CN101495863A - 一种细胞观测实验方法及实验用芯片与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞观测实验方法及实验采用的芯片和装置。方法是：(1)图像摄取装置通过显微镜动态获取载物台上芯片内微通道中细胞的位置、流体流动的方向和速度的数据并传输给计算机；(2)计算机实时收集图像摄取装置采集的数据并进行分析，计算实验所需的细胞位置与压力的关系，同时，将计算所得结果与计算机接收到的微压力控制器反馈的实时压力数据比对，输出控制指令给微压力控制器；(3)微压力控制器根据指令改变施加在芯片微通道两端的压力，调节芯片微通道中的流体的流动方向和速度以调整流体中细胞的位置。本发明可实现快捷、准确地观测细胞，能真正广泛应用于科学研究及医学检测或教学的针对细胞进行动态研究。
Description
一种细胞观测实验方法及实验用芯片与装置 技术领域 本发明涉及一种细胞研究的观测实验方法，特别涉及一种应用于 科学研究及医学检测或教学的针对细胞进行动态研究的实验方法，以 及实验采用的芯片和为实现该方法所设计的装置。 背景技术 当前生物学或医学研究及应用中， 细胞培养是最重要的一项技 术。 而细胞作为生命的基本单元，要将其分离出来进行接近于活体的 体外培养并进行实验却成为一项技术难关。原因在于：在离体培养时， 细胞周围的微环境无法很好地控制，而控制微环境却又是科学实验与 研究的基本方法。 特别是， 当对细胞进行研究的时候， 常常需要引入 试剂， 并需要在显微镜下进行观测跟踪记录， 而流动的液体却会使悬 浮在液体中的细胞在显微镜下消失， 使得培养或实验无法正常进行， 除非采用强制性的物理或化学手段固定或一定程度上限制细胞，但这
来技术上的突破。 本专利申请人已申请了一项 "芯片内进行培养和 实验单细胞或多细胞的 PCT (Publ ication Number: WO/2006/007701)，， 专利， 该专利的主要内容是， 利用微流控芯片技术在理论上实现了单 细胞的选择、 分离、 定位、 保留及在芯片微流场中进行悬浮培养， 试 剂的输送及切换过程中细胞仍然可以被连续地显微观测和记录。该技 术实际上从细胞微环境的实时控制以及细胞在微流中处于悬浮状态 为基本出发点，从理论上解决了单细胞培养及实验的基本问题。但是， 该专利对方法中所采用的芯片只限于原理上的叙述，即所述的芯片内 部具有微通道， 微通道中设有凹形控制区。通过控制流体的压力与流 速， 使细胞相对稳定地停留在控制区内部以便观察， 但是， 所述的芯 片结构难以实现液体流场的可视化控制。且该专利中未解决实际中如 何实现细胞观测实验的微流体自动控制问题，而实验中常需要对细胞 进行培养， 实验的时间可能长达几天甚至几个星期， 因而对细胞观测 实验的 ί敖流体采用手动控制是不现实的， 必须采用自动控制。 因此， 使得理论和应用之间有一段距离。
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发明内容
确 认 本
本发明的目的在于提供一种快捷、 准确的细胞观测实验方法。 本发明的另一目的在于提供一种细胞观测实验用芯片 , 以确保细 胞控制的稳定性。
本发明的再一目的在于提供一种细胞观测实验的装置，该装置利 用显 图像设备动态识别单细胞或多细胞的位置、运动的方向及速度 来建立反馈， 并准确实施芯片内微通道中微流体的控制。
为实现上述目的， 本发明的技术解决方案是：
本发明涉及一种细胞观测实验方法， 它包括如下过程： ( 1 )图像 摄取装置通过显微镜动态获取载物台上芯片内微通道中细胞的位置、 流动的方向和速度的数据并传输给计算机； ( 2 )计算机实时收集图像 摄取装置采集的数据并进行分析，计算实验所需的细胞位置与压力的 关系， 同时， 将计算所得结果与计算机接收到的微压力控制器反馈的 实时压力数据比对， 输出控制指令给微压力控制器； （ 3 )微压力控制 器根据指令改变施加在芯片微通道两端的压力，调节芯片微通道中的 流体的流动方向和速度以调整流体中细胞的位置。
本发明涉及一种适用于上述实验方法的芯片， 它包括： 微通道、 芯片流路通往外部的接口、 密封层； 所述芯片流路通往外部的接口分 为试剂或培养基的入口及控制接口；所述微通道内形成用于进行细胞 培养及观察的凹型细胞控制单元， 通道两端分别连接控制接口， 与细 胞控制单元开口正对的微通道侧壁上设侧口与试剂或培养基的入口 连接； 所述密封层覆盖在整个芯片上， 使芯片的通道形成密闭结构， 从而实现在控制接口上连接压力控制装置以调节 ^啟通道内的压力。所 述微通道及细胞控制单元内都形成微型凹坑， 凹坑中放置微球， 可指 示该点流体的流速和方向， 实现流体流场的可视化控制。
