CN101443292B

CN101443292B - 制备治疗化合物和组合物的新方法、用该方法制备的化合物和组合物，及其用途

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Publication number: CN101443292B
Application number: CN2007800176929A
Authority: CN
Inventors: 拉斯·E·古斯塔夫森; 达格·林纳森; 克里斯托弗·尼尔森
Original assignee: 拉斯·E·古斯塔夫森; 达格·林纳森; 克里斯托弗·尼尔森
Current assignee: Gino Yate company
Priority date: 2006-03-14
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2027-03-14
Also published as: JP5191477B2; EP2004576A4; US20090258944A1; EP2004576A1; WO2007106034A1; CN101443292A; AU2007225489A1; ATE534618T1; DK2004576T3; EP2004576B1; US8030511B2; JP2009534298A

Abstract

有机亚硝酸酯可以由一元醇/多元醇或其醛或酮的衍生物的化合物，在对其脱氧后用NO气体制备，并存贮在以气体NO饱和的环境中。与常规制备方法相比，根据本发明制备的有机亚硝酸酯显示出杂质较少并且存贮稳定性改善。本发明的有机亚硝酸酯能容易地被配制成药物组合物并对治疗各种各样的疾病有效。

Description

制备治疗化合物和组合物的新方法、用该方法制备的化合物和组合物,及其用途

技术领域

本发明涉及用于制备能够在体内产生和释放气体一氧化氮的化合物，尤其是有机亚硝酸酯的方法，以及包括所述化合物的药物组合物或制剂。所述化合物或组合物显示出性质的改善，例如稳定性提高、生理可接受性增强并且副作用减少。本发明还涉及用所述方法可获得的化合物和组合物，以及它们在在制备药物制剂中的用途。本发明还涉及治疗多种疾病和病症的方法，包括将所述化合物或药物组合物向需要的患者给药。

背景

一氧化氮

一氧化氮(NO)是在几个生物系统中的一种重要的分子，它在肺内不断产生，并且可以在呼出的气体中可检测到ppb(十亿分之几)级。在呼出的空气内发现内源性NO，且它作为炎症的一个诊断标志的用途可追溯到1990年代早期(参见：已公开的国际专利申请WO93/05709和WO95/02181)。如今，内源性NO的重要性已被广泛承认，并且在几年前，市场上出现了临床分析仪(

，第一台定做的NO分析仪用于哮喘患者的常规临床应用，AEROCRINE AB，Solna，瑞典)。

美国胸科协会(American Thoracic Society)(ATS)出版了临床NO测量指南(American Thoracic Society，Medical Section of the American LungAssociation：Recommendations for standardized procedures for the online andoffline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitricoxide in adults and children-1999，in Am J Respir Crit Care Med，1999；160：2104-2117)。

通常认为内源产生的气体NO分子在肺血管的优选换气灌注匹配的调节中起重要的作用(Persson等，1990)。在健康成人中，NO在基础肺和系统血管阻力的调节中很重要(Stamler等，1994)。在健康人类个体中，通过NO合成酶抑制剂的给药影响血流的局部调节(Rimeika等，2004)。内源性NO的血管扩张作用在出生后的肺循环中无疑对胎儿肺对呼吸中交换空气的适应性起作用(Abman等，1990)。在出生后的肺中NO的产生被例如机械延展、剪切力增加和肺泡中O₂压力的增加所刺激(Heymann，1999)。测量呼出气体中的NO是监视肺中内源NO产生或清除的变化的好方法(Gustafsson等，1991)。

此外，美国专利5,670,177公开了治疗或预防局部缺血的方法，包括通过血管内的途径给药于患者包括NO和二氧化碳CO₂的一种气体混合物，其中NO以治疗或预防局部缺血的有效量存在。

美国专利6,103,769公开了相似的方法，区别在于使用NO饱和的盐水。

已公开的国际申请WO94/16740说明NO传递化合物的用途，所述化合物例如S-亚硝基硫醇、亚硝基硫醇(thionitrites)、硝基硫醇(thionitrates)、斯德酮亚胺(sydnonimines)、呋喃唑酮、有机硝酸酯、硝普盐、硝酸甘油、铁-亚硝酰络合物，等等，用于酒精肝损伤的治疗或预防。

