CN101501692A

CN101501692A - P53突变体的晶体结构及它们的用途

Info

Publication number: CN101501692A
Application number: CNA2007800297603A
Authority: CN
Inventors: 艾伦·弗史特; 安德里亚斯·卓尔格
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2006-08-10
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2009-08-05
Also published as: EP2050027A2; US20100130731A1; JP2010500543A; WO2008017863A2; GB2440736A; GB0615934D0; WO2008017863A3

Abstract

本发明涉及在β－夹心区的220、143或者270位具有突变的p53的晶体。所述结构可以用于基于计算机的药物设计以鉴定在β－夹心区内结合的配体，以便稳定所述蛋白。

Description

P53突变体的晶体结构及它们的用途

发明领域

本发明涉及肿瘤抑制蛋白p53变异体的晶体，它们的结构和它们的用途。

发明背景

肿瘤抑制蛋白p53是393个氨基酸的转录因子，其调节细胞周期，并在预防癌症发展中发挥关键作用。响应细胞应激诸如紫外线照射、缺氧和DNA损伤，p53诱导大量与G1和G2细胞周期阻滞和凋亡有关的基因的转录(1-3)。在大约50％的人类癌症中，由于p53基因的错义突变，p53失活(4，5)。

p53的多功能性反映在其结构的复杂性上。p53四聚体的每条链由几个结构域组成。存在良好定义的DNA结合和四聚体化结构域，以及高度变化的、大量无固定结构的区域(6-11)。大部分p53癌突变位于该蛋白的DNA结合核心结构域(4)。该结构域已经通过X-射线晶体衍射法(6)在与其同源DNA的复合物中进行了结构表征，并通过NMR(12)对溶液中的其游离形式进行了结构表征。它由2个反平行β-折叠的中心β-夹心组成，所述β-折叠作为DNA结合表面的基本支架。所述DNA结合表面由2个β-转角环(L2和L3)组成，所述β-转角环通过锌离子和环-片层-螺旋基序稳定。这些结构元件共同形成延展的DNA结合表面，所述DNA结合表面富含正电荷的氨基酸，并与各种p53响应元件特异性接触。人类癌症中突变最频繁的6个氨基酸残基位于或者接近于DNA结合表面(参见www-p53.iarc.fr中p53突变数据库的发布R10)(4)。根据这些残基是直接接触DNA还是在保持DNA结合表面的结构完整性方面起作用，它们被分为“接触”(Arg248，Arg273)或者“结构”(Arg175，Gly245，Arg249，Arg282)残基(6)。

越来越多的证据表明，在体温下只是近乎稳定的p53，已经衍变为高度动态的和固有的不稳定(12，22，35)，还对例如肿瘤抑制蛋白p16观察到也具有该特性(36)。

尿素变性研究显示，接触突变R273H对核心结构域的热力学稳定性没有影响，而结构突变实质上使蛋白去稳定，其范围从G245S的1kcal/mol和R249S的2kcal/mol直到R282W的超过3kcal/mol(13)。所述去稳定作用对这些突变体在细胞内的折叠状态有重要关联。因为野生型核心结构域只是近乎稳定，并且具有稍微高于体温的解链温度，所以在生理条件下高度不稳定的突变体诸如R282W主要是未折叠的，因此，不再有功能性(14)。

因为许多p53突变体是未折叠的，所以不可能产生这些突变体的蛋白晶体。为了克服这个问题，使用被称为“T-p53C”的p53的功能性热稳定合成变异体。该变异体具有取代M133L、V203A、N239Y和N268D。该变异体被用于引入癌症热点突变R273H和R249S，并通过X-射线晶体衍射法确定这两种突变体的结构(18)。这些结构研究确认了R273H是纯的DNA-接触突变，其中重要的DNA-接触丢失，但DNA-结合表面的整体结构是保守的。与此相反，R249S突变诱导L3环的实质构象变化，所述L3环直接参与通过Arg248的DNA结合，并形成DNA-结合形式中不同核心结构域之间界面的部分。此外，可以证明第二个位点的抑制基因突变H168R通过模拟野生型中Arg249的结构作用，以特异性方式恢复R249S的功能(18)。

但是，癌症相关的突变并不限于DNA-结合表面，在蛋白β-夹心区也有发现。DNA-结合表面之外最常见的突变是Y220C。它位于连接β-链S7和S8的转角起始处β-夹心的远端。Tyr220的苯基部分构成β-夹心的疏水核心部分，而羟基指向溶剂。

远离DNA-结合表面的其他突变包括V143A癌突变(位于β-链S3)和F270L。前者是温度敏感的p53突变体的典型实例。在体温下，该突变体是无活性和未折叠的，但它在低温下保留反式激活活性(15)。

最近，通过筛选综合错义突变文库，已经鉴定出大量温度敏感型突变体(16)。大部分突变集聚在β-夹心。定性NMR研究已经证明热点突变显示典型的局部结构变化(17)。

发明公开

本发明涉及p53突变体的结构，所述p53突变体在DNA-结合表面之外的β-夹心区具有变化。利用T-p53C，我们发现了导致p53改变以产生所述蛋白的有效结合腔的特定突变体的结构变化。这些腔提供用于稳定和恢复p53突变体的靶标。

一方面，我们发现Y220C突变造成p53的结构变化，这导致在β-夹心结构域的远端产生溶剂可及的缝隙。突变中的所述结构变化将预先存在于野生型中的两个较浅表面裂隙连接，在T-p53C-Y220C中形成延伸的长缝隙(残基109，145-157，202-204，219-223，228-230和257)。这种突变诱导的缝隙其最深处指向突变位点Cys220，因此提供了小分子药物的结合口袋，尤其是具有选择性针对所述腔的突变Y220C和/或残基的部分的小分子药物。

另一方面，我们发现位于β-夹心区疏水核心任一侧的残基的两个单独的突变-V143A和F270L-导致大的疏水腔的产生。尽管所述腔在各种情况下看起来都不会造成周围结构的塌陷，但空隙体积的增加导致蛋白稳定性的损失，这反映在这些突变体更低的解链温度。这些突变体的结构因此允许发现靶向的药物以鉴定可用于稳定由这些突变造成的腔的分子。

因此总的来说，本发明涉及p53突变体结构的提供以及它们在建模分子结构相互作用中的用途，例如具有该结构的有效和现有的药物化合物或者这类化合物的片段。

本发明的这些和其他方面以及实施方式在下文进行描述。

表格简述

表1(图1)显示T-p53C-Y220C结构的坐标数据。

表2(图2)显示T-p53C-V143A结构的坐标数据。

表3(图3)显示T-p53C-F270L结构的坐标数据。

表4显示本发明中结晶的序列。参照野生型人p53(SWISS PROTP04637)标示残基数。用粗体表示的残基是与野生型相比改变的残基。如本文使用的(除非明确相反的说明)，p53残基的编号参照表4显示的野生型编号，与序列表的编号相对。

表5显示数据收集和精化统计表。

表6显示尿素诱导的未折叠的p53核心结构域突变体的自由能变化。

表7显示突变诱导的内部腔的体积。

附图简述

图1显示表1。

图2显示表2。

图3显示表3。

图4显示与gadd45共有DNA(PDB ID码1TSR，分子B)结合的p53核心结构域的线框模型。用半透明的丝带和圆筒高亮显示二级结构元件。模型的顶部显示结合的共有DNA的两条链。用橙色显示在本工作和Joerger et al.2005中进行结构研究的癌突变位点的侧链。黑色球体显示超稳定的四元突变体M133L/V203A/N239Y/N268D(T-p53C)中突变位点的位置。“热点”突变区的残基，以及位于220、143和270的β-夹心区的残基被显示。

图5显示突变位点的立体视图，所述突变位点位于与T-p53C结构(PDB ID码1UOL，分子A)重叠的T-p53C-Y220C(分子A)中β-夹心周围。用球体显示与T-p53C-Y220C中Cys220接近的数个水分子，所述水分子填充突变产生的裂隙。

图6A显示与T-p53C(PDB ID码1UOL，分子A)重叠的T-p53C-V143A结构的立体视图。位于T-p53C中Val143侧链半径以内的β-夹心的疏水核心内的全部残基都被显示。图6B是与T-p53C(PDBID码1UOL，分子A)重叠的Tp53C-F270L结构的立体视图。位于T-p53C中Phe270侧链6-

半径以内的全部残基都被显示。

序列简述

SEQ ID NO：1是蛋白T-p53C-Y220C的序列。

SEQ ID NO：2是蛋白T-p53C-V143A的序列。

SEQ ID NO：3是蛋白T-p53C-F270L的序列。

发明详述

A.蛋白晶体。

本发明提供T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白的晶体。这些蛋白可以按照所附实施例的描述产生。

本发明的晶体可以是T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白与配体的脱辅基晶体或者共晶体。因此在另一方面，本发明提供T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白和配体的共晶体。

所述配体可以是针对其稳定蛋白的能力进行筛选的化合物。

可以通过共结晶或者浸泡获得这类共晶体。

在更具体的实施方式中，本发明提供T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白的晶体，每个晶体都具有空间群P2₁2₁2₁。任选地这些晶体可以是所述蛋白与配体的共晶体。

