CN101448851A - 改进的抗微生物肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗微生物肽，所述肽包含与氨基或羧基末端连接的具有大约2至大约36个氨基酸残基或其类似物的长度的第一组氨基酸和包含大约3至8个疏水性氨基酸残基或其类似物的第二组氨基酸残基，且所述肽具有抗微生物活性。

Description

改进的抗微生物肽

发明领域

本发明涉及抗微生物肽，所述肽包含：与氨基或羧基末端连接的具有长度为大约2至大约36个氨基酸残基或其类似物的长度的第一组氨基酸，和包含大约3至8个疏水性氨基酸残基或其类似物的第二组氨基酸残基，其中所述肽具有抗微生物活性。

发明背景

哺乳动物例如人的免疫系统成功地抵抗了几种感染。然而，在一些情况下，并非总能清除细菌、真菌或病毒，这可引起局部或全身急性感染。这在围产期监护病房(perinatal care unit)、烧伤监护病房(burn care unit)或重症监护病房中和在免疫低下个体中是个严重问题(concern)。局部急性感染引起极高的发病率。例如，绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)是严重的细菌性角膜炎的主要病因，而且用现有的抗微生物剂难以成功地治疗而引起的感染。在其他情况下，上皮表面上持续的细菌持久存在可引起或加重慢性疾病。在人中，所述疾病是例如慢性皮肤溃疡、特应性皮炎(atopic dermatitis)和其他类型的湿疹、痤疮或泌尿生殖器感染。例如，现有大量的证据表明革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的定殖(colonization)或感染是特应性皮炎中的触发或加重因子(exacerbating factor)。大约90％的所有特应性皮炎患者具有金黄色葡萄球菌或受其感染，然而只有5％的健康个体携带有该细菌。慢性溃疡遭受各种细菌例如绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的定殖和感染，从而导致这些溃疡延迟愈合。

可通过各种药物治疗有病征感染(symptomatic infection)。还可通过例如疫苗抵抗一些疾病。然而，疫苗并非总是最佳选择，对于某些微生物没有可获得的疫苗。当不能获得保护时，努力获得疾病的治疗。通常，通过使用杀死微生物的抗生素进行治疗。然而，在过去的几年中，几种微生物已对抗生素试剂产生了抗性。很有可能抗性问题在不远的将来将会增加。此外，几个个体已产生对抗生素试剂的过敏症(allergy)，从而减少了有效使用某些抗生素试剂的可能性。

各种生物的上皮表面持续暴露于细菌。在最近的几年中，在易受感染的生物边界(boundarias)上，基于抗菌肽的先天性免疫系统在细菌的最初清除中起着重要的作用(Lehrer，R.I.和Ganz，T.(1999)Curr Opin Immunol 11：23-27，Boman，H.G.(2000)Immunol.Rev.173，5-16)。通常认为抗微生物肽通过穿透它们的膜来杀死细菌，从而特定的分子微生物靶的缺乏使抗性的发生减少至最低程度。

与此处描述的肽不相关的几种抗微生物肽和蛋白质在本领域内是已知的。

US 6,503.881公开了为用作抗微生物肽的Indolicidin类似物的阳离子肽。所述阳离子肽来源于不同的物种，包括动物和植物。

US 5,912,230公开了基于抗真菌和抗细菌富组蛋白(histatin)的肽。该肽基于天然发生的人富组蛋白的氨基酸序列的确定的部分以及用于治疗真菌和细菌感染的方法。

US 5,717,064公开了甲基化的富含赖氨酸的裂解肽。裂解肽具有胰蛋白酶降解抗性且为非天然的。裂解肽适合用于体内施用。

US 5,646,014公开了抗微生物肽。从家蚕血淋巴的抗微生物级分分离该肽。该肽展示优良的抗几种细菌株系例如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌(Bacil luscereus)的抗微生物活性。

WO2004016653公开了基于天青素(azurocidin)的20-44的序列的肽。该肽包含通过二硫键连接的环结构。

US 6495516和相关专利公开了基于杀细菌55kDa蛋白细菌性/通透性增加蛋白(BPI)的肽。该肽产生抗微生物效应且具有LPS中和能力。

WO 01/81578公开了许多编码G偶联蛋白-受体相关多肽的序列，其可用于许多疾病。

目前，已知700多种抗微生物肽序列(www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/search.htm)，包括天蚕抗菌肽(cecropin)、防御素(defensin)马加宁(magainin)和cathelicidin。

即使今天存在相对大量的可获得的抗微生物肽，仍然存在对可用于抵抗抗或耐受抗生素和/或其他抗微生物剂的微生物的新的改进的抗微生物肽的增加的需要。更重要地，存在对当导入哺乳动物例如人时不引起过敏的新型抗微生物肽的需要。

由于抗细菌和哺乳动物膜的AMP的潜在的裂解性质和其他特性的原因，设计新型肽的其中一个挑战依赖于开发具有针对微生物例如细菌或真菌细胞的高特异性，即高治疗指数(最小溶血浓度/最小抗微生物活性；MHC/MEC)的AMP。