硝酸酯目前用于治疗心绞痛(胸痛)的症状。硝酸酯通过松弛血管和增加对心脏的血液和氧气的供给起作用，因而减少了它的工作负荷。目前可用的硝酸酯药物的例子包括：

硝酸甘油(硝酸甘油酯)(1，2，3-丙三醇硝酸酯)，目前主要被用于舌下抑制心绞痛的急性发作。由于迅速和普遍的血管舒张作用而导致剧烈的头疼和眩晕是常遇到的副作用。也可使用硝酸甘油输注浓缩物，并稀释在等渗的葡萄糖或生理盐水中用于静脉内输注。在急性和长期治疗方案中，耐受性的发生是一个问题。

单硝酸异山梨酯(1，4：3，6-二脱水-D-山梨醇-5-硝酸酯)，被用于预防心绞痛。在长期治疗方案中，耐受性的发生是一个问题。和硝酸甘油遇到的问题一样，经常发生的副作用包括头疼和头晕。

二硝酸异山梨酯(1，4：3，6-二脱水-D-山梨醇-2，5-硝酸酯)，用于治疗急性和预防心绞痛和心机能不全。

季戊四醇硝酸酯，一种有机硝酸酯，已知具有长效的抗氧化和抗动脉粥样硬化作用，机理还不明确。在硝酸酯治疗中有害的发展，硝酸酯耐受的情况下，研究季戊四醇四硝酸酯，在肺动脉高血压下进行了实验测定。

许多化合物，硝酸甘油、亚硝酸乙酯、硝酸异丁酯、亚硝酸异丁酯、亚硝酸异戊酯和亚硝酸丁酯，在体内进行了测试并且发现产生了NO(Cederqvist等，1994)。发现体内NO的产生和在兔子模型中对血压的作用显著相关。

因此，在美国专利5,646,181中说明传统合成的某些有机亚硝酸酯，通过对阴茎局部或海绵体内给药用于治疗治疗男性阳痿和勃起功能障碍。

无机硝酸盐和亚硝酸盐，例如亚硝酸钾和亚硝酸钠，已用作食品防腐剂很长时间。硝酸盐和亚硝酸盐一般被认为有潜在伤害，这是由于在食物中和在人体内，其在理论上可能形成致癌的N-亚硝基化合物。最近，食用的硝酸盐和亚硝酸盐的作用被重新评价，特别是发现在精氨酸-一氧化氮体系中作为内源NO产生，以及在宿主防御中的作用(Larsen等人，Effects of dietarynitrate on blood pressure in healthy volunteers，N Engl J Med 355，2792-3(2006))。

最后，L-精氨酸及其酯，例如L-精氨酸乙酯，L-精氨酸甲酯和L-精氨酸丁酯用于增加内源NO的产生。

WO96/38136公开了用气体一氧化氮在无氧条件下使蛋白质亚硝化，形成用于涂布植入人体内设备的表面的一氧化氮加合物。相关专利是U.S.6,352,709和国际专利公开WO96/35416。

在目前可用的化合物和组合物中，许多与不希望的性质或副作用联系在一起，例如毒性问题、稳定性问题、延时作用、不可逆作用或延长作用等。一个经常遇到的特殊问题是，当NO供体化合物以输注的形式给药时，会产生高铁血红蛋白(metHb)。

本发明的一个目的是开发制备和处理NO供体化合物，例如有机亚硝酸酯的改良方法，和包含这些化合物的药物制剂的制备或配制。已知的有机亚硝酸酯和它们的治疗用途常常与由于组合物中存在的杂质和降解产物而可能存在问题联系在一起。由于混合步骤和所使用的载体可能引起进一步的降解，制备包含有机亚硝酸酯的药物制剂也是困难的。同样地，由于NO的反应特性，这些制剂的存贮特性通常难以令人满意。

另一个目的是确定递送NO的新方法和组合物，它们没有与常规治疗和药物相关的副作用或耐受性的产生。

另一个目的是确定和合成新颖的NO供体化合物。

其他目的，得到的解决方案和与此相关的优点在研究说明书和实施例后会很明显。

发明概述

本发明者开发了合成和处理有机亚硝酸酯的新颖方法，在说明书，实施例和权利要求书中所公开的常规合成的有机亚硝酸酯，在此引入作为参考。

本发明也涉及制备有用的有机亚硝酸酯化合物和由有机亚硝酸酯组成或包括有机亚硝酸酯的组合物，与按照常规合成和配制的化合物和组合物相比显示出有利性质，和它们治疗多种疾病的用途，其中认为NO起到有利的作用。特别地，本发明涉及制备有用的具有下述式I和II的二种新颖的NO供体：