所述微通道及细胞控制单元内分布有一组凹坑， 形成凹坑阵列， 流体在各点处的流速和方向会被凹坑中的微球所显示，通过凹坑阵列 可以直观地显示某一时刻的流场，该实时流场观测计算结果可帮助控 制系统采取正确的应对方案。
所述接口包括一組试剂或培养基的入口；该組试剂或培养基的入 口依具体的试剂或培养基的种类分为需要阻尼緩冲的普通液体入口 和用于微小试剂定量进样的特殊液体入口。
所述接口包括一組控制接口；该组控制接口通过阻尼 通道与细 胞控制单元的两端连接， 该组控制接口连接在阻尼 通道的不同位 置， 便于选择不同的阻尼系数， 以适应不同类型的细胞控制。
所述芯片为集成芯片， 接口包括一组试剂或培养基的入口、 一组 控制接口；微通道上分布一组细胞控制单元。
所述微球为磁性微球， 借助外磁场使磁性微球产生微小震动， 以
避免磁性微球黏附于凹坑的内壁上而失去指示作用。
所述细胞控制单元的内壁上连接细胞收集单元，用于细胞的收集 和储存。 所述细胞收集单元为由窄渐宽的结构， 其较窄的一端与细胞 控制单元相连， 且连接处有在一定流速下阻挡细胞通过的挡墙， 而较 宽的一端通过微通道连接到通往外部的接口，且较宽的一端与微通道 的连接处也有在一定流速下阻挡细胞通过的挡墙，当有需要时可通过 接口将细 ϋ包收集单元中培养的细胞导出。
所述放置在凹坑中用于流体指示的微球可采用磁性微球。这种磁 性微球可用外磁场进行控制。用交变的磁场使微球产生微小的震动以 避免微球黏附于芯片内壁上而失去指示作用。可利用固定方向的磁场 强度的调节改变磁性微球所受到的垂向作用力来调节微球的指示灵 敏度。
所述细胞在通道中的黏附作用会对控制过程产生一定影响，但细 胞的黏附作用可受到声波的影响。 因此， 可在芯片中植入声波发生装 置以消除控制过程中细胞的黏附作用。 '
本发明涉及一种细胞观测实验装置， 它包括显微镜、 图像摄取装 置、 计算机、 微压力控制器、 芯片； 所述的计算机通过通讯总线连接 图像摄取装置； 图像摄取装置与显微镜连接， 芯片放置在载物台上； 所述的微压力控制器的压力输出端通过管线连接芯片的控制接口；所 迷的微压力控制器同时通过数据线连接计算机， 反馈实时压力， 并接 受计算机的压力调节指令。
所述的微压力控制器可采用气压控制或液压控制。 . 所述的 压力控制器由压力源和多组气压控制单元组成;所述的 压力源通过气压通道连接多组气压控制单元；所述的压力源主要由真 空泵、真空池、压力变送器和测控仪组成，所述的真空泵连接真空池， 测控仪电连接真空泵并通过压力变送器连接真空池；所述的气压控制 单元包括流量调节阀、 电磁阀、 緩冲容器、 压力变送器、 测控仪， 所 述的流量调节阀和电磁阀相互串接，有两组， 分别连接在緩冲容器的 输入通道和输出通道上，测控仪分别电连接设于緩冲容器的输入通道 和输出通道的电磁阀上并通过压力变送器连接緩冲容器。
所述微压力控制器采用动态控制。 采用大流量气压源， 采取一系 列截流阀串联或并联的方式调节气压。还可不采用压力连续控制的方 式， 而采用固定系列气压值等待切换的快速反应方式。
所述微压力控制器用位移传感器进行液压控制。液压调节较气压 调节精密， 但可调范围小。 因此， 压力控制可采用气压控制同液压调 节相结合的方式。 气压控制具有快速反应的特点， 用于控制细胞回复 到预期位置。液面高度控制作为长期过程进行精密调节以消除细胞在 长期培养过程中的动态失衡，如液面的左右失衡或左右通道的阻尼失
衡。气压控制和液面高度控制都可以植入计算机的控制程序中以达到 自动控制的目的。
采用双显微镜同轴单一光源的控制光路，双显微镜包括反射式显 微镜和倒置显微镜，光源产生的光通过反射镜进入反射式显微镜的光 轴线照射到芯片上，其反射的光返回到进行动态图像观察以供芯片动 态控制的反射式显微镜的 CCD1 , 透过芯片的光则被主要用于生物学 观察分析的倒置显 4敫镜的 CCD2所获取。
采用上述方案后， 由于本发明通过显微镜和图像摄取装置获取颗 粒的位置以及流动的方向和速度等信息，进行单细胞或多细胞显微图 像的动态识别， 反馈给计算机进行计算，根据所需实现的控制， 比对 实时采集的微压力数据反馈， 输出控制信号， 改变施加在微通道两端 的压力，调节 通道中的流体的流动方向和速度以及流体中颗粒的位 置， 从而使得单芯片培养的实验过程更加快捷、 准确。
该装置可形成一种能真正广泛应用于科学研究及医学检测或教 学的针对细胞动态研究与实验的自动化仪器。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。 附图说明 图 la是本发明芯片的结构示意图；
图 lb是本发明芯片的上半部分的局部结构示意图；
图 lc是本发明芯片的下半部分的局部结构示意图；
图 Id是本发明芯片中细胞收集单元的结构示意图；
图 le是本发明芯片中微通道的结构示意图；
图 If是本发明芯片中细胞控制单元的结构示意图；
图 lg是本发明芯片中另一种细胞控制单元的结构示意图； 图 lh是本发明芯片中微型凹坑示意图；
