CN101479592A - 通过同时尺寸/荧光测量来进行病原体检测 - Google Patents

通过同时尺寸/荧光测量来进行病原体检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用来检测流体中的病原体与颗粒的方法与装置，其可检测一简单颗粒的颗粒大小与自身荧光。

Description

通过同时尺寸/荧光测量来进行病原体检测
技术领域
本发明一般关于一种检测空气或水中颗粒的方法与系统，特别是有关于用来检测空气或水中颗粒并且将测得颗粒加以分类(classify)的方法与系统。本发明在检测与分类过敏原及生物性战争试剂上特别有用，以下将针对此一用途来说明本发明，但本发明亦可用于其它用途。
背景技术
涉及释放诸如炭疽杆菌等生物性战争试剂的而对城市进行恐怖攻击活动是目前备受关注的问题。由于武器化的炭疽杆菌孢子能够进入人体肺部，因此极危险。对人类而言，炭疽杆菌孢子的致死吸入量LD50(足以杀死50％暴露于该菌中的个人的剂量)估计约2500至50000个孢子，参见T.V.Inglesby等人于JAMA，vol.281.page 1735，1999(1999年发表于JAMA期刊第281卷第1735页中)标题为“Anthrax as a Biological Weapon”)。其它可能的武器化生物试剂还有鼠疫杆菌(yersinia pestis，或称plague)、肉毒杆菌(clostridium botulinum，或称botulism)与土伦法兰西司杆菌法(francisella tularensis)。有鉴于这些潜在的威胁，目前需要一种早期警报系统以检测此类攻击活动。在医疗、健康与食品工业中，使用能检测环境微生物量的实时检测器有利于公共卫生与质量的控制及管理。例如，非肠胃道药物制造商需要监控其无菌室中的微生物浓度。在这些应用中，能立即检测环境中的微生物的设备将会是一种有力的工具，并且比起需要等待数天让微生物生长以进行检测的传统培养皿培养法来说更加有益。
颗粒尺寸测量法以及紫外光(UV)诱导荧光检测法已被用来检测空气中的生物物质。有多项专利描述这些技术可作为检测释放生物武器试剂的恐怖攻击活动的早期警报器。这些装置是由MIT的Lincoln实验室所发展出来的生物试剂警报感应器(BAWS)、由Ho等人所提出的荧光生物颗粒检测系统(Jimyew-Wah Ho，美国专利案5701012、5895922与6831279号)、由Minnesota的TSI所提出的FLAPS与UV-APS装置(Peter P.Hairston与Frederick R.Quant，美国专利案5,999,250号)以及Silcott所发表的荧光传感器(美国专利案6,885,440号)。
T.H.Jeys等人描述一种使用脉冲紫外光激光来诱导荧光的生物传感器(T.H.Jeys，et al.，Proc.IRIS Active Systems，vol.1，p.235，1998)。此传感器能检测每升空气中五个颗粒的空气悬浮浓度(aerosol concentration)，但其设备昂贵又易碎。而诸如美万仪器公司(Met One Instrument，Inc，of Grants Pass，Oregon)、颗粒测量系统公司(Particle Measurement Systems，Inc.，of Boulder，Colorado)以及泰拉全球股份有限公司(Terra Universal Corp.，of Anaheim，California)则制造了其它数种颗粒计数器。
目前已设计出各种传感器来检测空气中的过敏原颗粒，并且当空气样品中的颗粒数量超过一预定最小数量时对过敏体质的个体提出警告。这些传感器揭示于授予Hamburger等人的美国专利案5646597、5969622、5986555、6008729、6087947与7053783号中。这些传感器都涉及引导光束通过一环境空气样品，使得一部分的光线被空气中的颗粒散射掉，并且包含一光束阻档器用以让仅有以一预定角度范围散射的光线通过，该预定角度范围相应于一预定过敏原尺寸，以及还具有一检测器用以检测该通过的光线。
