁螯合化合物中的一种或多种的量。两种或更多种铁螯合化合物的剂量和/或至少一种抗真菌剂的两种或更多种的剂量可以彼此相关地调整。这样组合的有效量的所有其它调整可以被用在本发明所述的方法中。

[0085]应该理解：本质上不影响本发明多种实施方式的活性的修改也被包含在本文提供的本发明的定义中。因此，以下实施例意欲示例而并非限制本发明。

实施例I

用于减轻真菌疾病严重性的铁螯合疗法

[0086]本实施例描述了初步的研究，其显示出去铁酮和Exjade^Tm能够降低毛霉病的发病机理。

[0087]动物模型已经显示出施用去铁胺或游离铁使受根霉(Rhizopus)感染的动物的存活率下降，但是受白色假丝酵母感染的存活率下降较少，这强调了根霉病原性对铁的独特需求(Abe等，Mycopathologia 110：87-91(1990)；Boelaert等，(1993)，上文；Boelaert等，(1994)，上文；Van Cutsem和Boelaert，Kidney International36：1061-68(1989))。此外，在血清中从去铁胺放射性标记的铁摄取的体外研究表明：根霉积累比烟曲霉和白色假丝酵母分别高8倍和40倍量的铁(Boelaert等，(1993)，上文)。根霉提高的铁摄取与其在血清中的生长线性相关(Boelaert等，(1993)，上文)。血清中提高的生长可以解释接合菌对直接穿透血管并在血管中生长的特殊亲和性，这导致患病期间血栓形成和组织坏死的倾向性(Edwards，(1989)，上文；Ibrahim等，(2003)，上文；Ventura等，上文)。

[0088]如前文所述，患有糖尿病酮症酸中毒的患者也有发生鼻脑型毛霉病的高风险。这些患者也具有升高的可用血清铁水平，相似地由于铁在酸中毒中存在的情况下从结合蛋白的释放(Artis等，上文)。从患有糖尿病酮症酸中毒的患者收集的血清支持米根霉在酸性pH(7.3-6.88)，而非碱性pH(7.78-8.38)存在下的生长。不支持米根霉在酸性pH下生长的血清被发现具有比支持真菌生长的血清较少的可用铁。而且，向血清中加入外源性铁允许米根霉在酸性而非pH>7.4的条件下大量地生长。最后，模拟的酸中毒状况降低了从正常志愿者收集的血清的铁结合能力，表明酸中毒暂时地破坏了转铁蛋白结合铁的能力。因此，患有糖尿病酮症酸中毒的患者对毛霉病提高的易感性可能至少部分是由于糖尿病酮症酸中毒过程中可用血清铁的升高。

[0089]毛霉病发病机理中铁代谢的作用使得可能使得应用有效铁螯合剂用于真菌疗法，包括作为辅助抗真菌疗法。与去铁胺相反，其它铁螯合剂不允许生物体摄取铁，并且不支持其在体外在铁存在的情况下的生长(参见，例如Boelaert等，(1994)，上文)。而且，当去铁胺使豚鼠中弥散性米根霉感染显著恶化时，其它螯合剂之一对体内感染没有作用，并且其它螯合剂使受感染豚鼠的平均存活时间延长了两倍多(表1)。

表1.铁螯合剂对米根霉感染的豚鼠存活率的影响

 

治疗	平均(±SD)存活时间(天)
		盐水	7.8±1.1
去铁胺	4.8±1.1
		去铁酮	16.2±4.0
CP94	8.7±1.0
		*p<0.05对盐水对照

[0090]本文所述的体外和体内数据表明，去铁酮可以被用于有效地治疗毛霉病感染。表1显示了初期研究的结果，其中去铁酮显著地提高了受感染动物的平均存活时间。这些初始研究进一步表明：去铁酮在体外对抗米根霉中具有高度活性，在温育24h时显示出静态效应，而在温育48h时显示杀死效应(cidal effect)[48h后，对两者，6.25μg/ml的最低抑制浓度(MIC)和最低真菌杀死浓度(MFC)]。在被感染的DKA小鼠中，与安慰剂相比，脂质体两性霉素B(LAmB)——其是毛霉病的普通疗法——或去铁酮(Def)提高了28天的存活率(LamB的52％存活率对Def的30％存活率对安慰剂的0％，对于LAmB或Def对安慰剂，通过对数秩检验(Log Rank test)，p<0.003；对于LAmB对Def，p＝0.15)。Def的效力通过给予小鼠FeCl₃而消除，这确认了Def-介导的保护机理是铁螯合(图1)。后一试剂——去铁酮，在欧洲和印度被批准临床用作铁螯合剂，并且在同情使用(compassionate use)的基础上在美国可用于铁过载。

[0091]Exjade^Tm(Novartis)，另一种铁螯合剂，已经在美国被批准用于临床治疗铁过载患者。该药物已经针对米根霉在体外和在动物模型中测试，使用糖尿病酮症酸中毒小鼠模型。用致死剂量米根霉感染并用Exjade^Tm以1、3或10mg/kg每日两次治疗的小鼠存活比安慰剂治疗的小鼠长[28天存活日，安慰剂为0％存活率对1mg/kg 

为29％存活率(p＝0.03)，对用3mg/kg 

治疗的小鼠40％的存活率(p＝0.049)对用10mg/kg 

治疗的小鼠57％的存活率(p＝0.01)，通过对数秩检验](图2)。这些研究显示了使用Exjade^Tm在治疗毛霉病中的效力。这些研究额外地表明，上述铁螯合剂可以应用于其它真菌感染的治疗，包括嗜中性白细胞减少症个体中的毛霉病，以及其它真菌感染，如弥散性念珠菌病和曲霉病。

实施例II

用于毛霉病治疗的铁螯合疗法

[0092]本实施例显示了去铁酮与脂质体两性霉素B(LAmB)治疗糖尿病酮症酸中毒(DKA)小鼠的毛霉病的效力比较，或预防嗜中性白细胞减少症小鼠的毛霉病的效力比较。

[0093]米根霉是毛霉病常见的病因(Ibrahim等，(2003)，上文)。具有提高的可用血清铁的患者，如酮症酸中毒的糖尿病患者，有发生毛霉病感染的高风险(Artis等，上文)。此外，去铁胺铁螯合疗法使患者对这些感染易感。去铁胺发挥异铁载体的作用，向真菌提供了先前不可用的铁(Boelaert等，(1993)，上文)。因此，不能被真菌用以从宿主清除铁的铁螯合剂的使用被评估对抗毛霉病的效力。Def是不能被根霉用于清除铁的铁螯合剂(Boelaert et al，，(1994)，上文)。