不同细菌，例如绿脓杆菌、粪肠球菌(E.faecalis)、奇异变型杆菌(Proteus mirabilis)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)和金黄色葡萄球菌都分泌降解几种抗微生物肽例如cathelicidinLL-37的蛋白酶。因此，从治疗观点来看抗蛋白酶的抗微生物肽是有利的。此外，许多抗微生物肽在挑战通常在问题发病机理(poblematicpatogeneses)中起关键作用的微生物例如细菌(例如金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌)中并非十分有效，因而需要对其进行最优化以显示增加的效应。

发明概述

本发明涉及具有与其对应的肽相比增加了抗微生物活性的新的改进的抗微生物肽。已令人惊奇地发现，需要特定数目的氨基酸以增加抗微生物活性，即，如果少于3个或多于8个氨基酸残基，抗微生物活性将减少。本研究特别适合亲水性的、高度带正电荷的肽，因为这些肽具有高度的膜破坏性。通过用一个或几个疏水氨基酸修饰，可能增强它们对细菌的类脂膜(lipid membrane)的结合能力，所得的更高的肽结合导致微生物的膜的增加的缺陷结构和微生物的更高的死亡率。然而，这仅仅是理论，作用模式可能不同或者是不同作用模式的组合。

在第一方面，本发明涉及抗微生物肽，所述肽包含与氨基或羧基末端连接的具有长度大约2至大约36个氨基酸残基或其类似物的第一组氨基酸和包含大约3至8个疏水性氨基酸残基或其类似物的第二组氨基酸残基，其中所述肽获得抗微生物活性或抗微生物活性提高。

在另一个方面，本发明涉及包含抗微生物肽和可接受的缓冲剂、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂的抗微生物/药物组合物。

在其他方面，本发明还涉及包含所述抗微生物肽的产品，所述产品选自绷带、膏药、缝线、肥皂、棉球、尿布、洗发剂、牙膏、抗痤疮化合物、防晒霜、织物、导管和针的涂层、隐形眼镜、包含在伤口敷剂中的粘合剂、清洁液和植入物。

在另一个方面，本发明涉及抗微生物肽或抗微生物/药物组合物或产品在治疗或诊断中的用途。

在最后的方面，本发明涉及抗微生物肽、包含所述抗微生物肽的抗微生物/药物组合物或产品用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗由选自细菌、病毒、寄生虫、真菌和酵母的微生物引起的抗微生物疾病或感染。

通过提供此类抗微生物肽，由于所述肽可以来自内源蛋白质和/或肽的多肽序列或具有与之相似的氨基酸组成的事实，对抗微生物肽产生过敏反应的风险可被减少。通过使用短肽，与更长的肽和蛋白质相比，肽的稳定性得到加强，生产成本降低，由此本发明在经济上可以是有利的。

本发明的肽提供有助于微生物的有效预防、减少或消除的组合物。从而可增加抵抗抗或耐受抗生素的微生物的可能性。此外，可治疗对商购获得的抗微生物过敏的哺乳动物。通过提供从内源性改进的蛋白质产生的抗微生物/药物组合物，可减少或消除哺乳动物将对这些特定的肽产生过敏症的可能性。这使抗微生物/药物组合物能够用于数种应用，在所述应用中，抗微生物/药物组合物可作为药物或作为添加剂接触哺乳动物，从而预防感染。

另外，短肽的用途可提高生物利用度。此外，具有对革兰阴性或革兰阳性细菌或真菌的特异性或偏爱性(preferable)作用的结构不同的肽的使用使得能够特异性靶向不同的微生物，从而能够使抗性和生态学问题的产生减少至最低程度。通过使用补充(supplementing)的肽(所述肽可与已存在于哺乳动物中的肽相当)，进一步消除由新的抗生素导致的额外的生态学压力的风险。最后，这些制剂还可增强内源抗微生物肽或其类似物的效应。

本发明的抗微生物素肽增加了抗微生物剂的名单，所述抗微生物剂被选择用作预防、减少或消除所有类型的应用中的微生物，但不限于侵害或感染哺乳动物例如人的微生物。

发明详述

定义

在本申请和发明的说明书中，使用下列定义：

术语“核苷酸序列”意指两个或更多个核苷酸的序列。核苷酸可以是基因DNA、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其混合物。术语包括单链和双链形式的DNA或RNA。

术语“抗微生物组合物”意指包含本发明的发明的肽的任何组合物，例如用于抵抗攻击哺乳动物的微生物的抗微生物或药物组合物以及包含一种或多种额外的抗微生物剂例如抗生素和其他试剂的组合物。

术语“取代的”意指氨基酸残基被另一种氨基酸残基替代。

术语“其类似物”意指肽的部分或整个肽基于非蛋白质氨基酸残基(合成的或半合成的)例如氨基异丁酸(Aib)、正缬氨酸γ-氨基丁酸(Abu)或鸟氨酸。其他非蛋白质氨基酸残基的实例可见于http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.h tm。