发明内容
为了检测空气或水中的微生物，需要发展出一种有效系统，其能同时测量颗粒尺寸与微生物自身所产生出来的荧光。本发明提供一种检测系统，其能逐个颗粒地同时测量颗粒尺寸以及检测来自代谢物或其它生物分子的自身荧光。相较于传统技术，此检测方法具有多种优点。其中一优点是，该系统能提供鉴别颗粒的测量方法以识别颗粒，而而不是依赖现有技术中用于颗粒识别的统计模式。该鉴别性测量方法比现有方法更能够明确地指出颗粒特性且较不依赖统计模式。其亦可减少微生物检测误判的可能性，例如可将尺寸大于微生物的花粉以及尺寸小于微生物的烟雾颗粒排除在检测范围之外。再者，该系统亦允许细节分析从每一个单独颗粒上所收集到的数据以鉴定该颗粒，例如来自颗粒的荧光信号强度与颗粒截面或体积有关，以测定该颗粒的生物状态。
本发明包含三种主要构件：(1)一第一光学系统，用以测量一单独颗粒的尺寸；(2)一第二光学系统，用以检测来自该单独颗粒的紫外光诱导发光的自身荧光信号；以及(3)一用以将颗粒尺寸与荧光强度指派给一单独颗粒的数据纪录格式(data recording format)，以及计算机可读程序代码，用以区分(differentiating)微生物与非微生物，非微生物即例如惰性灰尘颗粒。
本发明的光学组件具有两种光学子组件：(a)一光学机构(optical setup)以测量颗粒尺寸，举例而言，本发明一较佳实施例中以新的方式来使用公知且常用的米氏散射检测机构(Mie scattering detection scheme)，使该系统能够高度精准地测量空气中尺寸介于0.5微米至20微米之间的颗粒。由于不同种类的微生物具有不同的颗粒尺寸范围，因此能够细微区分颗粒尺寸的能力是很重要的，其能用以判定微生物的种类；(b)测量颗粒尺寸的同时，一光学设备用来测定来自该待测颗粒的荧光强度，举例来说，本发明较佳实施例中使用一椭圆镜，其设置用来收集从该已测量尺寸之同一颗粒所发出的荧光。
附图说明
可从上述详细叙述配合附图说明来了解本发明的进一步特征与优点，附图如下：
图1显示数种空气中的惰性颗粒与微生物颗粒的颗粒尺寸范围；
图2(a)为同时测定颗粒尺寸与荧光所得测量值的直方图，显示不含微生物的空气的颗粒分布情形；
图2(b)显示对含有贝克氏酵母菌粉末的空气同时测量颗粒尺寸与荧光所得测量值的直方图；
图3为掺杂了7微米的荧光染料后同时测量颗粒尺寸与荧光的测量值的直方图；
图4为根据本发明的光学系统的示意图，其可执行同时测量颗粒尺寸与荧光的方法；以及
图5为图4的光学系统的方块图。
具体实施方式
图4显示一光学系统的示意图，其可用于根据本发明第一示范实施例的流体颗粒检测系统。此系统的第一示范实施例被设计例如用来检测恐怖份子或他人释放在空气或水中的生物试剂，但亦可用来检测空气或水中自然存在、意外、不慎或蓄意释出的霉菌或细菌等有害颗粒浓度等一般用途，或者应用于诸如食品与药物制造工厂及无菌室等工业应用用途。
“流体悬浮颗粒(fluid borne particles)”一词在此处指空气悬浮颗粒与水中悬浮颗粒两种。
“病原体(pathogen)”一词在此指任何空气或水中悬浮颗粒、生物试剂或有毒物质，如果这些颗粒在空气或水中存在足够数量，则可能伤害或甚至杀死暴露于这些颗粒中的人类。
“生物试剂(biological agent)”一词定义为任何微生物(microorganism)、病原体或感染性物质(infectious substance)、毒素、生物毒素，或是微生物、病原体或感染性物质的任何天然、生物工程或人工合成成分，而不论其来源或制造方法为何。此类生物试剂包括例如生物毒性、细菌、病毒、立克次体(rickettsiae)、孢子、真菌以及单细胞动物(protozoa，原生动物)以及其它公知物种。
