CN101485885B

CN101485885B - 蛋白磷酸酯酶PPM1E作为疾病的治疗靶标及其应用和siRNA

Info

Publication number: CN101485885B
Application number: CN2009100365495A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 李素萍; 陈妙娟; 王国新
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2029-01-09
Also published as: CN101485885A

Abstract

本发明公开了蛋白磷酸酯酶PPM1E调控NFκB信号通路，并作为与NFκB信号通路相关疾病治疗靶基因的应用，以及蛋白磷酸酯酶PPM1E作为靶基因在治疗NF kB相关疾病中的应用，以及一种抑制磷酸酶PPM1E表达的siRNA，其是具有以下碱基序列的双链RNA：(1)正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA 3′；反义链3′AGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′；或(2)正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU5′。本发明为NF kB相关的疾病的治疗提供了新的分子靶标，同时也为临床提供新的由抑制蛋白磷酸酯酶的siRNA的药物。

Description

蛋白磷酸酯酶PPM1E作为疾病的治疗靶标及其应用和siRNA

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体地是涉及到蛋白磷酸酯酶PPM1E调控NFκB信号通路，并作为与NFκB信号通路相关疾病治疗靶基因的用途和siRNA。

背景技术

核因子NFκB是由Sen等于1986年首次从B细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子。[Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factorsinteract with the immunoglobulin enhancer sequences[J].Cell 1986；46(5)：705-716.]

现在已经证实NFκB是广泛存在于真核细胞中，能够与多种基因的启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达，与炎症反应，免疫应答以及细胞的增生，转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关，近年来研究发现NFκB在炎症性疾病如类风湿性关节炎、炎性手腕疾病和哮喘，危重疾病如肺炎、ARDS等，还有肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。研究NFκB信号通路的调控机制，能够改善病情和提高预后，甚至将为治疗这些疾病提供新的分子生物学手段。

NF kB是Rel蛋白家族的成员，目前发现在哺乳动物中其家族共有5个成员，包括p65(RelA)、RelB、C2Rel、p50/p105(NF kB1)、p52/p100(NF kB2)。Rel蛋白成员间可形成同源或异源二聚体，但在细胞最常见的是P65/P50异源二聚体。NF kB通常与抑制因子IkBs相结合，以非活性的形式存在于细胞质中，NF kB能被各种刺激因子激活。细胞在上游刺激因素的作用下，通过不同的胞内信号传递途径，导致IkBs的降解和NF kB的活化。在许多炎性疾病中NFκB被激活。NFκB是促炎症基因表达的枢纽之一，可诱导细胞因子、趋化因子、粘附因子、基质金属蛋白酶(MMP)、环加氧酶2(cox2)和诱导性一氧化氮合酶(iNos)的表达。很多炎症介质基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列，如TNFα、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、GCSF、GM-CSF、ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等。NFκB活化后参与这些基因的表达。而这些介质在一些疾病的发病中起着重要的作用。NFκB抗凋亡、促细胞增殖和免疫激活功能是导致正常细胞恶变的潜在因素。近年来研究发现，在许多肿瘤细胞中均有NF kB的持续高表达。HTLV-1中的TAX原蛋白可激活IκK复合物，引起原发性人急性淋巴瘤细胞中NFκB蛋白表达升高，在病毒诱发肿瘤过程中起介导作用；与肿瘤发生相关染色体的转位、缺失、突变影响编码NFκB和IκB的基因；Ras癌基因诱导的致癌作用需要NF kB的活化等等。越来越多的报道表明，NFκB信号通路参与调控多种疾病以及肿瘤的发生发展。NFkB在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和急慢性白血病等多种肿瘤中持续激活。NF kB活性调节的关键因子都可以作为药物设计的靶标。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又叫基因沉默，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，是生物基因组抵抗病毒之类的外来遗传元件入侵的一种生物保护机制。

快速发展的RNAi技术具有高效特异的特点，为大规模的研究基因功能提供了新的实验手段，为分子生物学的研究提供了有力工具。化学合成的siRNA具有制备快速便捷，毒性小等优点，越来越多的应用于分子生物学领域。