T-p53C-Y220C晶体的晶胞尺寸可以是

β＝90°，所有尺寸上晶胞变异性为5％。

T-p53C-V143A晶体的晶胞尺寸为

β＝90°，所有尺寸上晶胞变异性为5％。

T-p53C-F270L蛋白晶体的晶胞尺寸为

β＝90°，所有尺寸上晶胞变异性为5％。

更普遍的，所述晶体的晶胞尺寸为

β＝90°，所有尺寸上晶胞变异性为5％，优选2.5％，优选1％(其中根据所述各个范围的中点计算变异性)。

结晶蛋白可以具有表4所示的序列。

就T-p53C-Y220C来说，其包括对应于p53的残基94-312的残基。但是，因为第一个可解析的残基是96，最后一个是291，所以可以使用表4序列的截短型。尤其是，所述序列可以被截短为N末端的直到10个，优选直到5个，例如直到2个氨基酸。所述序列可以被截短为C末端的直到25个，优选直到21个，优选直到15个，例如直到10个，例如直到5个氨基酸。上述N-端和C-端截短型的任意组合可以用于产生本发明T-p53C-Y220C的晶体。这类组合的实例是蛋白T-p53C-Y220C1_04-287；T-p53C-Y220C_104-291；T-p53C-Y220C_104-302；T-p53C-Y220C_104-307；T-p53C-Y220C_104-312；T-p53C-Y220C_99-287；T-p53C-Y220C_99-291；T-p53C-Y220C_99-302；T-p53C-Y220C_99-307；T-p53C-Y220C_99-312；T-p53C-Y220C_96-287；T-p53C-Y220C_96-291；T-p53C-Y220C_96-302；T-p53C-Y220C_96-307和T-p53C-Y220C_96-312(其中T-p53C-Y220C_x-y代表从p53残基x到p53残基y的表4T-p53C-Y220C蛋白的片段)。

还有可能T-p53C-Y220C蛋白可以包括短的N-端或者C-端延伸，例如天然存在的p53序列和/或异源序列的延伸，例如与蛋白如短标记的表达或者纯化相关的延伸。这类序列可以独立的向表4序列的N-端或者C-端或者两端添加直到5个如直到10个氨基酸残基。

因此本文提到的T-p53C-Y220C蛋白包含包括至少残基104-287(例如直到至少94-312，并任选地如上述延伸)并且能够形成晶体的蛋白。所述晶体可以具有空间群P2₁2₁2₁，并且采用该形式的晶体在所附实施例所示T-p53C-Y220C晶体的各个方向将具有5％内的晶胞尺寸。

就T-p53C-V143A来说，其包括对应于p53的残基94-312的残基。但是，因为第一个可解析的残基是96，最后一个是290，所以可以使用表4序列的截短型。尤其是，所述序列可以被截短为N末端的直到10个，优选直到5个，例如直到2个氨基酸。所述序列可以被截短为C末端的直到25个，优选直到21个，优选直到15个，例如直到10个，例如直到5个氨基酸。上述N-端和C-端截短型的任意组合可以用于产生本发明T-p53C-V143A的晶体。这类组合的实例是蛋白T-p53C-V143A_104-287；T-p53C-V143A_104-290；T-p53C-V143A_104-302；T-p53C-V143A_104-307；T-p53C-V143A_104-312；T-p53C-V143A_99-287；T-p53C-V143A_99-290；T-p53C-V143A_99-302；T-p53C-V143A_99-307；T-p53C-V143A_99-312；T-p53C-V143A_96-287；T-p53C-V143A_96-290；T-p53C-V143A_96-302；T-p53C-V143A_96-307和T-p53C-V143A_96-312(其中T-p53C-V143A_x-y代表从p53残基x到p53残基y的表4T-p53C-V143A蛋白的片段)。

还有可能T-p53C-V143A蛋白可以包括短的N-端或者C-端延伸，例如天然存在的p53序列和/或异源序列的延伸，例如与蛋白诸如短标记的表达或者纯化相关的延伸。这类序列可以独立的向表4序列的N-端或者C-端或者两端添加直到5个如直到10个氨基酸残基。

因此本文提到的T-p53C-V143A蛋白包含包括至少残基104-287(例如直到至少94-312，并任选地如上述延伸)并且能够形成晶体的蛋白。所述晶体可以具有空间群P2₁2₁2₁，并且采用该形式的晶体在所附实施例所示T-p53C-V143A晶体的各个方向将具有5％内的晶胞尺寸。

就T-p53C-F270L来说，其包括对应于p53的残基94-312的残基。但是，因为第一个可解析的残基是96，最后一个是290，所以可以使用表4序列的截短型。尤其是，所述序列可以被截短为N末端的直到10个，优选直到5个，例如直到2个氨基酸。所述序列可以被截短为C末端的直到25个，优选直到21个，优选直到15个，例如直到10个，例如直到5个氨基酸。上述N-端和C-端截短型的任意组合可以用于产生本发明T-p53C-F270L的晶体。这类组合的实例是蛋白T-p53C-F270L_104-287；T-p53C-F270L_104-290；T-p53C-F270L_104-302；T-p53C-F270L_104-307；T-p53C-F270L_104-312；T-p53C-F270L_99-287；T-p53C-F270L_99-290；T-p53C-F270L_99-302；T-p53C-F270L_99-307；T-p53C-F270L_99-312；T-p53C-F270L_96-287；T-p53C-F270L_96-290；T-p53C-F270L_96-302；T-p53C-F270L_96-307和T-p53C-F270L_96-312(其中T-p53C-F270L_x-y代表从p53残基x到p53残基y的表4T-p53C-F270L蛋白的片段)。

还有可能T-p53C-F270L蛋白可以包括短的N-端或者C-端延伸，例如天然存在的p53序列和/或异源序列的延伸，例如与蛋白诸如短标记的表达或者纯化相关的延伸。这类序列可以独立的向表4序列的N-端或者C-端或者两端添加直到5个诸如直到10个氨基酸残基。

因此本文提到的T-p53C-F270L蛋白包含包括至少残基104-287(例如直到至少94-312，并任选地如上述延伸)并且能够形成晶体的蛋白。所述晶体可以具有空间群P2₁2₁2₁，并且采用该形式的晶体在所附实施例所示T-p53C-F270L晶体的各个方向将具有5％内的晶胞尺寸。

B.晶体坐标。

在其他方面，本发明还提供具有来自表1三维原子坐标的T-p53C-Y220C蛋白的晶体；具有来自表2三维原子坐标的T-p53C-V143A蛋白的晶体；具有来自表3三维原子坐标的T-p53C-F270L蛋白的晶体。

由表1-3原子坐标确定的结构的有利特征在于它们具有高于大约

的分辨率。

表1-3分别给出T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A和T-p53C-F270L蛋白的原子坐标数据。在表格中第三栏显示原子，第四栏显示残基类型，第五栏显示链标识，第六栏显示残基数字，第七、第八和第九栏分别是所讨论原子的X、Y、Z坐标，第十栏显示原子的占位，第十一栏显示原子的温度因子，第十二栏显示链标识符。

表1-3以内部一致的形式表示。例如(除表1的第一个残基以外)，列出各个氨基酸残基的原子坐标使得骨架氮原子是第一个，继之以C-α骨架碳原子(被称为CA)，然后是侧链残基(根据一个标准惯例进行命名)，最后是蛋白骨架的碳和氧。本领域其他技术人员可以使用或者优选其他的文件格式(诸如与EBI大分子结构数据库(Hinxton，UK)的格式一致的格式)，其可以包括这些原子的不同排序，或者侧链残基的不同命名。但是，显而易见使用不同的文件格式表示或者处理所述表格的坐标也属于本发明的范围。

表1-3包括T-p53C变异蛋白的两个蛋白单位。所述表格还包括大量水分子(被称为“WAT”)和锌离子。在两个构象中观察到大量残基，例如182和277位的Cys残基，所以提供每条链的各个构象。

在本文描述的利用本发明晶体结构的本发明实施方式中，应理解本发明提到的T-p53C结构和它们的用途应当被解释为任一构像中任一单独蛋白链的结构或者用途。两个单位的使用不被排除，但不是实施本发明所需的。同样，本发明提到的T-p53C结构不包括溶剂或者离子坐标，尽管这些的使用不被排除，其中这些可能有利于本发明的特定应用或者是为它们所必需。

通常通过均方根差(r.m.s.d.)表示和测量蛋白结构的相似性，所述均方根差测量两组原子间空间定位的差异。r.m.s.d.测量等同原子在最佳重叠之后它们之间的距离。可以计算所有原子、残基骨架原子(即蛋白氨基酸残基的氮-碳-碳骨架原子)、仅主链原子(即蛋白氨基酸残基的氮-碳-氧-碳骨架原子)、仅侧链原子或者更通常仅C-α原子的r.m.s.d.。出于本发明的目的，可以利用任意一项下文所列的方法，计算上述中任一种的r.m.s.d.。

优选的，参照C-α原子计算rmsd，条件是使用挑选的坐标，这些包括至少这类原子的大约5％，优选至少大约10％。当挑选的坐标没有包括所述的至少大约5％时，可以参照全部4个骨架原子计算rmsd，条件是这些包括所选坐标的至少大约10％，优选至少大约20％，更优选至少大约30％。当挑选的坐标包括90％或者更多的侧链原子时，可以参照所选全部坐标计算rmsd。

因此表1-3提供以埃(Angstroms)为单位的原子位置测量值，具有3个小数位。坐标是一套确定三维形状的相对位置，但技术人员将理解具有不同原点和/或轴的完全不同套的坐标能够确定类似或者相同的形状。此外，技术人员将理解通过改变所述结构上原子的相对原子位置使残基骨架原子(即蛋白氨基酸残基的氮-碳-碳骨架原子)的均方根差低于2.0