术语“除去的”意指已除去至少一个氨基酸残基，即从多肽释放至少一个氨基酸残基而不被另一个氨基酸残基替代。

术语“同源性”意指多肽的总的同源性，不与表示特定氨基酸残基属于相同组(即疏水性、亲水性)的术语“相似性”或表示氨基酸残基是相同的“同一性”混淆。

术语“连接的”意指使用共价键或化学键的“连接”。

术语“抗微生物肽”意指预防、抑制、减少或破坏微生物的肽。可通过任何方法例如实施例1中的方法确定抗微生物活性。

术语“两亲性的(amphipathic)”意指亲水性和疏水性氨基酸残基沿着α-螺旋结构相对表面、β链、线性的、环状的或其他二级构象和沿着肽的一级结构分布，这导致分子的一个或几个结构域主要是带电荷的和亲水性的，而其他结构域主要是疏水性的。

术语“阳离子的”意指在大约2至大约12的pH范围内例如在大约4至大约10的pH范围内具有净正电荷的分子。

术语“微生物”意指任何活的微生物。微生物的实例是细菌、真菌、病毒、寄生虫和酵母。

术语“抗微生物剂”意指预防、抑制或破坏微生物的生命的任何试剂。抗微生物剂的实例可见于The Sanford Guide to AntimicrobialTherapy(第32版，Antimicrobial Therapy，Inc，US)。

在本说明书中，按照Protein DataBank(PNB)(www.pdb.org)所定义的使用氨基酸名称和原子名称，所述名称基于IUPAC命名法(用于氨基酸和肽的IUPAC命名法和符号)(残基名称，原子名称等)和EurJ Biochem.，138，9-37(1984)和Eur J Biochem.，152，1(1985)中的它们的修正版。术语“氨基酸”意指选自丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(leu或L)甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)以及酪氨酸(Tyr或Y)或其衍生物的氨基酸。

描述

抗微生物肽

在第一实施方案中，本发明涉及包含与第二组氨基酸残基(包含至少一个疏水性氨基酸残基或其类似物)连接的第一组氨基酸残基(具有大约2至大约36个氨基酸残基或其类似物的长度)的抗微生物肽，其中所述肽获得抗微生物活性或抗微生物活性增加。通过连接第二组氨基酸残基(其中氨基酸残基是疏水性的)，可提高/增加或获得肽的抗微生物活性。通过使用第一和第二组氨基酸残基的组合(其中第二组包含疏水性氨基酸残基)，甚至可能使失活的第一组氨基酸残基活跃地抗微生物。第一组氨基酸残基只对微生物具有亲和力或可具有抗微生物活性。

第二组疏水性氨基酸残基可以是3、4、5、6、7或8个氨基酸残基或其类似物，疏水性氨基酸残基可选自V、L、I、F、Y和W。第二组疏水性氨基酸残基可包含同一个疏水性氨基酸残基例如W或F的组，或是不同的疏水性氨基酸残基以及D氨基酸残基或合成的氨基酸残基的混合物，只要它们是疏水性的即可。可将第二组氨基酸残基在第一组氨基酸残基的C或N末端或两个末端与所述第一组氨基酸残基连接。第二组3至8个氨基酸残基的实例是F_(3-8)、W_(3-8)、I_(3-8)、Y_(3-8)、V_(3-8)和所述氨基酸残基或其类似物的混合物。F_(3-8)意指第二组疏水性氨基酸残基中存在3至8个F，即，3、4、5、6、7或8个氨基酸残基是同一个氨基酸或其混合物以及其类似物。氨基酸残基的混合物的实例是FWY、WWYYII、WYIV、YYVVFF等，即，最重要的方面是末端是与其他部分连接的，从而使得能够产生抗微生物活性增加的疏水性末端。还令人吃惊地发现，需要特定数目的氨基酸以增加抗微生物活性，即，如果低于3个或多于8个氨基酸残基，抗微生物活性降低。第一组可以是具有氨基酸残基例如阳离子氨基酸或产生线性结构的其他氨基酸残基的线性结构。第一组氨基酸残基总体上可具有净正电荷。

可从任何来源获得第一组氨基酸残基，只要第一组氨基酸残基显示对微生物的结合或抗微生物活性或当与第二组氨基酸残基组合时可以是抗微生物的。第一组氨基酸残基可以是合成的和半合成的和天然的。从其产生第一组氨基酸残基的蛋白质的实例是激肽原蛋白、生长因子蛋白、富含组氨酸的糖蛋白、凝固因子(coagulation factor)蛋白例如凝血酶、因子IX和X、补体因子C3a、血管假性血友病因子、玻璃粘连蛋白(vitronectin)、C蛋白抑制剂、纤连蛋白、趋化因子、层粘连蛋白(laminin)、过氧化物歧化酶、朊蛋白或PRELP(富含脯氨酸精氨酸末端富含亮氨酸的重复蛋白(proline arginine-rich endleucine-rich repeat protein))。另一个实例是从SEQ ID NO 1或表中所见的序列以及SEQ ID NO 2-12产生的第一组氨基酸残基。第一组氨基酸残基的大小可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个氨基酸残基或其类似物。

此外，可在一个或多个氨基酸残基例从2至21个氨基酸残基中对肽进行取代。例如，可除去和/或替代3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基。

