CN101460613A - 三酰甘油脂肪酶的功能性表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码三酰甘油脂肪酶的核酸、包含此类核酸的载体、包含此类核酸或载体的宿主细胞、在原核生物中表达三酰甘油脂肪酶的方法、检测和产生三酰甘油脂肪酶的方法，以此方式获得的三酰甘油脂肪酶，以及编码三酰甘油脂肪酶的核酸、载体和重组宿主细胞用于上述方法的用途。

Description

三酰甘油脂肪酶的功能性表达
本发明涉及编码三酰甘油脂肪酶的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞、在原核生物中表达三酰甘油脂肪酶的方法、用于检测和用于产生三酰甘油脂肪酶的方法、由此获得的三酰甘油脂肪酶，以及编码三酰甘油脂肪酶的核酸、载体和重组宿主细胞用于前述方法的用途。
发明背景
三酰甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)是用于多种工业用途的有价值的有效催化剂，例如用于去污剂工业、油化学、食品工业以及精细化学品的产生中(Schmid 1998)。脂肪酶是羧酸酯酶，其催化三酰甘油以及其它通常的疏水性酯类的水解和合成。其三维晶体结构已经被阐明的所有三酰甘油脂肪酶属于α/β-水解酶折叠蛋白质家族，它们具有相似的整体构造(Ollis 1992)。
南极假丝酵母(Candida antarctica)-脂肪酶B(CalB)是用于许多反应的有效催化剂，并且被用于例如立体选择性转化和聚酯合成(Anderson1998)。CalB具有溶剂可及活性中心(Uppenberg 1994)，并且不显示出间期活性(Martinelle等人，1995)。活性中心是窄的漏斗，并且由于此原因，CalB在羧酸酯类(例如辛酸乙酯)方面比三酰甘油方面具有更高的活性(Martinelle 1995)。CalB在有机介质中与在水中的活性相当，特别是CalB对于仲醇的高对映选择性，这一事实使得该酶目前在生物技术的使用中成为最重要的脂肪酶之一。
过去，为了用于大规模工业应用，CalB主要在米曲霉(Aspergillusoryzae)中表达(Hoegh 1995)。为了研究目的，该酶在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(Rotticci-Mulder等人2001)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Zhang等人2003)中成功表达。在容易操作的原核生物表达系统大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))中没有成功表达CalB(Rotticci-Mulder 2003)。在大肠杆菌中的表达随后第一次实现，但是仅产生低产量的功能性CalB(Rusnak 2004)。这是不利的，因为大肠杆菌具有许多优于其它表达系统的显著优点并且允许快速、便宜的高通量筛选大基因文库。
近期描述了通过随机诱变修饰CalB(Chodorge等人，2005)。文献中也已经报道了通过合理的酶设计改良CalB用于特定应用的许多尝试。尽管这些中的一些产生了好结果(Patkar等人1998；Rotticci 2000)，通过对酶的催化性质的不足的理解，合理酶设计的可能性仍然是有限的。
但是，要解决的主要问题是CalB在大肠杆菌中表达时不充分的功能性，这是通过定向进化改善酶的前提。究其原因在于酶的复杂三级结构，这需要三个二硫桥的形成，以确保功能性构象。在大肠杆菌或其它原核生物中产生此类蛋白质是很难的，因为原核生物的细胞环境、折叠机制和折叠质量控制的限制点不同于真核生物的那些(Baneyx和Mujacic 2004)。相应地，在大肠杆菌的CalB的前期表达实验中，发明人发现有内含体形成并且缺乏CalB活性(结果未显示)。
在翻译水平上可以发生额外问题。在许多生物中tRNA种类的量可以差别很大。这一问题可以通过密码子优化来克服，事实上，一些真核蛋白质(例如人1型神经纤维瘤蛋白的结构域)的表达水平显著升高(Hale1998)。但是，功能性酶的量不直接与表达水平相关，因此也是仅有条件地与密码子选择相关。
除了实际的基因序列，启动子在表达效率中起到了关键作用。在生物技术中，通常使用的载体系统，例如pET载体系统(诺华基因公司(Novagen))包含T7启动子，其使得所述载体适于在大肠杆菌中严格调节异源蛋白质的显著过量表达。但是，异源表达的酶的高表达水平非常通常地导致不正确折叠的蛋白质。
已经显示冷敏感启动子可以在降低的温度下促进某些蛋白质的有效基因表达。特别地，过去使用主要的冷激基因cspA的启动子(Goldstein等人1990)。但是，从相当的研究中明显可见，大肠杆菌中可溶性蛋白质的表达仍是有问题的并且取决于蛋白质和蛋白质所来源的生物(Qing等人2004)。
细胞环境也可以对功能性(即酶促活性)的蛋白质的产量造成影响。已经报道了谷胱甘肽还原酶(gor)和硫氧还蛋白还原酶(trxB)的基因中的突变可以导致在大肠杆菌细胞质中表达时蛋白质中增加的二硫桥的形成(Prinz等人1997)。
改良大肠杆菌细胞质中可溶性蛋白质的产量的一种方法包括涉及从头的蛋白质折叠的分子陪伴的共表达。因此，过去已经报道了分子伴侣DnaK-DnaJ或引发因子(TF)的过量表达增加了在大肠杆菌中表达时选定蛋白质的溶解性(Nishihara等人2000)。对于>60kD的靶蛋白质报道了好结果。基于GroEL-GroES的另一机制可以用于小于约60kD的靶蛋白质(Baneyx和Mujacic 2004)。
除了过去在异源蛋白质在大肠杆菌中的功能性表达方面产生的进展外，成功的表达还不能被预测，但是相当程度上取决于在每种情形中所用的蛋白质。
还没有报道在重组三酰甘油脂肪酶(特别是例如CalB)的功能性表达中的增加。
本发明的目标因此是提供编码三酰甘油脂肪酶的核酸以及在原核生物中其改良的功能性表达的方法。另一目标是提供检测三酰甘油脂肪酶的方法、筛选所述三酰甘油脂肪酶的方法，以及产生所述三酰甘油脂肪酶的方法。
发明概述：
本发明的目标是通过表达三酰甘油脂肪酶的方法来实现的，所述方法中蛋白质的增加的功能性表达是通过在原核生物，特别是大肠杆菌宿主菌株中在下文详细描述的特定条件下表达来实现的。
目标还是通过下述实现：提供就原核生物(特别是大肠杆菌)中脂肪酶B的表达而被优化的编码核苷酸序列。
该目标还是通过检测三酰甘油脂肪酶(特别是CalB)的方法、用于筛选三酰甘油脂肪酶的检测方法的用途以及其产生方法来实现的。
附图描述：
图1：从南极假单胞菌(C.antarctica)扩增的calB_wt与源自pPCR/calB载体的合成序列-优化的基因calB_syn之间的序列比较。差异突出显示。
图2：在CaIB-表达实验中使用表达载体pET32-b(+)(在OrigamiTM 2(DE3)细胞中)或pColdIII(在OrigamiTM B细胞中)在15℃获得的可溶(S)和不可溶(I)级分的SDS-PAGE分离。用箭头指出CalB条带(33kDa)和Trx-CalB融合蛋白条带(45kDa)。M：分子量标准。C：用空载体的对照级分。
图3：可溶(S)和不可溶(I)级分的SDS-PAGE分离，所述级分是通过在OrigamiTM B细胞中用pColdIII构建体与不同分子伴侣质粒(a：pGro7，b：pG-Tf2，c：pTf16，d：pKJE7，e：pG-KJE8)的CalB共表达实验获得的。用箭头标出CalB(33kDa)和分子伴侣(GroEL：60kDa，Tf：56kDa，DnaK：70kDa，DnaJ：40kDa)。M：分子量标准(29、43和66kDa)。C：来自用空载体的对照的级分。
图4：来自大肠杆菌OrigamiTM 2(DE3)细胞(在pET32b(+)表达的情形中)和OrigamiTM B细胞(所有其它构建体)的澄清的细胞裂解物的丁酸甘油酯方面的水解活性，所述细胞具有所述构建体。显示了4-6个独立表达实验的平均值和标准偏差。
图5：通过澄清的细胞裂解物的96孔微量滴定板中pNPP的水解，所述细胞裂解物来自包含pColdIII/calB_wt或_syn和GroES/GroEL(pGro7)的Origami B细胞。在表达CalB的细胞的情形中，研究了17(calB_wt)和18(calB_syn)个孔。使用具有包含空pColdIII载体和pGro7的OrigamiTM B细胞的6个孔作为对照。将值用背景消光值(无细胞裂解物的底物)进行标准化。
发明详述：
本发明的第一个目标涉及在原核生物中表达功能性三酰甘油脂肪酶的方法，这是通过在诱导型启动子控制下，在原核细胞(优选在大肠杆菌中)表达编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列。表达特别在重组原核细胞中发生。