“生物毒素(Biological toxins)”一词指从活植物、动物或微生物所生产或衍生出，但也可通过化学方法制造或改变而得的有毒物质。然而，毒素(toxin)通常从宿主微生物中自然产生，例如海藻会产生贝毒素(saxitoxin)，但是也可在实验室中通过基因改造及/或人工合成的方式来制造毒素。相较于微生物，毒素具有相对较简单的生物化学成分，并且无法自行复制。在许多方面上，毒素相当于化学试剂。此类生物毒素例如肉毒杆菌素、破伤风毒素(tetanustoxins)、金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B)、霉菌毒素(tricothocene mycotoxins)、
Figure A200780024666D0009081830QIETU
麻毒素(ricin)、贝毒素(saxitoxin)、志贺菌素(Shiga)与类志贺菌素、绿树眼镜蛇毒(dendrotoxins)、扁尾蛇毒素(erabutoxin b)以及其它公知毒素。
本发明检测系统被设计用来检测空气或水中悬浮颗粒，并且产生多个输出值以指示例如检测样品中各种颗粒尺寸范围内的颗粒数量，以及指示这些颗粒是生物性或非生物性颗粒。若颗粒的数量及/或生物有机体、生物试剂与潜在危险物质超过一高于正常背景浓度的预定数值时，该系统亦可产生一警示信号或其它反应。
图4显示根据本发明实施例的流体颗粒检测系统10。如图4所示，该系统10包含一紫外光(UV)激发光源12，例如能提供电磁辐射束14的激光且具有紫外光波长。该UV光源可加以选择，使其具有能够激发微生物内部代谢物质的自身荧光的波长。举例而言，该激发光源12的较佳操作波长介于约270纳米(nm)至约410纳米之间、或较佳介于约350纳米至约410纳米之间。可假设这些微生物包含三种主要代谢物：色胺酸(tryptophan)，其正常荧光约270纳米且范围介于约220至约300纳米；烟酰胺腺嘌呤二核苷(nicotinamideadenine dinucleotide，NADH)其正常荧光约340纳米且范围约介于320至约420纳米之间；以及核黄素(riboflavin)，其正常荧光约为400纳米且范围介于约320纳米至约420纳米之间，故可选择介于约270至约410纳米的波长。然而较佳者，该激发光源12具有介于约350至约410纳米之间的波长。此波长确保能激发生物试剂中三种主要代谢物中的其中两种，即NADH与核黄酸，但排除对诸如来自柴油引擎废气与如灰尘或爽身粉等其它惰性颗粒的干扰激发作用。因此，在本发明一较佳实施例中可根据能够激发NADH与核黄素(或激发色胺酸)的荧光同时不会发生如柴油引擎废气的干扰激发情形的能力来选择激发光源12的波长范围。此步骤是用来减少因柴油废气所造成的误报机率，其中柴油废气的紫外光激发波长为266纳米。
在图4所绘示的系统10中，透过一颗粒采样喷嘴16将环境空气或液体样品注入该系统中。喷嘴16在其中间区段具有一开孔18，以允许激光束通过该颗粒流。该激光束下游是一米氏散射颗粒尺寸检测器(Mie scatteringparticle-size detector)20。米氏散射颗粒尺寸检测器20包含一光束阻挡镜22、一准直器透镜24(collimator lens)以及一聚光镜26，用以将一部分的光束14聚焦在颗粒检测器28上。
偏离该激光束14的轴处，一椭圆镜(elliptical mirror)30设置在颗粒采样区域处，如此一来，该注入颗粒流与该激光束的相交点位在该椭圆的两交点的其中一交点处，同时一荧光检测器32(在此范例中为光电倍增管)则占据在另一交点处。此种设计利用从该椭圆镜两交点其中一者发出的光源点将会聚焦至另一交点上的原理所设计而得。在此种光学设计中，椭圆镜30将来自微生物的荧光信号集中起来，并将其聚焦在荧光检测器32上。光学滤片(filter)34设置于该荧光检测器的前方，以阻挡已散射的紫外光，并使诱发出来的荧光通过该滤片。
光束阻挡镜22被设计用以反射该激光束14的非散射光部分并具有诸如乙烯系的材料黏附在一前表面上，以反射该电磁辐射束中的非散射部分。该光束阻挡镜22的其它特征与考虑揭示于如上所列之Hamburger等人的较早美国专利案中，以及PCT申请案PCT/US2006027638号中，在此以引用方式并入这些参考文献以供参考。