可使抗微生物肽延伸一个或多个氨基酸残基，例如1至100个氨基酸残基、5至50个氨基酸残基或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。此类额外的氨基酸可使与从非抗微生物蛋白产生的抗微生物肽的序列相邻的序列加倍。加入的数目取决于待抵抗的微生物种类，包括肽的稳定性、毒性、待治疗的哺乳动物或取决于肽应当存在于其中的产品和抗微生物肽所基于的肽结构。加入至肽的氨基酸残基的数目还取决于生产的选择，例如表达载体和表达宿主的选择和生产抗微生物/药物组合物的选择。延伸可以在抗微生物肽的N或C末端部分或在两个部分，只要其不破坏肽的抗微生物效应。抗微生物肽还可以是融合蛋白，其中抗微生物肽融合至另一种肽。

此外，可将抗微生物肽与其他已知的抗微生物肽或其他物质例如其他肽、脂质、蛋白质、寡糖、多糖、其他有机化合物或无机物有效连接。例如可将抗微生物肽偶联至物质，所述物质在抗微生物肽抑制、预防或破坏微生物的生命之前在哺乳动物体内保护抗微生物肽免受降解。

因此可通过酰胺化或酯化在C末端部分和通过酰化、乙酰化、PEG化、烷基化等在N末端部分修饰抗微生物肽。

被抗微生物肽抑制、预防或破坏的微生物的实例是细菌，革兰阳性和革兰阴性细菌例如粪肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、奇异变型杆菌(Proteus mirabilis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylorii)、病毒、寄生虫、真菌和酵母，例如白色念珠菌(Candida albicans)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosi)以及马拉色菌(Malassezia)种类。其他目的微生物包括但不限于柠檬酸菌属(Citrobacter sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、海洋病原菌(Enterobacter sp.)、(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、李斯特菌属(Listeria sp.)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、沙雷氏菌属(Serratiasp.)、志贺氏菌(Shigella sp.)、耶尔森氏菌(Yersinia sp.)、巴斯德氏菌属(Pasteurella sp)、海洋弧菌(Vibrio sp.)、(Campylobacter sp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)、(Bordetellasp.)、布鲁菌(Brucella sp.)、奈瑟氏球菌(Neiserria sp)、(Legionella sp.)、支原体(Mycoplasma sp.)和衣原体(Chalmydiasp.)。其他实例是病毒例如单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(Varizella Zooster)、流感病毒。寄生虫的实例是体内寄生虫和体外寄生虫，包括疟原虫形式。

可从天然发生的来源例如从人细胞、c-DNA、基因组克隆、化学合成物获得抗微生物肽或通过重组DNA技术获得抗微生物肽如来自细胞来源的表达产物。

可通过标准的化学方法(包括通过自动化方法(automatedprocedure))进行的合成)合成抗微生物肽。通常，基于标准固相Fmoc保护策略使用HATU(N-[二甲氨基-1H-1.2.3.-三唑[4，5-B]嘧啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸(methylmethanaminiumhexafluorophos)-phaten-氧化物)作为偶联剂或其他偶联剂例如HOAt-1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑合成肽类似物。使用包含合适的消除剂(scavenger)的三氟乙酸(其还使侧链官能团脱保护)从固相树脂切取肽。使用制备反相色谱法(preparative reversed-phasechromatography)进一步纯化粗制的肽。可使用其他纯化方法，例如分配层析法(partition chromatography)、凝胶过滤法、凝胶电泳或离子交换层析。可使用本领域已知的其他合成技术例如tBoc保护策略、或不同偶联剂的使用等产生相同的肽。

可选择地可通过重组生产(参见美国专利5,593,866)合成肽。许多宿主系统适合用于产生肽类似物，包括细菌例如大肠杆菌、酵母菌例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia)、昆虫例如Sf9和哺乳动物细胞例如CHO或COS-7。存在许多可获得的用于各个宿主的表达载体，本发明不限定于它们中的任何一个，只要载体和宿主能够产生抗微生物肽。用于在大肠杆菌中克隆和表达的载体和方法可见于例如Sambrook等人(Molecular Cloning.：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1987)和Ausubel等人(Current ProtocolsinMolecular Biology，Greene Publishing Co.，1995)。

最后，可从血浆、血液、各种组织等纯化肽。肽可以是内源的或在酶促和化学降解纯化的蛋白质后产生。例如，可通过胰蛋白酶降解蛋白质，然后以更大的规模进一步分离所得的抗细菌的肽。

将编码抗微生物肽的DNA序列导入适合宿主的合适的表达载体。在优选实施方案中，将基因克隆入载体以产生融合蛋白。为了帮助肽序列的分离，使用易于化学切割(例如，CNBr)或酶促切割(例如，V8蛋白酶、胰蛋白酶)的氨基酸连接肽和融合伴侣。至于在大肠杆菌中的表达，优选融合伴侣是指导表达朝向内含体形成的正常的细胞内蛋白质。在该情况下，在切割从而释放终产物后，不需要对肽进行复性。在本发明中，可将包含融合伴侣和肽基因的DNA盒插入表达载体。优选，表达盒是包含帮助插入的DNA序列在宿主中有效转录的诱导型或组成型启动子的质粒。