，优选低于1.5

，优选低于1.0，如低于0.75

，更优选低于0.5

，更优选低于0.3

，如低于0.25

，或者低于0.2

，和最优选低于0.1

，当与表1提供的残基骨架原子重叠时，就本发明T-p53C蛋白结构的结构特性和基于结构分析的有效性以及其与分子结构的相互作用而言，通常将产生与表1结构基本上相同的结构。

同样地，技术人员将理解改变所述表格上水分子的数目和/或位置通常不会影响用于T-p53C蛋白-相互作用结构的基于结构分析的结构有效性。因此作为本发明方面的本文所述目的，其属于本发明的范围，如果：表1-3中任一的坐标被调换到不同的原点和/或轴；当与表1-3提供的残基骨架原子的坐标重叠时，改变所述结构上原子的相对原子位置使得残基骨架原子的均方根差低于1.5

，优选低于1.0，如低于0.75

，更优选低于0.5

，更优选低于0.3

，如低于0.25

，或者低于0.2

，和最优选低于0.1

；和/或改变水分子的数目和/或位置。

因此本文提到的表1-3中任一的坐标数据、其用途等等包括坐标数据，其中所述表格的一个或者多个单独值以所述方式变化，应被理解为表示这种含义，除非有相反的明确规定。

确定rmsd的程序包括MNYFIT(称为COMPOSER的程序汇编的部分，Sutcliffe，M.J.，Haneef，I.，Carney，D.and Blundell，T.L.(1987)Protein Engineering(蛋白质工程)，1，377-384)，MAPS(Lu，G. AnApproach for Multiple Alignment of Protein Structures(蛋白结构多重比对的方法)(1998，以原稿形式在http://bioinfol.mbfys.lu.se/TOP/maps.html)。

通常要考虑C-α原子，因此使用诸如LSQKAB(CollaborativeComputational Project 4(协作计算计划4).The CCP4 Suite：Programsfor Protein Crystallography(CCP4套件：用于蛋白晶体学的程序)，ActaCrystallographica，D50，(1994)，760-763)、QUANTA(Jones et al.，ActaCrystallography A47(1991)，110-119，可购自Accelerys，San Diego，CA)、Insight(可购自Accelerys，San Diego，CA)，(可购自Tripos，Inc.，St Louis)、O(Jones et al.，Acta Crystallographica，A47，(1991)，110-119)以及其他坐标拟合程序计算rmsd，，。

在诸如程序LSQKAB和O中，使用者可以限定用于计算而配对的两种蛋白的残基。可选择地，可以通过产生两种蛋白的序列比对来确定残基的配对，在下文中将更详细的描述用于序列比对的程序。然后根据所述比对和计算的r.m.s.d.值可以重叠原子坐标。程序Sequoia(C.M.Bruns，I.Hubatsch，M.Ridderstr

m，B.Mannervik，and J.A.Tainer(1999)Human Glutathione Transferase A4-4 Crystal Structures andMutagenesis Reveal the Basis of High Catalytic Efficiency with ToxicLipid Peroxidation Products(人谷胱甘肽转移酶A4-4晶体结构和诱变揭示毒性脂质过氧化产物高催化效率的基础)，Journal of MolecularBiology 288(3)：427-439)进行同源蛋白序列的比对以及同源蛋白原子坐标的重叠。比对后，可以利用上文详述的程序计算r.m.s.d.。对于相同或者高度相同的序列，可以人工或者如上所述自动完成蛋白的结构比对。另一种方法将不考虑序列而产生蛋白原子坐标的重叠。

它在比较显著不同套的坐标以计算只基于C-α原子的rmsd值时更为标准。当分析侧链移动以计算所有原子的rmsd时尤其有用，这可以利用LSQKAB以及其他程序完成。

本领域技术人员将理解在本发明的许多应用中，并不是必须利用表1-3的全部坐标，而仅仅是它们的一部分。例如，如下所述，在建模本发明T-p53C-蛋白的分子结构的方法中，可以使用如本文所述的挑选的坐标。

“挑选的坐标”旨在表示例如T-p53C蛋白结构的至少5个，优选至少10个，更优选至少50个，甚至更优选至少100个，例如至少500或者至少1000个原子。同样地，本文描述的本发明其他应用，包括同源建模和结构解析，以及坐标的数据存储和计算机辅助处理，可以利用表1-3中任一坐标(即挑选的坐标)的全部或者一部分。

一方面，表1中挑选的坐标可以包括来自残基109、145-157、202-204、219-223、228-230和257中至少一种的至少一个原子。某些方面，可能希望包括Cys 220的至少一个原子。在所述方面，表1中挑选的坐标可以包括：

(i) 来自残基109、145-157、202-204、219-223、228-230和257中至少一个残基的原子的至少一个坐标，任选地来自所述残基的至少两个原子，其中至少一个原子是Cys 220的原子；

(ii) 来自残基Arg156、Arg158、Arg202、Glu204、Pro219和Glu258中至少一个或者多个残基的至少一个原子，任选地与Cys220的至少一个原子组合；或者

(iii)来自残基Trp146、Val147、Thr150和Pro223中至少一个或者多个残基的至少一个原子，任选地与Cys220组合。

优选地，所述挑选的坐标包括来自残基的上述组(i)-(iii)的至少2个，例如至少3，4，5，6，7，8或者9个残基的原子。

另一方面，表2中挑选的坐标可以包括来自组111，113，124，133，141-143，145，157，232，234，236，255和270中至少一个残基的至少一个原子，优选组113，124，133，141-143，234，236和270中至少一个残基。所述组可以包括143的一个或多个原子，或者可以是其他残基的其他原子的组合。

其他方面，表3中挑选的坐标可以包括来自组111，113，133，143，159，234，236，253，255，270和272中至少一个残基的至少一个原子。所述组可以包括270的一个或多个原子，或者可以是其他残基的其他原子的组合。

优选地，所述挑选的坐标包括上述残基组的至少2个，例如至少3，4，5，6，7，8或者9个残基的原子。在一个实施方式中，当挑选的坐标的数目是n(其中n是从2到任意上述组中的氨基酸总数的数目)时，这些可以来自于使用的所选组的至少n种不同的氨基酸。挑选的残基可以是侧链或者主链原子，或者其任意组合。

此外，上文提及的原子组(与通过本文描述的突变产生的腔有关)的鉴定，使得可以鉴定、设计或者修饰在所述腔中结合的配体和/或针对这些残基的结构相邻物的配体。

C.计算机系统。

另一方面，本发明提供系统，尤其是计算机系统，所述系统包含表1-3中任一的坐标数据，所述数据限定本发明T-p53C变异蛋白的三维结构或者至少其挑选的坐标。

例如所述计算机系统可以包括：(i)计算机可读的数据存储媒介，包括计算机可读数据编码的数据存储物质；(ii)处理所述电脑可读数据的存储指令的工作存储器；和(iii)与所述工作存储器和用于处理所述计算机可读数据的所述计算机可读数据存储媒介偶联的中央处理器，并由此产生结构和/或进行合理的药物设计，包括基于计算机的化合物筛选，所述化合物与本发明p53结构相互作用的能力是未知的。所述计算机系统还可以包括与所述中央处理器偶联的显示器，用于显示所述结构。

本发明还提供包含上文提及的靶蛋白原子坐标数据的这类系统，其中基于表1数据提供的起始数据或者其挑选的坐标，根据本文描述的本发明方法产生这类数据。

这类数据可用于各种目的，包括产生结构以分析p53蛋白的作用机制和/或进行合理的化合物药物设计，所述化合物与p53蛋白，尤其是p53 Y220C、p53 V143A或者p53 F270L蛋白相互作用，例如是这类蛋白的潜在稳定剂的化合物。

另一方面，本发明提供包含表1-3中任一的坐标数据的计算机可读介质，所述数据限定本发明T-p53C变异蛋白的三维结构或者至少其挑选的坐标。

如本文使用的，“计算机可读介质”是指任意媒介(medium)或者介质(media)，其可以通过计算机直接读出和存取。这类介质包括，但不限于：磁存储介质如软盘、硬盘存储器介质和磁带；光存储介质如光盘或者CD-ROM；电存储介质如RAM和ROM；和这些种类的杂合如磁/光存储介质。

通过提供这类计算机可读介质，通常可以使用本发明的原子坐标数据建立本发明的T-p53C-变异蛋白或者其挑选的坐标的模型。例如，RASMOL(Sayle et al.，TIBS，Vol.20，(1995)，374)是公众可获得的计算机软件包，其允许存取和分析用于结构确定和/或合理药物设计的原子坐标数据。

如本文使用的，“计算机系统”是指用于分析本发明原子坐标数据的硬件设备、软件设备和数据存储设备。本发明基于计算机系统的最小硬件设备包括中央处理器(CPU)、输入设备、输出设备和数据存储设备。理想地提供监视器以可视化结构数据。数据存储设备可以是RAM或者存取本发明计算机可读介质的设备。这类系统的实例是购自硅谷图形公司(Silicon Graphics Incorporated)的微型计算机工作站和基于Unix运行的太阳微系统(Sun Microsystems)、Windows NT或者IBMOS/2操作系统。

本发明的另一方面提供方法，所述方法提供用于产生化合物的结构和/或对其进行优化的数据，所述化合物与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白相互作用，所述方法包括：

(i)建立与包含计算机可读数据的远程设备的通信，所述数据包括来自表1的T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过