根据本发明，“三酰甘油脂肪酶”意思是根据IUBMB酶命名(http://www.iubmb.unibe.ch；http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) 的类E.C.3.1.1.3的酶。此外，根据本发明的方法特别适合于用于脂肪酶的功能性表达，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一个或多个S-S桥(二硫桥)，例如每条肽链1、2、3、4、5或6个S-S桥，其中S-S桥可以在相同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子内)和/或不同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子间)。具有S-S桥的脂肪酶的其它实例是来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的脂肪酶(Tsuchiya等人，1996)、来自Penicillum camenbertii的脂肪酶(Yamaguchi等人，1991)、来自Rhizomucor mihei的脂肪酶(Boel等人，1988)和来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶(Longhi等人，1992)。
在特定实施方案中，表达在低温下进行。对于本发明的目的，将低温理解为室温或低于室温的温度，即大约25℃或更少，例如25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃的温度，或者这些值之间的温度。
根据其它实施方案，用于表达的温度选自1℃至20℃的范围，特别是10℃至20℃的范围，例如10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃，并且特别是13℃至16℃的范围，例如13℃、14℃、15℃或16℃。在特定的实施方案中，用于表达的温度是大约15℃。
本发明的一个目的涉及在缺乏硫氧还蛋白还原酶和/或缺乏谷胱甘肽还原酶的大肠杆菌菌株中的表达。所述菌株的实例为OrigamiTM 2((DE3)和OrigamiTM B(诺华基因公司(Novagen)，Darmstadt，德国)。
不希望受到理论的限制，假设这些酶阻止了蛋白质中的S-S桥的形成或有助于已经形成的S-S桥的还原。一种或多种这些酶的不存在或者其酶活性的阻抑因此稳定了包含所述S-S桥的蛋白质的构象。
根据本发明方法的特定实施方案，功能性表达的三酰甘油脂肪酶是脂肪酶B，即来自南极假丝酵母的CalB的基因产物。描述了calB基因(Uppenberg等人，1994)，并且其核苷酸或蛋白质序列在GeneBank中在登录号Z30645和CAA83122.1下存储。除非更加精确地指明，在此CalB意思是具有该登录号的核苷酸序列。三酰甘油脂肪酶的另一实例是来自Pseudozyma tsukubaensis的脂肪酶B(Suen等人2004)。
根据本发明方法的另一特定实施方案，编码三酰甘油脂肪酶的序列是calB_wt(SEQ ID NO：2)。calB_wt源自发明人的前一个项目，其中，CalB在巴斯德毕赤酵母中功能性表达，并且包含在pPICZαA/calB构建体中(Rusnak2004)。在该项目中，扩增自南极假丝酵母的基因组DNA的calB基因相对于公开的CalB序列(CAA83122.1)在氨基酸水平上表现出两处改变(T57A，A89T；SEQ ID NO：13)。这两处偏差出现在两个独立的扩增测定中，在所述测定中基因扩增自两个不同的基因组DNA提取物。由于该原因，它们极有可能是脂肪酶基因的天然变异。在巴斯德毕赤酵母中表达时，所述脂肪酶显示出与野生型CalB的公布的值相当的活性，从而在前一个项目中，发明人用所述扩增的基因继续了这一工作(Rotticci-Mulder等人，2001；Rusnak 2004)。
根据本发明方法的另一特定实施方案，编码三酰甘油脂肪酶的序列是calB_syn(SEQ ID NO：1)。从序列优化中获得calB_syn。序列优化方案是本领域技术人员已知的，并且可以包含多种测量之一或其组合。例如，就氨基酸选择密码子，从而使它们对应于在所选定的宿主中相对最频繁发生的转移RNA。此外，避免具有非常高(>80％)或低(<30％)的GC含量的区域或对于表达(以及因此DNA的转录和/或mRNA的翻译)有影响的特定的序列基序是有优势的。为了产生calB_syn，使用GeneOptimizerTM技术(基因阿特公司(GeneArt)，Regensburg，德国)优化密码子选择，并且此外，如果可能避免具有非常高(>80％)或低(<30％)的GC含量的区域。此外顺式作用的序列基序，例如内部TATA框、chi位点、核糖体连接位点、ARE、INS和CRS序列元件以及重复序列和RNA二级结构被避免。该基因在253个核苷酸(26.5％)上不同于calB_wt序列(图1)。在氨基酸水平上，合成基因编码公开的蛋白质(CAA83122.1；SEQ IDNO：12)。
根据本发明方法的另一个特定实施方案，编码三酰甘油脂肪酶的序列是calB_wt或calB_syn的同源物。在本文描述的各个背景中，来自南极假丝酵母的calB，特别是calB_wt和/或calB_syn以及其同源物，尤其是编码功能性等价物的同源物是优选的编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列的代表。
根据本发明，同源核苷酸序列或同源核酸或同源物意思是，当与参照核苷酸序列或参照核酸相比，不超过40％的核苷酸，特别是不超过35％的核苷酸，例如不超过30％的核苷酸或不超过26％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的核苷酸是不同的。例如，与SEQ ID NO：1同源的序列与SEQ ID NO：1的不同不超过40％的核苷酸，特别是不超过35％的核苷酸，例如不超过30％的核苷酸，或不超过26％、25％、20％、15％或10％的核苷酸。
同源核苷酸序列特别表示这样的序列，例如与前述参照核苷酸序列在“严格条件”下杂交的那些。将这一性质理解为多聚核苷酸或寡核苷酸在严格条件下结合几乎互补的序列的能力，其中在所述这些条件下，较少互补的对之间的非特异性键不存在。为此，所述序列应当有70％-100％的互补，优选75％、80％、85％或90％至100％的互补。能够特异性彼此结合的互补序列的性质在例如Northern印迹或Southern印迹技术中或在PCR或RT-PCR的引物结合中被使用。通常为此使用从30个碱基对的长度开始的寡核苷酸。“严格条件”意思是，例如在Northern印迹技术中，使用在50-70℃(优选60-65℃)的热洗涤溶液，例如具有0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)，用于洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，之后仅高度互补的核酸保留彼此结合。严格条件的建立是本领域技术人员已知的并且描述在例如Ausubel等人(1989)(节6.3.1-6.3.6)中。例如通过检查基因组或cDNA库来鉴定同源核酸，并且任选地可以在PCR中用适当的引物从它们中扩增所述同源核酸，然后例如使用适当的探针进行分离。
根据本发明的三酰甘油脂肪酶(特别是根据本发明的来自南极假丝酵母的脂肪酶B)的同源物可以通过筛选突变体(例如缩短突变体)的组合文库来鉴定。例如，通过核酸水平的组合诱变来产生蛋白质变体的文库，这是例如通过合成的寡核苷酸混合物的酶促连接来实现的。有许多方法可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的同源物文库。简并的基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成的基因连接进适当的表达载体中。简并基因组的使用使得在混合物中提供所有序列成为可能，所述混合物编码所需的潜在蛋白质序列组。合成简并的寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang 1983；Itakura等人.1984；Ike等人，1983)。
根据其它实施方案，编码三酰甘油脂肪酶并且特别是编码根据本发明的CalB的核苷酸序列受到T7启动子的控制，所述启动子例如根据SEQ IDNO：3的启动子或与其同源的序列。允许在T7启动子的控制下表达的适当的载体是本领域技术人员已知的，例如pET载体系统(诺华基因公司(Novagen))如载体pET-32a-c(+)。根据本发明，在pET-32b(+)中制备calB_syn或calB_wt(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)。从这些载体中的表达特别在上述温度下发生。根据本发明，令人惊讶地发现，不使用特定冷诱导型启动子从pET-载体表达calB_wt或calB_syn时，通过在低温下孵育形成了增加比例的功能性蛋白质。
根据其它实施方案，编码三酰甘油脂肪酶并且特别是编码根据本发明的CalB的核苷酸序列受到由冷激可诱导的启动子的控制。就本发明的目的而言，冷激意思是将启动子暴露给低温。由冷激诱导的适当的启动子是大肠杆菌的初级冷激基因cspA的启动子(SEQ ID NO：4)(Goldstein等人，1990)。本领域技术人员已知包含该启动子的表达载体(使得可能通过常规方法克隆所需靶基因)，例如来自塔卡拉生物有限公司(Takara Bio Inc.，日本(Takara2003))的以其多种形式的载体pCOLD。根据本发明，在pCOLDIII中制备calB_syn或calB_wt(SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10)。已经令人惊讶地发现，在OrigamiTM 2(DE3)细胞和OrigamiTM B细胞中从这些载体表达时，形成了增加量的功能性蛋白质。冷激启动子的诱导通过在低温下孵育并且任选地添加表达所需的其它因子(例如在lac-操纵基因控制下的基因的情形中的IPTG)而发生。任选地通过在冰上在前孵育(例如30分钟孵育)促进低温的受控的建立。其它冷诱导型启动子是本领域技术人员已知的，并且描述在例如Qoronfleh等人，1992，Nakashima等人1996或Giladi等人1995中。