可通过常规转化技术例如通过钙介导的技术、电穿孔或本领域技术人员熟知的其他方法将表达载体导入宿主。

可从天然来源例如哺乳动物细胞、现有的cDNA或基因组克隆或合成物产生编码抗微生物肽的序列。可使用的一个方法是借助于PCR，使用来源于抗微生物DNA模板的5’和3’且通常整合入针对载体的克隆位点而选择的限制性位点的扩增引物扩增抗微生物肽。如果需要，可通过基因工程将翻译起始和终止密码子导入引物序列。可对编码抗微生物肽的序列进行密码子最优化以促进在特定宿主中的表达，只要密码子的选择最适宜待治疗的终哺乳动物。因此，例如，如果在细菌中表达抗微生物肽，最优化密码子以使之适合细菌。

表达载体可包含启动子序列，从而促进导入的抗微生物肽的表达。如果需要，还可导入调控序列，例如一个或多个增强子、核糖体结合位点、转录终止信号序列、分泌信号序列、复制起始区、选择标记等。将调控序列相互有效地连接，从而允许转录和随后的翻译。如果在细菌中表达抗微生物肽，调控序列是设计用于细菌中的调控序列，此类调控序列对于本领域技术人员来说是熟知的。合适的启动子例如组成型和诱导型启动子是可广泛获得的，其包括来自T5、T7、T3、SP6噬菌体和trp、lpp和lac操纵子的启动子。

如果将包含抗微生物肽的载体在细菌中表达，复制起始区的实例是产生高拷贝数目的复制起始区或产生低拷贝的复制起始区例如f1-ori或col El ori。

优选，质粒包含至少一个在宿主中具有功能的选择标记，该选择标记允许转化的细胞被鉴定和/或选择性生长。用于细菌宿主的合适的选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、氯酶素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉抗性基因和本领域内已知的其他抗性基因。

用于在细菌中表达的质粒的实例包括pET表达载体pET3a、pET11a、pET 12a-c和pET 15b(可从Novagen，Madison Wis.获得)。低拷贝数目载体(例如，pPD100)可用于对大肠杆菌宿主有害的肽的有效的过量生产(Dersch等人，FEMS Microbiol.Lett.123：19，1994)。

合适的宿主的实例是细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。然而，通常使用任一种细菌例如大肠杆菌。

通过常规分离技术例如亲和层析、大小排阻层析或离子交换层析、HPLC等分离表达的抗微生物肽。各种纯化技术可见于Biologist’s Guide to Principles and Techniques of PracticalBiochemistry(eds.Wilson和Golding，Edward Arnold，London)，或见于Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc)。

此外，肽可结合和使来自革兰阴性细菌的脂多糖失活，从而用作脂多糖诱导的炎症的抑制剂。肽还可调节真核细胞的生长。可将发明的抗微生物肽置于/整合入产品例如绷带、膏药、缝线、肥皂、棉球、尿布、洗发剂、牙膏、抗痤疮化合物、防晒霜、织品、包含在伤口敷剂中的粘合剂、清洁液、隐形眼镜和植入物。

此外，本发明涉及包含上述的抗微生物肽和药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。可在组合物中包含额外的物质例如其他抗微生物肽、免疫调节剂、止痒剂(antipruritusagent)。其他抗微生物肽的实例公开于WO 2005/061535和WO2005/001737。其他实例包括，螯合剂例如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。可以以本领域内已知的方式制备具有充分的贮存稳定性和适合用于对人和动物施用的抗微生物/药物组合物。可以例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾冷却(spray cooling)对药物组合物进行冻干。

“药学上可接受的”是指不减少活性成分即抗微生物肽的生物学活性的功效的无毒物质。此类药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂在本领域内是熟知的(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company(1990)和handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000)。

术语“缓冲剂”意指包含具有稳定pH的目的酸-碱混合物的水溶液。缓冲液的实例是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲砷酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

术语“稀释剂”意指具有稀释药物制剂中的肽的目的的水溶液或非水溶液。稀释剂可以是一种或多种盐溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或，芝麻油)。

术语“佐剂”意指加入至制剂中以增加肽的生物功效的任何化合物。佐剂可以是一种或多种具有不同阴离子的锌盐、铜盐或银盐，例如，但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和不同酰基组合物的醋酸盐。

赋形剂可以是一种或多种糖类、聚合物、脂质和矿物质。糖类的实例包括加入至组合物例如以促进冻干的乳糖、蔗糖、甘露糖和环糊精。聚合物实例是加入至组合物中例如以进行粘性控制，以获得生物粘附或以保护脂质免受化学和蛋白水解降解的淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、鹿角菜胶(carageenan)、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸酯(polysulphonate)、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯和聚乙烯吡咯酮(分子量都不相同)。脂质的实例是因为与对于聚合物的理由相似的理由而加入至组合物的脂肪酸、磷脂、甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(全都具有不同的酰基链长度和饱和度)、卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂和氢化大豆卵磷脂。矿物质的实例是加入至组合物中以获得益处例如脂质累积的减少或有利的色素特性的滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛。