的Cα原子均方根差范围内变化；和

(ii)从所述远程设备接收所述计算机可读数据。

因此远程设备可以包括如本发明前述方面之一的计算机系统或者计算机可读介质。所述设备可以位于不同的国家或者地区，从那里可以接收计算机可读数据。

所述通信可以通过因特网，内部网，电子邮件等等，通过电线或者无线设备传输，诸如通过地上的无线电或者通过卫星。通常所述通信实质上是电子的，但通信途径的一些或者全部可以是光学的，诸如通过光纤。

一旦从所述设备接收到数据，本发明还可以包括在本文描述的本发明建模系统中使用所述数据的步骤。

D.本发明结构的用途。

我们的结构观察对于新的治疗策略具有重要意义，所述治疗策略旨在用稳定p53的小分子药物恢复p53的功能。基于我们的结构研究，β-夹心突变体，诸如V143A和F270L，代表了通过通用小分子药物恢复的有希望的靶标，因为在这种情况下稳定蛋白足以恢复生理条件下的野生型样活性。Y220C不仅具有通过被通用野生型结合化合物恢复的潜能，而且也是特异性药物的靶标，所述药物可以结合到由缺失形成的缝隙。所述缝隙区域是尤其有吸引力的，因为它远离蛋白的功能位点和界面。

通常核心结构域的β-夹心区中的癌突变频率要低于DNA-结合区中的突变频率。但是，总的来说，它们代表癌相关错义突变的重要部分。实际上，报道的p53核心结构域中癌突变的大约三分之一位于形成DNA-结合表面的结构元件(环L2、L3和LSH-基序)之外。T-p53C-V143A和T-p53C-F270L的结构阐明了两种癌相关β-夹心突变的结构影响。Val143和Phe270位于β-夹心的反向链上。它们的侧链相对，形成β-夹心疏水核心的整体部分(图4)。V143A突变具有特别的意义，因为其在酵母和哺乳动物系统中对于许多反应元件的结合均具有明确证实的温度敏感性能(15，24)。最近的研究利用基于酵母的功能分析，从综合错义突变文库分离出温度敏感的p53突变体(16)。大部分突变聚集在蛋白的β-折叠区域，取代主要是从大的疏水性残基变为更小的疏水性残基(在这项研究中没有检测到V143A，但检测到残基270的突变(F270I和F270C))。T-p53C-V143A和T-p53C-F270L的结构提供用于理解许多p53突变的温度敏感性能的分子基础。V143A和F270L突变均在β-夹心的疏水核心中产生腔，但不造成周围组织的塌陷。尽管所述核心结构域的整体结构是完全保守的，但空隙体积的产生造成3.7和4.1 kcal/mol的高能量消耗。这些结构和能量变化与对T4-溶菌酶和芽孢杆菌RNA酶的工作一致，所述工作显示对蛋白疏水核心中“大-到-小”取代的特定类型的能量反应与生成腔的体积以及近邻的结构改变有关(25-27)。有趣地是，还有报道称Y220C突变造成温度敏感性能(24)。此外，这些性能完全符合本发明的结构数据。所述突变在β-夹心的远端产生溶剂可及的裂隙。Tyr220芳香族侧链的去除在β-夹心的疏水核心周围留下能量不倾向于堆积相互作用或者部分溶剂接触的数种残基，导致热力学稳定性的损失。但是，所述结构变化是高度定位的，远离DNA-结合表面。

β-夹心突变体的常见结构特征似乎在于突变时只存在较小结构破坏，尽管对蛋白热力学稳定性的影响通常要比DNA-结合表面的热点突变更严重。与锌-结合区和环-片层-螺旋基序相比更加致密和坚固的β-夹心结构骨架使其对突变诱导的结构变化不太敏感，尤其是对“大-到-小”取代。但是，表面区特别是DNA-结合表面中结构变化的缺失对于功能非常关键。对于全部癌突变都预期有温度敏感性，所述癌突变使核心结构域不稳定，但不损害表面互补性，所述表面互补性对于p53功能非常重要，不仅对于结合特异性启动子序列，而且对于与其他蛋白的完整亚组的相互作用以及对于四聚体全长p53中的正确结构域组织(11，28-31)。

因此，可以采用数种方式使用根据本发明获得的晶体结构进行药物设计，这将在下文中更详细的进行描述。在具体实施方式中，所述结构可以用于鉴定化合物，所述化合物以稳定口袋的方式在突变p53的Y220C口袋中相互作用。这种稳定可以恢复具有Y220C突变的个体中p53的功能，这样的话肿瘤细胞中的p53功能可以被恢复。类似地，表2和3的结构可以用于鉴定稳定V143和F270L突变产生的腔的其他化合物。稳定所述腔的化合物在稳定p53 β-夹心区突变中具有广泛应用。

可以通过共结晶、浸泡或者在结合口袋中计算机对接药物来获得关于这类化合物或者潜在化合物结合的信息。这将指导对化学结构的特异性修饰，所述化学结构被设计成介导或者调控药物与蛋白的相互作用。这类修饰可以被设计以提高其治疗和/或预防作用。

(i)获得和分析晶体复合物。

在一种方法中，可以通过实验确定与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结合的化合物的结构。这将为分析与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结合的化合物提供起点，因此为本领域技术人员提供了详细洞察特定化合物如何与野生型p53-Y220C、p53C-V143A或者p53C-F270蛋白相互作用以及它的作用机制。

关于如上所述基于结构的药物设计的许多技术和方法在某一阶段依赖于X射线分析以鉴定配体-蛋白复合物中配体的结合位置。实现上述目的的常用方式是对复合物进行X-射线晶体衍射，产生差异傅立叶电子密度图，并将电子密度的特定图谱与配体建立联系。但是，为了产生图谱(例如由Blundell等人在Protein Crystallography(蛋白晶体学)，Academic Press，New York，London and San Francisco，(1976)中所解释的)，必须事先知道蛋白三维结构(或者至少蛋白结构因子)。因此，T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结构的确定还能够产生蛋白-化合物复合物的差异傅立叶电子密度图，确定药物的结合位置，从而极大的帮助合理的药物设计步骤。

因此，本发明提供确定与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结合的化合物的结构的方法，所述方法包括：

提供本发明的T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白的晶体；

将晶体与所述化合物浸泡；和

通过分别使用表1-3的坐标数据或者其挑选的坐标，确定T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白化合物复合物的结构。

可选择地，T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白和化合物可以被共结晶。因此本发明提供确定与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结合的化合物的结构的方法，所述方法包括：

将蛋白与一种或多种化合物混合，结晶蛋白-一种或多种化合物复合物；和通过分别参考表1-3的坐标数据或者其挑选的坐标确定所述蛋白-一种或多种化合物复合物的结构。

这类结构的分析可以使用(i)来自所述复合物的X射线结晶衍射数据和(ii)T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白的三维结构，或者至少其挑选的坐标，以产生所述复合物的差异傅立叶电子密度图，分别由表1-3的原子坐标数据或者其挑选的坐标确定其三维结构。然后可以分析差异傅立叶电子密度图。

因此，这类复合物可以被结晶并利用X-射线衍射法进行分析，例如根据Greer等描述的方法，J.of Medicinal Chemistry，Vol.37，(1994)，1035-1054，可以基于浸泡或者共结晶蛋白的X射线衍射图和未复合蛋白的解析结构计算差异傅立叶电子密度图。然后可以分析这些图谱，例如确定特定化合物是否以及在哪与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结合和/或改变所述蛋白的构象。

可以利用程序诸如来自CCP4计算包的那些程序(CollaborativeComputational Project 4.The CCP4 Suite：Programs for ProteinCrystallography，Acta Crystallographica，D50，(1994)，760-763.)计算电子密度图。对于图谱可视化和建模，可以使用程序如“O”(Jones et al.，ActaCrystallographica，A47，(1991)，110-119)。

上面提及的全部复合物都可以利用公知的X射线衍射技术进行研究，并利用计算机软件如CNX(Brunger et al.，Current Opinion inStructural Biology，Vol.8，Issue 5，1998年10月，606-611，并可购自Accelrys，San Diego，CA)，以及按照Blundell等，(1976)和Methods inEnzymology(酶学方法)，vol.114 & 115，H.W. Wyckoff et al.，eds.，Academic Press(1985)的描述，将1.0到

分辨率的X射线数据精化到大约0.30或者更低的R值。

(ii)计算机(In silico)分析和设计

尽管本发明将有利于确定包括T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白和化合物(与所述蛋白相互作用)的实际晶体结构，现有的计算机技术为产生这类晶体以及产生和分析衍射数据的需求提供强大的选择。因此，本发明尤其优选的方面涉及用于分析和开发与本发明T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白结构相互作用的化合物的“计算机”方法。

T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270蛋白三维结构的确定提供了关于所述蛋白结合位点的重要信息，尤其是当作出与类似蛋白的比较时。

如所附实施例所述，在Y220C改变造成的β-夹心区中具有显著差异，导致与野生型蛋白相比该区域一些残基的显著位移。

然后可以将所述信息用于p53配体的合理设计和修饰，例如通过鉴定结合位点的可能结合配体的计算机技术，通过使连接-片段方法用于药物设计，以及利用X射线晶体学分析使结合配体(例如包括上文提及的那些配体)的鉴定和定位称为可能。这些技术将在下文中更详细的进行描述。

