TWI712410B - 艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途 - Google Patents

艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI712410B
TWI712410B TW108138454A TW108138454A TWI712410B TW I712410 B TWI712410 B TW I712410B TW 108138454 A TW108138454 A TW 108138454A TW 108138454 A TW108138454 A TW 108138454A TW I712410 B TWI712410 B TW I712410B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cryptococcus
eltrombopag
growth
guttata
neoformans
Prior art date
Application number
TW108138454A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202116302A (zh
Inventor
陳穎練
柯皓達
徐立航
楊聖永
Original Assignee
國立臺灣大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立臺灣大學 filed Critical 國立臺灣大學
Priority to TW108138454A priority Critical patent/TWI712410B/zh
Priority to US16/714,867 priority patent/US11160790B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI712410B publication Critical patent/TWI712410B/zh
Publication of TW202116302A publication Critical patent/TW202116302A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4152—1,2-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. antipyrine, phenylbutazone, sulfinpyrazone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明提供一種艾曲波帕用於製備抑制真菌生長之藥物之用途，其中該真菌係選自於由隱球菌、光滑念珠菌、及紅色毛癬菌所組成的群組。本發明亦提供一種艾曲波帕與一巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑用於製備抑制隱球菌生長之併用藥物之用途。此外，本發明提供一種艾曲波帕用於製備抑制隱球菌毒力因子發展之藥物之用途，其中該毒力因子發展包括生物膜形成、莢膜形成、及黑色素生成。

Description

艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途
本發明係關於一種肼(hydrazine)化合物之新穎用途，特別係關於艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途。
隱球菌病(cryptococcosis)是一種主要由新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)/格特隱球菌(Cryptococcus gattii)物種集團(species complex)所引起的遍及全球的侵襲性真菌感染，每年造成約180,000人死於隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis)及造成約15%的愛滋病(AIDS)相關死亡。在1980年代愛滋病大流行開始時，人類隱球菌病被認為是威脅健康的主因，在此期間，這類真菌感染成為判定T細胞功能大幅下降患者患有愛滋病的普遍標準。此外，在健康個體中也發現少數隱球菌病病例。習知隱球菌病的治療方法包括使用5-氟胞嘧啶(5-flucytosine)或氟康唑(fluconazole)之單一療法，以及使用5-氟胞嘧啶連同兩性黴素B(amphotericin B)或高劑量氟康唑之合併療法。
然而，兩性黴素B具有腎毒性，並且5-氟胞嘧啶僅在限定地域內可取得。另外，儘管氟康唑是一種相對更安全且價位較低的抗真菌藥物，但在南非和其他一些國家，氟康唑抗藥性菌株的數量正在增加。雖然全球人口對安全而有效的抗隱球菌藥物有迫切需要，但新藥開發的緩慢時程導致超過25年來沒有針對隱球菌病的新穎抗真菌藥物被核准。
已知藥物的再利用是藥物研發的另一種策略。使用現有藥物於抑制真菌感染的例子之一是具有免疫抑制作用的鈣調去磷酸酶(calcineurin)抑制劑，例如屬於巨環類(macrolides)的FK506與屬於環狀胜肽(cyclopeptides)的環孢菌素(cyclosporine)，該二者於單獨使用或合併使用皆表現出抗隱球菌活性。然 而，該些藥物具有毒副作用，包括腎毒性及神經毒性。因此，開發更安全而有效的藥物以治療隱球菌感染實為至關重要。
艾曲波帕(eltrombopag)是一種低分子量的合成非肽分子，可用作血小板生成素受體(thrombopoietin receptor)促效劑(agonist)。藉由刺激骨髓中巨核細胞(megakaryocytes)的繁殖及分化，艾曲波帕能促進血小板生成。文獻顯示對慢性免疫性血小板缺乏紫斑病(immune thrombocytopenic purpura，ITP)患者而言，口服艾曲波帕能有效地增加血小板的數量，並且減少出血症狀。此外，艾曲波帕具有良好的耐受性和可接受的安全性。因此，艾曲波帕在2008年被美國食品和藥物管理局(US Food and Drug Administration)批准用於治療ITP患者。然而，目前未有任何研究探討艾曲波帕的抗真菌活性。