该颗粒检测器20可包含例如一光电二极管(photodiode)，用以测定颗粒尺寸，例如于上述Hamburger等人的较早美国专利案中所述，并将这些文献以引用方式结合在本文中。
本发明使用米氏散射亦有例于光学构件的配置，用于检测紫外光发光作用以同时检查单独颗粒是否存在有NADH、核黄素等代谢物及其它生物分子，这些代谢物是活有机体的代谢作用中的必要中间产物，因此其会存在于诸如细菌与真菌等微生物中。若有这些化学物质存在于生物悬浮物中，则这些物质会被紫外光子能量所激发，随后会放出自身荧光而可利用根据上述检测系统所做成的设备来测量。虽然上述机构不能识别微生物的属别或种类，并且病毒亦因颗粒太小且缺乏用以检测的代谢作用，因此该检测系统还能同时测量每个颗粒的尺寸，并且根据是否测出微生物性或惰性颗粒，会指示使用者是否发生微生物污染。
参见第5图，本发明系统能同时测定颗粒尺寸与测量荧光的功能以图表来显示其测量结果。该系统的操作原理如下：一设备持续监控环境空气或液体，以实时测量每个单独空气悬浮颗粒的尺寸，并且同时判定该颗粒是否发出荧光。并且为荧光信号设定一阈值(threshold)。若该荧光信号低于该设定阈值，则将该颗粒标示为惰性颗粒。此荧光信号阈值可为荧光信号强度，荧光强度与颗粒截面积或颗粒体积成函数关系。若荧光信号阈值超过该设定值，则将颗粒标示为生物性颗粒。由颗粒尺寸与荧光信号强度所组合而得的数据将用来逐个颗粒地判定是否为微生物。图2(a)与图2(b)显示根据本发明的检测器的功能。这些图显示出利用此检测系统所测得的环境空气悬浮颗粒数据。在每个图中，图的上半部分以对数坐标来绘示出颗粒浓度(每升的空气)对颗粒尺寸(从1至13微米)做图的直方图；其中实心直条代表惰性颗粒，而斜纹直条则代表微生物。图的下半部分则是在一秒内所检测颗粒的实时截图：每个长条(spike)代表单一个颗粒，而长条的高度则相应于颗粒的尺寸。图2(a)是对干净空气进行测试的结果，因此图中仅显示出惰性颗粒而没有微生物。在第二个实验中，则在空气中加入贝克氏酵母菌粉末(Saccharomyces cerevisiae)。此试验检测到微生物的存在，并且绘示成图2(b)中的斜纹直条。
图3显示当将掺有7微米荧光染料的塑料颗粒注入能同时测量颗粒尺寸与荧光的检测器中时所获得的数据组。这些斜纹直条显示出在这些颗粒中，分布在7微米颗粒尺寸处的颗粒发出荧光。
需强调的是，上述多个本发明实施例，特别是较佳实施例，仅是本发明的数个可行范例，用以清楚说明本发明原理。然而在不偏离本发明精神与原理的条件下，当可对上述多个实施例进行修改与变化。所有的修改与变化亦为本文揭示内容与本发明范围所涵盖，且受后附权利要求所保护。

Claims (36)

1.一种区分一流体中的生物颗粒与惰性颗粒的方法，其包含同时测量颗粒尺寸以及检测来自该颗粒的自身荧光。
2.根据权利要求1所述的方法，其中测量荧光强度并且指定一数值，以及包括根据颗粒尺寸与荧光强度来分类该颗粒是惰性颗粒或生物颗粒的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该颗粒的尺寸信息用来分类该颗粒是否为微生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该颗粒的尺寸信息是藉由测定该颗粒的截面积或体积而得。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过测定该颗粒的直径，并且根据该直径计算出该颗粒的体积，而得出该颗粒的体积。
6.根据权利要求2所述的方法，其中从一单独颗粒得来的颗粒尺寸与荧光强度数据能用来从微生物中区别出花粉与过敏原。
7.根据权利要求2所述的方法，其中从一单独颗粒得来的颗粒尺寸与荧光强度数据能用来估计出这些生物颗粒内部的生物化学物质的相对含量。