因此作为T-p53C-Y220C三维结构确定的结果，用于合理药物设计的更纯粹的计算机技术也可用于设计结构，所述结构与载有Y220C变化的p53的相互作用被更好的了解(这些技术的概述参见例如Walters et al.(Drug Discovery Today (今日药物发现)，Vol.3，No.4，(1998)，160-178；Abagyan，R.；Totrov，M.Curr. Opin.Chem.Biol.2001，5，375-382)。同样地，T-p53C-V143A和T-p53C-F270L结构可以用于设计配体，所述配体靶向于腔的残基，或者是由这些突变产生的直接结构相邻的残基。

例如，可以使用自动化配体-受体对接程序(例如由Jones et al.，Current Opinion in Biotechnology，Vol.6，(1995)，652-656和Halperin，I.；Ma，B.；Wolfson，H.；Nussinov，R.Proteins 2002，47，409-443中所讨论的)，其需要关于靶受体原子坐标的准确信息。

因此，本发明提供用于分析分子结构与p53结构相互作用的基于计算机的方法，其包括：

提供表1的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

其中所述挑选的坐标包括来自残基109，145-157，202-204，219-223，228-230和257的原子的至少一个坐标。

实际上，希望能够建模如表1坐标或者其挑选的坐标(其代表结合口袋)确定的T-p53C-Y220C结构的足够数目的原子，例如上文B部分限定的优选残基的原子数目或原子。因此在本发明的这个方面，所述挑选的坐标可以包括上述残基的一些或者全部坐标。

提供表2的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

其中所述挑选的坐标包括来自残基113，124，133，141-143，234，236和270的原子的至少一个坐标。

实际上，希望能够建模如表2坐标或者其挑选的坐标(其代表结合口袋)确定的T-p53C-V143A结构足够数目的原子，例如上文B部分限定的优选残基的原子数目和原子。因此在本发明的这个方面，所述挑选的坐标可以包括上述残基的一些或者全部坐标。

提供表3的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过1.5

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

其中所述挑选的坐标包括来自残基111，113，133，143，159，234，236，253，255，270和272的原子的至少一个坐标。

实际上，希望能够建模如表3坐标或者其挑选的坐标(其代表结合口袋)确定的T-p53C-F270L结构足够数目的原子，例如上文B部分限定的优选残基的原子数目和原子。因此在本发明的这个方面，所述挑选的坐标可以包括上述残基的一些或者全部坐标。

在拟合分子结构后，本领域技术人员可以设法使用分子建模来确定所述结构彼此相互作用(例如通过氢键键合，其他非共价相互作用，或者通过反应以提供所述结构各部分之间的共价键)的程度。

本领域技术人员可以使用计算机建模方法改变一种或者多种结构，以便设计以不同方式与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构相互作用的新结构。

新设计的结构可以被合成，它们与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的相互作用可以被确定或者预测以便获悉新设计的结构如何与所述T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构结合。该步骤可以被重复以便进一步改变其与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的相互作用。

此外，一旦确定被拟合的结构以稳定本发明T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的方式拟合，通过计算机辅助方法或者通过配体的合成和测试，所述结构可以用于拟合其他p53蛋白，包括野生型序列的突变体。

“拟合”表示通过自动或者半自动装置，确定分子结构的至少一个原子与本发明T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的至少一个原子之间的至少一种相互作用，并计算所述相互作用稳定的程度。相互作用包括由疏水性的、极性的、带电荷的、空间的、π-π相互作用等等引起的吸引和排斥。在本文中还将进一步描述用于拟合的各种基于计算机的方法。

更具体地，一种或多种化合物与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的相互作用可以通过使用诸如GOLD(Jones etal.，J.Mol.Biol.，245，43-53(1995)，Jones et al.，J.Mol.Biol.，267，727-748(1997))、GRAMM(Vakser，I.A.，Proteins，Suppl.，1：226-230(1997))、DOCK(Kuntz et al，J.Mol.Biol.1982，161，269-288，Makino etal，J.Comput.Chem.1997，18，1812-1825)、AUTODOCK(Goodsell et al，Proteins 1990，8，195-202，Morris et al， J.Comput.Chem.1998，19，1639-1662.)、FlexX、(Rarey et al，J.Mol.Biol.1996，261，470-489)或者ICM(Abagyan et al，J.Comput.Chem.1994，15，488-506)的对接程序应用计算机建模来检测。所述步骤可以包括化合物与T-p53C-Y220C结构的计算机拟合以确定所述化合物的形状和化学结构是如何很好地与所述结构结合。

可以利用诸如在先前部分描述的那些计算机系统进行本文描述的各种基于计算机的分析方法。通常，使用的计算机系统被配置为显示或者传输表1、2或者3的结构或者其挑选的坐标与分子结构的模型，以便显示上述两者的一种或者多种相互作用。各种显示格式是本领域已知的，可以由本领域普通技术人员根据各种因素包括诸如被测定的相互作用的性质来挑选。

同样可以实现T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270活性位点结构的计算机辅助的人工检测。诸如GRID(Goodford，J.Med.Chem.，28，(1985)，849-857)(确定具有各种官能团的分子和蛋白表面之间的可能相互作用位点的程序)的程序也可用于分析活性位点以预测，例如，将改变化合物或者蛋白稳定性的修饰类型。

然后就可以获得关于化合物与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构结合的详细结构信息，并根据所述信息可以调整所述化合物的结构或者功能，诸如改变其与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的相互作用。根据需要可以重复以及反复重复上述步骤。

在本发明中使用的分子结构通常是正在进行药物研发的化合物。通常这类化合物是有机分子，其分子量通常从大约100到2000Da，更优选从大约100到1000Da。这类化合物包括肽及其衍生物。原则上，正在药学领域进行开发的任意化合物都可以在本发明中使用，以便有利于其开发或者允许进一步的合理药物设计以提高其性能。

在另一个实施方式中，本发明提供修饰化合物结构的方法，以便改变其与T-p53C-Y220C的相互作用，所述方法包括：

将起始化合物与本发明T-p53C-Y220C结构的配体-结合区的至少一个氨基酸残基的一个或者多个坐标拟合；

改变所述起始化合物结构以便增强或者减弱其与配体-结合区的相互作用；

其中所述配体-结合区被定义为包括残基109，145-157，202-204，219-223，228-230和257的至少一个，且优选超过一个。残基的优选数目和组合如上文所定义。

本领域技术人员将理解结构的修饰通常将利用计算机进行，能够预测所述被修饰的结构如何与p53或者其突变体相互作用。一旦这类化合物被研发，则其可以如上所述被合成和测试。

(iii)片段连接和延长。

本发明晶体结构的提供还允许基于片段连接或者片段延长方法，开发与T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270的结合口袋区相互作用的化合物(例如作用于稳定所述蛋白)。

例如，可以通过X-射线晶体衍射法确定蛋白结合口袋中一个或者多个分子片段的结合。分子片段通常是分子量为100至200Da的化合物。因此这为利用基于结构的方法优化相互作用的药物化学提供起点。所述片段可以被合并到模板或者用作“延长(growing out)”抑制剂进入该蛋白其他口袋的的起点。所述片段可以位于T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的结合口袋，然后“延长”以填充可用空间，探索参与分子识别的静电、范德华或者氢-键相互作用。因此利用基于结构的迭代化学合成可以快速提高初始结合较弱片段的功效。

在片段延长方法的一个或者多个阶段，所述化合物可以被合成并在生物系统中测试其活性。这可用于指导所述片段的进一步延长。

当鉴定出两个片段-结合区时，连接片段方法可以基于尝试直接连接两个片段，或者以如上所述的方式延长一个或者两个片段，以便获得具有所需性质的更大连接结构。

当确定两种或更多种配体的结合位点时，它们可以被连接形成潜在的先导化合物，所述先导化合物还可以利用例如Greer等的迭代技巧进一步精化。虚拟的连接-片段方法可以参见Verlinde et al.，J.ofComputer-Aided Molecular Design，6，(1992)，131-147，NMR和X射线方法可以参见Shuker et al.，Science，274，(1996)，1531-1534和Stout etal.，Structure，6，(1998)，839-848。通过确定本发明提供的结构使利用这些方法设计p53-结合配体成为可能。

(iv)p53-配体的分析

另一方面，当已经根据本发明获得分子结构时，本发明还可以包括将所述结构与p53结构拟合的步骤，所述p53结构不包括作为设计根据的结构。例如，这类结构可以是T-p53C(PDB ID码1UOL)，T-p53C-R273H(PDB ID码2BIM)或者野生型p53(PDB ID码1TSR)。

可以进行这种类型的比较以确定结构是否可以在β-夹心区中与非突变的残基结合，这样的话所述分子的稳定性有可能被增强。

如果必要或者需要，可以根据与其他p53结构的拟合以及与本发明p53突变结构的再拟合对结构进行修饰。根据需要可以重复该步骤以进一步确定p53-结合结构。

当使用本发明提供计算机设计的结构(其结合如上所述突变的T-p53C结构)时，在本发明的另一方面这类结构可以被合成或者获得并采用许多方法进行检测。

因此一方面，在本文描述的分析或者设计分子结构后，本发明提供一种或者多种下列步骤：

(a)获得或者合成具有所述分子结构的化合物；和

将所述化合物与p53蛋白接触以确定所述化合物与所述p53蛋白相互作用的能力；或者

(b)获得或者合成具有所述分子结构的化合物；

形成p53蛋白和所述化合物的复合物；和

通过X-射线晶体衍射法分析所述复合物以确定所述化合物与所述p53蛋白相互作用的能力；或者

(c)获得或者合成具有所述分子结构的化合物；和

确定或者预测所述化合物如何与p53结构相互作用；和

修饰所述化合物的结构以改变其与p53的相互作用。

可以使用的p53蛋白可以是野生型、稳定的变异体或者突变体，包括p53Y220C、T-p53C-Y220C、p53V143A、T-p53C-V143A、p53F270L或者T-p53C-F270L蛋白中的任意一种。