緣此，本發明之一目的在提供一種艾曲波帕(如式(I)所示；本文中亦稱ETP)用於製備抑制真菌生長之藥物之用途，其中該真菌係選自於由隱球菌(Cryptococcus)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、及紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)所組成的群組。
Figure 108138454-A0101-12-0002-1
在本發明之一實施例中，該隱球菌係為新型隱球菌、格特隱球菌、或次生格特隱球菌(Cryptococcus deuterogattii)。
本發明之另一目的在提供一種艾曲波帕與一巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑用於製備抑制隱球菌生長之併用藥物之用途。該巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑係指具有一巨環內酯(macrolide lactone)的結構的鈣調去磷酸酶抑制劑。
在本發明之一實施例中，該巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑係為他克莫司(tacrolimus；別名為FK506)或其類似物。該類似物係指具有近似於FK506的分子結構的化合物。
本發明之又一目的在提供一種艾曲波帕用於製備抑制隱球菌毒力因子發展之藥物之用途。
在本發明之一實施例中，該毒力因子發展係為生物膜(biofilm)形成、莢膜(capsule)形成、或黑色素(melanin)生成。
本發明揭露艾曲波帕可用作一種相對廣譜的抗真菌劑，其能夠抑制多種隱球菌菌株以及光滑念珠菌與紅色毛癬菌等其他真菌的生長。再者，艾曲波帕能抑制臨床及唑類抗藥性隱球菌菌株，故可用於發展替代唑類的抗真菌療法。此外，艾曲波帕與巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑之組合表現出抑制隱球菌生長的協同效果，故能減少該二種藥物用於抑制真菌時的必需用量。同時，艾曲波帕尚能抑制隱球菌的多種毒力因子的發展。因此，本發明為治療真菌感染、特別是隱球菌感染提供了一項新策略。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1顯示新型隱球菌H99以不同濃度艾曲波帕處理後的生長動力學曲線。
圖2A係為新型隱球菌H99在紙片擴散易感性試驗中所生長的瓊脂平板的照片，其中該紙片加載10μg艾曲波帕。
圖2B係為次生格特隱球菌R265在紙片擴散易感性試驗(disk diffusion susceptibility assay)中所生長的瓊脂平板的照片，其中該紙片加載10μg艾曲波帕。
圖3A係為新型隱球菌H99細胞在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)照片；圖中比例尺表示2μm。
圖3B係為次生格特隱球菌R265細胞在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的SEM照片；圖中比例尺表示2μm。
圖4A顯示新型隱球菌H99以艾曲波帕與FK506進行棋盤式稀釋試驗(checkerboard titration assay)後的生長狀況。
圖4B顯示次生格特隱球菌R265以艾曲波帕與FK506進行棋盤式稀釋試驗後的生長狀況。
圖4C係為得自圖4A所示棋盤式稀釋試驗的新型隱球菌H99細胞在無藥下再培養48小時後的照片。
圖4D係為得自圖4B所示棋盤式稀釋試驗的次生格特隱球菌R265細胞在無藥下再培養48小時後的照片。
圖5A顯示新型隱球菌H99以最小抑菌濃度之艾曲波帕(ETP)、兩性黴素B(AMB)、或氟康唑(FLC)處理24小時後的代謝活性。
圖5B顯示新型隱球菌H99以二倍連續稀釋的艾曲波帕、兩性黴素B(AMB)、或氟康唑(FLC)處理48小時後的代謝活性。
圖6A係為新型隱球菌H99在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的顯微照片；圖中比例尺表示10μm。
圖6B係為次生格特隱球菌R265在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的顯微照片；圖中比例尺表示10μm。
圖6C顯示新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265細胞的莢膜尺寸。
圖7A係為新型隱球菌H99在含有或不含艾曲波帕(ETP)的液體培養基中培養十天後的照片。
圖7B係為得自圖7A所示的新型隱球菌H99在含有或不含艾曲波帕(ETP)的固體培養基中再培養四天後的照片。
本發明提供艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物的數種應用，包括：(1)將艾曲波帕用於製備抑制真菌生長之藥物，其中該真菌係選自於由隱球菌、光滑念珠菌、及紅色毛癬菌所組成的群組；(2)將艾曲波帕與一巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑用於製備抑制隱球菌生長之併用藥物；以及(3)將艾曲波帕用於製備抑制隱球菌毒力因子發展之藥物。以下實施例係舉例說明艾曲波帕對數種致病性真菌生長的抑制作用；艾曲波帕與巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑FK506之合併使用抑制隱球菌生長的協同效果；以及艾曲波帕能夠干擾隱球菌的數種毒力因子的發展，如生物膜形成、莢膜形成、及黑色素生成。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。因此，「約」及「近似」等用語係指在一給定數值或範圍的20%範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