发明的制剂还可包含一种或多种单糖或二糖例如木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、拉克替醇(lactitiol)、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇或木糖苷和/或单酰基甘油例如月桂酸甘油酯。载体的特征取决于施用的途径。施用的一个途径是局部施用。例如，对于局部施用，优选载体是包含活性肽的乳化的乳膏(cream)(但可使用其他常用的载体例如某些基于凡士林(petrolatum)/矿物质和基于植物的软膏(ointment))以及聚合物凝胶、液晶相和微乳剂。

组合物可包含一种或多种肽，例如1、2、3或4种不同的肽。通过使用不同肽的组合，可增加抗微生物效应和/或微生物可能抗和/或耐受抗微生物剂的可能性降低。

作为盐的肽可以是具有无机酸例如盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等或具有有机酸例如甲酸、醋酸、卤代乙酸、丙酸、乙醇酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、丙二酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、磺胺酸等的酸加合物。可加入无机盐例如单价钠、钾或二价锌、镁、铜、钙盐(全都具有相应的阴离子)以提高抗微生物组合物的生物学活性。

本发明的抗微生物/药物组合还可以以脂质体的形式存在，其中除其他药学上可接受的载体外，还将肽与以聚集的形式(如微团、不溶性单层和液晶)存在的两亲性试剂例如脂质混合。用于脂质体形成的合适的脂质包括，但不限于，甘油一酯、甘油二酯、硫酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂草苷、胆汁酸等。此类脂质体制剂的制备可见于例如US4,235,871。

本发明的抗微生物/药物组合物还可以以生物可降解的微球体的形式存在。脂肪族聚酯例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)和聚酐已在微球体的生产中广泛用作生物可降解的聚合物。此类微球体的制备可见于US5,851,451和EP0213303中。

本发明的抗微生物/药物组合物还可以以聚合物凝胶的形式存在，其中可聚合物例如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、鹿角菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯和聚乙烯吡咯酮增加包含肽的溶液的稠度。聚合物还可包含明胶或胶原。

可选择地，可将抗微生物肽溶解于盐溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或，芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。药物组合物还可包含用于增强抗微生物肽的作用的离子和确定的pH。

抗微生物/药物组合物可经历常规的药物操作例如灭菌和/或可包含常规佐剂例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、充填剂等，例如，本说明书中其他地方所公开的。

可局部或全身性施用本发明的药物组合物。施用途径包括局部、眼、鼻、肺、口腔、胃肠外(静脉内、皮下和肌内)、口、胃肠外、阴道和直肠途径。还可通过植入体进行施用。合适的制剂形式是例如颗粒、粉剂、片剂、包被的片剂、(小)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、微乳剂(定义为由水、油和表面活性剂组成的光学各向同性的热力学稳定系统)、液晶相(定义为特征在于长程有序但短程无序(short-range disorder)的系统)(实例包括片层、六角形的和立方体相，连续的水或油)或它们的分散的配对物(counterpart)、凝胶、软膏、分散体、混悬液、乳膏、气雾剂(aerosol)、小滴(drople)、以安瓿形式存在的可注射形式，还有缓释活性化合物的制剂，在该制剂中，如上所述常规使用赋形剂、稀释剂、佐剂或载体。还可在绷带、膏药或缝线等中提供药物组合物。

可以以药学上有效剂的剂量对患者施用药物组合物。“药学上有效的剂量”是指足以产生希望的效应(该效应与针对其施用药物组合物的状况相关)的剂量。确切的剂量取决于化合物的活性、施用的方式、病症的性质和严重度、患者的年龄和体重，可能需要不同的剂量。可通过以单个剂量单位或几个更小的剂量单位的形式单次施用和通过以特定的间隔多次施用细分的剂量来进行剂量施用。

可单独地或与其他治疗剂例如抗生素、抗炎药或防腐剂(antiseptic agent)例如抗菌剂、防霉剂(anti-fungicide)、抗病毒剂和抗寄生虫剂一起施用本发明的药物组合物。可选择地，药物组合物包含一种或多种抗生素或防腐剂。实例是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯(carbacephem)、头霉素、碳青霉烯(carbapenem)、单酰胺菌素、氨基葡糖苷、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、clorhexidine、聚盐酸己双胍和其他双胍、壳聚糖、醋酸和过氧化氢。可将这些试剂整合为相同药物组合物的部分或可分别施用这些试剂。药物组合物还可包含抗炎药例如类固醇和大环内酰胺类衍生物。

本发明涉及人和其他哺乳动物例如除其他以外马、狗、猫、牛、猪、骆驼。因此方法可用于人的治疗和兽医应用。可通过感染的已为大家接受的标志例如发烧、出疹(puls)、生物的培养等鉴定适合用于这样的治疗的物质。可用抗微生物肽治疗的感染包括由微生物引起的或归因于微生物的感染。微生物的实例包括细菌(例如，革兰阳性、革兰阴性)、真菌(例如，酵母和霉)、寄生虫(例如，原生动物、线虫、绦虫和吸虫)、病毒和朊病毒。这些类型中的特定的生物是熟知的(参见，例如，Davis等人，Mircrobiology，第3.sup.rd版，Harper&Row，1980)。感染包括，但不限于，慢性皮肤溃疡、感染的急性和慢性创伤和烧伤、感染的皮肤湿疹、脓疱病、特应性皮炎、痤疮、外耳炎、阴道感染、脂溢性皮炎、口腔感染和牙周炎、念珠菌性擦烂、结膜炎和其他眼感染例如铜绿假单胞菌性角膜炎和肺炎。