8.根据权利要求2所述的方法，其中从一单独颗粒得来的颗粒尺寸与荧光强度数值利用该颗粒的尺寸或体积加以归一化，且用来区分微生物与惰性颗粒。
9.根据权利要求2所述的方法，其中从一单独颗粒得来的颗粒尺寸与荧光强度数值利用该颗粒的尺寸或体积加以归一化，且用来从微生物中区分出花粉与过敏原。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该流体包括空气。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该流体包括水。
12.一种检测与分类一液体或气体中的颗粒的方法，其包括以一紫外光源照射该颗粒，并且同时测量该颗粒的尺寸以及任何来自该颗粒的自身荧光。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该颗粒包括生物颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该生物颗粒包括一微生物。
15.根据权利要求12所述的方法，其中该生物颗粒选自于由细菌、霉菌、真菌及孢子所构成的群组中。
16.根据权利要求12所述的方法，包括测量荧光强度的步骤。
17.根据权利要求12所述的方法，包括比较颗粒尺寸信息与荧光强度以分类该颗粒为惰性来源或微生物来源的步骤。
18.根据权利要求12所述的方法，包括区分该颗粒为细菌、霉菌、真菌或孢子的步骤。
19.根据权利要求12所述的方法，包括区分该颗粒为花粉或过敏原的步骤。
20.根据权利要求18所述的方法，包括根据该颗粒的荧光反应来分类该颗粒的步骤。
21.根据权利要求19所述的方法，包括根据该颗粒的荧光反应来分类该颗粒的步骤。
22.根据权利要求18所述的方法，包括根据该颗粒的直径或体积来分类该颗粒的步骤。
23.根据权利要求18所述的方法，包括根据该颗粒已使用其直径或体积加以归一化后的荧光强度，来分类该颗粒的步骤。
24.根据权利要求19所述的方法，包括根据该颗粒的直径或体积来分类该颗粒的步骤。
25.根据权利要求19项所述之方法，包括根据该颗粒已使用其直径或体积加以归一化后的荧光强度，来分类该颗粒的步骤。
26.一种颗粒检测系统，包括：
一样品槽；
一光源，其位于该样品槽的一侧，用以输出一聚焦光束通过该样品，藉此该样品区域中各种尺寸的颗粒会以各种角度散射一部分光束，并且该光束未被散射掉的部分则保持未散射状态；
一光束阻档器，其位于该样品槽的一相反侧上，用以至少阻挡掉该光线未被散射的部分，以限制所测定的颗粒范围；
一第一检测器，设置于该光线路径中且位于该光束阻档器之后，用以检测一部分向前散射的光线，以及产生一输出值，该输出值包含在该光束路径内落在一预定尺寸范围中的单一颗粒的尺寸信息；
一第二检测器，设置于偏离该光束轴处，用以检测来自该相同单一颗粒的自身荧光。
27.根据权利要求26所述的系统，其中一椭圆镜位于一颗粒采样区域中，使得该光束与该通入颗粒流的相交点位于该椭圆的一焦点处，并且该第二检测器位在该另一焦点处。
28.根据权利要求26所述的系统，还包括一警示单元，用以当检测到介于该预定尺寸范围内的一颗粒，且亦发出荧光时，提供一警示信号。
29.根据权利要求26所述的系统，其中该光源发出紫外光。
30.根据权利要求26所述的系统，其中该光源包含一发光二极管。
31.根据权利要求30所述的系统，还包括一准直仪透镜，其光学性地设置在该光源与该第一检测器之间。
32.根据权利要求26所述的系统，还包括一处理单元，用以处理一指定时间的颗粒尺寸分布与颗粒荧光，并将该颗粒的直方图显示在一输出装置上。
33.根据权利要求26所述的系统，其中该第一检测器包括光电二极管。
34.根据权利要求26所述的系统，其中该样品槽包括一空气样品槽。
35.根据权利要求26所述的系统，其中该样品槽包括一水样品槽。
36.根据权利要求26所述的系统，还包括计算机可读程序代码，用以积分所测得的颗粒尺寸以及所测得的自身荧光。
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