除非另有定義，本文所述的「真菌」包括酵母菌及絲狀真菌，其中酵母菌包括隱球菌(Cryptococcus)及念珠菌(Candida)；絲狀真菌包括麴黴菌(Aspergillus)、鐮孢菌(Fusarium)、及毛癬菌(Trichophyton)。
除非另有定義，本文所述的「隱球菌」係指隱球菌屬的真菌，包括但不限於新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隱球菌(Cryptococcus gattii)、次生格特隱球菌(Cryptococcus deuterogattii)、淺白隱球菌(Cryptococcus albidus)、羅倫特隱球菌(Cryptococcus laurentii)、彎曲隱球菌(Cryptococcus curvatus)、及土生隱球菌(Cryptococcus humicola)。
本文所述的「隱球菌毒力因子」係指隱球菌所具備能增加隱球菌致病性的因素，包括生物膜、莢膜、隱球菌代謝產物、黑色素或甘露醇、及其他協助隱球菌在宿主體內存活與增殖的物質，例如蛋白酶與磷脂酶。因此，本文中所謂「隱球菌毒力因子發展」係指該些毒力因子的形成過程，例如生物膜形成、莢膜形成、黑色素生成。
本文所述的「藥物(agent)」包括可施用於動物(包括人類)的醫藥品(medicament)或醫藥組合物(pharmaceutical composition)，以及用於動物以外對象的化學產品，例如用於無生命物體(如醫療器械)、水、土壤、或其他環境區域的抗菌劑(antimicrobial)。
本文所述的「併用藥物(combination agent)」係指二種以上藥物之組合，且該組合造成協同效果。併用藥物之一例是艾曲波帕與FK506之組合，該組合對隱球菌生長的抑制作用大於任一組成藥物單獨使用時的抑真菌效果。
本文所述的「醫藥品」或「醫藥組合物」可利用熟習此技藝者所詳知的技術而製備成一適合於口服地(orally)或非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，其包括但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)、細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
本文所述的醫藥組合物可由非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥，其包括但不限於：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、及靜脈內注射(intravenous injection)。
本文所述的醫藥組合物可包含一廣泛使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carrier)。該藥學上可接受的載體可包含一或多種選自於由下列所組成之群組的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。該些試劑的選用與數量落在熟習此項技術者的專業素養與例行技術範疇內。
前述藥學上可接受的載體可包含一選自於由下列所組成之群組的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、含糖溶液、含醇水溶液(aqueous solution containing alcohol)、及其組合。
本文所述的「有效量」係指抑制真菌生長或抑制隱球菌毒力因子發展所需的藥物的量。如本領域熟習技藝人士所知，有效量將依據給藥途徑、使用賦形劑、及與其他治療性處置共同使用而變化。
本文所述的「個體」係指需要治療真菌感染如隱球菌病或隱球菌性腦膜炎的哺乳動物。該個體可以是人類或非人類，例如靈長類、小鼠、狗、貓、牛、馬、兔、豬等。
材料及方法 材料
自Bioshop公司(伯靈頓，安大略省，加拿大)購買酵母萃取物(yeast extract)、葡萄糖(glucose)、蛋白腖(peptone)、及瓊脂(agar)。自慧眾生物科技有限公司(Bioman，新北市，臺灣)購買葡萄糖(dextrose)。自HiMedia公司(孟買，印度)購買馬鈴薯浸液(potato infusion)。自Sigma-Aldrich公司(聖路易市，密蘇里州， 美國)購買RPMI 1640培養基(RPMI 1640 medium)、三嗎啉丙磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)、及基於2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2氫-四唑-5-甲醯胺內鹽(2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt，XTT)的體外毒理學試驗套組(In Vitro Toxicology Assay Kit；TOX2)。自自Selleckchem公司(休士頓，德克薩斯州，美國)購買艾曲波帕、兩性黴素B、氟康唑、及FK506。自Santoku Chemical公司(東京，日本)購買硫酸鎂(magnesium sulfate)。自Shimakyu’s Pure Chemicals公司(大阪，日本)購買磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)。自盟基生物科技股份有限公司公司(Omics Bio.，新北市，臺灣)購買甘胺酸(glycine)。自W.S.Simpson公司(伊斯頓，麻薩諸塞州，美國)購買鹽酸硫胺素(thiamine hydrochloride)。