PP2C是真核生物体内一大类重要的蛋白磷酸酯酶，PP2C通过催化底物蛋白的去磷酸化反应，负调控生物体内的信号转导途径。可逆性蛋白磷酸化的发现是人类研究细胞信号转导工作的一个里程碑。蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶是催化可逆性蛋白磷酸化和去磷酸化的关键酶。这种在蛋白翻译后水平的修饰可以改变信号通路中许多关键蛋白的生理生化特性，影响细胞的的表型。目前，有关蛋白激酶方面的研究和成果较为可观，而蛋白磷酸酯酶方面的研究一直未受到足够的重视。事实上，蛋白磷酸酯酶和蛋白激酶一样对生物体的生物学过程具有极为重要的调控作用。磷酸酯酶通过对蛋白的活性状态修饰，具有灵敏和可逆转的特点。做为药物靶标，有着其不可替代的优越性。

探究磷酸酯酶对NF kB信号通路的调控不仅对信号转导机制的基础理论研究有着重要意义，而且为免疫、炎症以及肿瘤的医学干预提供了机遇。

发明内容

本发明的目的之一是提供蛋白磷酸酯酶PPM1E作为NFκB信号通路相关疾病新的治疗靶基因。

本发明的另一目的是提供抑制磷酸酯酶PPM1E表达的siRNA。

具体技术方案如下：

蛋白磷酸酯酶PPM1E作为治疗靶基因在调控NFκB核转运的功能的应用。

蛋白磷酸酯酶PPM1E作为靶基因在治疗NF kB相关疾病中的应用。优选地，蛋白磷酸酯酶PPM1E作为炎症疾病治疗靶基的应用；蛋白磷酸酯酶PPM1E作为代谢疾病治疗靶基的应用；蛋白磷酸酯酶PPM1E作为肿瘤治疗靶基的应用。

针对蛋白磷酸酯酶PPM1E的小分子化合物在制备治疗炎症、代谢性疾病、肿瘤的药物中的应用。所述针对蛋白磷酸酯酶PPM1E的小分子化合物可以是任何药用的有机化合物，分子量为300-500效果更好。

针对蛋白磷酸酯酶PPM1E的蛋白和多肽化合物在制备治疗炎症、代谢性疾病、肿瘤的药物中的应用。

蛋白磷酸酯酶PPM1E siRNA在制备治疗炎症、代谢性疾病、肿瘤的药物中的应用。特别地，所述蛋白磷酸酯酶PPM1E siRNA是针对PPM1E基因序列的任何19-28个碱基的双链RNA。优选地，所述蛋白磷酸酯酶PPM1E siRNA是具有以下碱基序列的双链RNA：(1)正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA 3′；反义链3′AGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′；或(2)正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU5′。

抑制磷酸酯酶PPM1E表达的siRNA，其是具有以下碱基序列的双链RNA：(1)正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA 3′；反义链3′AGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′；或(2)正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU 5′。

本发明利用化学合成的siRNA通过RNAi的方法，对PP2C家族的磷酸酯酶进行NF kB活性筛选，得到能够作为治疗NF kB信号通路相关疾病分子靶标的磷酸酯酶。通过NFκB报告基因活性检测实验，我们发现干扰磷酸酯酶PPM1E表达之后，NF kB信号通路的活性受到抑制。然后，我们通过一系列的分子生物学实验研究发现，PPM1E通过与P65相互作用，调节P65的磷酸化水平，进而影响其入核发挥活性。

与现有的药物相比，PPM1E做为分子靶标，直接调控P65的磷酸化水平，而且其本身是一个酶，具有很高的调控灵敏度。信号通路上游受到的调控因子非常多，PPM1E直接针对P65发生作用，位于最下游的药物，能够在多因素引起的NF kB相关疾病的治疗中发挥综合的作用。

小鼠体内实验表明PPM1E通过参与调节NF kB信号通路，调控P65下游的与细胞增殖凋亡相关基因的转录激活，最终细胞甚至肿瘤的生长受到调节。细胞癌变究其根本原因还是在于细胞增殖失控和凋亡受阻。小鼠皮下肿瘤模型实验证实了PPM1E作为治疗某些肿瘤的提供了科学依据。本发明为NF kB相关的疾病的治疗提供了新的分子靶标，同时也为临床提供新的由抑制蛋白磷酸酯酶的siRNA的药物。