图 2a- 2g是用显微镜观察芯片微通道中颗粒的过程图； 图 3是凹坑阵列指示流体流场的示意图；
图 4a- 4c是在本发明芯片中被培养细胞的控制过程图； 图 5是本发明芯片 ^敖通道中的多次曲回阻尼通道示意图； 图 6是本发明芯片设置外磁场的示意图；
图 7是在本发明芯片中设置声波发生器的示意图；
图 8是本发明的结构框图；
图 9是本发明微压力控制器实施例一的结构示意图；
图 1 Oa- 1 Oc是本发明图像反馈控制过程图；
图 11是本发明微压力控制器实施例二的截流阀串联压力控制示 意图；
图 12a是本发明微压力控制器实施例二以单风扇作为气压源的 示意图；
图 12b是本发明微压力控制器实施例二以多风扇串联作为气压 源的示意图；
图 13是本发明微压力控制器实施例二的固定系列气压值切换方 式示意图；
图 14是本发明微压力控制器实施例三的截流阀并联压力控制示 意图；
图 15是本发明微压力控制器实施例四的气液共同调节方式示意 图；
图 16是本发明控制光路采用默显微镜同轴单一光源方式的示意 图；
图 17是本发明实验方法的控制流程图。 具体实施方式 本发明涉及一种细胞观测实验方法，结合本申请人已申请了一项 "芯片内进行培养和实验单细胞或多细胞的 PCT (Publ ication Number: WO/2006/007701) " 专利 （该专利的主要内容是， 利用微流 控芯片技术在理论上实现了单细胞的选择、 分离、 定位、保留及在芯 片微流场中进行悬浮培养，试剂的输送及切换过程中细胞仍然可以被 连续地显^:观测和记录）， 如图 17所示， 本发明增加如下过程： ( 1 ) 图像摄取装置通过显微镜动态获取载物台上芯片内微通道中细胞的 位置、 流体流动的方向和速度的数据并传输给计算机； （2 )计算机实 时收集图像摄取装置采集的数据并进行分析，计算实瞼所需的细胞位 置与压力的关系， 同时， 将计算所得结果与计算机接收到的微压力控 制器反馈的实时压力数据比对， 输出控制指令给微压力控制器； （3 ) 微压力控制器根据指令改变施加在芯片微通道两端的压力，调节芯片 微通道中的流体的流动方向和速度以调整流体中细胞的位置。 本发明涉及一种适用于上述实验方法的芯片， 如图 la所示， 它 包括： 微通道 52 (几十微米到几百微米宽）、 芯片流路通往外部的接 口 51、 密封层 5B (图 6 ); 所述芯片流路通往外部的接口 51分为试 剂或培养基的入口 511和控制接口 515;所述 通道 52连通各芯片流 路通往外部的接口 51 , 且芯片中部的微通道中分布着细胞控制单元 521 , 是进行细胞培养及观察的场所； 所述密封层覆盖在整个芯片上， 使芯片的通道 52形成密闭结构， 从而实现在控制接口 515上连接压 力控制装置以调节微通道 52 内的压力。 微通道 52及细胞控制单元
521内形成微型凹坑 522, [鼓型凹坑 522中放置 £球， 可指示该点流 体的流速和方向， 实现流体流场的可视化控制。 型凹坑 522也可以 只形成在细胞控制单元 521内。
本发明的设计原理：
颗粒位置指示流体的流动方向和速度。
如图 2a- 2d所示， 如果球形重物 Q (指会在流体中下沉）处于芯 片 5A—个特别设计的微通道 51A中的弧形凹坑内 52A，则微通道 52A 中流体运动的方向及速度就会使得该球形重物 Q 处于弧形斜面的不 同位置。 图 2a 球形重物 Q (黑色）置于芯片 5A弧形凹坑 52A的最低 处， 如果通道中没有液体流动， 球形重物 Q会停留在最低处， 其位置 可以通过显微观察确定； 图 2b如果微通道 51A中有流体从右向左流 动， 则球形重物 Q会被流体推向左边并在左边斜坡上平衡； 图 2c如 果微通道 51A中有流体从左向右流动，则球形重物 Q会被流体推向右 边并在右边斜坡上平衡； 图 2d如果流速增加则球形重物 Q增加离开 最低平衡点的距离， 该距离可被显微观测确定， 并反过来推算流体流 动的速度。
如图 2e-2g所示，如果考虑微通道 51B在二维平面上有四个通路 的微通道 511B、 512B、 513B、 514B, 则处于交汇处凹坑 52B中的球 形重物 Q就可以指示各个通道口的流动情况。 如图 2e , 如果流体没 有流动， 则球形重物 Q停留在中间的平衡点； 如图 2f , 如果左边通 道为流体出口， 则球形重物 Q向左边移动， 偏离平衡点的距离由流速 决定； 如图 2g, 如果上边通道为流体出口， 则球形重物 Q向上移动 (实际上都是在水平面上）， 偏离平衡点的距离由流速决定。
如图 3所示，利用凹坑 522进行流速的指示不限于单一通道或交 叉口，也可通过凹坑阵列来直接显示复杂的动态流体场。 当放置微球 57 的凹坑阵列处于一个流场中时， 流体在各点处的流速和方向会被 凹坑中的微球所显示， 所以， 通过凹坑阵列可以计算出某一时刻的流 场。