菌株及培養基
以下實施例中使用的真菌菌株可購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)或得自於學術期刊發表該菌株之實驗室。例如，新型隱球菌H99(Cryptococcus neoformans H99)由Perfect JR等人發表(參見Perfect JR et al.J Clin Microbiol.1993；31：3305-3309)；新型隱球菌T1(Cryptococcus neoformans T1)及新型隱球菌89-610(Cryptococcus neoformans 89-610)由Odom A等人發表(參見Odom A et al.Antimicrob Agents Chemother.1997；41：156-161)；次生格特隱球菌R265(Cryptococcus deuterogattii R265)及次生格特隱球菌R272(Cryptococcus deuterogattii R272)由Kidd SE等人(參見Kidd SE et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：17258-17263)或Hagen F等人(參見Hagen F et al.Fungal Genet Biol.2015；78：16-48)發表；格特隱球菌WM276(Cryptococcus gattii WM276)由Kidd SE等人發表(參見Kidd SE et al.Eukaryot Cell.2005；4：1629-1638)；白色念珠菌SC5314(Candida albicans SC5314)由Jones T等人發表(參見Jones T et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：7329-7334)；熱帶念珠菌MYA3404(Candida tropicalis MYA3404)、平滑念珠菌ATCC22019(Candida parapsilosis ATCC22019)、及葡萄牙念珠菌ATCC42720(Candida lusitaniae ATCC42720)由Butler G等人發表(參見Butler G et al.Nature.2009；459：657-662)；克魯斯念珠菌ATCC6258(Candida krusei ATCC6258)由Forastiero A等人發表(參見Forastiero A et al.Antimicrobial agents and chemotherapy.2015；59：6975- 6982)；光滑念珠菌CBS138(Candida glabrata CBS138)由DujonB等人發表(參見Dujon B et al.Genome evolution in yeasts.Nature.2004；430：35-44)；煙麴黴菌AF293(Aspergillus fumigatus AF293)由Nierman WC等人發表(參見Nierman WC et al.Nature.2005；438：1151-1156)；茄形鐮孢菌III-6(Fusarium solani Fungus III-6)由Hsu LH等人發表(參見Hsu LH et al.Int J Antimicrob Agents.2017；49：740-748)；紅色毛癬菌MYA4438(Trichophyton rubrum MYA4438)由Jo Siu WJ等人發表(參見Jo Siu WJ et al.Antimicrob Agents Chemother.2013；57：1610-1616)。
隱球菌及念珠菌菌株係培養於酵母萃取物-蛋白腖-葡萄糖(yeast extract-peptone-dextrose，YPD)培養基(含1%酵母萃取物、2%蛋白腖、及2%葡萄糖，且選擇性添加2%瓊脂以製備瓊脂平板)。麴黴菌、鐮孢菌、及毛癬菌菌株係培養於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)平板(含2%馬鈴薯浸液、0.2%葡萄糖、及1.5%瓊脂)。進行微量稀釋試驗(microdilution assay)時，使用以MOPS作為緩衝液的RPMI 1640培養基測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、最小殺真菌濃度(minimum fungicidal concentration，MFC)、及分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，FIC)指數(FIC index，FICI)。進行莢膜尺寸試驗(capsule size assay)及黑化試驗(melanization assay)時使用基本培養基(minimal medium；含15mM葡萄糖、10mM硫酸鎂、29.4mM磷酸二氫鉀、13mM甘胺酸、及3μM鹽酸硫胺素，pH 5.5)。
實施例1 艾曲波帕的抗隱球菌活性
為檢視艾曲波帕對真菌生長的抑制作用，對表1所列多種致病性酵母菌或絲狀真菌，包括隱球菌、念珠菌、麴黴菌、鐮孢菌、及毛癬菌，進行微量稀釋試驗(基於CLSI M27-A3及M38-A2標準)。簡言之，將最終濃度約為103cfu/mL的酵母菌或絲狀真菌菌株接種於含有二倍連續稀釋的艾曲波帕(始於64mg/L)的RPMI 1640培養基中。另設置不含艾曲波帕的真菌培養物作為正控制組，及設置不含艾曲波帕與真菌的培養基作為負控制組。將載有前述培養物的96孔盤在35℃培養48小時，並觀察各孔的細胞生長情況以判斷最小抑菌濃度(MIC)，其為沒有肉眼可見細胞生長所對應的最低艾曲波帕濃度。其後，將取自該96孔盤的各孔的3μl酵母菌或絲狀真菌培養物滴加至不含艾曲波帕的YPD瓊 脂平板或PDA瓊脂平板。該些瓊脂平板在35℃培養48小時並觀察菌落形成以判斷最小殺真菌濃度(MFC)，其為沒有菌落形成所對應的最低艾曲波帕濃度。前述試驗重複三次。