因此，药物组合物可在术后和皮肤创伤后用于烧伤的预防性治疗。还可在想要用于与人体接触的外部材料例如隐形眼镜、矫形外科植入物(orthopedic implant)和导管的保存和处理的溶液中包含药物组合物。

此外，药物组合物可用于治疗特应性皮炎、疱性皮炎、慢性皮肤溃疡、感染的急性创伤和烧伤、痤疮、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、念珠菌性擦烂、念珠菌阴道炎、口咽念珠菌病(oropharyngeal candidiasis)、眼感染(细菌性结膜炎)和鼻感染(包括MRSA携带(MRSA carriage))。

药物组合物还可用于清洗液例如透镜杀菌剂和贮存液或用于预防与导尿管的使用或中心静脉导管的使用相关的细菌性感染。

此外，组合物可在药膏、粘合剂、缝线中用于预防术后感染或包含在伤口敷剂中。

抗微生物肽还可用于聚合物、织物等中以建立抗菌表面或可用药物组合物补充化妆品和个人生活自理品(肥皂、洗发剂、牙膏、抗痤疮化合物、防晒霜、棉球、尿布等)。

最后，本发明涉及治疗具有微生物感染或遭受过敏症的哺乳动物的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的上面定义的药物组合物。

下列实施例意欲以任何方式、形状或形式明确地或含蓄地举例说明本发明。

实施例

抗微生物肽

肽：肽来自从Sigma-Genosys，通过肽合成平台(

Custom Peptide Libraries，SigmaGenosys)产生的。产量为大约1至6mg，肽长度为20个氨基酸。对这些肽进行MALDI-ToF质谱分析。20聚体的平均粗制纯度(average crude purity)为大约60％。将肽进行冻干并置于96孔试管架上。在进行生物学试验之前，将PEPscreen肽稀释在dH₂O(5mM原液)中，然后在-20℃下贮存。该原液用于随后的实验。

微生物

从医学院的微生物系获得大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和真菌分离株白色念珠菌ATCC90028。

实施例1

辐射状扩散测定(radial diffusion assay)

大体上按照早期描述的(Lehrer，R.I.，Rosenman，M.，Harwig，S.S.，Jackson，R.& Eisenhauer，P.(1991)Ultrasensitive assaysfor endogenous antimicrobial polypeptides，JImmunol Methods.137，167-73.)进行辐射状扩散测定(RDA)。结果示于表1a-e。

简而言之，在10ml的全剂量(full-strength)(3％w/v)胰酶大豆肉汤(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中将细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)或真菌(白色念珠菌)培养至中对数期(mid logarithmic phase)。使用10mM Tris，pH7.4清洗微生物一次。向5ml底层(underlay)琼脂糖凝胶(由0.03％(w/v)TSB，1％(w/v)低电渗型(Low-EEO)琼脂糖(Sigma，St Louise MO)和0.02％(v/v)的终浓度的Tween20(Sigma)组成)中加入4 x 10⁶细菌cfu或1 x 10⁵真菌cfu。将底层倾倒入直径85mm的培养皿。在琼脂糖固化后，打出4mm直径的小孔，向各孔中加入6μl的受试样品。将板在37℃下温育3小时，使肽扩散。然后用5ml熔化的覆盖层(dH₂O中6％TSB和1％Low-EEO琼脂糖)覆盖底层凝胶。在37℃(对于细菌)和28℃(对于白色念珠菌)下温育18至24小时后，肽的抗微生物活性显现为围绕各个小孔的清亮区带。

经筛选且发现显示增加的抗上述微生物的效应的肽的其他实例列于下面。其中一些结果见于表1c(显示抗白色念珠菌的效应)、表1d(大肠杆菌)和表1e(金黄色葡萄球菌)。

补体

CNY1

CNY1WWW     CNYITELRRQHARASHLGLAWWW

CNY187

CNY187WWW   CKYILLLRRQHARAWRRGLRWWW

生长因子

GKR22

GKR22WWW    GKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKWWW

PKR21

PKR21WWW    PKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNWWW

凝固因子II

VFR17

VFR17WWW    VFRLKKWIQKVIDQFGEWWW

C蛋白抑制剂

SEK20

SEK20WWW    SEKTLRKWLKMFKKRQLELYWWW

PRELP

QPT22

QPT22WWW    QPTRRPRPGTGPGRRPRPRPRPWWW

LL-37

LL-37

LL-37WWW    LLGDFFRKSKEKI

            KEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTESWWW

Omiganan

OmigananWWW ILRWPWWPWRRKWWW

实施例2

溶血试验(hemolyis assay)