通过控制微通道两端压力， 调节细胞位置。
如图 4a-4c所示， 6为一个细胞控制单元， 流体由通道 63进入， 图 4a, 如果细胞（类似于球形重物但不局限于球形）处于平衡点， 则 61、 62两端的压力可以控制为不变； 图 4b, 如果要向右移动细月包 的位置， 则增加左端 61的压力即可； 图 4c, 如果要向左移动细胞的 位置， 则增加右端 62的压力即可。 这样， 就可以使细胞静止处在所 需位置便于观察， 且细胞处于一个不断更新的流体环境中，保证了细 胞营养吸收及代谢能够正常进行，使细胞在芯片中静止的培养能够实 现。
液体阻尼装置， 如多次曲回的流体通道可对液体起緩沖作用， 在
控制流路中设置阻尼装置， 能降低液体对压力变化的敏感度，提高压 力对流体流速调节的精密度。
如图 5所示， 流体从 C流入， 从 A 、 B流出， 控制 A、 B的压力 是控制细胞的基本方法。但同样的压力变化值， 如果接上作为阻尼的 多次曲回的管道以后， 流速的变化会更小，从而达到调节流速对压力 敏感程度的目的。 因此芯片上的控制流路中可设计流体的阻尼装置， 如多次曲回的通道， 使得流体流速对于外界压力的响应敏感性降低， 以利于压力的精密控制。
综合考虑以上描述的各项技术， 设计出图 la所示本发明的一个 较佳实施例。 本实施例所示芯片为集成芯片， 整个芯片由玻璃制成， 尺寸为 63腿 *63mm。 其四周均匀分布着 72个直径为 2隨的芯片流路 通往外部的接口 51 , 其作用相当于计算机 CPU的针脚， 是实现外部 与内部相连的标准化通道。 以 PDMS (聚二甲基硅氧烷）或其它相同 性质的材料制成的透明密封层覆盖在整个芯片上， 使芯片的通道 52 形成密闭结构，从而实现在控制接口 515上连接压力控制装置以调节 微通道 52内的压力。
图 lb为图 la上半部分的放大图，其主要功能为试剂及培养基的 导入。 图中所示的接口为一组试剂或培养基的入口， 该组试剂或培养 基的入口又分为一组需要阻尼緩冲的普通液体入口 511 和一组用于 微小试剂定量进样的特殊进样入口 513, 为了在流体进入细胞培养通 道前将多余的液体排出， 设置了一组液体出口 512。 511与 512之间 用到了阻尼通道，是为了在流体进入细胞培养通道前将多余的液体排 出并起到緩冲作用。
图 lc为图 la的下半部分放大图， 其主要功能为细胞的进样、培 养、控制和收集等。 一组控制接口 515通过阻尼微通道与细胞控制单 元的两端连接， 该组控制接口连接在阻尼微通道的不同位置，便于选 择不同的阻尼系数来适应不同类型的细胞控制。在实际应用中， 控制 接口除了可以作为连接外部微压力控制器的通道口夕卜，还可以作为细 胞进入通道口和液体的进出口。芯片中部的微通道中分布一组细胞控 制单元 521 , 是进行细胞培养及观察的场所， 中间三个细胞控制单元 的内壁上连接细胞收集单元 53 (图 Id ), 用于细胞的收集和储存。 所 述细胞收集单元为由窄渐宽的结构，其较窄的一端与细胞控制单元相 连， 且连接处有在一定流速下阻挡细胞通过的挡墙 534, 而较宽的一 端通过微通道连接到通往外部的接口，且较宽的一端与微通道的连接 处也有在一定流速下阻挡细胞通过的挡墙 535, 当有需要时可通过接 口将细胞收集单元中培养的细胞导出。 图 Id中流体流向为从细胞控 制单元 521到细胞收集单元 53, 流体流经挡墙 534处时因通道由宽 变窄而流速高， 细胞会随着流体一起进入细胞收集单元 53， 而挡墙
535处因通道较宽而使流速降低， 起到阻隔细胞的作用。 因此， 可以 通过调节流体的流速将细胞控制在细胞收集单元 53中。 细胞收集单 元 53较宽的一端通过微通道连接到细胞收集口 516， 当有需要时可 通过细胞收集口 516将细胞收集单元 53中培养的细胞导出。
微通道 52 及细胞控制单元 521 内都分布着微型凹坑 522 (图 le-lg ), 形成一个个凹坑阵列， 凹坑中分别放置微球， 流体在各点处 的流速和方向会被凹坑中的微球所显示，通过凹坑阵列可以计算出某 一时刻的流场，该实时流场观测计算结果可帮助控制系统采取正确的 应对方案。图 lg与图 If所示为凹坑阵列可在细胞控制单元 521内以 不同形式排布。在微通道各交叉口分布的凹坑阵列还可指示不同流路 的流量， 方便在进行细胞培养时多种培养液的定量进样的控制。
放置在凹坑中用于流体指示的微球可采用磁性微球。这种磁性微 球可用外磁场进行控制。用交变的磁场使微球产生微小的震动以避免 微球黏附于芯片内壁上而失去指示作用。利用固定方向的磁场强度的 调节改变磁性微球所受到的垂向作用力来调节微球的指示灵敏度。如 图 6所示， 501为芯片的玻璃结构部分， 502为密封层， 在芯片 5下 方放置线圈 7, 通入线圈的电流可是直流电和交流电的合成， 以产生 合适强度和合适波动磁场用来控制芯片中凹坑中的磁性微球的受力 状况， 这样既可以控制微球于凹坑中， 又可以使 球对流体的流速和 方向有一定的响应灵敏度。