依據表1，艾曲波帕對多種新型隱球菌/格特隱球菌在35℃的MIC約為0.125mg/L。值得注意的是，已知對唑類(azoles)具有臨床抗性的兩種新型隱球菌菌株(T1及89-610)也對艾曲波帕敏感，其MIC約為0.125mg/L。此結果說明艾曲波帕對抗隱球菌的作用機制不同於唑類。
Figure 108138454-A0101-12-0009-2
依據表1，儘管艾曲波帕對大多數念珠菌屬(Candida)菌株未表現出高度抗真菌活性(MIC
Figure 108138454-A0101-12-0009-20
64mg/L)，但它確實對光滑念珠菌(Candida glabrata) 有抑制效果，其MIC約為0.25mg/L。此外，艾曲波帕對通常會引起動物和人類皮膚感染的紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)有抗真菌活性，其MIC約為0.5mg/L。然而，艾曲波帕對煙麴黴菌(Aspergillus fumigatus)或茄形鐮孢菌(Fusarium solani)沒有抗真菌效果。此外，艾曲波帕對隱球菌屬、光滑念珠菌及紅色毛癬菌的MFC皆大於64mg/L，說明艾曲波帕並非藉由真菌毒殺作用抑制該些真菌的生長。
實施例2 艾曲波帕對隱球菌生長的抑制作用
為檢視艾曲波帕對隱球菌生長的抑制作用，首先將新型隱球菌H99的細胞在30℃隔夜培養，再以二次水清洗二次。其後，將該細胞以RPMI 1640培養基稀釋至0.0005 OD600/mL，所得5mL細胞懸浮液以0.5、0.25、0.125、0.06、或0mg/L艾曲波帕處理並且在37℃、150rpm振盪培養4天。該細胞懸浮液的細胞密度用SpectraMax190微量盤檢測儀(SpectraMax190 microplate reader；Molecular Devices)每隔12小時測量，並以Prism 5.03軟體(GraphPad Software，聖地牙哥，加利福尼亞州，美國)繪製該細胞的生長動力學曲線。前述試驗重複三次，試驗結果表示為平均值±標準偏差。
圖1顯示新型隱球菌H99以不同濃度艾曲波帕處理後的生長動力學曲線。依據該圖，艾曲波帕以劑量依賴方式抑制新型隱球菌的生長。當施以0.25mg/L或0.5mg/L艾曲波帕，新型隱球菌在37℃培養96小時後顯出持平生長，說明艾曲波帕具有抑制隱球菌生長的活性。
為進一步測試艾曲波帕在不同溫度下的抑菌效果，對隱球菌進行紙片擴散易感性試驗。簡言之，在30℃隔夜培養新型隱球菌H99或次生格特隱球菌R265，再將100μl該培養物(OD600約為0.1)塗布於RPMI 1640瓊脂平板。其後，在複數個該瓊脂平板上各放置紙片(直徑為6mm)，各紙片添加10μg艾曲波帕(溶於5μL DMSO)或5μL DMSO(控制組)。該些瓊脂平板在25℃、30℃、或37℃培養48小時並拍照。
圖2A及圖2B分別為前述試驗中新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265所生長的瓊脂平板的照片。該些照片顯示瓊脂平板上的隱球菌菌落在加載艾曲波帕的紙片周圍消失。並且，相比在30℃或25℃下形成的抑菌圈(inhibition zone)，在37℃下可觀察到明顯較大的抑菌圈，說明艾曲波帕在人體溫度下表現出更強的抗隱球菌活性。
實施例3 艾曲波帕影響隱球菌之細胞超微結構
為檢視艾曲波帕對隱球菌細胞結構的影響，首先將新型隱球菌H99或次生格特隱球菌R265在37℃下培養於含有0.06或0mg/L艾曲波帕的RPMI 1640培養基中48小時，再利用掃描式電子顯微鏡(FEI Inspect S SEM，美國)觀察隱球菌的細胞形態。
圖3A及圖3B分別為新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265細胞在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的SEM照片。依據圖3A-3B，該二種隱球菌經過艾曲波帕處理後在細胞表面產生數個不完整的芽，但在未經艾曲波帕處理的隱球菌細胞沒有觀察到這種現象。此結果說明艾曲波帕能藉由影響隱球菌細胞正常結構(例如細胞膜或細胞壁)的發育而抑制其生長。
實施例4 艾曲波帕與FK506的協同抗隱球菌效果
兩性黴素B與5-氟胞嘧啶或氟康唑之組合經常用於治療隱球菌性腦膜炎。為檢驗艾曲波帕與現有抗真菌藥物或其他藥物之間的協同作用，對隱球菌進行棋盤式稀釋試驗。簡言之，將新型隱球菌H99或次生格特隱球菌R265的細胞在30℃隔夜培養，再以二次水清洗二次。其後，將該細胞以RPMI 1640培養基稀釋至103cfu/mL，所得細胞懸浮液依100μL/孔移入96孔盤。各孔細胞被施加自8mg/L至0.015mg/L二倍連續稀釋的艾曲波帕及自16mg/L至0.25mg/L二倍連續稀釋的一指定藥物(即氟康唑、兩性黴素B、FK506、或環孢菌素A)。該些不同處理之細胞在30℃培養48小時後，藉由測量在600nm的吸光值(即OD600)評估其生長。此試驗可用以計算分級抑菌濃度指數(FICI)：(藥物A的MIC組合/藥物A的MIC單一)+(藥物B的MIC組合/藥物B的MIC單一)。棋盤式稀釋試驗後，將該96孔盤中的細胞(3μl)轉移到無藥物的YPD瓊脂平板。該瓊脂平板於30℃培養48小時後予以拍照，以便評估細胞存活狀況。
圖4A及圖4B分別顯示新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265以艾曲波帕與FK506進行棋盤式稀釋試驗後的生長狀況；淺灰色表示真菌生長，黑色表示缺少真菌生長。下表2顯示不同藥物組合的FICI數值；FICI