[0094]最初，去铁酮对抗米根霉的体外活性在本研究中被评估。简单地说，米根霉99-880从糖尿病患者的脑脓肿中分离。该生物体于37℃在土豆葡萄糖琼脂(PDA)上生长3天。在一些实验中，米根霉通过在1mM抗坏血酸和菲咯嗪(ferrozine)存在的PDA上生长来耗尽铁。孢囊孢子被收集在含有0.01％ Tween 80无内毒素的PBS中，用PBS清洗，随后用血球计数器计数，以制备最终的接种体。对于易感性测试，通过Espinel-Ingroff的方法(J Clin Microbiol 39：954(2001))，测定Def和去铁胺的最低抑制浓度(MIC)和最低真菌杀死浓度(MFC)。

[0095]结果显示于下面的表2。去铁酮在24h对米根霉是静态的(MIC和MFC分别为3.12和100μg/ml)，但是在温育48h时显示出杀死活性(MIC和MFC＝6.25μg/ml)。相反，去铁胺，其已知向米根霉提供铁，不抑制米根霉的生长(24或48小时后，MIC和MFC>100μg/ml)，并且事实上，通过肉眼检查，在含有去铁胺的孔中的生长比对照孔(不含铁螯合剂)中的生长好。

表2：DEF和去铁胺对抗米根霉的MIC90和MFC数值用mg/ml表示

[0096]已经证实了其对抗米根霉的体外活性，我们使用DKA小鼠模型评估去铁酮在体内治疗弥散性米根霉感染中的作用。简单地说，对于体内感染，在真菌攻击前10天，通过单次腹腔注射在0.2ml柠檬酸盐缓冲液中的210mg/kg链脲霉素(streptozotocin)使BALB/c雄性小鼠(>20g)患糖尿病。在链脲霉素处理7天后，糖尿和酮尿在所有的小鼠中得到证实。小鼠用适当的米根霉接种体通过尾静脉感染。为了证实接种体，稀释物在PDA盘上划线，并在室温培养24小时后对菌落计数。主要的效力端点为到死亡的时间。作为第二端点，脑真菌负荷(主要的靶向器官)通过匀质化确定，匀质化通过在置于含有2ml盐水的Whirl-Pak袋(Nasco，Fort Atkinson，WI)的器官上摇动移液器完成。匀浆在0.85％的盐水中连续稀释，并随后在PDA上定量培养。数值表达为log₁₀cfu g^-1组织。所有涉及小鼠的步骤都由实验动物使用与管理委员会(institutional animal use and carecommittee)，按照全国卫生研究院对动物笼栏和看护的指导方针批准。

[0097]关于药物和治疗方案，在5％葡萄糖水中稀释的LAmB从GileadSciences获得，并且以15mg/kg qd(每天一次)的剂量通过尾静脉静脉给药。去铁酮(Apotex Research Inc.)被溶解在不含铁的水中，并以50、100或200mg/kg qd或qod(每隔一天)的剂量腹腔内给药。治疗开始于感染后24小时并持续共4个剂量。对照组用稀释剂——5％的葡萄糖水——处理。

[0098]在一些实验中，饱和的无铁药剂与去铁酮一起给药，试图逆转铁螯合的效力。已知去铁酮与三价铁(³⁺Fe)以铁:去铁酮1:3的比例形成分子复合体。基于氯化铁(FeCl₃，分子量162.22g/mol)和去铁酮(分子量139g/mol)已知的分子量，经计算给予18g的小鼠60mg/kg剂量的FeCl₃产生相比100mg/kg剂量的去铁酮明显过量的³⁺Fe:³⁺Fe摩尔数＝(0.060g/kg*0.018kg[小鼠体重]/162.22g/mol)＝6.5×10^-6mol对去铁酮摩尔数＝(0.1g/kg*0.018kg[小鼠体重]/139g/mol)＝1.3×10^-5mol比例＝1:2摩尔的³⁺Fe比去铁酮，这比达到1:3的饱和比例所需要的多。

[0099]统计分析通过使用非参数的对数秩检验进行，用于确定小鼠存活时间的差异。被感染器官中组织真菌负荷的差异通过用于多重比较的非参数Steel检验(nonparametric Steel test)比较。<0.05的P值被认为是显著的。

[0100]最初，使用基于来自制造商未公开的观察的剂量(50、100或200mg/kg的去铁酮每日或每隔一日一次给药)进行剂量反应。小鼠用4.3×10³个米根霉孢子感染，并且在感染后24小时开始去铁酮治疗并持续共4剂。结果显示于图3和1，表明去铁酮保护DKA小鼠免受米根霉感染。与安慰剂相比，100mg/kg每隔一天的去铁酮剂量提高了DKA小鼠的存活率(p＝0.027，图3)。更高的剂量，包括100mg/kg每天一次或200mg/kg每天一次或每隔一天一次，不提高存活率；50mg/kg每天一次或每隔一天一次的剂量也不提高存活率。

[0101]如前文实施例I中所述，将去铁酮的效力也与米根霉的普通治疗——高剂量LAmB——进行比较。选择每天一次施用15mg/kg LAmB的剂量，因为我们显示了该剂量在DKA小鼠模型中比1mg/kg两性霉素B脱氧胆酸酯更具保护性。而且，要证实去铁酮的保护机理是铁的螯合，去铁酮加饱和剂量的(60mg/kg)FeCl₃形式的游离铁的效力也被评估。每次去铁酮被给予动物时，FeCl₃被静脉给药。

[0102]100mg/kg每隔一天一次的LAmB或去铁酮与安慰剂相比提高了28天的存活率(图1，比安慰剂，通过对LAmB或去铁酮的对数秩检验，P<0.003)。用LAmB治疗的小鼠与用去铁酮治疗的小鼠的存活率没有统计学差异(P＝0.15)。去铁酮的效力通过施用氯化铁完全消除(图1)。

[0103]在其它研究中，也评估了用Def和LAmB的组合对实验性毛霉病的治疗。简单地说，小鼠(对于感染未处理和Def，n＝11；且对LAmB和Def+LamB；n＝6)用米根霉感染，24小时后，接着用Def、LAmB或两种药物的组合治疗，共4剂。结果显示于图4，并且表明使用两种治疗的组合增强了效力。(与感染未治疗的小鼠相比，^*p<0.005)

[0104]相似地，也评估了用米根霉感染并用Def、LAmB或两者预防的嗜中性白血球减少症小鼠的存活率。小鼠(n＝9)在第-1天用Def隔天一次、LAmB每天一次或两者治疗共四剂。这些结果显示于图5，并且也表明使用抗真菌治疗结合铁螯合的组合增强了效力(对于LAmB或LAmB+Def对感染未处理，^*p<0.05)。例如，预防性的Def产生22％的存活率，相对于安慰剂治疗的小鼠0％的存活率(p>0.05)；LAmB和LAmB+Def都产生100％的存活率(对于两者，对安慰剂p<0.05)。