不受到理论的限制，假设用于三酰甘油脂肪酶(特别是CalB和其功能性等价物)的增加的功能性表达的方案包括：允许仅在低温下蛋白质的基本表达。如果表达在高于以上的温度下发生(即使表达随后在正常导致功能性蛋白质的条件(例如低温)下发生)，形成不正确折叠的蛋白质，其作用为结晶核，扰乱功能性蛋白质的形成。根据本发明执行该方案包括在启动子的控制下表达(所述启动子仅允许在低温下显著表达(例如在pCOLD载体中包含的启动子))，以及表达任选地还受到转录阻抑物(例如lacI的基因产物，其在IPTG不存在时阻止转录并且在IPTG存在时允许所述转录)的控制。另一执行包括：使用启动子，特别是强启动子，所述启动子的转录活性可以受到严格控制并且其允许这些启动子仅在低温下转录。包含T7-启动子的pET-载体与其它启动子或者启动子的组合，以及调节元件(例如阻抑物)是本领域技术人员已知的，例如C1-调节的启动子(Schofield等人，2002)，PltetO-1启动子(Lutz和Bujard，1997)或rhaT启动子(Giacalone等人2006)。
就所用的每种载体系统选择孵育时间，使得形成最大量的功能性蛋白质，所述孵育时间可以由本领域的技术人员就在每种情形中从给定核酸中待表达的蛋白质进行常规测试来容易地确定。时间的通常长度是1至48小时，例如8、12、16和24小时。
根据本发明方法的另一实施方案，与编码三酰甘油脂肪酶并且特别是编码CalB的核苷酸序列同时，表达一种或多种分子伴侣。分子伴侣例如选自大肠杆菌的GroES、GroEL、DnaK，DnaJ、GrpE和引发因子(TF)。表达可能以任何组合，但是特别是共表达的下述组合：GroEL和GroES；或DnaK、DnaJ和GrpE；或DnaK、DnaJ、GrpE、GroES和GroEL；或者引发因子任选地与GroES和GroEL一起共表达。分子伴侣可以与来自载体的编码三酰甘油-脂肪酶的核苷酸序列一起表达。可选地，表达来自分开的载体的编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列和编码一个或多个伴侣分子的一个或多个核苷酸序列。适当的载体包含在可商购的“伴侣分子质粒组(Chaperone Plasmid Set)”中，其包括质粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16(塔卡拉生物医药公司(Takara Biomedicals)，日本，Takara2003b)。
本发明的另一目标涉及用于检测三酰甘油脂肪酶的方法，其中
i)假设有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质根据本发明前述方法之一被表达，
ii)将表达产物与可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接触，以及
iii)确定水解活性。
该方法适合用于鉴定(即筛选)新的三酰甘油脂肪酶，特别是那些具有与来自南极假丝酵母的脂肪酶B的酶促活性相当的酶促活性的酶。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，该方法可以类似地应用于下述脂肪酶，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一个或多个S-S桥，例如每条肽链1、2、3、4、5或6个S-S桥，并且S-S桥可以在相同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子内)和/或不同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子间)。
适当的可水解底物是本领域技术人员已知的，并且水解活性的证明也可以以常规方式进行。例如，当以适当的浓度(例如1％)添加到琼脂板上时，丁酸甘油酯导致其混浊，这在酶促水解过程中消失。其它适当的底物是其水解切割导致颜色改变的化合物，其可以是例如可光度检测的(例如棕榈酸对硝基苯酯)。水解活性还可以通过在pH-stat测定中酶促切割羧酸酯来确定。用NaOH滴定恒定保持由释放的羧酸所引起的pH值的降低。与释放的羧酸的量成比例的NaOH的消耗因此提供了酶水解活性的信息。前述检测方法参考Rusnak，2004(章节8.4.2)，其以其全文引用作为参考。
由三酰甘油脂肪酶可水解的其它底物可以通过以下确定：尝试用本领域技术人员已知的三酰甘油脂肪酶(例如具有序列CAA83122.1的CalB)水解给定底物。如果水解发生，那么该底物可以用于根据本发明的方法用于检测三酰甘油脂肪酶。
尽管上述检测方法可以在常规培养皿或细胞培养容器中进行，在特定实施方案中设想使用微量滴定板。例如，具有假定的三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质的表达已经在微量滴定板中发生，例如通过在微量滴定板中培养原核生物并且诱导蛋白质的表达。此外，水解活性的检测还可以在微量滴定板中发生，并且根据给定培养物的参数，检测可以在不事先移除微生物下发生。例如，在微量滴定板的分别的孔中细胞密度低时，无需分别的测量被高细胞密度所虚构的值，可以直接从培养基的浊度性质的改变或者光度底物的转化来确定水解活性。可选地，在表达了释放到培养基中的具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质后，将原核细胞从培养基分离(例如通过离心细胞沉降以及移除上清液或者在生长在孔表面的贴壁细胞或与支持物结合的细胞的情形中，立即移除培养基)并且包含具有假定三酰甘油脂肪酶的蛋白质的培养基被转移到新的微量滴定板上用于确定水解活性。
根据特定的实施方案，具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质的表达在可水解底物存在时发生，所述底物例如溶解在培养基中的底物。根据另一实施方案，可以在例如包含可水解底物的培养基上培养表达具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质的原核生物。就此而论，由于其丁酸甘油酯含量而混浊的琼脂培养基特别适合。水解活性的三酰甘油脂肪酶表达时，例如在通过化学物质或温度改变(取决于所使用的表达载体)诱导编码三酰甘油脂肪酶的基因后，有丁酸甘油酯的切割并且因此混浊的琼脂澄清。在具有充足的三酰甘油脂肪酶活性的琼脂区域上，因此有晕轮形成，其可以是视觉检测的或者用适当的图像处理系统(例如Quantimet 500 Qwin；雷卡公司(Leica，Cambridge)，英国)自动检测并且可以作用于鉴定产生了三酰甘油脂肪酶活性的细菌菌落。对于本领域的技术人员来说，方法的其它改变是显而易见的，例如将微量滴定板的充有丁酸甘油酯琼脂的孔用细菌悬液接种(所述细菌悬液被稀释为允许在每个孔中发育单个细菌菌落)，然后进行视觉或自动成像分析。
根据另一实施方案，将具有假定三酰甘油脂肪酶活性的表达的蛋白质从表达原核细胞(特别是大肠杆菌)中分离出来，然后在无细胞状态中与可水解底物相接触。适当的分离方法是本领域技术人员已知的，例如通过离心沉降细胞或者通过过滤分离。这一实施方案具有以下优势，即水解活性的随后检测不受到原核细胞存在的影响。
根据特定的实施方案，所述检测通过确定可水解底物的减少或水解产物的增加来光度测定进行。适当的底物是本领域技术人员已知的，例如对硝基苯基酯例如棕榈酸对硝基苯酯或乙酸对硝基苯酯。光度测量的参数可以由本领域技术人员根据所使用的底物和溶液来容易地改变(例如，当使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)时，建议测量410nm处的消光的增加)。