细胞在通道中的黏附作用会对控制过程产生一定影响，但细胞的 黏附作用可受到声波的影响。 因此，控制过程中细胞的黏附作用的消 除可采用声波控制的方法。 如图 7所示， 可将声音发生装置 8植入芯 片 5中， 便于直接控制细胞所接受声音的频率强度等参数。
本发明所设计芯片的优点：
1.在微通道及细胞控制单元中设置凹坑， 并在凹坑中放置微球， 用于指示流体在各点处的流速和方向，通过凹坑阵列可以计算出某一 时刻的流场，该实时流场观测计算结果可帮助控制系统采取正确的应 对方案， 实现了流体流场的可视化控制。
2.芯片的集成化。芯片流路通往外部的接口包括一组试剂或培养 基的入口、 一组控制接口；微通道上分布一组细胞控制单元， 此结构 使得芯片适用范围更广， 具有通用性。
3.在控制流路中设置了流体阻尼装置，提高压力对流体流速调节 的精密度。
4.在试剂或培养基的入口连接阻尼微通道， 对液体起到緩冲作 用。
5.细胞控制单元的设计既保证了细胞能够静止于细胞控制单元 中以便于观测， 又保证了细胞处在一个动态的环境中，周围的流体不
断更新， 使细胞在芯片中静止的培养能够实现。
6.芯片中的微通道设置了多个与外界相通的出口，利于通道中气 体的排出， 使整个微通道充满液体。
7.芯片中的微通道设置了多个与外界相通的出口， 当某个出口被 堵塞时， 还能有其它出口作为备用， 保证实验的顺利进行。
8.用于流体指示的微球采用磁性微球， 并在芯片下方放置线圈 , 用交变的磁场使磁性微球产生微小的震动以避免磁性微球黏附于芯 片内壁上而失去指示作用。
9.通过声波控制消除细胞的黏附作用。 本发明涉及一种细胞观测实验装置。如图 8所示， 根据上述实一睑 方法所发明的一种细胞观测实验装置， 它包括显微镜 1、 图像摄取装 置 2、 计算机 3、 微压力控制器 4、 芯片 5。
所述的芯片 5为前述的芯片；所述的计算机 3通过通讯总线连接 图像摄取装置 2的 USB端口； 图像摄取装置 2与显微镜 1连接， 芯片 5放置在显微镜 1的目镜 31和物镜之间， 其显微镜 1的目镜 31对准 芯片 5中央的细胞控制单元 521; 所述的微压力控制器 4通过气动管 线连接芯片 5的控制接口 515 , 以便调节微通道 52内的压力。
此外，本发明还可以包括一些辅助仪器，如： 恒温控制装置、 恒 氧分压控制装置、 自动进样装置、 培养后细胞收集装置、 试剂自动切 换装置、 试剂自动混合装置、 荧光信号计量装置、 芯片自动清洗装 置等。
本发明的工作原理：
所述的显微镜 1一般是指倒置显微镜，这样显微镜的物镜处于培 养芯片 5的下方，便于留出培养芯片 5上方的空间连接微压力控制器。 所述的图像摄取装置 2 —般指活动图像的数字摄像装置和静止图像 的摄像装置，它们将显微图像在线传输给计算机 3便于进行图像分析 处理。 图像摄取装置 2同时具备记录培养及实验过程的功能。微压力 控制器 4通过数据线连接计算机 3, 计算机 3内的图像分析软件用于 分析目标细胞或颗粒的位置及移动速度，并将此位置及移动速度信息 与微压力控制器实时反馈的压力数据对比进行分析，以输出合适的压 力控制信号到微压力控制器 4。 微压力控制器 4根据计算机 3软件送 来的控制信号输出相应的压力给芯片 5以达到输送试剂、控制细胞培 养及实验过程的目的。
所述的微压力控制器可采用气压控制或液压控制。
微压力控制器具体实施例一
如图 9所示， 所述的微压力控制器 4由压力源 41和多组气压控 制单元 42组成。 所述的压力源 41通过气压通道 43连接多组气压控
制单元 42。
所述的压力源 41主要由真空泵 411、 真空池 412、 压力变送器 413和测控仪 414组成。 所述的真空泵 411连接真空池 412, 测控仪 414电连接真空泵并通过压力变送器 413连接真空池 412。
所述的气压控制单元 42包括流量调节阀 421、 电磁阀 422、緩冲 容器 423、 压力变送器 424、 测控仪 425。 所述的流量调节阀 421和 电磁阀 422相互串接，有两组， 分别连接在緩冲容器 423的输入通道 和输出通道上。 连接在输入通道的这组连接顺序为： 电磁阀 422、 流 量调节阀 421、 緩冲容器 423; 连接在输出通道的这组连接顺序为： 流量调节阀 421、 电磁阀 422、 緩冲容器 423。 测控仪 425电分别连 接设于緩冲容器 423的输入通道和输出通道上的电磁阀 422并通过压 力变送器 424连接緩冲容器 423。
本实施例微压力控制器 4的工作原理：