附图说明

图1是实施例1中磷酸酯酶PP2C家族的不同基因对NFκB luciferase报告基因活性的影响结果示意图；

图2是实施例2中mRNA水平和蛋白水平检测siRNAPPM1E对PPM1E基因的沉默效果示意图；

图3是实施例3中在TNFa刺激的条件下，siRNAPPM1E抑制Hela细胞中P65的核输入过程示意图；

图4是实施例4中PPM1E与P65之间存在相互作用示意图；

图5是实施例4中PPM1E与P65之间存在相互作用示意图；

图6是实施例5中转染siRNA-PPM1E对P65磷酸化水平影响示意图；

图7是实施例6中siRNAPPM1E靶向抑制PPM1E基因后对裸鼠肺癌皮下移植瘤生长结果示意图。

具体实施方式

本发明用的材料如下：

1.1细胞细菌

人肺腺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela、肺巨细胞癌细胞95D、人胚肾细胞株HEK293、转T抗原的人胚肾细胞株293T购自ATCC。大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自TAKARA生物公司。NFκB luciferase报告质粒购自clontech公司。

1.2主要试剂

siRNA 广州锐博生物科技公司

TNFa R&D公司

DMEM Hyclone公司

RPMI 1640 Hyclone公司

OPTI-MEM Hyclone公司

胎牛血清 Hyclone公司

胰蛋白酶 Hyclone公司

Sepharose 4B beads GE公司

ProteinA/G beads SANTA CLUZ公司

Lipofectamine^TM 2000 Invitrogene公司

Jet PEI PolyPlus-transfection公司

荧光素酶底物 Promega公司

Trizol Promega公司

oligo(dT)₁₅ 上海生工生物工程技术服务有限公司

逆转录试剂盒 Promega公司

IPTG 广州威佳生物科技有限公司

P65抗体 SANTA CRUZ公司

Flag抗体 sigma公司

PPM1E抗体 SANTA CRUZ公司

裸鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司

实施例1：磷酸酯酶PP2C家族的不同基因对NFκB luciferase报告基因活性的影响。

蛋白磷酸酯酶对生物体的生物学过程具有极为重要的调控作用，目前关于磷酸酯酶的研究的报道还不是很多，磷酸酯酶PP2C家族的功能尚不清楚。我们通过化学合成靶向干扰PP2C家族基因表达的siRNA，将siRNA与NFκB luciferase报告基因质粒共同转染多种人细胞株，通过检测NFκB luciferase报告基因的活性来确定不同磷酸酯酶对NFκB信号通路的影响。

A549、293T细胞常规培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，Hela、95D细胞常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的孵箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。

取对数生长期细胞5×10³细胞接种于96孔板中，使得次日转染时细胞汇合度达70％～80％。根据Lipofectamine^TM 2000试剂操作指南进行转染，设阴性对照Notarget siRNA转染组和PP2CsiRNA转染组，每组设6个重复。转染方案为：在25μL OPTI-MEM中加入0.25μL 20μM的siRNA(正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA dTdA 3′；反义链3′dTdAAGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′)和150ng的NFκB luciferase报告质粒，室温孵育5min。在25μL OPTI-MEM中加入0.65μL Lipofectamine^TM 2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。

48小时后，加入TNFa至终浓度10ng/mL刺激4-6小时，胰蛋白酶消化，按照promega公司提供的单荧光素酶底物检测步骤进行操作，最后测定荧光读数，进行结果分析，并且将对照组(Notarget siRNA)的读数设为100，其他组取相对活性值，最后显示的结果是6孔平均值，做柱状分析图。结果见图1A。与Notarget siRNA转染组比较，PP2C siRNA转染组除了siPPM1J在A549、siPPM1K在293T细胞中上调NFκB luciferase报告基因转录激活活性，其他的均表现为下调NFκB luciferase报告基因转录激活活性，其中siPPM1E抑制其活性超过80％，如图1B所示，提示磷酸酯酶PPM1E与NFκB信号通路之间存在着重大的相关性。

实施例2：mRNA水平和蛋白水平检测siRNAPPM1E对PPM1E基因的沉默效果

磷酸酯酶PPM1E的siRNA显著下调NFκB报告基因的活性，表明其参与调控NFκB信号通路。本发明中用到的siRNAPPM1E是由广州锐博公司应用自主开发的软件进行设计，其序列如下：