在特定的实施方案中，根据本发明的检测方法用于就三酰甘油脂肪酶活性筛选诱变的蛋白质或者由诱变的核酸编码的蛋白质。这些可以是通过诱变要被赋予三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质(例如通过向蛋白质(如果有也是很少的三酰甘油脂肪酶活性)中掺入序列基序，所述序列基序被认为对于该酶促活性是重要的)，或者具有已知的三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质(其被通过引入一处或多处突变来修饰)。诱变(导致突变或突变的核苷酸序列或突变的蛋白质)意思是：在核苷酸序列方面，添加、移除或替换至少一个核苷酸。在蛋白质方面其意思是添加、移除或替换至少一个氨基酸。根据本发明诱变的蛋白质特别是其编码核苷酸序列包含编码来自南极假丝酵母的脂肪酶B(CalB)的核苷酸序列的蛋白质，或者其编码核苷酸序列相对于编码来自南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的核苷酸序列而言具有至少一处突变的蛋白质，或者其编码核苷酸序列与来自南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的编码核苷酸序列同源的蛋白质，或者与来自南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)功能性等价的蛋白质。对于所有这些蛋白质，编码分别的蛋白质的核苷酸序列的诱变不必须导致所表达的蛋白质的氨基酸序列的改变。如已经描述的，优化基因的核苷酸序列的方法是本领域技术人员已知的，例如在提供用于表达的宿主生物中优选的密码子选择方面，避免mRNA二级结构或特定的序列基序(例如来自基因阿特公司(GeneArt，Regensburg，德国)的GeneOptimizerTM技术)。这些优化可以用于在转录水平和在翻译水平上都改良表达，并且同时，使用允许用于某些氨基酸的一些碱基三联体的简并密码子，用于翻译未改变的蛋白质。在该情形中，根据本发明的检测方法被用作监控功能性蛋白质的表达。另一方面，通过编码核苷酸序列的诱变，可以产生这样的蛋白质，其氨基酸序列与未经诱变的初始序列所表达的蛋白质相比是不同的。在该情形中，使用根据本发明的检测方法，可以确认由诱变的核苷酸序列编码的蛋白质，与由未经诱变的初始序列编码的蛋白质相比，是否具有未改变的水解活性或经修饰的水解活性，例如在酶促活性的一个或多个参数方面被减少(或缺乏)、增加或改变。作为所述参数，可以考虑例如底物特异性、对映选择性或蛋白质的转换数以及其对例如温度、pH、离子浓度和/或可能的抑制剂或激活物的存在的依赖性，所述参数特别可以是由条件选择所测试的，其中根据本发明检测方法步骤ii)，将具有假定的三酰甘油脂肪酶活性的诱变的蛋白质与可水解底物相接触。
通过靶向改变核苷酸序列(例如通过聚合酶链式反应(PCR))以及通过非定向改变(例如通过化学诱变)的诱变是本领域技术人员已知的并且描述在例如Roufa 1996或Kirchhoff和Desrosiers 1996中。
根据本发明检测方法的上述用途特别适合于筛选基因文库。例如，可以通过在核酸水平的组合诱变(例如通过合成寡核苷酸混合物的酶促连接)来产生蛋白质变体的文库。有大量方法可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的同源物的文库。简并的基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，随后该合成的基因可以被连接到适当的表达载体中。使用简并的基因的组使得在混合物中提供所有序列成为可能，所述混合物编码所需的潜在蛋白质序列组。合成简并的寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang 1983；Itakura等人，1984；Itakura等人1984；Ike等人1983)。
根据本发明的用途特别适合于样品的高通量筛选，例如在短时间内接连筛选大量的样品或者同时筛选许多平行的样品或其组合。因此，特别地，其是用于筛选上文所述的基因文库的适当的方法。例如，可以就展示出三酰甘油脂肪酶的特别高的功能性表达的克隆或者表达具有改变的性质的三酰甘油脂肪酶的那些克隆进行筛选。关于这一点，特别是使用微量滴定板对于表达一种或多种研究的蛋白质和/或确定它/它们的水解活性是有利的。如本领域技术人员已知的，可以通过自动控制实现高样品通量，例如用移液自动装置，其将包含具有假定的水解酶活性的蛋白质的上清液从用于表达这些蛋白质的微量滴定板的孔中转移至用于检测水解活性的孔中，或者将检测试剂移液到包含所述上清液的孔中。此外，使用微量滴定板的光度评估可以特别地用平板读数器来进行，所述平板读数器自动测量包含在单个孔中的溶液的消光。当使用琼脂平板时，通过水解活性产生的清晰的晕轮或者以其它方式可视觉检测的晕轮(如上述已经描述的)，可以例如使用适当的图像处理系统(例如Quantimet 500 Qwin；雷卡公司(Leica，Cambridge)，英国)来检测。
本发明的另一目标涉及产生三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中通过上述检测方法之一检测具有三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)活性的表达的蛋白质，将表达该蛋白质的菌株培养在表达脂肪酶的条件下，并且任选地，分离所表达的脂肪酶。可以根据需要通过常规测试被改变用于特定蛋白质的适当的分离方法是本领域技术人员已知的，并且例如如下所述。本领域技术人员显而易见的，可以将方法类似地应用于脂肪酶，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一个或多个S-S桥，例如每条肽链1、2、3、4、5或6个S-S桥，并且S-S桥可以在相同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子内)和/或不同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子间)。
本发明的另一目标涉及通过上述产生方法获得的三酰甘油脂肪酶，例如在原核宿主细胞环境中存在的三酰甘油脂肪酶或者部分、大部分或完全纯化的三酰甘油脂肪酶。特别适合的三酰甘油脂肪酶是来自南极假丝酵母的脂肪酶B(其在至少一个氨基酸上不同于以登录号CAA83122.1存储在GenBank的序列)，以及与以GenBank登录号CAA83122.1存储的序列同源的蛋白质，其代表功能性等价物。
“功能性等价物”意思是，特别地根据本发明，这样的突变体，其在至少一处序列位置上不同于作为基础的三酰甘油脂肪酶(特别地任何脂肪酶B)的氨基酸序列，但是仍然具有一种前述生物学活性，例如恒定的、减少的或增加的水解活性，或者改变的底物特异性、对应选择性或转换数，以及其对于例如温度、pH、离子浓度、或可能的抑制剂或激活物的存在的依赖性。
因此，“功能性等价物”包含通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体，其中所述改变发生在任何序列位置中，条件是它们导致具有根据本发明性质的模式的突变体。如果突变体和未改变的多肽之间的反应模式在质上是一致的，即例如相同的底物以不同的速率被转化，则功能等价性特别也是存在的。
描述的多肽的“前体”和多肽的“功能性衍生物”和“盐”也是上述含义中的“功能性等价物”。
“前体”是有或没有所需生物学活性的多肽的天然或合成的初步阶段。
在本文上下文中表述“盐”意思是本发明蛋白质分子的羧基基团的盐和氨基基团的酸加成的盐。羧基基团的盐可以通过熟知的方法产生并且包含无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，以及具有有机碱的盐，例如胺，例如三羟乙基胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成的盐例如具有矿物质酸(例如盐酸或硫酸)的盐和具有有机酸(例如乙酸和草酸)的盐也是本发明的目标。
根据本发明的酶的“功能性衍生物”也可以通过已知的技术在功能性氨基酸侧基或在其N-或C-末端上产生。所述衍生物包含例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺(通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得的)；游离氨基的N-酰基衍生物(通过与酰基基团反应产生的)；或游离羟基基团的O-酰基衍生物(通过与酰基基团反应产生的)。
“功能性等价物”天然还包含可以从其它生物获得的多肽以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较建立同源序列区域，并且可以在本发明的具体说明书的基础上确定等价酶。
“功能性等价物”还包含根据本发明多肽的片段，特别是单个结构域或序列基序，它们例如具有所需的生物学活性。
此外，“功能性等价物”是具有以功能性N-或C-末端连接的天然消旋酶序列或来自其的功能性等价物之一以及至少一种其它功能性不同的异源序列(即无融合蛋白部分的显著相互功能性损害)的融合蛋白。此类异源序列的非限制性实例为例如信号肽或酶。
本发明包括的“功能性等价物”是与天然蛋白质同源的蛋白质。它们与天然氨基酸序列之一具有至少60％、优选至少75％、特别是至少85％、例如至少90％、95％或99％的同源性，这是根据Pearson和Lipman(Pearson和Lipman 1988)算法计算的。根据本发明的同源多肽百分比同源性意思特别是基于本发明酶或酶亚基的氨基酸序列之一的总长度的氨基酸残基的百分比同一性。本发明特别包含根据上述定义的功能性等价物，其额外与初始序列具有至少60％、优选至少75％、特别是至少85％、例如至少90％、95％或99％的同源性。
在可能的蛋白质糖基化的情形中，根据本发明的“功能性等价物”包含去糖基化形式或糖基化形式以及通过改变糖基化模式获得的经修饰形式的上述指定类型的蛋白质。
可以使用本发明的方法确定功能性等价物。例如，可以通过本发明的表达方法表达并且通过本发明的检测方法研究待被确定其与三酰甘油脂肪酶并且特别是CalB的功能等价性的蛋白质。具有水解活性，特别是与三酰甘油脂肪酶或CalB相比改变的水解活性的表达的蛋白质是功能性等价物。