Figure 108138454-A0101-12-0011-21
0.5表示協同 作用，FICI>4.0表示拮抗作用，FICI>0.5-4表示無交互作用。依據表2，艾曲波帕(ETP)與現有抗真菌藥物如氟康唑(FLC)、兩性黴素B(AMB)、或環孢菌素A(CsA)之間沒有協同作用，但如圖4A-4B所示，艾曲波帕與FK506之組合發揮協同抗隱球菌活性。表2顯示該ETP+FK506的組合對新型隱球菌H99的FICI為0.07，且對次生格特隱球菌R265的FICI為0.03。此結果說明艾曲波帕與FK506之組合使其各自可以在明顯更低的濃度產生抑制真菌生長的效果，因此，艾曲波帕與巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑之組合可用作抑制隱球菌生長的併用藥物。此試驗選用鈣調去磷酸酶抑制劑以測試與艾曲波帕的組合效果的理由在於，發明人發現艾曲波帕的抗真菌作用與鈣調去磷酸酶途徑相關(資料未顯示)。
圖4C及圖4D分別為得自圖4A及圖4B所示棋盤式稀釋試驗的隱球菌細胞在無藥下再培養48小時後的照片。依據圖4C-4D，該二種隱球菌在30℃培養48小時後仍然能夠生長，說明艾曲波帕與FK506之間的協同作用並未將抑真菌活性轉化為殺真菌活性。
Figure 108138454-A0101-12-0012-3
實施例5 艾曲波帕抑制新型隱球菌之生物膜形成
隱球菌生物膜包含隱球菌細胞及細胞外基質(extracellular matrix)，其存在能增加隱球菌對抗真菌製劑(如兩性黴素B)及宿主防禦機制的耐受性。為評估艾曲波帕是否影響隱球菌形成生物膜，利用XTT還原試驗(XTT reduction assay)測量新型隱球菌在37℃以艾曲波帕處理後的代謝活性。簡言之，將新型隱球菌H99的細胞在30℃隔夜培養於YPD培養基。該細胞以磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗二次後，再懸浮於含有或不含指定濃度之艾曲波帕的RPMI 1640培養基，所得細胞懸浮液(0.0005 OD600/mL)載入96孔盤並在37℃下培養24或48小時。作為對比，以類似方式將新型隱球菌H99培養於添加1mg/L兩性黴素B、4mg/l氟康唑、或僅DMSO(控制組)的RPMI 1640培養基。培養後細胞以PBS清洗三次再用於XTT還原試驗，測量甲
Figure 108138454-A0101-12-0013-22
(formazan)產物在492nm的吸光值。前述試驗重複三次，試驗結果表示為平均值±標準偏差。數據間差異在統計上的顯著性使用雙尾t檢定判定。
圖5A顯示新型隱球菌H99以最小抑菌濃度(MIC)之艾曲波帕(ETP)、兩性黴素B(AMB)、或氟康唑(FLC)處理24小時後的代謝活性，其值表示為相對於控制組細胞代謝活性的百分比；*及**分別表示相比控制組為P<0.05及P<0.01。依據圖5A，相比控制組，以0.125mg/L艾曲波帕處理的新型隱球菌的代謝活性下降超過70%。此外，在各自的最小抑菌濃度下，兩性黴素B或氟康唑對新型隱球菌生物膜代謝活性的抑制效果弱於艾曲波帕。
圖5B顯示新型隱球菌H99以二倍連續稀釋的艾曲波帕(4至0.015mg/L)、兩性黴素B(1mg/L)、或氟康唑(4mg/L)處理48小時後的代謝活性，該代謝活性程度以OD492表示；*表示相比控制組為P<0.05。依據圖5B，艾曲波帕以劑量依賴方式抑制新型隱球菌生物膜的形成。
實施例6 艾曲波帕減少隱球菌之莢膜形成
隱球菌的莢膜是附著於細胞壁外表面且主要包含多醣的構造，其存在能協助隱球菌抵抗宿主的免疫反應(如巨噬細胞的吞噬作用)及惡劣環境(如極端的酸性或鹼性、高度的二氧化碳水平、或鐵缺乏)。為檢驗艾曲波帕是否影響隱球菌的莢膜形成，首先將新型隱球菌H99或次生格特隱球菌R265的細胞在30℃隔夜培養於YPD培養基。該細胞以PBS清洗二次後，再懸浮於含有0.06或0mg/L艾曲波帕的RPMI 1640培養基，並在37℃下培養48小時。其後，該細胞加載於載玻片上並以印度墨水在室溫下進行對比染色(counterstain)。染色後細胞以顯微鏡觀察並拍照，同時，在不同處理的各組細胞中隨機選擇50個細胞以ImageJ軟體估計其莢膜尺寸，其定義為細胞壁與莢膜外緣之間的距離。前述實驗重複 三次，實驗結果表示為平均值±標準偏差。數據間差異在統計上的顯著性使用雙尾t檢定判定。
圖6A及圖6B分別為新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265在有或無艾曲波帕的情況下培養48小時後的顯微照片。圖6C顯示新型隱球菌H99及次生格特隱球菌R265細胞的莢膜尺寸；**表示相比無艾曲波帕處理者P<0.01。由圖1可知，0.06mg/L艾曲波帕不會影響隱球菌的生長動力學，即艾曲波帕的亞抑菌濃度約為0.06mg/L以下；然而，如圖6A-6C所示，相比無艾曲波帕處理的情況，以0.06mg/L艾曲波帕處理新型隱球菌H99或次生格特隱球菌R265會顯著減少其莢膜尺寸，說明艾曲波帕以有別於抑制隱球菌生長的機制干擾隱球菌的莢膜形成。
實施例7 艾曲波帕抑制新型隱球菌之黑色素生成
黑色素能保護隱球菌免受宿主防禦系統產生的有毒自由基(free radicals)的侵害，因此黑色素生成有助於隱球菌的致病性。為檢驗艾曲波帕是否影響隱球菌的黑色素生成，將5×104個新型隱球菌H99細胞在有或無艾曲波帕的情況下培養於含有或不含1mM L-多巴(L-DOPA)的基本培養基(簡稱MM)。該培養物所盛裝的錐形瓶包裹在錫箔中以防止L-DOPA自行聚合。該培養物在30℃下於液體MM培養基中振盪(150rpm)培養十天，再於固體MM培養基上於黑暗中培養四天。