在确定p53蛋白与这类化合物相互作用的能力时，可以使用大量不同的分析方法。例如，可以在细胞中表达p53，然后比较所述化合物存在或者缺失条件下所述细胞的凋亡速率。当所述化合物稳定p53时，这可以反映为促凋亡效果。在另一个实施方式中，可以将化合物与p53接触以便确定其稳定性，例如通过尿素诱导的未折叠的自由能变化来测量。

此外，因为通过本发明方法鉴定的化合物将稳定本文鉴定的腔，所以这类化合物可以用于稳定存在于β-夹心区的p53突变体，这样的话所述突变体可以与所述化合物共结晶。

因此，在一方面，本发明提供一种方法，包括：

将p53 β-夹心突变蛋白与化合物混合；

将蛋白-化合物复合物结晶；和

通过使用表1至3中任一数据，任选地在不超过1.5

的Cα原子均方根差内变化，或者其挑选的坐标确定所述复合物的结构。

可以在将配体结构与本发明表1-3中任一表的p53突变体的结构拟合后进行所述方法。

在优选的方面，所述β-夹心突变体是在220、143或者270位之一突变的p53蛋白。所述突变体可以是p53 Y200C、p53 V143A或者p53 F270L。当所述突变位于220、143或者270位时，理想地在先前章节的方法中分别使用表1、2和3的数据。

(v)本发明的化合物。

当通过将起始化合物与本发明的T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构拟合并据此预测改变的作用速率(包括对p53更高或者更低的亲和力)的修饰化合物来开发潜在的修饰化合物时，本发明还包括以下步骤：合成所述被修饰的化合物，并在体内或者体外生物系统中对其进行检测，以确定其活性和/或其作用速率，例如改变p53的稳定性或者p53突变被恢复的能力。这可以通过例如在细胞中表达突变的p53，并在所述化合物存在或者缺失的条件下检测细胞凋亡的速率来确定。

另一方面，本发明包括通过如上所述的本发明方法鉴定的化合物。

在这类化合物被鉴定后，它可以被制造和/或在制剂中使用，即诸如药剂、药学上的组合物或者药品的组合物的制造或者制备。这些可以给予个体。

因此，本发明延伸至各个方面，不仅是本发明提供的化合物，而且涉及包括所述化合物的药学上的组合物、药物、药品或者其他组合物。所述组合物可用于治疗(其可以包括预防性治疗)疾病，尤其是癌症。这类治疗可以包括给予患者这类组合物，例如用于疾病的治疗；使用这类抑制剂制备用于给药的组合物，例如用于疾病的治疗；和制备药学上的组合物的方法，包括将这类抑制剂与药学上可接受的赋形剂、媒介或者载体以及任选地其他成分混合。

因此本发明的其他方面提供制备药剂、药学上的组合物或者药品的方法，所述方法包括(a)通过本文公开的本发明其他方面中任一方面的方法鉴定或者修饰化合物；(b)最优化所述分子结构；和(c)制备包含所述被优化化合物的药物、药学上的组合物或者药品。

本发明的上述步骤可以被重复，因为被修饰的化合物自身可以是进一步化合物设计的基础。

“优化结构”表示例如添加分子骨架，增加或者改变官能团，或者将所述分子与其他分子连接(例如利用片段连接方法)，这样的话所述调节分子的化学结构被改变，而其初始调节功能仍被保持或者被增强。通常这类优化在进行药物研制计划时进行，以增强先导化合物的效力，提高其药学上可接受性，增加其化学稳定性等等。

修饰将是本领域有经验的药物化学家已知的那些常规修饰，包括，例如，包含与本发明T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270结构的氨基酸侧链基团相互作用的残基的基团的取代或者去除。例如，取代可以包括基团的添加或者去除以减少或者增加试验化合物中基团的电荷，用带相反电荷的基团替换带电基团，或者用亲水基替换疏水基或者反过来。应了解这些仅仅是药物化学家在开发新药物化合物时考虑的取代类型的实例，根据起始化合物的性质及其活性，还可以做出其他修饰。

可以将组合物配制为适于任何合适的给药途径和方式。药学上可接受的载体或者稀释剂包括那些在制剂中使用的、适用于口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或者肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内，真皮内，鞘内和硬膜外)给药的载体或稀释剂。通常所述制剂可以存在于单位剂型中，并且可以采用药学领域公知的任意方法制备。

对于固体组合物来说，常用的无毒固相载体包括，例如，药用级别的甘露醇，乳糖，纤维素，纤维素衍生物，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等可以被使用。可以通过将如上所述的活性化合物以及任选地药物佐剂在载体(诸如，水，葡萄糖的盐水溶液，甘油，乙醇等等)中溶解、分散等从而形成溶液或者悬液，来制备液态的药学上可给药的组合物。如果需要，欲给药的药学上的组合物还可以包含诸如润湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂等等的少量的无毒辅助剂，例如，醋酸钠，脱水山梨醇单月桂酸酯，三乙醇胺醋酸钠，脱水山梨醇单月桂酸酯，油酸三乙醇胺酯，等等。制备这类剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的，或者显而易见的；例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，第15版，1975。

利用以下实施例对本发明进行说明：

实施例

诱变和蛋白纯化

按照先前的描述(18)，通过诱变、表达和纯化制备T-p53C突变体T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A和T-p53C-F270L(分别为SEQ IDNOs：1-3)。在最终纯化步骤(凝胶过滤)后，将突变蛋白浓缩到6-7mg/ml，快速冷冻并在液氮中保存。

尿素变性

通过Hamilton Microlab分配器利用尿素、缓冲液和蛋白的储液制备用于尿素变性实验的样品，使其在25mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2，150mM KCl和5mM DTT以及浓度增加的尿素中包含1μM蛋白。在测量前，所述样品在10℃孵育14小时。在配备Waters 2700样品管理器的Perkin-Elmer LS50B荧光分光计上，在300-400nm范围内记录用280nm激发的p53核心结构域的内源荧光光谱，并通过实验室软件进行控制。按照先前的描述(39)进行数据分析。

结晶和结构确定

全部晶体在17℃利用座滴蒸气扩散法生长。按照对T-p53C描述的条件(19)生长晶体。在所有情况下，必须采用引晶技术(seedingtechniques)提高晶体质量。利用20％ PEG200或者20％甘油作为冷冻保护剂的母液，晶体在液氮中快速冷冻。利用1.488

的波长，在Synchrotron Radiation Source(同步辐射源)Daresbury的光束线14.1上100K收集T-p53C-V143A的X射线数据集。利用1.284

的波长在光束线10.1上收集T-p53C-Y220C和T-Tp53C-F270L的数据集。利用Mosflm(40)和Scala(41)进行数据处理。全部晶体属于空间群P212121，并与从Tp53C和T-p53C-R273H获得的空间群同晶型(18，19)。晶胞尺寸符合0.6％以内。利用CNS(42)进行结构解析和精化。在利用T-p53C(PDB ID码1UOL)或者T-p53C-R273H(PDB ID码2BIM)的任一的结构作为起始模型进行第一轮刚体精化后，通过利用CNS的精化和利用MAIN的人工建模的反复循环对所述结构精化(43)。利用CNS内应用的喷水(waterpick)选项将水分子添加到所述结构。使用15-3.5

的衍射数据和T-p53C链A(PDB ID码1UOL)作为搜索模型，利用程序CNS通过分子替换解析结构。旋转和平移搜索以不对称单位给出4个分子的确定解。后续的精化按如上所述进行。精化统计值显示于表5。

结构分析

除非另有说明，突变结构的详细说明是基于特定突变体的分子A与T-p53C的分子A的比较。二级结构元件的编号和对与DNA的复合物中野生型结构的报道(6)相同。利用

的探针半径通过CNS计算溶剂可及表面积。特定残基的溶剂可及百分比被定义为亲代蛋白的溶剂可及表面积除以延伸Ala-X-Ala三肽的溶剂可及面积(44)。利用下列参数通过程序VOIDOO(45)计算内部腔的体积：初始网格间距0.295

，VDW生长因子1.1，原子补偿(fattening)因子1.1，和网格收缩系数0.9。通过利用连续的精细网格(finer grids)对腔体积精化，直至达到趋同(趋同标准0.1)。因为基于网格方法的结果可能依赖于分子相对于网格的方向，所以每项计算采用所述分子随机方向的拷贝重复9次。尝试不同的探针大小。1.4

的探针半径模拟水分子的大小。更小的探针大小更好的描绘腔的形状。因此，计算的体积将随着探针大小的降低而增加。但是采用更小的探针大小可能导致特定腔漏入相邻腔或者溶剂中，所述方法将变得对分子的方向更加敏感。因此我们利用1.2