关于这一点，可以通过已知方法培养和发酵表达本发明三酰甘油脂肪酶的原核生物。随后，如果多肽未分泌到培养基中，将细胞破坏并且通过已知的蛋白质分离方法将产物从裂解物中获得。任选地可以通过高频超声、通过高压(例如在弗氏压碎器中)，通过渗透溶胞(osmolysis)、通过去污剂、分解酶(lytic enzyme)或有机溶剂作用、使用匀浆器或通过组合几种所列方法来破坏细胞。
通过已知色谱方法以及通过其它常规方法可以纯化多肽，所述色谱方法例如分子筛色谱(凝胶过滤)，例如Q-sepharose色谱、离子交换色谱、亲和色谱和疏水色谱，所述其它常规方法例如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳。适当的方法描述在例如Cooper(1980)或Scopes(1981)中。
本发明的另一目标涉及编码三酰甘油脂肪酶的核酸，特别是编码来自南极假丝酵母的脂肪酶B的核酸，其包含根据SEQ ID NO：1的编码核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2有至少一个核苷酸不同的核苷酸序列，或者包含与其同源的核苷酸序列。前述核苷酸序列编码例如CalB的功能性等价物。根据特定的实施方案，核酸包含根据SEQ ID NO：1的编码核苷酸序列或与其同源的核苷酸序列。
本发明的另一目标涉及包含编码三酰甘油脂肪酶的核酸的重组载体，所述核酸与至少一个调节核酸序列有效连接。根据另一特定的实施方案，编码三酰甘油脂肪酶的核酸序列包含根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。“有效连接”意思是启动子、编码序列、终止子以及任选地其它调节元件的顺序排列，其以这样的方式，即调节元件中的每一个可以在所定义的编码序列表达中实现其功能。可有效连接的序列的实例是靶序列和增强子、聚腺苷酸化信号等。其它调节元件包含可选择标记、扩增信号、复制起点等。适当的调节序列描述在例如Goeddel 1990中。根据本发明，发现例如特别地，在与pGRO7共表达时，增加了calB_syn(SEQ IDNO：1)和calB_wt(SEQ ID NO：2)的功能性表达。
除了质粒和噬菌体外，“载体”还表示本领域技术人员已知的所有其它载体，因此例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、噬粒、黏粒、以及线性或环形DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制，或者可以通过染色体复制。这些载体代表本发明的其它实施方案。适当的质粒是例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC19、pKC30，pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11或pBdCI；链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214；棒杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667。前述质粒代表可能质粒的少量选择。其它质粒很显然是本领域技术人员已知的并且可以例如在书Cloning Vectors(publ.Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444 904018)中找到。适当的载体是允许核苷酸序列功能性表达的那些，所述核苷酸序列编码具有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质，所述蛋白质随后可以通过上述检测方法确定。
特定的实施方案包含载体pET32b(+)和pET载体家族(诺华基因公司(Novagen)1999)的其它代表(特别是pET-32a-c、pET-41a-c和pET-42a-c)，以及pCOLD III和pCOLD载体家族的其它代表(例如pCOLD I、pCOLD II、pCOLD IV、pCOLD TF，例如从塔卡拉欧洲S.A.S生物公司(Takara Bio Europe S.A.S)，Gennevilliers，法国获得)。根据非常特定的实施方案，根据本发明作为包含编码三酰甘油脂肪酶的核酸的重组载体，制备pET-32b(+)/calB_syn(SEQ ID NO：7，pET-32b(+)中calB_syn)、
pET-32b(+)/calB_wt(SEQ ID NO：8，pET-32b(+)中calB_wt)、
pCOLDIII/calB_syn(SEQ ID NO：9，pCOLDIII中calB_syn)以及
pCOLDIII/calB_wt(SEQ ID NO：10，pCOLDIII中calB_wt)。
本发明的另一目标涉及包含此类编码三酰甘油脂肪酶的载体或核酸的重组宿主细胞，其包含根据SEQ ID NO：1的编码核苷酸序列或与其同源的核苷酸序列。重组细胞特别可以是原核细胞，特别是大肠杆菌细胞。原核细胞的其它实例是革兰氏阴性细菌中，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的代表例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、赛氏杆菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)或肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)；革兰氏阳性细菌中例如芽孢杆菌属的代表例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。
本发明的其它目标涉及根据本发明的编码核酸序列、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞用于实行表达功能性三酰甘油脂肪酶的本发明的方法、用于检测功能性三酰甘油脂肪酶的本发明的方法或用于产生功能性三酰甘油脂肪酶的本发明的方法的用途。发现当根据本发明的载体用于本发明的表达方法中时(特别是在低孵育温度下)，calB_wt和calB_syn令人惊讶地在pET-32b(+)(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：7)或在pCOLDIII(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：9)中以增加的程度功能性表达。此外，发现根据本发明，当与pG-KJE8共表达时，特别是与pGRO7、pG-Tf2或pTf16共表达时，calB_syn(SEQ ID NO：1)和calB_wt(SEQ ID NO：2)功能性表达至特别高的程度。
对于本领域的技术人员来说显而易见，用于表达功能性三酰甘油脂肪酶的本发明的方法、用于其检测的方法和产生其的方法也可类似地应用于除三酰甘油脂肪酶外的其它酶。例如这些方法可以被改变以适用于EC类3.1(酯水解酶)的酶，或通常适用于EC类3(水解酶)的那些(http://www.iubmb.unibe.ch；http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)。根据本发明的方法因此可以扩展至可以使用这些方法中公开的一般原理表达、检测或产生的所有酶，特别是一个或多个S-S桥(例如1、2、3、4、5或6个S-S桥)的形成对于其功能性是必需的那些酶，其中S-S桥可以在相同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子内)和/或不同肽链的含硫氨基酸之间形成(分子间))。
实施例
I.一般信息
化学物
除非另外说明，所有化学物从弗拉卡公司(Fluka(Buchs，瑞士))、西格玛-阿尔德里克公司((Taufkirchen，德国))和罗斯有限公司(RothGmbH(Karlsruhe，德国))获得。
菌株和质粒
大肠杆菌DH5α获得自克隆泰克公司(Clontech)(Heidelberg，德国)。大肠杆菌OrigamiTM2(DE3)、OrigamiTM B和质粒pET-32b(+)获得自诺华基因公司(Novagen)(Darmstadt，德国)。质粒pUC18获得自MBI菲门特公司(MBI Fermentas)(St.Leon-Rot，德国)，pColdIII和包含质粒pG-KJE8、pGro7、pKJe7、pG-Tf2和pTf16的分子伴侣-质粒组获得自塔卡拉公司(Takara)(Otsu，日本)。包含密码子优化的calB基因的构建体pPCR/CalB由GENEART公司(Regensburg，德国)合成。构建体pPICZαA/calB以前描述过(Rusnak 2004)。
calB变体的克隆
使用引物wt_pUC18_fw和wt_pUC18_rev(表1)，从模板构建体pPICZαA/calB扩增calB_wt，然后，将其克隆进载体pUC18，获得构建体pUC18/calB_wt。为了亚克隆进pET-32b(+)，使用引物wt_pET-32b(+)_fw和wt_pET32b(+)_rev(表1，见下)扩增脂肪酶基因，然后通过EcoR1和NotI限制性位点克隆到载体中(pET-32b(+)/calB_wt)。为了亚克隆到pColdIII中，使用引物wt_pColdIII_fw和wt_pColdIII_rev(表1)扩增CalB，然后使用标准方法克隆到载体中(pColdIII/CalB_wt)。