圖7A係為新型隱球菌H99在含有或不含艾曲波帕(ETP)的液體培養基中培養十天後的照片；圖7B係為得自圖7A所示的新型隱球菌在含有或不含艾曲波帕的固體培養基中再培養四天後的照片。依據圖7A-7B，新型隱球菌的培養物及菌落在沒有艾曲波帕的情況下呈深棕色；相對地，在0.03mg/L(1/4 MIC)或0.06mg/L(1/2 MIC)艾曲波帕存在的情況下，新型隱球菌的黑色素生成減少而使培養物及菌落呈淺棕色，且該減少量隨艾曲波帕的濃度上升而增加，說明艾曲波帕對黑色素生成之抑制作用有劑量依賴性。
綜上所述，前述實驗資料顯示艾曲波帕是一種相對廣譜的抗真菌劑，其能夠抑制多種隱球菌菌株以及光滑念珠菌與紅色毛癬菌等其他真菌的生長。再者，艾曲波帕能抑制臨床及唑類抗藥性隱球菌菌株(例如表1所載新型隱球菌T1及新型隱球菌89-610)的生長，其MIC約為0.125mg/L，低於現有藥物氟康唑 及兩性黴素B的MIC，顯示艾曲波帕使用有別於唑類的抗隱球菌機制，故可用於發展替代唑類的抗真菌療法。此外，艾曲波帕與巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑之組合表現出抑制隱球菌生長的協同效果，故能減少該二種藥物用於抑制真菌時的必需用量。同時，艾曲波帕尚能抑制隱球菌的多種毒力因子的發展。因此，本發明提供了一種治療真菌感染、特別是治療隱球菌感染的新方法，包括施予一真菌感染或隱球菌感染的個體有效量的艾曲波帕，或有效量的艾曲波帕與巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑的組合。

Claims (10)

  1. 一種艾曲波帕(eltrombopag)用於製備抑制真菌生長之藥物之用途，其中該真菌係選自於由隱球菌、光滑念珠菌、及紅色毛癬菌所組成的群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該隱球菌係為新型隱球菌、格特隱球菌、或次生格特隱球菌。
  3. 一種艾曲波帕與一巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑用於製備抑制隱球菌生長之併用藥物之用途。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該隱球菌係為新型隱球菌、格特隱球菌、或次生格特隱球菌。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該巨環類鈣調去磷酸酶抑制劑係為他克莫司。
  6. 一種艾曲波帕用於製備抑制隱球菌毒力因子發展之藥物之用途。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該隱球菌係為新型隱球菌、格特隱球菌、或次生格特隱球菌。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該毒力因子發展係為生物膜形成。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該毒力因子發展係為莢膜形成。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該毒力因子發展係為黑色素生成。
TW108138454A 2019-10-24 2019-10-24 艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途 TWI712410B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108138454A TWI712410B (zh) 2019-10-24 2019-10-24 艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途
US16/714,867 US11160790B2 (en) 2019-10-24 2019-12-16 Method of inhibiting Cryptococcus growth using eltrombopag

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108138454A TWI712410B (zh) 2019-10-24 2019-10-24 艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI712410B true TWI712410B (zh) 2020-12-11
TW202116302A TW202116302A (zh) 2021-05-01

Family

ID=74669896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108138454A TWI712410B (zh) 2019-10-24 2019-10-24 艾曲波帕用於製備抗隱球菌藥物之用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11160790B2 (zh)
TW (1) TWI712410B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020000265A (es) * 2017-07-07 2020-07-22 Epicentrx Inc Composiciones para la administración parenteral de agentes terapéuticos.
US20190234933A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-01 Genadam Therapeutics, Inc. Compositions and assays