碱基序列SEQ ID NO：

正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA dTdA 3′1

反义链3′dTdAAGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′2

正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；3

反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU 5′.4

为了确认PPM1E对NFκB通路的影响，我们在Hela细胞中mRNA水平和蛋白水平检测siRNAPPM1E对PPM1E基因的沉默效果。

Hela细胞常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的孵箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。

取对数生长期的Hela细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为1×10⁵/孔，使得次日转染时细胞汇合度达30％～50％。根据Lipofectamine^TM 2000试剂操作指南进行转染，设阴性对照转染组(siRNA Notarget)、siRNAPPM1E转染组。转染方案为：在250μL OPTI-MEM中加入5μL 20μM的siRNA，室温孵育5min。在250μL OPTI-MEM中加入5μL Lipofectamine^TM2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。

收集转染后36h的细胞，6孔板每孔加入1mL Trizol，加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA，所提RNA溶于40μL无RNA酶水中，紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察RNA完整性。以oligo(dT)₁₅为引物，1μg RNA为模板，按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。

各取逆转录的cDNA产物1μL做模板，以β-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

①PPM1E基因PCR扩增长度为379bp，退火温度为55℃。

上游引物：5′-GGAGTAGATGCTGCTATTTATG-3′SEQ ID NO：5

下游引物：5′-TAGCTCTGGAAACCGACA-3′SEQ ID NO：6

②β-Actin基因PCR扩增长度为452bp，退火温度为55℃。

上游引物：5′-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3′SEQ ID NO：7

下游引物：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′SEQ ID NO：8

PCR反应条件为：95℃预变性10s；94℃变性5s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环。

PCR产物按比例加入SYBR荧光染料，1％琼脂糖凝胶电泳，拍照。结果如图2A，与No target对照组相比，siRNA-PPM1E有效的抑制了PPM1EmRNA水平的表达。

蛋白水平的检测siRNAPPM1E对PPM1E基因表达的干扰，转染细胞与mRNA水平检测的处理相同。转染之后48小时，用细胞刮收集六孔板中的细胞，PBS清洗，3000rpm，5min离心，弃去上清，加入80ul蛋白裂解液TNE(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.1mol/L NaCl；0.1mol/LEDTA，pH8.0；5g/L SDS)，用移液器吹吸几次，充分混匀，冰上裂解15min，4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，加入5xSDS上样缓冲液，95℃-100℃热变性10min。Western blot依照分子克隆实验指南进行操作。SDS PAGE，积层胶80v，分离胶120v。转膜(PVDF膜)横流转膜3mA/cm²，1.5小时。5％TBST-脱脂奶粉室温封闭1小时。PPM1E抗体1∶300稀释在5％脱脂奶粉中，4℃孵育过夜。TBST溶液洗脱3次，每次10min。HRP标记的兔抗羊抗体1∶5000稀释在5％脱脂奶粉中，室温孵育1小时。TBST洗脱3次，每次10min。ECL显色，曝光，显影。结果如图2B所示，与No target对照组相比，siRNA-PPM1E有效的抑制了PPM1E蛋白水平的表达量。

实施例3：在TNFa刺激的条件下，siRNAPPM1E抑制Hela细胞中P65的核输入过程。

静息状态下，NF kB二聚体与IkB结合而存在于胞质中。当NF kB结合位点接受多种免疫刺激，如：肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF)、白细胞介素21(interleukin21，IL21)、脂多糖、T细胞激活剂、生长因子以及病毒感染等均可通过一个或多个信号转录途径激活蛋白激酶，致使NF2kB的抑制物IkB磷酸化而解离，并发生核转位，NF kB二聚体被激活进入细胞核，从而激活基因表达。

本发明中利用TNFa刺激条件下，转染siRNAPPM1E对P65的入核过程的影响直接体现了PPM1E对NF kB信号通路的影响。

取对数生长期的Hela细胞，转染前24h将细胞接种到特制用于激光共聚焦显微镜的带有载玻片的细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵/孔，使得次日转染时细胞汇合度达30％～50％。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染，设阴性对照转染组(Notarget siRNA)、PPM1E siRNA转染组。转染方案为：在250μL OPTI-MEM中加入5μL 20μM的siRNA，室温孵育5min。在250μL OPTI-MEM中加入5μL LipofectamineTM 2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。