芯片 5的通路需要多路（视使用时的需要而定）压力控制， 这每 一路的压力控制需求对应于微压力控制器 4 中的一个气压控制单元 42 (见图 9中的气压控制单元 42A、 42B、 42C, 更多的单元设计相同 而无需重复绘出）。 真空池 412的气压由压力变送器 413将气压数据 传送至测控仪 414， 测控仪 414根据气压的测量数据对比设定数据并 输出控制电流启动或关闭真空泵 411 (或压缩机） 以达到控制并恒定 真空池 412中气压的目的。真空池 412的气压并不直接输送到芯片 5, 而只是作为压力源。緩冲容器 423是真正与芯片相连的气压受控的部 件， 其气压决定施加给芯片的一路气压。緩冲容器 423—端连接真空 池 412以取得与真空池 412接近的气压。另一端连接大气以取得接近 大气的压力。 因此， 緩冲容器 423的压力控制范围将介于大气压和真 空池 412的气压之间， 其气压变化的速度将由流量调节阀 421控制。 因此， 施加于芯片 5的气压的大小及调节的速度都是严格受控的， 气 压调节所引起的脉冲也会因为緩冲容器 423 的緩冲作用被降至足够 小。緩冲容器 423气压的调节由测控仪 425根据压力变送器 424的压 力数据对照设定值， 再通过控制电磁阀 422得以实现。每一个气压控 制单元的测控仪 425都连接在 RS485计算机控制总线上， 测控仪 425 的设定值由计算机 3通过总线寻址给出。测控仪 425测得的气压数据 也可以及时通过总线送给计算机 3。 通过这种方式， 100路以上的气 压控制单元也可以在 RS485总线上实现。
本实施例描述的微压力控制装置实际上是一种静压力的控制方 案，空气在容器中基本处于静止状态，即在不处于调节压力的状态下， 容器中的空气并没有流动， 而保持一种静止的状态。这种静止的状态 容易受到温度、压力和气体泄漏的影响。 与该静压力控制方法的功能 相似， 另一种压力控制的方法采用动态控制， 即空气处于持续的流动
之中。在空气从高压流向低压的过程中由于遇到的阻力或摩擦形成压 力逐渐变化的过程。 根据此原理产生了以下实施例。
微压力控制器具体实施例二
如图 11所示为 压力控制器的另一实施例。 在空气从高压流向 低压的过程中由于遇到的阻力或摩擦形成压力逐渐变化的过程。如果 在这个过程中串联上一系列的截流阀，则每一段的压强就可以受到控 制。 只要开头和结尾的压差恒定不变， 这种通过一系列截流阀所控制 的分段压强也是恒定不变的。 如图 11, 气体从 P0流向 P1 (气压从 P0过渡到 P1 ) ，通过一系列的截留阀（V1，V2，V3, V4)可以对緩冲容器 中的压强 P2, P3, P4进行控制，使得 P0到 P1的气压降在 P2, P3, P4间 按照要求进行分配。 如将 V3的流量调小则 P4的气压则向 P1方向降 而 P2, P3则向 P0方向升高。 由此可见， 通过调节一系列的流量 调节阀可以得到一系列稳定的逐渐降低的气压。
为满足本实施例所需连续大流量气压源的要求，气压的产生可以 不采用真空泵而采用其他大流量的装置如风扇。风扇的串联可以提高 气压差， 而通过调节风扇的转速也可以达到调节气压的目的。 如图 12所示， 由于串联了更多的风扇， 图 12b中 P2与外界的气压差值比 图 12a中 P1与外界的气压差值更大。 而风扇本身的功率、 转速与串 联的个数决定了容器内与外界的气压差。
但是， 本实施例采用的这种截流阀串联控制方式， 其不足之处在 于只要调节了通路上的其中一个截流阀，整条通路上所有的分段压强 都会改变。 因此， 根据这种串联方式的特点， 可不采用压力连续调节 的方式， 而采用固定系列气压值而等待切换的快速反应方式。 如图 13 所示， 根据细胞所在的位置可以反馈调节气压以达到控制细胞的 目的。 如细胞在位置 A附近的时候采用 P10,在位置 B附近的时候采 用 P20,在位置 C附近的时候采用 P30,在位置 D附近的时候采用 P40, 在位置 E附近的时候采用 P50， 以此类推。 而 P10、 P20、 P30等分别 对应图 11中 P2、 P3、 P4处输出的气压值。
微压力控制器具体实施例三
为弥补实施例二中截流阀串联控制方式不能单一调节分段压强 的不足， 可采用将截流阀并联的控制方式， 使每个分段气压都得到独 立的控制。如图 14所示，由 V1，V2调节 P2， 由 V3, V4调节 P3,由 V5，V6 调节 P4。 本实施例中的气压源也可采用实施例二中的风扇串联的方 式。
微压力控制器具体实施例四
压力控制除可采用气压控制方式外， 还可以采用液压控制。 如采 用位移传感器调节液面高度，从而进行连续的液压调节。 液压调节较 气压调节精密， 但可调范围小。 因此， 压力控制可采用气压控制同液