和1.4

的探针大小。利用结晶建模程序O(46)目测检查腔。利用MOLSCRIPT(47)和RASTER3D(48)绘制结构图。

表5：数据收集和精化统计表

^a括号里的值表示最高分辨率。

^bR_merge＝∑(I_h，i-<I_h>)/∑I_h，i

^c数目包括可选的构象。

^dR_cryst和R_free＝∑||F_obs|-|F_calc||/∑|F_obs|，其中R_free针对随机选择的5％振幅计算，并不用于精化。

表6.尿素诱导的未折叠的p53核心结构域突变体的自由能变化。

(kcal/mol)代表T-p53C或者野生型中由突变引起的尿素诱导的未折叠的自由能变化，被分别定义为：

和

在10℃的25mM磷酸钠，pH 7.2，150mM KCl，5mM DTT中收集数据。

^b野生型突变的数据来自(14)。

^cF270C使野生型核心结构域不稳定4.5kcal/mol(14)。

表7.突变-诱导的内部腔的体积

^a利用程序VOIDOO采用不同的探针大小(1.2-

和1.4-

半径)计算腔体积。给出的数字是突变诱导腔(由探针占据的体积)的平均大小，根据所述分子的10个不同方向计算。括号中给出标准偏差。

^b在两种突变体中，用1.2

的探针半径计算的腔基本上是增大的，因为漏入T-p53C中已有的更小的腔。在T-p53C-V143A中，突变位点的大腔与两个已有的更小的腔合并。更小腔的大部分事先存在于T-p53C中，接近Val143的Cγ1原子。在T-p53C-F270L中，所述腔包括3个已有的更小的腔。

Y220C在β-夹心周围诱导次优堆积

Y220C是DNA-结合表面之外最常见的癌突变(参见www-p53.iarc.fr中p53突变数据库的发布R10)，对核心结构域的稳定性具有很高的失稳作用。它位于连接β-链S7和S8的转角起始处β-夹心的远端(图4)。Tyr220的苯基部分形成β-夹心疏水核心的一部分，而羟基指向溶剂。T-p53C-Y220C的晶体结构显示，Y220C突变产生溶剂可及的裂隙(被确定位置的水分子填充)，但保留完整的核心结构域的整体结构(图5)。Cys220大概占据野生型中Tyr220等同原子的位置。相邻残基的结构响应与它们在结构中位置有关。位于β-夹心核心的相邻疏水性侧链的位置没有显著改变(Leu145，Val157和Leu257)。但是突变导致疏水性相互作用的损失以及这些疏水核心残基的次优堆积。在野生型中被完全包埋的Leu145的侧链在T-p53CY220C中变得部分溶剂可及。Pro151周围富集刚性脯氨酸的S3/S4转角的构象(其在野生型中针对Tyr220侧链堆积)也基本上未受到影响，并显示与T-p53C非常类似的温度因素模式。最大的结构变化发现于Pro222的S7/S8转角自身。但是整个结构都不存在大于0.9

的Cα-位移。

V143A和F270L是产生腔的突变

V143A是温度敏感型p53突变体的典型实例(15)。突变位点位于β-夹心的疏水核心(图4)。总的来说，Tp53C和T-p53C-V143A的结构实际上是相同的，突变时只存在小的结构运动(图6A)。两种结构都可以0.12

的均方根差与等同链的Cα-原子重叠。在T-p53C-V143A中，Val143两个甲基的截短产生疏水性的腔，其具有未填充水的的

的溶剂可及体积(表7)。几乎没有结构响应，因此在产生所述能量不利的腔时没有周围结构的塌陷。突变的残基只是近乎向新产生的腔移动，在突变位点的直接环境中单个原子的最大位移是0.3

。所述腔内衬Leu111，Phe113，Leu133，Tyr234，Ile255和Phe270的疏水性侧链。T-p53C-V143A中所述能量不利腔的产生导致蛋白的热力学稳定性降低3.7 kcal/mol。

T-p53C-V143A中蛋白原子的平均B因子是，其显著高于从T-p53C结构观察到的。考虑到两种结构都是以类似的分辨率进行解析，在实质相同的条件下利用同形晶体生长，这反映了T-p53C-V143A中蛋白链的更高总活动性。对骨架原子归一化的平均结晶B因子的分析显示β-链S3上残基143-145(包括突变位点)的相对活动性的显著增加。观察到内衬腔的其他结构元件中残基相对活动性的变化不是那么显著。

F270L癌突变与V143A突变一样影响相同的疏水核心，我们假定这种突变对p53核心结构域的结构和稳定性具有相同的影响。这被T-p53C-F270L的结构确认，所述结构显示对突变的结构响应与对V143A基本相同。所述突变产生内部腔，但不影响蛋白的整体结构。此外，所述突变结构与T-p53C的结构完全重叠(对于等同链的Cα原子的均方根差＝0.09

)。由F270L突变产生的内衬于腔的侧链构象基本上与T-p53C相同(图6B)。位于突变位点的6-

半径内的最大原子位移是0.5

。因为Leu270-Cγ相对于Phe270-γ的不同杂交(sp3对sp2)以及由此导致的键角差异，亮氨酸侧链必须采取与T-p53C中苯丙氨酸相应原子不同的方式。作为X1转动10°的结果，Cγ和Cδ2原子稍微脱离苯丙氨酸的原有环平面，而Cδ1原子指向远离该平面，并针对Phe113、Tyr126、Leu133和Val272的侧链堆积。由F270L突变产生的内部腔稍大于由V143A产生的腔(表7)。它是高度疏水性的，因为理论上可以与包埋的水分子接触的29个内衬原子中的27个是碳(

探针半径)。这与以下观察一致，即在该腔中没有检测到包埋的水分子。

上述说明中提及的全部出版物和专利均在此通过引用并入。本发明描述的各种改进和变化对本领域技术人员来说是显而易见的，并不脱离本发明的范围和精神。尽管本发明针对特别优选的实施方式进行了描述，但应理解所要求的本发明不应过度限于这类特定的实施方式。

表4：

p53 Y220C(SEQ ID NO：1)：

94 SER SER SER VAL PRO SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER

107 TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER GLY THR ALA

120 LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS

133 LEU PHE CYS GLN LEU ALALYS THR CYS PRO VAL GLN LEU

146 TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG

159 ALA MET ALA ILE TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLU

172 VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU ARG CYS SER ASP

185 SER ASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG VAL

198 GLU GLY ASN LEU ARG ALA GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN

211 THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO CYS GLU PRO PRO

224 GLU VAL GLY SER ASP CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR

237 MET CYS TYR SER SER CYS MET GLY GLY MET ASN ARG ARG

250 PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER SER GLY

263 ASN LEU LEU GLY ARG ASP SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS

276 ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN

289 LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO

302 GLY SER THR LYS ARG ALA LEU PRO ASN ASN THR

T-p53C-V143A(SEQ ID NO：2)：

94 SER SER SER VAL PRO SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER

107 TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER GLY THR ALA

120 LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS

133 LEU PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO ALA GLN LEU

146 TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG

159 ALA MET ALA ILE TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLU

172 VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU ARG CYS SER ASP

185 SER ASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG VAL

198 GLU GLY ASN LEU ARG ALA GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN

211 THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO Tyr GLU PRO PRO

224 GLU VAL GLY SER ASP CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR

237 MET CYS TYR SER SER CYS MET GLY GLY MET ASN ARG ARG

250 PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER SER GLY

263 ASN LEU LEU GLY ARG ASP SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS

276 ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN

289 LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO

302 GLY SER THR LYS ARG ALA LEU PRO ASN ASN THR

T-p53C-F270L(SEQ ID NO：3)：

94 SER SER SER VAL PRO SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER

107 TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER GLY THR ALA

120 LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS

133 LEU PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO VAL GLN LEU

146 TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG

159 ALA MET ALA ILE TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLU

172 VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU ARG CYS SER ASP

185 SERASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG VAL

198 GLU GLY ASN LEU ARG ALA GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN

211 THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO Tyr GLU PRO PRO

224 GLU VAL GLY SER ASP CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR

237 MET CYS TYR SER SER CYS MET GLY GLY MET ASN ARG ARG

250 PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER SER GLY

263 ASN LEU LEU GLY ARG ASP SER LEU GLU VAL ARG VAL CYS

276 ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN

289 LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO

302 GLY SER THR LYS ARG ALA LEU PRO ASN ASN THR

参考文献

1.Vogelstein，B.，Lane，D.，and Levine，A.J.(2000)Nature 408，307-310

2.Ryan，K.M.，Phillips，A.C.，and Vousden，K.H.(2001)Curr.Opin.Cell Biol.13，332-337

3.Vousden，K.H.，and Lu，X.(2002)Nat.Rev.Cancer 2，594-604

4.Olivier，M.，Eeles，R.，Hollstein，M.，Khan，M.A.，Harris，C.C.，andHainaut，P.(2002)Hum Mutat 19，607-614

5.Beroud，C.，and Soussi，T.(2003)Hum Mutat 21，176-181

6.Cho，Y.，Gorina，S.，Jeffrey，P.D.，and Pavletich，N.P.(1994)Science265，346-355

7.Clore，G.M.，Ernst，J.，Clubb，R.，Omichinski，J.G.，Kennedy，W.M.，Sakaguchi，K.，Appella，E.，and Gronenborn，A.M.(1995)Nat Struct Biol2，321-333

8.Jeffrey，P.D.，Gorina，S.，and Pavletich，N.P.(1995)Science 267，1498-1502

9.Bell，S.，Klein，C.，Muller，L.，Hansen，S.，and Buchner，J.(2002)J MolBiol 322，917-927

10.Dawson，R.，Muller，L.，Dehner，A.，Klein，C.，Kessler，H.，andBuchner，J.(2003)J Mol Biol 332，1131-1141