[0105]作为效力的又一标记物，去铁酮疗法对脑真菌负荷的效果也被评估，因为脑是该动物模型中主要的靶向器官。小鼠用3.8×10³个孢子感染，随后用两剂LAmB(每天一次)或去铁酮(隔一天一次)治疗。在上述研究中，对照小鼠在第二剂去铁酮施用之前开始死亡。为了能够在确定组织真菌负荷之前测试至少两剂隔一天一次的去铁酮，在本研究中，去铁酮在感染后30分钟和48小时时施用，而LAmB在感染后24和48小时时给药。脑在感染后约54小时时收集。结果显示于表6，并且表明与安慰剂相比，两种药物都降低了脑真菌负荷(P≤0.036)。

[0106]上述结果表明：Def铁螯合疗法在治疗实验性鼠类毛霉病中有效，并且也具有预防的效力，包括在嗜中性白细胞减少症情况中。特别地，Def体外抑制米根霉的生长，而去铁胺不抑制。Def在治疗DKA模型中的毛霉病方面具有相当的效力，并且这种效力与LAmB的高剂量疗法相当。Def的效力可能是由于其螯合铁的能力，因为游离铁的施用逆转了其保护。Def预防在毛霉病的嗜中性白细胞减少症小鼠模型中没有显示出拮抗LAmB的保护作用。

实施例III

用于毛霉病治疗性处理的地拉罗司施用

[0107]本实施例示出了地拉罗司——铁螯合试剂——的使用，用作鼻脑型毛霉病的补救疗法。

地拉罗司是一种新型、一流的可口服铁螯合剂，其最近由美国(US)食品和药品管理局(FDA)批准，用于输血依赖的贫血症中铁过载的治疗。本研究描述了地拉罗司用作最大传统抗真菌疗法失败的鼻脑型毛霉病患者的补救疗法。

[0108]患有糖尿病酮症酸中毒的40岁男性出现在医院的急诊部，他有多尿、烦渴(多饮)、左眼球后疼痛和左侧颅神经(CN)VI麻痹的症状。头部的计算断层照相法(CT)扫描仅显示左侧蝶骨和筛骨鼻窦炎。该患者在前24小时中发展为完全的左侧眼肌瘫痪。怀疑鼻脑型毛霉病，并对他开始5mg/kg/天的两性霉素B脂质复合体(ABLC)，与经验性抗菌剂一起，用于鼻窦炎的治疗。在医院的第2天，他进行了内窥镜蝶筛(sphenooethmoid)检查。没有发现坏死组织或焦痂，并且多次活体检查显示非特异性炎症。真菌培养为阴性并且特殊的染色没有显示生物体。细菌培养仅生长少量的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。

[0109]在接下来的12天中，该患者发生失明并且左眼突出(proptosis)恶化。他继续使用ABLC并没有进行进一步的手术。眼眶和脑的系列核磁共振成像(MRI)揭示了左侧全窦炎的发展，和左侧眼外肌的增厚和不正常的增强。

[0110]该患者于入院的第14天被转移到我们的机构以进一步管理。在到达后，对他立即进行了左侧眼眶内容物去脏术(exenteration)和摘除术(enucleation)，以及广泛的鼻窦清创术和切除术(resection)。外科手术发现包括具有眼外肌广泛外周坏死的缺血性眼球(ischemic globe)。病理标本显示了毛霉的证据(图7)；真菌培养为阴性。开始对该患者进行15mg/kg/天的脂质体两性霉素B(LamB)和70mg/kg/天的卡泊芬净治疗(基于公开的小鼠数据，其显示了多烯-棘白菌素协同效应)。在眼眶内容物去脏术后进行的头部CT扫描显示左侧海绵窦的血栓形成；这一发现在后续MRI中被证实。

[0111]尽管没有新的神经学发现，就医36天时的MRI显示出左侧海绵窦血栓形成的发展和左颈内动脉流动缓慢，和与进行性毛霉病一致的新的CNV增强。继续抗真菌疗法。入院第71天，脑MRI显示了碟鞍上脑池(suprasellar cistem)中新的增强，并且第一次在脑桥中显示出脑干的损伤和周围水肿。考虑到损伤的位置在脑桥的表面方位，施用了一剂脑池内两性霉素，但是该患者拒绝进一步的剂量。该患者在临床上和神经学上保持不变。由于后续成像的稳定，他在入院第86天转出，以继续门诊LAmB单一疗法每周三次。

[0112]他的疾病在临床上和射线照相上保持稳定数个月。由于出院后10周肾功能不全的恶化(Cr 3.5-4.0，从0.8的基线)，LAmB的剂量被减少到10mg/kg每周两次，并接着在出院后4个月降到每月一次。一个月后，重复MRI显示左中小脑脚(cerebellar peduncle)中外周水肿新的增强，并且左小脑脑桥角与进行性疾病一致。

[0113]基于来自实验性铁螯合剂——去铁酮——的数据，以及地拉罗司在小鼠中的未公开的观察，地拉罗司以1000mg的剂量每天一次(口服)给药7天。继续LAmB。在地拉罗司治疗的最后一天，患者发生红斑性的轻度瘙痒症，在躯干和肢体四肢爆发融合性斑丘疹，与可能的药疹一致。瘙痒症用苯海拉明治疗。没有观察到其它不良事件。地拉罗司治疗后一周，脑部的重复MRI显示出左侧小脑脚中水肿的消退。五周后的跟踪成像显示没有新的损伤。由于肾功能不全的恶化(Cr～5.5)，以及在重复成像上放射照相发现的稳定性的情况中，LAmB治疗中断。他初始诊断10个月后，该患者保持无症状且神经学上完整。

[0114]尽管进行大量的手术和数月的抗真菌治疗，这里所述的患者明显没有被治愈他的侵袭性毛霉病，因为他在用最高耐受剂量LamB治疗7个月后，出现了与进行性毛霉病一致的新的放射照相发现。然而，用地拉罗司治疗7天后，注意到了本质的放射照相的改善。施用地拉罗司两个月后，所有的抗真菌疗法被中断。该患者后来保持临床无症状和放射照相稳定，没有疾病发展的迹象。除了微弱的药物反应外，该患者耐受地拉罗司良好，这可能归因于螯合剂。