36小时后，加入TNFα至终浓度10ng/mL，处理15min，然后吸去培养液，4％的多聚甲醛固定1hr，PBS漂洗5min，0.5％Triton透化15min，PBS漂洗2次，每次5min，10％的羊血清封闭1hr，加入2％羊血清稀释的P65抗体，4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5min，加入2％羊血清稀释的TRITC标记的二抗，PBS漂洗3次，每次5min。Hoechst33342孵育30min。激光共聚焦显微镜观察，拍照。

结果如图3A所示，在TNFa刺激的条件下，与对照siRNANo target组相比，转染siRNAPPM1E的Hela细胞，P65的入核受到了显著的抑制。图3B是整个视野范围内，P65在Hela细胞中核质分布的统计结果，可以直观的看出siRNAPPM1E处理组的Hela细胞中P65入核受到了显著的抑制。

实施例4：PPM1E与P65之间存在相互作用

siRNAPPM1E抑制P65的入核，参与NF kB信号通路调控。我们希望找到PPM1E的靶标分子，于是，我们克隆了NF kB信号通路重要成员，并表达蛋白，希望通过GST pull down实验来找到与PPM1E相互作用的成员。

首先，我们构建PGEX-4T2-PPM1E表达质粒，转化E.coli BL21DE3菌株。37℃，200rpm过夜振荡培养。取过夜培养物，1∶100转接到新鲜的LB培养液中，OD600达到0.6-0.8之间，加入IPTG至终浓度0.8mM，28℃，180rpm诱导表达4hr。收集细菌，200w超声破碎，并用Sepharose4B beads纯化GST融合表达的PPM1E蛋白。同时做空载体质粒PGEX-4T2的对照，纯化GST蛋白，作为阴性对照。

取对数生长期的Hela细胞，使得次日转染时细胞汇合度达70-80％。根据LipofectamineTM2000试剂操作指南进行转染。转染方案为：在500μL OPTI-MEM中加入5μg质粒pcR3.1-TRAF2-flag、pcR3.1-IKKa-flag、pcR3.1-IKKβ-flag，室温孵育5min。在500μL OPTI-MEM中加入10μL LipofectamineTM 2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。48小时后收集细胞，提取总蛋白。

将得到纯化的GST-PPM1E蛋白和阴性对照GST蛋白溶液中，分别加入等量的上述细胞总蛋白提取物混合，4℃混合翻转1.5-2小时，然后离心收集沉淀的beads，4℃，500g离心，洗脱3次，去除非特异结合。95-100℃热变性10min，上样，电泳，westernblot检测。westernblot检测主要实验步骤同2.2，这里的检测用抗P65的抗体，IκBα用抗IκBα的抗体，TRAF2、IKKa、IKKβ因为构建的表达载体上有flag标签，故用抗flag抗体检测。结果如图4所示，与阴性对照GST蛋白组相比，PPM1E特异的与P65发生相互作用。

得到上述结果，我们希望通过免疫共沉淀实验去验证。由于Hela细胞中，P65表达量本底较高，于是，我们采取单赚PPM1E表达质粒，检测活细胞体内P65和PPM1E的关系。

取对数生长期的Hela细胞，使得次日转染时细胞汇合度达60-80％。根据LipofectamineTM2000试剂操作指南进行转染。转染方案为：在500μL OPTI-MEM中加入5μg质粒pcDNA3.1-PPM1E，室温孵育5min。在500μL OPTI-MEM中加入10μL LipofectamineTM 2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。48小时后，收取细胞，提取细胞总蛋白。

ProteinA/G agarose beads50ul，两份，TBS平衡2次，其中一份加入2ug抗P65抗体共同孵育，另外一份加入5ug IgG共同孵育，4℃翻转混匀2hr。再分别加入上述细胞总蛋白提取物，4℃翻转混匀2hr，4℃500g，5min，弃上清。IP buffer洗脱4次，去除非特异结合。95-100℃热变性10min，上样，电泳，westernblot检测。结果如图5所示，与阴性对照IgG组相比，P65特异的与PPM1E发生相互作用。