11.Veprintsev，D.B.，Freund，S.M.，Andreeva，A.，Rutledge，S.E.，Tidow，H.，Canadillas，J.M.，Blair，C.M.，and Fersht，A.R.(2006)ProcNatl Acad Sci U S A 103，2115-2119

12.Canadillas，J.M.，Tidow，H.，Freund，S.M.，Rutherford，T.J.，Ang，H.C.，and Fersht，A.R.(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103，2109-2114

13.Bullock，A.N.，and Fersht，A.R.(2001)Nat.Rev.Cancer 1，68-76

14.Bullock，A.N.，Henckel，J.，and Fersht，A.R.(2000)Oncogene 19，1245-1256

15.Zhang，W.，Guo，X.Y.，Hu，G.Y.，Liu，W.B.，Shay，J.W.，andDeisseroth，A.B.(1994)EMBO J.13，2535-2544

16.Shiraishi，K.，Kato，S.，Han，S.Y.，Liu，W.，Otsuka，K.，Sakayori，M.，Ishida，T.，Takeda，M.，Kanamaru，R.，Ohuchi，N.，and Ishioka，C.(2004)J Biol Chem 279，348-355

17.Wong，K.B.，DeDecker，B.S.，Freund，S.M.，Proctor，M.R.，Bycroft，M.，and Fersht，A.R.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8438-8442

18.Joerger，A.C.，Ang，H.C.，Veprintsev，D.B.，Blair，C.M.，and Fersht，A.R.(2005)J Biol Chem 280，16030-16037

19.Joerger，A.C.，Allen，M.D.，and Fersht，A.R.(2004)J.Biol.Chem.279，1291-1296

22.Pan，Y.，Ma，B.，Levine，A.J.，and Nussinov，R.(2006)Biochemistry45，3925-3933

24.Di Como，C.J.，and Prives，C.(1998)Oncogene 16，2527-2539

25.Eriksson，A.E.，Baase，W.A.，Zhang，X.J.，Heinz，D.W.，Blaber，M.，Baldwin，E.P.，and Matthews，B.W.(1992)Science 255，178-183

26.Buckle，A.M.，Cramer，P.，and Fersht，A.R.(1996)Biochemistry 35，4298-4305

27.Xu，J.，Baase，W.A.，Baldwin，E.，and Matthews，B.W.(1998)Protein Sci 7，158-177

28.Derbyshire，D.J.，Basu，B.P.，Serpell，L.C.，Joo，W.S.，Date，T.，Iwabuchi，K.，and Doherty，A.J.(2002)EMBO J.21，3863-3872

29.Joo，W.S.，Jeffrey，P.D.，Cantor，S.B.，Finnin，M.S.，Livingston，D.M.，and Pavletich，N.P.(2002)Genes Dev.16，583-593

30.Gorina，S.，and Pavletich，N.P.(1996)Science 274，1001-1005

31.Friedler，A.，Veprintsev，D.B.，Rutherford，T.，von Glos，K.I.，andFersht，A.R.(2004)J.Biol.Chem.

35.Huyen，Y.，Jeffrey，P.D.，Derry，W.B.，Rothman，J.H.，Pavletich，N.P.，Stavridi，E.S.，and Halazonetis，T.D.(2004)Structure 12，1237-1243

36.Tang，K.S.，Guralnick，B.J.，Wang，W.K.，Fersht，A.R.，and Itzhaki，L.S.(1999)J Mol Biol 285，1869-1886

39.Bullock，A.N.，Henckel，J.，DeDecker，B.S.，Johnson，C.M.，Nikolova，P.V.，Proctor，M.R.，Lane，D.P.，and Fersht，A.R.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，14338-14342

40.Leslie，A.G.W.(1992)Joint CCP4 and ESF-EACMB Newsletter onProtein Crystallography Vol.26，Daresbury Laboratory，Warrington，UK

41.Collaborative Computational Project，N.(1994)Acta Crystallogr.D50，760-763

42.Brünger，A.T.，Adams，P.D.，Clore，G.M.，DeLano，W.L.，Gros，P.，Grosse-Kunstleve，R.W.，Jiang，J.-S.，Kuszewski，J.，Nilges，M.，Pannu，N.S.，Read，R.J.，Rice，L.M.，Simonson，T.，and Warren，G.L.(1998)Acta Crystallogr.D 54，905-921

43.Turk，D.(1992)Weiterentwicklung eines Programms fürMolekülgrafik und Elektrondichte-Manipulation und seine Anwendungauf verschiedene Protein-

Ph.D.thesis，Technische

München，Germany

44.Lee，B.，and Richards，F.M.(1971)J Mol Biol 55，379-400

45.Kleywegt，G.J.，and Jones，T.A.(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50，178-185

46.Jones，T.A.，Zou，J.-Y.，Cowan，S.W.，and Kjeldgaard，M.(1991)Acta Crystallogr.A 47，110-119

47.Kraulis，P.J.(1991)J.Appl.Crystallogr.24，946-950

48.Merritt，E.A.，and Bacon，D.J.(1997)Methods Enzymol.277，505-524

Claims

1.用于分析分子结构与p53结构相互作用的基于计算机的方法，所述方法包括：

提供表1的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过2.0

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

2.如权利要求1所述的方法，其中所述挑选的坐标包括来自Arg156，Arg158，Arg202，Glu204，Pro219和Glu258中至少一个残基的至少一个原子，其任选地与Cys220的至少一个原子组合。

3.如权利要求1或者2所述的方法，其中所述挑选的坐标包括来自至少一个或者多个残基Trp146，Val147，Thr150和Pro223的至少一个原子，其任选地与Cys220组合。

4.用于分析分子结构与p53结构相互作用的基于计算机的方法，所述方法包括：

提供表2的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过1.5

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

5.用于分析分子结构与p53结构相互作用的基于计算机的方法，所述方法包括：

提供表3的p53结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过1.5

的Cα原子均方根差内变化；

提供用于拟合所述p53结构或者其挑选的坐标的分子结构；和

将所述分子结构与所述p53结构拟合；

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将所述结构与野生型或者热稳定的p53结构拟合。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

获得或者合成具有所述分子结构的化合物；和

将所述化合物与p53蛋白接触以确定所述化合物与所述p53蛋白相互作用的能力。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

获得或者合成具有所述分子结构的化合物；

形成p53蛋白和所述化合物的复合物；和

通过X-射线晶体衍射法分析所述复合物以确定所述化合物与所述p53蛋白相互作用的能力。

9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

获得或者合成具有所述分子结构的化合物；和

确定或者预测所述化合物如何与p53蛋白相互作用；和

修饰所述化合物的结构以改变其与p53的相互作用。

10.如权利要求7、8或者9所述的方法，其中所述p53蛋白是野生型p53蛋白或者p53Y220C、p53V143A或者p53F270L蛋白。

11.化合物，具有利用前述权利要求中任一项所述方法鉴定的修饰的结构。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述挑选的坐标具有至少5，10，50，100，500或者1000个原子。

13.确定与p53β-夹心突变蛋白结合的化合物的结构的方法，所述方法包括：

将所述突变蛋白与化合物混合；

将蛋白-化合物复合物结晶；和

通过使用表1至3中任一数据，任选地在不超过1.5

14.如权利要求13所述的方法，其中所述p53β-夹心突变蛋白是p53Y220C、p53V143A或者p53F270L。

15.为产生与p53Y220C突变蛋白相互作用的化合物的结构和/或对其进行优化提供数据的方法，所述方法包括：

(i)建立与包含计算机可读数据的远程设备的通信，所述数据包括来自表1的p53Y220C突变结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过2.0

的Cα原子均方根差范围内变化；和

(ii)从所述远程设备接收所述计算机可读数据，

16.为产生与p53V143A突变蛋白相互作用的化合物的结构和/或对其进行优化提供数据的方法，所述方法包括：

(i)建立与包含计算机可读数据的远程设备的通信，所述数据包括来自表2的p53V143A突变结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过1.5的Cα原子均方根差范围内变化；和

(ii)从所述远程设备接收所述计算机可读数据，

其中所述挑选的坐标包括来自残基111，113，124，133，141-143，145，157，232，234，236，255和270的原子的至少一个坐标。

17.为产生与p53F270L突变蛋白相互作用的化合物的结构和/或对其进行优化提供数据的方法，所述方法包括：

(i)建立与包含计算机可读数据的远程设备的通信，所述数据包括来自表3的p53F270L突变结构或者其挑选的坐标，任选地在不超过1.5

的Cα原子均方根差范围内变化；和

(ii)从所述远程设备接收所述计算机可读数据，

18.如权利要求15、16或者17所述的方法，其还包括用所述数据进行权利要求1-12中任一所述的方法。

19.T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白的晶体。

20.T-p53C-Y220C、T-p53C-V143A或者T-p53C-F270L蛋白和配体的共晶体。

21.权利要求19或者20中任一项所述的晶体或者共晶体，其中所述p53-Y220C蛋白包括SEQ ID NO：1的残基104-287，所述T-p53C-V143A蛋白包括SEQ ID NO：2的残基104-287，或者所述T-p53C-F270L蛋白包括SEQ ID NO：3的残基104-287。

22.如权利要求19-21中任一项所述的晶体或者共晶体，具有空间群P2₁2₁2₁。

23.如权利要求22所述的晶体或者共晶体，其晶胞尺寸为a＝64.50-64.71

b＝71.04-71.11

c＝104.90-105

β＝90°，在所有尺寸上，晶胞变异性为5％。