[0115]这里我们描述了晚期(advanced)毛霉病的病例，其在适当的手术明显延误后涉及脑干和海绵窦，在使用地拉罗司补救治疗后具有明显成功的结果。地拉罗司治疗的准确效果有些与同时的多烯治疗混淆。但是，在加入地拉罗司之前，非常积极的多烯疗法对该患者明显失败。考虑到该病例令人鼓舞的结果，和有限的选择及毛霉病较差的预后——尽管有当前的抗真菌治疗，毛霉病治疗中铁螯合的其它研究是有理由进行的。

实施例IV

地拉罗司对体外毛霉的作用

[0116]本实施例显示了地拉罗司对米根霉中高亲和性铁通透酶基因(rFTR1)表达的作用。本实施例也显示了毛霉多个临床分离物的地拉罗司敏感性。

[0117]以下描述了本实施例或后续实施例中所述程序中使用的材料和方法。

米根霉和培养条件

[0118]米根霉99-880是来自糖尿病患者的脑脓肿的临床分离物。米根霉99-892是临床的肺部分离物。米根霉M16是通过化学诱变从米根霉99-880产生的pyrF无效突变体(pyrF编码乳清酸核苷5′-磷酸盐脱羧酶，它是尿嘧啶合成需要的一种酶)。即使当以多于1×10⁹个孢子铺板时，该突变体显示出对尿嘧啶营养缺陷型稳定的表现型。生物体在37℃生长在土豆葡萄糖琼脂(PDA)[制剂/升；土豆淀粉4g，葡萄糖20g，琼脂15g]上4天。对于M16，PDA用100μg/ml尿嘧啶补充。在一些实验中，米根霉通过在1mM抗坏血酸和菲咯嗪存在下在酵母氮源(YNB)(Difco/Becton Dickinson，Sparks，MD)上生长被耗尽铁，所述酵母氮源用不含尿嘧啶的完全补充培养基(CSM-URA)补充，(YNB+CSM-URA)[制剂/100ml，1.7g无氨基酸的YNB，20g葡萄糖，0.77g CSM-URA]。孢囊孢子被收集在含有0.01％Tween 80无内毒素的PBS中，用PBS清洗，并用血球计数器计数，以制备最终的接种体。

米根霉高亲和性铁通透酶基因(rFTRl)的表达分析

[0119]从汇合的PDA板上采集的米根霉99-880孢塞(plugs)于37℃在土豆葡萄糖培养液中摇动生长过夜。通过无菌的方法收集菌丝，并转移到含有350μM氯化铁的新PDB烧瓶中(以抑制rFTRl的表达)。350μM氯化铁加2mM地拉罗司以测试铁螯合，或2mM地拉罗司加6mM氯化铁使加入的地拉罗司过饱和。烧瓶在37℃摇动温育1小时。菌丝体通过过滤收集，并使用臼和杵在液氮中研磨。总RNA使用含有RLC缓冲液的RNeasy Plabt Mini^TM试剂盒

提取。所述RNA使用Superscript^TM第一链合成系统(First-Strand Synthesis System)

用寡聚(dT)(oligo(dT))引物反转录，以生成第一链cDNA。该产物被稀释并用于PCR，以检测米根霉FTR1和18s rDNA基因的表达。PCR引物的序列如下：用于米根霉rFTR1扩增的有义引物5′-TCAGAGAAGGACTTGAAGC-3′和反义引物5′-TAAGTAGCCGTATTGTTCC-3′；以及用于18s rDNA基因的有义引物5′-CATGGTTGAGATTGTAAGATAG-3′和反义引物5′-AGTCAATGGACGTGGAGTC-3′。该PCR产物在含有0.1μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分离。两个引物对被设计为扩增400bp的条带。

绿色荧光蛋白(GFP)报道基因测试

[0120]rFTR1ORF上游的1.5kb片段使用以下引物对被PCR扩增：有义引物5′-GCTCTAGATCAGTCTCAACACCATCAATT-3′；和反义引物5′-TGCGGCCGTGCTTTTTAGTTCTCCTTGGA-3′。含有组成型表达的肌动蛋白启动子的2.1kb片段也被PCR扩增用作对照，扩增使用以下引物对：有义引物5′-GCTCTAGATGGTATTATCGATTTAGA-3′；和反义引物5′-TACGGCCGCATACCGGAACCGTTATCG-3′。扩增的片段被连接进质粒pyr225b(35)的Xba1和Eag1位点。GFP从pGFPB21-43.31(36)中扩增，并且克隆进入质粒的任一启动子下游的Eag1-Sac1位点。最后，代表pyrF的ORF的2.1kb片段及其天然启动子被克隆进质粒的Spe1-Cla1位点，以发挥选择性标记的作用。含有被rFTR1p或ACT1p任一驱动的GFP的质粒用微粒粒子轰击

被转化进入米根霉M16。轰击后于37℃在YNB+CSM-URA平板上生长5-7天，选择转化体。然后通过使转化体在含有无尿嘧啶的基础培养基的平板上传代并在37℃温育该平板，测试分离物的尿嘧啶营养缺陷型。在尿嘧啶阴性平板上选择得到的纯化的转化体通过DNA印迹法分析。

[0121]rFTR1p和ACT1p的表达在生长于铁充分的培养基上(即YNB+CSM-URA)或铁耗尽条件下(即，用2mM地拉罗司补充的YNB+CSM-URA)的转化体中被研究。此外，要逆转地拉罗司的作用，将转化体生长在用2mM地拉罗司补充并用6mM氯化铁过饱和的YNB+CSM-URA中。最后，带有空质粒的M16转化体(没有GFP的pyr225b-pyrF)被用作阴性对照。孢子(1×10⁴/ml)被接种在上述培养基中并在37℃温育过夜。一滴培养物被加样到载玻片上，并用488nm的激发波长用Leica DMRXE共聚焦显微镜观察米根霉中的GFP表达。此外，使用装备有在488nm发射的氩激光器的FACSCaliber^TM(Becton 

)仪器，每个培养物中1ml的样品也被用于量化荧光发射。孢子通过前向和侧向散射被闸控(gated)，并且荧光在FL1测量。

易感性测试

[0122]最低抑制浓度(MIC)和最低真菌杀死浓度(MFC)通过Espinel-Ingroff的方法，使用铁耗尽的米根霉孢子对地拉罗司进行确定(Espinel-Ingroff，(2001)，上文)。致死率被定义为MIC和MFC之间的差异小于等于4倍。