实施例5：转染siRNA-PPM1E对P65磷酸化水平影响实验。

PPM1E与P65之间的相互作用，PPM1E是一种磷酸酯酶，进一步研究siRNAPPM1E对P65的磷酸化水平影响。

HEK293细胞常规培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的孵箱中培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的HEK293细胞，使得次日转染时细胞汇合度达30-50％。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组(control)、阴性对照转染组(Luciferase siRNA)、PPM1E siRNA转染组。转染方案为：在500μL OPTI-MEM中加入5μL 20uMsiRNA，室温孵育5min。在500μL OPTI-MEM中加入5μLLipofectamineTM 2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。48小时后，收取细胞，提取细胞总蛋白，进行western blot检测。

电泳、转膜和封闭与前面2.2的方法相同，封闭之后，用0.1％TBST溶液洗膜3次，每次5min。P65276和536位点磷酸化抗体1∶1000稀释到5％的BSA溶液中，4℃过夜孵育。.1％TBST溶液洗膜后3次，每次10min。HRP标记的二抗1∶5000稀释到5％的BSA溶液，室温1h。洗膜之后，曝光显影。结果如图6所示，实验结果可以看出，与对照组相比，在HEK293细胞中加了siRNA-PPM1E的实验组的p65-276和p65-536磷酸化水平都有明显升高。

实施例6：siRNAPPM1E靶向抑制PPM1E基因后对裸鼠肺癌皮下移植瘤生长的作用研究。

在细胞水平，我们做了一系列的实验证实了PPM1E参与调控NFκB信号通路。现有的研究证实，NFκB信号通路与多种肿瘤的发生发展相关。我们通过小鼠体内实验，检测PPM1E与皮下移植瘤的生长的影响，从而阐明PPM1E参与调控NFκB信号通路最终引起的效应。

BALB/c裸鼠，4～5周龄，体重20g左右，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于高度洁净的SPF环境下。光照和黑暗12小时循环，动物可自由摄食饮水。

取对数生长期A549细胞，用0.25％胰酶消化收集细胞，以1000r/min离心5min，弃上清液，PBS稀释细胞，血球计数仪计数细胞，用PBS调整细胞浓度至3×10⁶/mL。取上述备好的A549细胞悬液0.2mL，用微量注射器注射至裸鼠前肢皮下部位。

待细胞稳定生长4天后，测定肿瘤体积，按肿瘤大小将小鼠随机分组，每组n＝5，具体分组情况如下：control组(5％葡萄糖Glu+jetPEI)；no target组(5％Glu+jetPEI+15mgsiRNAnotarget)；siRNA组(5％Glu+jetPEI+15mg siRNA PPM1E)；此后，各组小鼠每2天瘤内注射给药一次，给药体积为70μl。每4-5天测定一次肿瘤体积，跟踪观察肿瘤生长情况。末次给药后48小时，脱颈处死小鼠，取背部肿瘤组织，称重(湿重)后，将一半组织冷冻处理，拟做生化指标实验检测；另外一半组织以福尔马林液处理，制作病理切片，观察病理变化。

将实验所测量的肿瘤体积数据统计分析。实验数据均以means±SD表示，以SPSS软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有显著的统计学差异。结果如图7所示，与对照组相比，注射了siRNAPPM1E的实验组裸鼠的肿瘤生长受到了明显的抑制，提示PPM1E可能通过NFκB信号通路调控细胞的增殖和调亡，进而调控肿瘤生长。

序列表

<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120>蛋白磷酸酯酶PPM1E作为疾病的治疗靶标及其应用和siRNA

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

ucaccuccac guuaacuua 19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>2

aguggaggug caauugaau 19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

cuacacgaga uuugcugca 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gaugugcucu aaacgacgu 19

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggagtagatg ctgctattta tg 22

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tagctctgga aaccgaca 18

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgtaccactg gcatcgtgat 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtgttggcgta caggtcttt g 21

Claims

1.蛋白磷酸酯酶PPM1E siRNA在制备治疗肺癌中的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述蛋白磷酸酯酶PPM1E siRNA是具有以下碱基序列的双链RNA：(1)正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA 3′；反义链3′AGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′；或(2)正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU 5′。

3.一种用于治疗肺癌的siRNA，其特征是，其是具有以下碱基序列的双链RNA：(1)正义链5′UCACCUCCACGUUAACUUA 3′；反义链3′AGUGGAGGUGCAAUUGAAU 5′；或(2)正义链：5′CUACACGAGAUUUGCUGCA 3′；反义链：3′GAUGUGCUCUAAACGACGU 5′。