压调节相结合的方式。 气压控制具有快速反应的特点， 用于控制细胞 回复到预期位置。液面高度控制作为长期过程进行精密调节以消除细 胞在长期培养过程中的动态失衡 ,如液面的左右失衡或左右通道的阻 尼失衡。气压控制和液面高度控制都可以植入计算机的控制程序中以 达到自动控制的目的。 液面高度的调节是一种连续液压的调节， 因此 在一定范围内 （通常是离工作位置比较近的中心位置附近）， 可对细 胞进行连续精密的位置控制。 更大范围（通常指离工作位置比较远的 两边）的控制则可采用气压控制。 如图 15， 液面的高度控制可由计 算机控制的电机执行，位置数据的在线获取可采用高 4青度的位移传感 器， 并由计算机计算出液压 A。 气压 B则由前述的气压装置输出。 合 成的压力 C (C=A+B)将输出到芯片。
本发明的控制光路除可采用单显微镜观测外，还可采用双显微镜 同轴单一光源的方式， 如图 16所示， 不同的 CCD (电荷耦合器件） 以采集不同放大倍数的图像， 也就是不同观察视野的图像。 高放大倍 数的图像通常用于细胞或颗粒的显微观察拍照，而低放大倍数但视野 大的显微图像实时采集常用于细胞或颗粒的控制。 如图所示， 光源 30 (白光或有色光）产生的光通过反射镜 31进入反射式显凝:镜 32的 光轴线照射到芯片 5上， 其反射的光返回到该反射式显凝:镜的 CCD1 进行动态图像观察以供芯片的动态控制。透过芯片的光则进入倒置显 微镜 33被 CCD2所获取。 其图像主要用于生物学观察分析。 如果是荧 光倒置显^:镜， 则也可进行荧光图像分析。
本发明的具体实施方法：
如图 10a- 10c所示， 本发明图像反馈控制的具体含义及方法： 芯 片 5微通道 52中的凹坑阵列中的微球 57在显微镜 3视野中是可见的。 微球在凹坑中的位置可以通过图像识别，利用计算机中的软件判断出 流体的流速和方向。由于微通道两端的压力决定了微通道中流体的流 动方向和速度 ,只要具备控制压力的策略就可以使流动的方向和速度 达到预定的要求。
微通道中细胞位置的压力控制过程。 如图 4a-4c所示， 6为一个 细胞控制单元， 流体由通道 63进入， 细胞在弧形斜面上的位置（包 括左右及上下）指示了细胞附近流场的形状及强度。 这样， 从显微图 像的动态分析，就可以采取适当而及时地反馈调节来控制细胞的培养 及实验（包括改变及切换试剂、 改变流的强度、 移动细胞位置等具体 操作）。
细胞实验芯片中被培养细胞的控制： 图 4a， 如果细胞处于平衡 点， 则 61、 62两端的压力可以控制为不变； 图 4b， 如果要向右移动 细胞的位置， 则增加左端 61的压力即可； 图 4c, 如果要向左移动细 胞的位置， 则增加右端 62的压力即可。 细胞移动的距离由两端的压
力差决定。
综上所述，结合本发明的实验方法，本发明的整个控制流程如下： 图像摄取装置 1通过显微镜 1动态获取载物台上芯片 5内微通道中细 胞的位置、 流体流动的方向和速度的数据并传输给计算机 3; 计算机 3实时收集图像摄取装置 2采集的数据并进行分析， 计算实验所需的 细胞位置与压力的关系， 同时， 将计算所得结果与计算机接收到的微 压力控制器 4反馈的实时压力数据比对，输出控制指令给 压力控制 器 4;微压力控制器 4根据指令改变施加在芯片 5微通道两端的压力， 调节芯片 5 微通道中的流体的流动方向和速度以调整流体中细胞的 位置。
Claims (1)
- 权 利 要 求1、 一种细胞观测实验方法， 其特征在于： 它包括如下过程： ( 1 ) 图像摄取装置通过显崔 £竟动态获取载物台上芯片内微通道 中细胞的位置、 流体流动的方向和速度的数据并传输给计算机； ( 2 ) 计算机实时收集图像摄取装置采集的数据并进行分析，计算实验所需 的细胞位置与压力的关系， 同.时， 将计算所得结果与计算机接收到的 微压力控制器反馈的实时压力数据比对，输出控制指令给微压力控制 器； （3 )微压力控制器根据指令改变施加在芯片微通道两端的压力， 调节芯片微通道中的流体的流动方向和速度以调整流体中细胞的位 置。2、 如权利要求 1所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 它包括微通道、 芯片流路通往外部的接口、 密封层； 所述芯 片流路通往外部的接口分为试剂或培养基的入口及控制接口；所述微 通道内形成用于进行细胞培养及观察的凹型细胞控制单元，通道两端 分别连接控制接口，与细胞控制单元开口正对的微通道侧壁上设侧口 与试剂或培养基的入口连接； 所述密封层覆盖在整个芯片上，使芯片 的通道形成密闭结构； 所述细胞控制单元内形成微型凹坑， 凹坑中放 置微球。3、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述微通道及细胞控制单元内都形成微型凹坑， 凹坑中放置 微球。4、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述细胞控制单元内分布着一组微型凹坑， 形成凹坑阵列， 凹坑中分别放置微球。