将EDTA-血液以800g离心10分钟，然后除去血浆和血沉棕黄层。清洗红细胞3次，然后将其重悬浮于5％PBS，pH7.4中。然后在肽(3-60μM)存在的情况下在持续旋转(end-over-end rotation)的条件下将细胞在37℃下温育1小时。2％Triton X-100(Sigma-Aldrich)用作阳性对照。然后将样品以800g离心10分钟。在λ540nm处测量血红蛋白释放的吸光率，所述吸光率在图中表示为Triton-X100诱导的溶血的百分数(表1a)。

表1b

表1c

表1d

表1e

序列表

<110>Dermagen AB

<120>改进的抗微生物肽

<130>P5856007

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>83

<212>PRT

<213>人类激肽原(human kininogen)

<400>1

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>2

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>3

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>4

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>5

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>6

<210>7

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>7

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>8

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<400>9

<210>10

<211>17

<212>PRT

<213>人类激肽原

<400>10

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>人类激肽原

<400>11

<210>12

<211>17

<212>PRT

<213>人类激肽原

<400>12

Claims (23)

1.一种抗微生物肽，其包含：

a)第一组氨基酸残基，其具有大约2至大约36个氨基酸残基或其类似物的长度，其与氨基和/或羧基末端连接，

b)第二组，其包含3至8个疏水性氨基酸残基或其类似物，从而获得具有抗微生物活性的肽。

2.权利要求1的抗微生物肽，其中所述第一组氨基酸残基具有抗微生物活性。

3.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述第二组包含3、4、5、6、7或8个疏水性氨基酸残基或其类似物。

4.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述疏水性氨基酸残基选自V、L、I、F、Y、W、合成的疏水性氨基酸残基或其类似物。

5.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述第二组包含相同的疏水性氨基酸残基或不同疏水性氨基酸残基或其类似物的混合物。

6.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述第二组选自F_(3-8)、W_(3-8)、I_(3-8)、Y_(3-8)、V_(3-8)和所述氨基酸残基或其类似物的混合物。

7.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中第一组氨基酸残基来自激肽原蛋白、生长因子蛋白、PRELP、凝固系统的蛋白质、补体因子C3a、血管假性血友病因子、玻璃粘连蛋白、过氧化物歧化酶、朊蛋白、C蛋白抑制剂、纤连蛋白、层粘连蛋白、趋化因子和富含组氨酸的糖蛋白。

8.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中第一组氨基酸残基具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个氨基酸残基或其类似物的长度。

9.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中第一组氨基酸残基总体上具有正净电荷。

10.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中已用其它氨基酸残基取代了第一组氨基酸残基的1至21个氨基酸残基。

11.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述第一组氨基酸残基与大约1至大约100个额外的氨基酸残基连接，例如与大约5至大约50个氨基酸残基或其类似物连接。

12.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中所述肽通过酰胺化、酯化、酰化、乙酰化、PEG化、烷基化而被修饰或所述氨基酸残基可以是D型氨基酸残基。

13.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中抗微生物肽选自SEQ ID NO：1、10-12。

14.前述权利要求的任一项的抗微生物肽，其中抗微生物肽选自SEQ ID NO：2-9。

15.一种抗微生物/药物组合物，其包含

a)权利要求1-14的任一项的抗微生物肽和

b)可接受的缓冲剂、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂。

16.权利要求15的抗微生物/药物组合物，其包含一种或多种抗微生物肽。

17.权利要求15-16的任一项的抗微生物/药物组合物，其中药物组合物包含一种或多种抗生素和/或防腐剂和/或免疫调节剂和/或止痒剂和/或类固醇。

18.权利要求15-17的任一项的抗微生物/药物组合物，其中抗微生物/药物组合物的形式为颗粒、粉末、片、包衣片、导管和针的涂层、胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、凝胶、软膏、分散体、混悬液、乳膏、气雾剂、小滴或可注射形式。

19.包含权利要求1-14的任一项的抗微生物肽或权利要求15-18的抗微生物/药物组合物的产品，其中所述产品选自绷带、膏药、缝线、肥皂、棉球、尿布、洗发剂、牙膏、抗痤疮化合物、防晒霜、织品、包含在伤口敷剂中的粘合剂、清洁液、隐形眼镜或植入物。

20.权利要求1-14的任一项的抗微生物肽或权利要求15-18的药物组合物或权利要求19的产品在治疗或诊断中的用途。

21.权利要求20的用于制造药物的用途，所述药物用于治疗或用于预防性治疗由选自细菌、病毒、寄生虫、真菌和酵母的微生物引起的抗微生物疾病或感染。

22.权利要求21的用于治疗或用于预防性治疗疾病或感染或用于在术后和皮肤创伤后预防性治疗烧伤的用途，所述疾病或感染选自特应性皮炎、脓疱病、慢性皮肤溃疡、感染的急性和慢性创伤和烧伤、痤疮、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、念珠菌性擦烂、念珠菌阴道炎、口咽念珠菌病、眼感染和鼻感染。

23.用于治疗或用于预防性治疗具有微生物感染或疾病的哺乳动物的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求15-19的任一项的药物组合物。