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Koehrer, S., Keating, M. & Wierda, W. Eltrombopag, a second-generation thrombopoietin receptor agonist, for chronic lymphocytic leukemia-associated ITP. Leukemia 24, 1096–1098 (2010). https://doi.org/10.1038/leu.2010.45 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202116302A (zh) 2021-05-01
US11160790B2 (en) 2021-11-02
US20210121443A1 (en) 2021-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rauseo et al. Hope on the horizon: novel fungal treatments in development
Boucher et al. Newer systemic antifungal agents: pharmacokinetics, safety and efficacy
Jarvis et al. Micafungin
Galgiani Fluconazole, a new antifungal agent
Pasqualotto et al. New and emerging treatments for fungal infections
Spampinato et al. Candida infections, causes, targets, and resistance mechanisms: traditional and alternative antifungal agents
Hoang Caspofungin acetate: an antifungal agent
Herbrecht et al. Efficacy of amphotericin B lipid complex in the treatment of invasive fungal infections in immunosuppressed paediatric patients
Nakajima et al. In vitro and in vivo antifungal activities of DU-6859a, a fluoroquinolone, in combination with amphotericin B and fluconazole against pathogenic fungi
Joseph et al. Micafungin: a new echinocandin antifungal
Gamal et al. Ibrexafungerp, a novel oral triterpenoid antifungal in development: overview of antifungal activity against Candida glabrata
TWI448285B (zh) 用以治療白黴菌症（ｍｕｃｏｒｍｙｃｏｓｉｓ）及其他真菌類疾病之組合物及方法
Shinde et al. Chloroquine sensitizes biofilms of Candida albicans to antifungal azoles
Ledoux et al. Isavuconazole: A new broad-spectrum azole. Part 2: Pharmacokinetics and clinical activity
Mei-Yu et al. Effect of loureirin A against Candida albicans biofilms
US20180256673A1 (en) Methods for treating fungal infections
Giacobbe et al. Recent advances and future perspectives in the pharmacological treatment of Candida auris infections
Herbrecht et al. Management of systemic fungal infections: alternatives to itraconazole
US20230364067A1 (en) Antifungal agents with enhanced activity in acidic ph
Hall et al. In vitro potency and fungicidal activity of CD101, a novel echinocandin, against recent clinical isolates of Candida spp.
TW464492B (en) Antifungal composition
Estes et al. Pharmacology and antifungal properties of anidulafungin, a new echinocandin
Bormann et al. Review of the pharmacology and clinical studies of micafungin
Jiang et al. In vitro and in vivo evaluation of the antifungal activity of fluoxetine combined with antifungals against Candida albicans biofilms and oral candidiasis
Carrillo-Muñoz et al. Current developments in anti-fungal agents