使用引物syn_pUC18/pET-32b(+)_fw和syn_pUC18_rev、syn_pUC18/pET-32b(+)_fw和syn_pET-32b(+)_rev或syn_pColdIII_fw和syn-pColdIII_rev(表1)从pPCR/calB扩增CalB_syn，然后使用标准方法克隆到质粒pUC18/calB_syn、pET-32b(+)/calB_syn和pColdIII/calB_syn中，获得构建体pUC18/calB_syn、pET-32b(+)/calB_syn和pColdIII/calB_syn。
下列表1显示了用于亚克隆calB变体的引物。限制性位点以下划线显示。
表1
 
引物 序列 限制性位点
wt-pUC18_fw gatgaattcgctaccttccggttcggacc EcoR1
wt-pUC18_rev ccacatatgtcagggggtgacgatgcc Ndel
wt_pET-32b(+)_fw ccggaattcgctaccttccggttc EcoR1
wt_pET-32b(+)_rev cggcatcgtcaccccctaagcggccgc Notl
wt_pColdIII_fw cgattcatatgctaccttccggttcggacc Ndel
wt_pColdIII_rev ccttaagaattctcagggggtgacgatgcc EcoR1
syn_pUC18/pET-32b(+)_fw ccggaattcgctgccgagcgg EcoR1
syn_pUC18_rev gtattgtgaccccgtaataacatatggaattcc Ndel
syn_pET-32b(+)_rev gcggtattgtgaccccgtaagcttggg Hindlll
syn_pColdIII_fw cagttcatatgctgccgagcggtagcgat Ndel
syn_pColdIII_rev ccttaagaattcttacggggtcacaataccgct EcoR1
脂肪酶表达和分子伴侣的共表达
将表达实验重复4-6次并且将活性表示为平均值。
pUC18表达：
将OrigamiTM B和DH5α细胞用pUC18构建体转化。将细胞在100mlLB培养基(Luria 1960)中，37℃、180rev/分钟生长到600nm处0.6的光密度，所述培养基包含100μg/ml氨苄青霉素(LBamp)。然后通过添加IPTG(终浓度1mM)诱导脂肪酶表达。将细胞在30℃和180rev/分钟生长额外4小时，并且通过在4℃4000g离心30分钟来收获。
pET-32b(+)-表达：
将OrigamiTM 2(DE3)细胞用pET32b(+)构建体转化。在100ml LBamp中37℃和180rev/分钟将细胞生长至600nm处0.6的光密度，并且按前述处理。可选地，在诱导前将细胞在冰上冷却并且在15℃进行24小时表达。
pColdIII-表达：
将OrigamiTM B细胞用pColdIII构建体转化。在100ml LBamp中37℃和180rev/分钟将细胞生长至600nm处0.4-0.6的光密度。然后将培养物在冰上冷却30分钟并且通过添加IPTG(终浓度1mM)诱导脂肪酶表达。将细胞在15℃和180rev/分钟生长另外24小时，并且通过在4℃4000g离心30分钟收获所述细胞。
分子伴侣质粒和pColdIII构建体的共表达：
将OrigamiTM B细胞用分子伴侣质粒转化。将细胞在包含34μg/ml氯霉素的100ml LB中在37℃生长，并且通过常规方法产生感受态细胞。将重组细胞用pColdIII构建体转化并且在LBcm+amp上选择。为了表达，将细胞在LBcm+amp中，37℃和180rev/分钟生长至600nm处的0.4-0.6的光密度，所述LBcm+amp(在pGro7、pKJE7和pTf16的情形中)包含1mg/ml的L-阿拉伯糖和(在pG-Tf2的情形中)5ng/ml的四环素或(在pG-KJE8的情形中)包含浓度为如上所述的L-阿拉伯糖和四环素。将培养物在冰上冷却30分钟。然后通过添加IPTG(终浓度1mM)诱导脂肪酶表达。将细胞在15℃和180rev/分钟生长另外24小时，并且在4℃在4000g离心30分钟进行收获。
丁酸甘油酯-琼脂平板测定
将细胞在LB-琼脂板上培养，所述LB-琼脂板在pGro7、pKJE7或pTf16的共表达中包含1％乳化的丁酸甘油酯和相应的抗生素以及1mg/mlL-阿拉伯糖，在pG-Tf2的共表达中包含5ng/ml的四环素，或者在pG-KJE8的共表达中包含L-阿拉伯糖和四环素。在37℃生长细胞24小时后，将平板用包含1mM IPTG的软琼脂层(水中0.6％琼脂)覆盖，在30℃、15℃或室温下孵育用于表达。功能性脂肪酶的表达由菌落周围清晰的晕轮形成所指示。
脂肪酶活性测定、SDS-PAGE和光密度分析
在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中通过超声处理三次每次30s的时期来破坏细胞，通过离心移除细胞碎片。使用pH Stat装置(美瑟姆公司(Metrohm)，Filderstadt，德国)就活性测试细胞裂解物。通过用10mMNaOH滴定监控底物的水解(5％丁酸甘油酯，在具有2％阿拉伯树胶的水中被乳化)。通过Bradford测定(Bradford 1976)测量细胞裂解物的蛋白质含量。将一个脂肪酶活性单位定义为每分钟1μmol的脂肪酸的释放。根据标准方法(Laemmli 1970)，使用50μg澄清的细胞裂解物(对应于0.2-0.4ml的细胞培养物)或来自0.5ml细胞培养物的不可溶细胞碎片，通过SDS-PAGE研究不可溶和可溶的级分。将凝胶用考马斯亮蓝染色。相对于总细胞蛋白质的可溶性CalB的百分比通过光密度测定法，使用＂ScionImage＂程序(弗雷德里克公司(Frederick)，Maryland，USA)来确定。
高通量表达和活性测定
在包含150μl LBcm+amp加分子伴侣诱导物(见上)的96孔微量滴定板(格林耐公司(Greiner)，Nürtingen，德国)中在37℃和400rev/分钟将pColdIII构建体和具有分子伴侣质粒的OrigamiTM B细胞生长至0.4-0.6的光密度。将细胞在冰上冷却30分钟，通过将IPTG添加至终浓度1mM诱导脂肪酶表达。在15℃，200rev/分钟摇动下表达24小时后，通过离心收获细胞，并且通过添加50μl裂解缓冲液(50mM磷酸钠pH7.5，1mg/ml溶菌酶，1μl/DNAse)将细胞裂解。将裂解物在37℃摇动(300rev/分钟)孵育，并且在冰上冷却30分钟。在-80℃孵育1小时后，将细胞在室温(RT)融化，并且通过在4℃ 4000rev/分钟离心30分钟来移除细胞碎片。
为了检测脂肪酶活性，将20μl澄清的细胞裂解物添加到180μl测定溶液(162μl溶液B(1g Triton X-100+200ml 0.1M Tris-HCl pH 7.5中的0.2g阿拉伯树胶)+18μl溶液A(20ml正丙醇中的60mg pNPP))。对硝基酚酯(p-nitrophenolate)的形成在5分钟后通过测量410nm处的消光来测量(Spectra Max 340PC，分子设备公司(Molecular Devices Corp.)，Sunnyvale，CA，USA)。可选地，通过pH Stat测定(如上所述)定量脂肪酶活性。
II.应用实例
1.从南极假丝酵母克隆calB
将没有编码N-末端前肽原序列的核苷酸序列的calB_wt基因克隆到大肠杆菌表达载体pUC18、pET-32b(+)或pColdIII(表2)中。包含来自南极假丝酵母的calB基因的pPICZαA/calB构建体(Rusnak 2004)作用为模板用于扩增脂肪酶基因。
使用GeneOptimizerTM技术优化calB基因。除了优化密码子偏好外，如果可能，避免具有非常高(>80％)或低(<30％)的GC含量的区域。此外顺式作用的序列基序，例如内部TATA框、Chi位点、核糖体连接位点、ARE、INS和CRS序列元件以及重复序列和RNA二级结构被避免。该优化的基因(calB_syn)在253个核苷酸(26.5％)上不同于calB_wt序列，有效的改变显示在图1中。在氨基酸水平上，合成基因编码公开的蛋白质(CAA83122.1)。然后，将合成的基因亚克隆到表2中所述的表达载体中。
表2
Figure A200780020728D00281
表2：所使用的质粒和菌株。Pro：启动子，Ori：复制起点
2.三个不同载体系统中的脂肪酶表达
为了表达编码calB的载体，使用菌株大肠杆菌OrigamiTM B和OrigamiTM 2(DE3)，其特征在于它们的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶缺乏。用pUC18/calB_wt转化的OrigamiTM B细胞在丁酸甘油酯-琼脂板上显示出晕轮形成，而对于相当的菌株DH5α没有显示此(数据未显示)。但是，CalB活性在用pUC18/calB_wt或pUC18/calB_syn转化的OrigamiTMB细胞中非常低，并且对于两个构建体来说，对应于每克总可溶性蛋白质仅约2U丁酸甘油酯的水解(图4)。1U(单位)被定义为每分钟1μmol底物的转换。在SDS-PAGE分析中，在可溶性级分中没有检测到对应于CalB(33kD)的量的蛋白质条带(数据未显示)，而不溶性级分的CalB含量是10-12％(表3)。