治疗方案

[0123]地拉罗司(Novartis Pharmaceuticals，Basel，瑞士)悬浮在0.5％羟丙基纤维素(Klucel)中，并通过口服管饲法以1、3或10mg/kg每天(qd)或每隔一天(qod)两次施用。治疗开始于感染后24小时并持续共5或7剂。对照组用稀释剂——5％的葡萄糖水和0.5％Klucel——处理。在一些实验中，饱和剂量的游离铁与地拉罗司一起给药。已知地拉罗司与三价铁(³⁺Fe)以铁:地拉罗司1:2的比例形成分子复合体。基于氯化铁(FeCl₃，分子量162.22g/mol)和地拉罗司(分子量373.4g/mol)已知的分子量，经计算给予18g的小鼠2.8mg/kg剂量的FeCl₃产生相比10mg/kg剂量的地拉罗司明显过量的³⁺Fe:³⁺Fe摩尔数＝(0.0028g/kg*0.018kg[小鼠体重]/162.22g/mol)＝3×10^-7mol对地拉罗司摩尔数＝(0.01g/kg*0.018kg[小鼠体重]/373.4g/mol)＝5×10^-7mol，比例＝1:1.7摩尔的³⁺Fe比去铁酮，这比达到饱和1:2比例所需要的多。稀释于5％葡萄糖水中的LAmB从Gilead 

(Foster city，CA)获得，并以每天(qd)15mg/kg的剂量通过尾静脉给药4天。

统计学分析

[0124]非参数对数秩检验被用于确定小鼠存活时间的差异。组织真菌负荷的、脾脏淋巴细胞频率和感染器官中全器官细胞因子的差异通过魏可逊曼-惠特尼U检验(Mann Whitney U Test)比较。小于0.05的P值被认为是显著的。

[0125]已经显示(在Fu等FEMS Micorbiol.Lett.235：169-176(2004))，铁耗尽引起高亲和性铁通透酶基因(rFTR1)在米根霉中的快速表达，这是毛霉病最常见的原因。因此，为了证实地拉罗司有效地螯合米根霉中的铁，我们确定了体外地拉罗司暴露对米根霉rFTR1表达的影响。米根霉99-880孢子在PDB中温育过夜。第二天，菌丝体被转移到用350μM氯化铁(铁充足)、350μM氯化铁加2mM地拉罗司(铁耗尽)、或2mM地拉罗司加过饱和的6mM氯化铁补充的PDB中。RNA从在每种条件下在37℃生长1小时的孢子中提取，并且进行RT-PCR以评估基因表达。rFTR1基因在地拉罗司存在的情况下表达，但是不在用氯化铁补充的培养基或在地拉罗司加过饱和氯化铁存在的情况下表达(图8a)。

[0126]为了证实螯合条件下rFTR1p表达和rFTR1启动子的活性，编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因被克隆在rFTR1启动子之后(图8b)。用rFTR1::GFP构建体或ACT1p::GFP(组成型阳性对照)转化的米根霉M16孢子与地拉罗司、地拉罗司加过饱和氯化铁、或铁丰富培养基(铁充足)温育过夜。图8c显示了与在ACT1启动子控制下的GFP相反，其被组成型表达而不管生长条件，在rFTR1启动子控制下的GFP仅在铁螯合的条件(地拉罗司)下被表达或有活性。如共聚焦显微镜所见，用组成型ACT1p::GFP构建体转化的M16无论在何种生长条件下都有荧光。相反，用rFTR1p::GFP转化的M16仅在地拉罗司存在的情况下有荧光。相似地，通过流式细胞计，小于1％在铁充足条件下生长的未转化的或rFTR1p::GFP转化的孢子有荧光。相反，43％用rFTR1p::GFP转化并在地拉罗司存在的情况下生长的孢子有荧光。总之，这些数据证实了地拉罗司诱导米根霉中的铁耗尽反应。

[0127]我们接下来确定了毛霉多个临床分离物对地拉罗司的易感性(表3)。地拉罗司抗毛霉、非米根霉种和米根霉的MIC_90S为3.12到6.25μg/ml。MFCs与MICs相似，并且地拉罗司对28/29(97％)的分离物致死。值得注意，即使在极高浓度地拉罗司的条件下，在前12小时中可见轻微生长。然而，即使在低浓度地拉罗司条件下，真菌在24小时内死亡，这表明地拉罗司的致死性是时间依赖而非浓度依赖的。而且，当以FDA批准的起始剂量(20mg/kg/d)给药时，地拉罗司对抗这些分离物的MICs和MFCs远低于稳定状态下药物的临床可达到的峰血清水平(～38μg/ml)及波谷血清水平(trough serum level)(～17μg/ml)。

[0128]除了显示出地拉罗司诱导米根霉中的铁耗尽反应，本实施例也显示了地拉罗司对来自毛霉科两个不同属的多个临床分离物是致死的。

表3：地拉罗司对毛霉的MICs和MFCs

实施例V

地拉罗司对抗体内米根霉的效力

[0129]本实施例显示了地拉罗司在治疗用毛霉感染的小鼠中的体内效力。

[0130]以下描述了本实施例或后续实施例中所述程序中使用的材料和方法。

鼠类模型

[0131]对于体内感染，在真菌攻击前10天，通过单次腹腔注射在0.2ml柠檬酸盐缓冲液中的210mg/kg链脲霉素(streptozotocin)使BALB/c雄性小鼠(>20g)患糖尿病。在链脲霉素处理7天后，糖尿和酮尿在所有的小鼠中得到证实。对于嗜中性白细胞减少症的小鼠模型，小鼠在用米根霉感染前2天被注射单一腹腔剂量的200mg/kg环磷酰胺(cycolphosphamide)(Bristol Myer Squibb)。这一处理方案在相对于感染的第-2天到第5天导致全血细胞减少症，细胞数的恢复从感染后第6天开始。小鼠用适当的米根霉接种体通过尾静脉感染。为了证实接种体，稀释物在含有0.1％ triton的PDA平板上划线，并且在37℃温育24小时后对菌落计数。主要的效力端点为到死亡的时间。作为第二端点，脑真菌负荷(主要的靶向器官)通过匀质化确定，匀质化通过在置于含有1ml盐水的Whirl-Pak^TM袋(

，Fort Atkinson，WI)的器官上摇动移液器完成。匀浆在0.85％的盐水中连续稀释，并随后在PDA上定量培养。数值表达为log₁₀cfu g^-1组织。最后，对于组织病理学分析，被感染的器官从小鼠收集并固定在10％锌福尔马林中。固定的组织被包埋在石蜡中，并且5mm的切片用苏木精和伊红染色，用于光学显微镜检查。所有涉及小鼠的步骤都由实验动物使用与管理委员会，按照全国卫生研究院对动物笼栏和看护的指导方针批准。