5、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述接口包括一组试剂或培养基的入口；该组试剂或培养基 的入口依具体的试剂或培养基的种类分为需要阻尼緩冲的普通液体 入口和用于微小试剂定量进样的特殊液体入口。6、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述的控制接口通过阻尼微通道与细胞控制单元的两端连 接。7、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述接口包括一组控制接口； 该组控制接口通过阻尼微通道 与细胞控制单元的两端连接，该组控制接口连接在阻尼微通道的不同 位置。8、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述芯片为集成芯片， 接口包括一组试剂或培养基的入口、 一组控制接口， 微通道上分布一组细胞控制单元， 该组试剂或培养基 的入口依具体的试剂或培养基的种类分为需要阻尼緩冲的普通液体 入口和用于微小试剂定量进样的特殊液体入口，该组控制接口通过阻 尼微通道与该组细胞控制单元的两端连接，该组控制接口连接在阻尼 微通道的不同位置。9、 如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述微球为磁性微球。10、如权利要求 2所述一种细胞观测实验方法使用的芯片， 其特 征在于： 所述细胞控制单元的内壁上连接细胞收集单元， 所述细胞收 集单元为由窄渐宽的结构， 其较窄的一端与细胞控制单元相连， 且连 接处有挡墙， 而较宽的一端通过 通道连接到通往外部的接口， 且较 宽的一端与微通道的连接处也有挡墙。11、 如权利要求 1所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于： 它包括显敫镜、 图像摄取装置、计算机、 敖压力控制器、 芯片； 所述的计算机通过通讯总线连接图像摄取装置； 图像摄取装置 与显微镜连接， 芯片放置在载物台上； 所述的微压力控制器的压力输 出端通过管线连接芯片的控制接口；所述的微压力控制器同时通过数 据线连接计算机， 反馈实时压力， 并接受计算机的压力调节指令。12、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于： 所述的微压力控制器由压力源和多组气压控制单元组 成； 所述的压力源通过气压通道连接多组气压控制单元； 所述的压力 源主要由真空泵、 真空池、 压力变送器和测控仪组成， 所述的真空泵 连接真空池， 测控仪电连接真空泵并通过压力变送器连接真空池； 所 述的气压控制单元包括流量调节阀、电磁阀、緩冲容器、压力变送器、 测控仪， 所述的流量调节阀和电磁阀相互串接， 有两組， 分别连接在 緩冲容器的输入通道和输出通道上，测控仪分别电连接设于緩冲容器 的输入通道和输出通道的电磁阀上， 并通过压力变送器连接緩冲容 器。13、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于：所述的微压力控制器由气压源和一系列与之串联的截流 阀组成。14、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于： 所述的微压力控制器采用风扇串联的方式作为气压源。15、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于：所述的微压力控制器由气压源和一系列并联的截流阀组 成。16、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于：所述的微压力控制器采用固定系列气压值等待切换的快 速反应方式。17、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于： 所述的微压力控制器采用位移传感器进行液压调节。18、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于：所述的微压力控制器采用气压控制与液压调节相结合的 方式进行压力控制。19、如权利要求 11所述一种细胞观测实验方法使用的实验装置， 其特征在于： 采用双显微镜同轴单一光源的控制光路， 又显微镜包括 反射式显敖镜和倒置显微镜，光源产生的光通过反射镜进入反射式显 微镜的光轴线照射到芯片上，其反射的光返回到进行动态图像观察以 供芯片动态控制的反射式显微镜的 CCD1 , 透过芯片的光则被主要用 于生物学观察分析的倒置显微镜的 CCD2所获取。
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