表3
Figure A200780020728D00301
表3：来自多个表达实验的细胞提取物中的CalB含量的光密度分析。用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶使用Scion Image程序评估。n.d.：未检测到。
为了增加活性酶的产量，将基因calB_wt和calB_syn使用载体pET-32b(+)与硫氧还蛋白-标签(Trx·TAGTM)融合，并且在大肠杆菌OrigamiTM2(DE3)中表达。在室温下孵育时，经转化的细胞显示出清楚的晕轮形成，而在37℃下培养时没有产生任何可检测的酶促活性。在30℃摇瓶培养物中的Trx-CalB的表达导致在不可溶级分中酶量的显著增加(18-19％，表3)，但是没有产生溶解度的增加以及因此CalB活性的增加，在15℃表达时产生高达17U/mg可溶性蛋白质(用wt-基因(calB_wt))和8U/mg(用合成基因(calB_syn))(图4)。此外，在此系统中，仅在低培养温度下观察到丁酸甘油酯琼脂平板上的晕轮形成。可是，即使在15℃表达时，使用SDS-PAGE，从pET-32b(+)(24％和26％)和从pColdIII(42％和38％)表达时仍检测到大量不可溶蛋白质(图2，表3)。
3.用共表达分子伴侣的脂肪酶表达
根据应用2的实例将pColdIII构建体与一些分子伴侣组合共表达，所述分子伴侣是塔卡拉分子伴侣质粒组(TaKaRa Chaperone Plasmid Set)提供的(见下表4)。
表4
 
质粒 分子伴侣 启动子 诱导物 抗性标记
pG-KJE8 dnaK-dnaJ-grpEGroES-groEL araBPzt1 L-阿拉伯糖四环素 Cm
pGro7 groES-groEL araB L-阿拉伯糖 Cm
pKJE7 dnaK-dnaJ-grpE araB L-阿拉伯糖 Cm
pG-Tf2 groES-groEL Pzt1 四环素 Cm
pTf16 Tig araB L-阿拉伯糖 Cm
表4：来自塔卡拉(TaKaRa)的分子伴侣质粒组的组成
在15℃的孵育温度下，所有具有CalB和分子伴侣表达质粒的重组OrigamiTM B细胞在丁酸甘油酯-琼脂平板上显示出清楚的晕轮形成，以及摇瓶规模的CalB表达(图3)，而可溶性脂肪酶的量则显著不同(图4)。在与pGro7一起表达时，CalB_wt最有效地表达(61U/mg)(图4)。还通过与pG-Tf2(33U/mg)、pTf16(24U/mg)一起表达增加了功能性酶的表达，并且通过与pG-KJE8(18U/mg)一起表达以较小程度增加了功能性酶的表达。与pKJE7一起共表达对于CalB的表达没有显著影响。活性测定的结果通过光密度测定法来确定，在与pGro7共表达中发现了最大量的可溶性CalB，随其后的是与pG-Tf2和pTf16共表达时(表3)。
用合成的calB基因获得类似的结果，因此显示pGro7、pG-Tf2、pTf16和pG-KJE8共表达的正向作用。如在pET-32b(+)和pColdIII表达中一样，与用野生型基因calB_wt相比，用合成基因calB_syn就脂肪酶活性和可溶酶含量获得的值更低(图4，表3)。
4.在丁酸甘油酯-琼脂板上的脂肪酶表达
在15℃孵育时，表达GroES和GroEL(由pGro7编码)和calB_wt或calB_syn的OrigamiTM B细胞在补充丁酸甘油酯的琼脂板上显示出清楚的晕轮形成。对于包含相同构建体的DH5α细胞和对于包含pGro7载体和无脂肪酶基因的pColdIII载体的OrigamiTM B对照细胞，都没有观察到晕轮形成(数据未显示)。
5.微量滴定板规模的脂肪酶表达
作为用于来自CalB的酶变体的高通量筛选系统的模型，calB_wt或calB_syn与pGro7的共表达在OrigamiTM B细胞中进行(96孔微量滴定板规模)。使用pNPP作为底物，通过比色测定定量澄清的细胞裂解物的活性。如黄色的对硝基酚盐的形成所示(图6)，两个构建体以相当的量功能性表达。无脂肪酶基因的对照细胞显示在410nm的显著减少的消光值。
为了比较微量滴定板中表达的活性与在摇瓶中共表达构建体pColdIII/calB_wt和pGro7获得的值，通过pH Stat测定研究具有底物丁酸甘油酯的5个代表性孔的活性。单个孔中的生长条件是相同的。发现的结果是在澄清的细胞裂解物中特异性活性为从57-81U/mg可溶性蛋白质，或总活性为10-15U/ml细胞培养物。孔中总脂肪酶的表达水平通过光密度分析确定为0.04±0.01μg CalB/ml细胞培养物。
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Figure A200780020728D0035091119QIETU
 Stuttgart(2004)
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在上述说明书中涉及的下列序列或质粒在指明的SEQ ID NO下包括在序列表中：
calB_syn：SEQ ID NO：1
calB_wt：SEQ ID NO：2
T7启动子：SEQ ID NO：3
cspA启动子(大肠杆菌)：SEQ ID NO：4
pUC19中calB_syn(pUC18/calB_syn)：SEQ ID NO：5
pUC19中calB_wt(pUC18/calB_swt)：SEQ ID NO：6
pET-32b(+)中calB_syn(pET-32b(+)/calB_syn)：SEQ ID NO：7
pET-32b(+)中calB_wt(pET-32b(+)/calB_wt)：SEQ ID NO：8
pCOLDIII中calB_syn(pCOLDIII/calB_syn)：SEQ ID NO：9
pCOLDIII中calB_wt(pCOLDIII/calB_wt)：SEQ ID NO：10
pPCR/CalB：SEQ ID NO：11
CalB(CAA83122.1)：SEQ ID NO：12
具有T57A和A89T交换的CalB：SEQ ID NO：13
序列表
<110>巴斯夫欧洲公司(BASF AG)
<120>三酰甘油脂肪酶的功能性表达
<130>M/46349
<160>13
<170>PatentIn 版本3.3
<210>1
<211>957
<212>DNA
<213>从南极假丝酵母(Candida antarctica)修饰的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>起始密码子后的第一编码碱基三联体
<220>
<221>mist_feature
<222>(952)..(954)
<223>终止密码子
<400>1
<210>2
<211>954
<212>DNA
<213>南极假丝酵母
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>起始密码子后的第一编码碱基三联体
<220>
<221>misc_feature
<222>(952)..(954)
<223>终止密码子
<400>2
Figure A200780020728D00381
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>来自 pET32b+
<400>3
Figure A200780020728D00382
<210>4
<211>67
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>来自cspA(大肠杆菌(E.coli))
<400>4
Figure A200780020728D00383
<210>5
<211>3383
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pUC18中的calB_syn
<220>
<221>misc_feature
<222>(222)..(236)
<223>来自lacz的起始密码子和编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(237)..(1190)
<223>calB_syn编码序列
<400>5
Figure A200780020728D00391
Figure A200780020728D00401
<210>6
<211>3333
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pUC18中的calB_wt
<220>
<221>misc_feature
<222>(222)..(236)
<223>来自lacz的起始密码子和编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(237)..(1190)
<223>calB_wt编码序列
<400>6
Figure A200780020728D00411
Figure A200780020728D00421