[0132]为了确定地拉罗司的体外活性是否转化为体内效力，我们使用糖尿病酮症酸中毒小鼠中弥散性毛霉病的鼠类模型。糖尿病酮症酸中毒小鼠用米根霉99-892的2.2×10⁴个孢子通过尾静脉感染。从感染后的第一天开始，小鼠通过口部管饲法用在0.5％羟丙基纤维素(Klucel)中的1、3或10mg/kg的地拉罗司一天两次(bid)治疗7天。阴性对照小鼠用羟丙基纤维素载体(安慰剂)或地拉罗司加饱和的氯化铁治疗(皮下给药)。额外的阴性对照包括用氯化铁治疗的未感染小鼠。与对照相比，每天两次1、3或10mg/kg的地拉罗司显著地提高了存活率(图9a)。

[0133]在单独的实验中，地拉罗司被发现对抗第二种米根霉的临床分离物——99-880分离物——有效。糖尿病酮症酸中毒小鼠用1.3×10³个更具毒性的米根霉99-880孢子通过尾静脉感染，并如上文所述用10mg/kg地拉罗司每天两次或安慰剂治疗7天。与安慰剂相比，地拉罗司显著地提高了由米根霉感染的小鼠到死亡的时间(图9b)。

[0134]为了确定地拉罗司对组织真菌负荷的影响，糖尿病酮症酸中毒小鼠用4.2×10⁴个米根霉99-892的孢子通过尾静脉感染。小鼠用地拉罗司(10mg/kg每天两次)、地拉罗司加饱和的氯化铁、或安慰剂治疗。治疗开始于感染后16小时并且每天给药持续3天。肾脏和脑在第四天被除去，匀质化，并定量培养。与用安慰剂或地拉罗司加饱和氯化铁治疗的小鼠比较，地拉罗司产生脑和肾脏(主要的靶器官)真菌负荷高于10倍的降低(图10a)。通过组织病理学，地拉罗司治疗的小鼠的肾脏没有可见的菌丝(如图10b中箭头所指)，而用安慰剂或地拉罗司加饱和氯化铁治疗的小鼠的肾脏具有广泛的有丝真菌。而且，用饱和铁治疗的小鼠在感染位点明显没有嗜中性白细胞流入，而嗜中性白细胞流入在用地拉罗司治疗的小鼠肾脏中是显著的(图10b)。

[0135]除了显示出地拉罗司的直接抗真菌作用，本实施例显示了地拉罗司的保护作用可以通过给予游离铁逆转，这证实了药物的保护机理是通过铁螯合实现的。

实施例VI

铁螯合和过量铁对宿主免疫反应的作用

[0136]本实施例显示了地拉罗司和地拉罗司加氯化铁对宿主免疫反应作用的比较。

以下描述了本实施例或后续实施例中所述程序中使用的材料和方法。脾脏淋巴细胞频率和全器官细胞因子试验

[0137]脾脏淋巴细胞频率如我们先前所述确定(Spellberg等，Infect.Immun.71：5756-5764(2003))。简单地说，使脾脏匀浆通过70μm过滤器，接着用0.15M氯化铵RBC裂解。细胞用Cytofix^TM缓冲液(BD 

)固定，用Cytoperm^TM缓冲液(BD Pharmingen)使其通透，并用10μg/ml的FITC-偶联的抗-小鼠CD4(克隆RM4-5)、PE-偶联的抗-小鼠IFN-γ(克隆XMG1.2)或同种型对照(克隆R-34)、别藻蓝蛋白(APC)-偶联的抗-小鼠IL-4(克隆11B11)或同种型对照(克隆R3-34)、或APC-偶联的抗-小鼠IL-10(克隆JES5-16E3)或同种型对照(克隆A95-1)(所有都来自BDPharmingen)染色。在独立的实验中，CD4+CD25+foxp3+T-调控细胞的频率使用小鼠调控T细胞染色^TM试剂盒(Mouse Regulatory T cell Staining^TM Kit)

按照制造商的建议确定。程序性细胞死亡的频率使用膜联蛋白FITC程序性细胞死亡^TM试剂盒(Annexin FITC Apoptosis^TM kit)(BD 

确定。

[0138]细胞被清洗，并且三色流式细胞计数在用CaliBRITE^TM珠(BDPharmingen)校准的Becton-Dickinson FACScan^TM仪上使用FACSComp^TM软件按照制造商的建议进行。在数据获得的过程中，CD4+淋巴细胞通过前向和侧向散射的拼接(concatenation)，和FITC-抗-CD4抗体的荧光性质闸控。每个样品的数据被获得，直到分析了10,000个CD4+淋巴细胞。

全器官细胞因子试验

[0139]脾脏和肾脏在1ml的PBS中匀质化。匀浆在台式离心机中以最大速度于4℃离心。使用细胞仪珠试验鼠类炎症性细胞因子^TM试剂盒(Cytometric BeadArray Murine Inflammatory Cytokine^TM kit)(BD Pharmingen)按照制造商的说明，测试上清液中的细胞因子。

[0140]由于用饱和氯化铁对铁螯合治疗的小鼠肾脏中见到的炎症性细胞流入的改变，在本实施例中，我们确定了地拉罗司治疗对感染小鼠中Th1/Th2和炎症性细胞因子反应的作用。糖尿病酮症酸中毒小鼠按上述用3.1×10⁴个米根霉99-892孢子感染，并用地拉罗司、地拉罗司加氯化铁、或安慰剂治疗。在感染的第四天，脾脏和肾脏被处理，用于细胞内和全器官细胞因子的确定。与用饱和氯化铁或安慰剂治疗的小鼠相比，地拉罗司导致Th1和Th2脾细胞频率的显著增加(图11a)。CD4+IL-10+或CD4+CD25+foxp3+脾细胞的频率在各组之间没有明显差异(数据未显示)。脾细胞程序性细胞死亡在各组之间也没有显著差异(数据未显示)。

[0141]地拉罗司治疗的小鼠比用饱和铁或安慰剂治疗的小鼠具有明显更高的脾脏典型促炎性细胞因子、TNF和IFN-γ水平。用地拉罗司治疗的小鼠也具有明显更高的肾脏IFN-γ水平(图11b)。

[0142]本研究显示了地拉罗司非特异地刺激糖尿病酮症酸中毒小鼠中被抑制的炎症反应，提高了Th1和Th2淋巴细胞的频率以及脾脏和肾脏炎症性细胞因子的水平。而且，通过给予过饱和铁剂量的螯合的逆转降低了在被感染肾脏中所见的嗜中性白细胞的数量。

实施例VII

地拉罗司

与脂质体两性霉素B组合用于鼠类毛霉病的治疗性处理

[0143]本实施例显示了使用铁螯合剂、地拉罗司

和脂质体两性霉素B(LAmB)的组合疗法用于毛霉病治疗的效果。

[0144]如上文所述，临床和动物模型数据表明：升高的可用血清铁的存在使宿主易感毛霉病。如上文的实施例示例，地拉罗司铁螯合疗法显示出提高用米根霉——毛霉病的最常见原因——感染的糖尿病酮症酸中毒小鼠的存活率。为了确证结合疗法中地拉罗司的效力，地拉罗司与LAmB组合的效力与用于治疗动物模型鼠类毛霉病的任一单独药物的效力比较。

[0145]方法、动物程序和试剂按前述进行和/或制备。简单地说，具有链脲霉素诱导的DKA的BALB/c小鼠用2.0×10³个米根霉孢子通过尾静脉感染。在感染后24小时开始治疗，使用：(1)LAmB(15mg/kg iv)，每天一次，给药4剂；(2)地拉罗司(10mg/kg po)每天两次，给药7剂；或(3)使用上述计量的LAmB和地拉罗司两者。安慰剂小鼠接受载体对照。端点为到死亡的时间和菌落形成单元(CFU)。

[0146]上述研究的结果显示于图12和13。图12显示了仅地拉罗司和仅LAmB的单一疗法，以及地拉罗司和LAmB一起的组合疗法在治疗毛霉病方面的效力。结果表明：与安慰剂相比，两种单一疗法提高了存活率(地拉罗司和LAmB的存活率分别为25％和28％，且安慰剂为0％，P<0.003)。与所有其它组相比，组合疗法显著地提高了感染的DKA小鼠(每组n>16)的存活时间和总体存活率(对组合疗法70％的存活率，通过对所有比较的对数秩检验，P<0.008)。

[0147]这些治疗相对于靶器官的结果显示于图13。该结果表明：与安慰剂相比，任何一种药物单独都不能降低脑CFUs(主要的靶器官)。然而，与所有其它臂相比，地拉罗司和LAmB两者的组合疗法降低脑CFUs两个对数级(2logs)以上(P<0.04)。与安慰剂治疗的小鼠相比，仅LAmB和组合疗法能够降低肾脏CFU(次要靶器官)(P<0.01)。

[0148]本研究表明：铁螯合疗法和高剂量LAmB在治疗DKA中实验性毛霉病方面可以同样有效。LAmB和地拉罗司的组合疗法比任一单独药物更有效。这些数据进一步确证了使用铁螯合，如地拉罗司，作为与两性霉素B的脂质制剂的组合疗法在治疗毛霉病感染方面的治疗效力。上述结果进一步表明：当组合使用时，铁螯合剂地拉罗司

和脂质体两性霉素B在动物模型中对毛霉病的治疗产生协同效应。

实施例VIII

地拉罗司在嗜中性白细胞减少的感染小鼠中的效力

[0149]本实施例显示了地拉罗司在治疗用米根霉感染的嗜中性白细胞减少的(neutropenic)小鼠中的效力。

[0150]为了确定地拉罗司在嗜中性白细胞减少状况中是否也有效，小鼠用环磷酰胺进行骨髓根除(myeloablated)。两天后，小鼠用2.7×10³个米根霉99-892孢子通过尾静脉感染。初始剂量反应研究表明：与糖尿病酮症酸中毒模型相反，每隔一天而非每天地拉罗司给药达到最佳结果(数据未显示)，如我们先前在铁螯合剂——去铁酮——中所述。与安慰剂相比，用地拉罗司(10mg/kg每隔一天两次，给药五剂，开始于感染后24小时)治疗显著改善了到死亡的时间(图14)。相反，与安慰剂相比，地拉罗司每天两次给药没有显著改善到死亡的时间。

[0151]本研究表明：地拉罗司在嗜中性白细胞减少症小鼠中的最大效力要求比糖尿病酮症酸中毒小鼠模型中较低的给药频率，并且地拉罗司在糖尿病酮症酸中毒小鼠中比在嗜中性白细胞减少症小鼠中显得有点更加有效。

实施例IX

地拉罗司在嗜中性白细胞减少症小鼠中特异毒性的评估

[0152]本实施例显示了用每天一剂地拉罗司治疗的嗜中性白细胞减少症小鼠中的毒性评估的结果。

[0153]以下描述了本实施例中所述程序中使用的材料和方法。

地拉罗司毒性研究

[0154]地拉罗司在嗜中性白细胞减少症小鼠中的毒性被评估。按上文所述使小鼠患上嗜中性白细胞减少症，并用地拉罗司以10mg/kg每天两次或每隔一天的剂量治疗7天。来自三个不同组(即安慰剂，地拉罗司每天治疗，和地拉罗司每隔一天治疗)的小鼠在第3天和第8天被杀死，收集血液并被送往Charles RiverLaboratories进行评估。此外，从股骨制备骨髓涂片，并且收集组织，在锌缓冲的福尔马林中保存，包埋在石蜡中，以5μm的厚度切片，并用苏木精和伊红染色。产生的载玻片由Charles River Laboratories的委员会认可的兽医病理学家检验。

[0155]因为每隔一天地拉罗司给药在嗜中性白细胞减少症模型中是最佳的，我们试图鉴定在嗜中性白细胞减少症小鼠中由地拉罗司每天给药引起的任何潜在毒性。如前所述用环磷酰胺使小鼠患有嗜中性白细胞减少症，但未被感染。小鼠用地拉罗司10mg/kg每天两次治疗7天，用10mg/kg每隔一天两次治疗4剂，或用安慰剂治疗。最终放血在第3天或第8天进行，以测量全部血细胞数、血清化学和肝功能试验。组织病理学在广泛的一系列器官中进行，包括脑、心、肺、肝、胆囊、脾、肾、胃肠道(包括胃、小肠和大肠)和骨髓(涂片和核心(core))。在白细胞数、绝对嗜中性白细胞数、血小板数、血红蛋白水平、血清化学(包括肌酸酐、血液尿素氮或电解质)或肝功能测试(包括AST、ALT或胆红素)方面，在任意时间点三组之间没有鉴定到差异。通过组织病理学，没有鉴定到可归因于地拉罗司的器官特异毒性，包括没有血细胞生成改变的证据。特别地，没有由化疗引起的骨髓去除(ablation)的恶化或延迟恢复的证据，也没有由实验室检测到的肾脏或肝脏功能异常的任何证据，也没有通过组织病理学评估得到的任何特异性器官毒性。

[0156]本研究显示了在嗜中性白细胞减少症小鼠中每天地拉罗司给药减小的活性不可能是由于地拉罗司在这些小鼠中的毒性作用，原因是没有发现毒性的证据。

[0157]贯穿整个本申请，多篇出版物在括号中被引用。这些出版物的公开在此通过引用以其整体并入本申请中，以便更充分地描述本发明所属领域的技术状态。

[0158]尽管本发明已经参考公开的实施方式进行描述，本领域普通技术人员将容易地认识到，上文详述的特定实施例及研究仅是本发明的示例。应该理解，可以进行多种修改而不背离本发明的精神。因此，本发明仅由所附的权利要求书限定。