<210>7
<211>6835
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pET32b+中的calB_syn
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(501)
<223>Trx-标签，其ATG也作用为起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(502)..(1455)
<223>calB_syn编码序列
<400>7
Figure A200780020728D00431
Figure A200780020728D00441
<210>8
<211>6835
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pET32b+中的calB_wt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(501)
<223>Trx-标签，其ATG也作用为起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(502)..(1455)
<223>calB_wt编码序列
<400>8
Figure A200780020728D00462
Figure A200780020728D00471
Figure A200780020728D00481
Figure A200780020728D00491
Figure A200780020728D00501
<210>9
<211>5307
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pCOLDIII中的calB_syn
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(957)
<223>calB_syn编码序列
<400>9
Figure A200780020728D00502
Figure A200780020728D00511
Figure A200780020728D00521
<210>10
<211>5307
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>克隆到pCOLDIII中的calB_wt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(957)
<223>calB_wt编码序列
<400>10
Figure A200780020728D00531
Figure A200780020728D00541
Figure A200780020728D00551
<210>11
<211>3836
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>pPCR/calB
<220>
<221>misc_feature
<222>(666)..(1619)
<223>calB_syn编码序列
<400>11
Figure A200780020728D00561
Figure A200780020728D00571
<210>12
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(342)
<223>成熟蛋白质CAA83122(无信号序列)
<400>12
Figure A200780020728D00581
<210>13
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>具有T57A和A89T的交换的成熟蛋白质CAA83122(无信号序列)
<400>13
Figure A200780020728D00591

Claims (30)

1.在原核生物中表达功能性三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在原核宿主细胞中在诱导型启动子的控制下表达。
2.如权利要求1中所述的方法，其中三酰甘油脂肪酶的表达在低温下发生。
3.如权利要求2所述的方法，其中低温选自1℃至25℃的范围。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中表达在硫氧还蛋白还原酶缺乏的和谷胱甘肽还原酶缺乏的大肠杆菌菌株中发生。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列编码来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(calB)。
6.如权利要求5中所述的方法，其中脂肪酶B由根据SEQ ID NO：1(calB_syn)或SEQ ID NO：2(calB_wt)的核苷酸序列或由与其同源的核苷酸序列编码。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在T7启动子(SEQ ID NO：3)的控制下。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中编码三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在冷激诱导型启动子的控制下。
9.如权利要求8所述的方法，其中冷诱导型启动子是大肠杆菌cspA基因的启动子(SEQ ID NO：4)。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中一个或多个分子伴侣共表达。
11.如权利要求10所述的方法，其中一个或多个共表达的分子伴侣选自大肠杆菌的GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、GrpE和引发因子(TF)。
12.如权利要求11所述的方法，其中GroEL和GroES是共表达的。
13.如权利要求11所述的方法，其中DnaK、DnaJ和GrpE是共表达的。
14.如权利要求11所述的方法，其中引发因子任选地与GroES和GroEL一起是共表达的。
15.如权利要求11所述的方法，其中DnaK、DnaJ、GrpE、GroES和GroEL是共表达的。
16.用于检测三酰甘油脂肪酶的方法，其中
i)根据权利要求1至15中所述的方法之一表达假定具有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白质，
ii)将表达产物与可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接触，以及
iii)确定水解活性。
17.如权利要求16中所述的方法，其中蛋白质的表达和/或其水解活性的确定在微量滴定板上进行。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中根据步骤i)的蛋白质的表达在可被脂肪酶水解的底物存在时发生。
19.如权利要求18所述的方法，其中蛋白质的表达在包含可被脂肪酶水解的底物的培养基上发生。
20.如权利要求16或17所述的方法，其中
i)将表达的蛋白质从细胞培养物分离，
ii)与可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接触，以及
iii)确定水解活性。
21.如权利要求20中所述的方法，其中从可水解底物的减少或水解产物的增加来光度确定水解活性。
22.如权利要求16至21中任一项所述的方法的用途，其用于就三酰甘油脂肪酶活性筛选诱变的蛋白质或由诱变的核酸编码的蛋白质。
23.如权利要求22中所述的用途，其中蛋白质在来自南极假丝酵母的脂肪酶B(calB)的编码核苷酸序列中具有至少一处突变。
24.如权利要求16至23中任一项所述的方法或用途，其中作为高通量筛选方法进行所述方法用于检测三酰甘油脂肪酶。
25.产生三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中检测使用如权利要求16至24中任一项所述的方法表达的具有三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)活性的蛋白质，在表达脂肪酶的条件下培养表达该蛋白质的大肠杆菌菌株，并且任选地分离表达的脂肪酶。
26.通过如权利要求25所述的方法获得的三酰甘油脂肪酶。
27.编码三酰甘油脂肪酶的核酸，其中其包含根据SEQ ID NO：1的编码核苷酸序列，或者包含在至少一个核苷酸上不同于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者包含在每种情形中与其同源的核苷酸序列。
28.重组载体，其中其包含如权利要求27所述的编码核酸，所述编码核酸与至少一个调节核酸序列有效连接。
29.重组宿主细胞，其中其包含如权利要求27所述的核酸和/或如权利要求28所述的重组载体。
30.如权利要求27所述的编码核酸序列、如权利要求28所述的载体或如权利要求29所述的宿主细胞用于进行如权利要求1至25中任一项所述的方法的用途。
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