Claims (44)

1.组合物，包含至少一种铁螯合化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种抗真菌剂或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述铁螯合化合物包括去铁酮或地拉罗司。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述抗真菌剂包括多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂。

4.权利要求3所述的组合物，其中所述多烯抗真菌剂选自两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体或两性霉素B硫酸胆甾醇酯。

5.权利要求3所述的组合物，其中所述吡咯抗真菌剂选自泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑或伊曲康唑。

6.权利要求3所述的组合物，其中所述棘白菌素抗真菌剂选自醋酸卡泊芬净或米卡芬净。

7.权利要求1所述的组合物，进一步包含两种或更多种铁螯合化合物。

8.权利要求7所述的组合物，其中所述两种或更多种铁螯合化合物包括去铁酮和地拉罗司。

9.权利要求1所述的组合物，进一步包含两种或更多种抗真菌剂。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述两种或更多种抗真菌剂选自多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂。

11.权利要求10所述的组合物，其中所述多烯抗真菌剂选自两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体、两性霉素B硫酸胆甾醇酯、泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、醋酸卡泊芬净或米卡芬净。

12.权利要求1所述的组合物，进一步包括治疗有效量的所述铁螯合化合物、所述抗真菌剂或两者。

13.权利要求1所述的组合物，进一步包括药学上可接受的介质。

14.治疗或预防真菌病症的方法，其包括给予患有真菌病症或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物，给予的时间足以降低真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包含与所述真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

15.权利要求14所述的方法，其中所述真菌病症包括接合菌病、曲霉病、隐球菌病、念珠菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、镰刀菌病(透明丝孢菌病)、芽生菌病、青霉病或孢子丝菌病。

16.权利要求15所述的方法，其中所述接合菌病进一步包括毛霉病。

17.权利要求16所述的方法，其中所述毛霉病包括鼻脑型毛霉病、肺毛霉病、胃肠毛霉病、弥散性毛霉病、骨毛霉病、纵膈毛霉病、气管毛霉病、肾脏毛霉病、腹膜毛霉病、上腔静脉毛霉病或外耳炎毛霉病。

18.权利要求17所述的方法，其中所述毛霉病与毛霉目中的传染原相关。

19.权利要求18所述的方法，其中所述毛霉目中的传染原选自根霉属的种，包括米根霉(Rhizopus oryzae)(少根根霉(Rhizopus arrhizus))、小孢子根霉变体(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)、毛霉属的种、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和小克银汉霉某种(Cunninghamella spp)(小克银汉霉科)。

20.权利要求15所述的方法，其中所述念珠菌病与选自包括白假丝酵母(Candida albicans)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的假丝酵母属种的传染原相关。

21.权利要求15所述的方法，其中所述曲霉病与选自包括烟曲霉(Aspergillusfiimigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的曲霉属种的传染原相关。

22.权利要求14所述的组合物，其中所述铁螯合化合物包括去铁酮或地拉罗司。

23.权利要求14所述的方法，进一步包括两种或更多种铁螯合化合物，其中每种铁螯合化合物包含与所述真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

24.权利要求23所述的方法，其中所述两种或更多种铁螯合化合物包括去铁酮和地拉罗司。

25.权利要求14所述的方法，其中所述预防包括在所述真菌病症发作之前，预防性给予所述至少一种铁螯合化合物。

26.治疗或预防真菌病症的方法，其包括给予患有真菌病症或易患真菌病症的个体治疗有效量的至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂，给予的时间足以降低所述真菌病症的严重性，其中所述铁螯合化合物包括与所述真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

27.权利要求26所述的方法，其中所述真菌病症包括接合菌病、曲霉病、隐球菌病、念珠菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、镰刀菌病(透明丝孢菌病)、芽生菌病、青霉病或孢子丝菌病。

28.权利要求27所述的方法，其中所述接合菌病进一步包括毛霉病。

29.权利要求28所述的方法，其中所述毛霉病包括鼻脑型毛霉病、肺毛霉病、胃肠毛霉病、弥散性毛霉病、骨毛霉病、纵膈毛霉病、气管毛霉病、肾脏毛霉病、腹膜毛霉病、上腔静脉毛霉病或外耳炎毛霉病。

30.权利要求29所述的方法，其中所述毛霉病与毛霉目中的传染原相关。

31.权利要求30所述的方法，其中所述毛霉目中的传染原选自根霉属的种，包括米根霉(Rhizopus oryzae)(少根根霉(Rhizopus arrhizus))、小孢子根霉变体(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)、毛霉属的种、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和小克银汉霉某种(Cunninghamella spp)(小克银汉霉科)。

32.权利要求27所述的方法，其中所述念珠菌病与选自包括白假丝酵母(Candida albicans)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的假丝酵母属种的传染原相关。

33.权利要求27所述的方法，其中所述曲霉病与选自包括烟曲霉(Aspergillusfiimigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的曲霉属种的传染原相关。

34.权利要求26所述的方法，其中所述铁螯合化合物包括去铁酮或地拉罗司。

35.权利要求26所述的组合物，其中所述抗真菌剂包括多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂。

36.权利要求35所述的方法，其中所述多烯抗真菌剂选自两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体或两性霉素B硫酸胆甾醇酯。

37.权利要求35所述的方法，其中所述吡咯抗真菌剂选自泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑或伊曲康唑。

38.权利要求35所述的方法，其中所述棘白菌素抗真菌剂选自醋酸卡泊芬净或米卡芬净。

39.权利要求26所述的方法，进一步包括两种或更多种铁螯合化合物，其中每种铁螯合化合物包含与所述真菌病症相关的非铁载体或非异铁载体。

40.权利要求39所述的方法，其中所述两种或更多种铁螯合化合物包含去铁酮和地拉罗司。

41.权利要求26所述的方法，进一步包含两种或更多种抗真菌剂。

42.权利要求41所述的方法，其中所述两种或更多种抗真菌剂选自多烯抗真菌剂、吡咯抗真菌剂或棘白菌素抗真菌剂。

43.权利要求42所述的方法，其中所述抗真菌剂选自两性霉素B脱氧胆酸盐、脂质体两性霉素B、两性霉素B脂质复合体、两性霉素B硫酸胆甾醇酯、泊沙康唑、伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、醋酸卡泊芬净或米卡芬净。

44.权利要求26所述的方法，其中所述预防包括在所述真菌病症发作之前，预防性给予所述至少一种铁螯合化合物和至少一种抗真菌剂。

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