亚硝酸2-羟基丙酯亚硝酸2-羟基-1-甲基乙酯

I II

本发明也涉及有机亚硝酸酯有用的改良存贮形式，防止或至少显著延迟它们的分解。在研究说明书、实施例和权利要求书和附图后，本发明其他方面对本领域技术人员是明显的。

虽然本发明的具体特征在一些实施方案中被提及，而在其他方面中没提及，这只是为了方便，因为每个特征能与与本发明任何其他或所有其他特征相结合。

附图的简要说明

本发明将用下述说明、实施例和附图更细致地说明，其中

图1是表示将溶解了NO气体的生理盐水或脂质乳液输注入抑制了内源性NO产生的动物体内(L-NAME30毫克每公斤)后，在人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子中混合呼出的一氧化氮(FE_NO)的变化的曲线图。水平轴显示输注时间。

图2是表示将溶解了NO气体的生理盐水或脂质乳液输注入抑制了内源性NO产生的动物体内(L-NAME30毫克每公斤)后，在人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子的动脉血中高铁血红蛋白(MetHb)变化的曲线图。水平轴表示输注时间。

图3由三条曲线图组成，涉及人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子(n＝4-5)的实验。该曲线图表示由于静脉输注(30微升每公斤每分钟)25％-甘油-NO，混合呼出的一氧化氮(FENO)，平均动脉血压(MAP)和心率(HR)的变化。水平轴表示输注时间。

图4由两个示意图组成，涉及人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子的实验(n＝3-5)。柱形图表示在输注前(空心柱)和在静脉内输注25％-甘油-NO时(实心柱)，混合呼出的一氧化氮(FENO)和平均动脉血压(MAP)。

图5由两个示意图组成，涉及人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子的实验(n＝3-5)。柱形图表示在输注前(空心柱)和在静脉内输注25％-甘油-NO时(实心柱)，心率(HR)和呼气末二氧化碳(ETCO₂)。

图6由两个曲线图组成，涉及人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子的实验(n＝3-5)。该曲线图显示由于在静脉内输注25％-甘油-NO，混合呼出的一氧化氮(FENO)，平均动脉血压(MAP)，心率(HR)和呼气末二氧化碳(ETCO₂)的剂量和响应关系。

图7由两个示意图组成，涉及人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子的实验(n＝2-3)。柱形图显示了在输注前(空心柱)和静脉内输注不同浓度一氧化氮(NO)-取代物时(实心柱)混合呼气的一氧化氮(FENO)和平均动脉血压(MAP)。

图8显示了来自使用机械通气的戊巴比妥麻醉的兔子的动物实验的结果。25％-甘油-NO(剂量分别为10，30和100微升每公斤每分钟)对U46619导致的肺动脉高血压的作用。所使用的缩写：PAP-肺动脉压力；CO-心输出量；PVR-肺血管阻力；MAP-平均全身动脉压。

图9显示了来自使用机械通气的戊巴比妥麻醉的兔子的动物实验的结果。1，2-丙二醇-NO(剂量分别为30和100微升每公斤每分钟)对U46619导致的肺动脉高血压。所使用的缩写：PAP-肺动脉压力；CO-心输出量；PVR-肺血管阻力；MAP-平均全身动脉压；FENO-在混合呼出气体中一氧化氮的浓度。

图10显示涉及使用甘油-NO治疗在戊巴比妥麻醉并机械通气的兔子中实验性肺栓塞(PE)的实验的曲线。对照组(空心圆，n＝3)和被治疗的兔子(实心圆，n＝1)在时间0时具有肺栓塞，PE。在20-50分钟的时间点之间静脉注射给予被治疗的动物100微升每公斤每分钟的甘油-NO(25％的甘油水溶液(v/v)所述水溶液经去氧并用纯一氧化氮气体处理过)。PVR-肺血管阻力。

图11显示涉及戊巴比妥麻醉并机械通气的兔子的实验的曲线图，其中静脉注射NO溶液，在心肌缺血-再灌注液损伤的再灌注阶段中心率失常的发生率更低。对照组(实线，n＝4)，葡萄糖-NO治疗组(虚线，n＝3)和1，2-丙二醇-NO治疗组(长虚线，n＝3)心肌缺血30分钟(图上未显示)，然后再灌注120分钟(图上显示)。在再灌注前15分钟(即，在缺血15分钟后)开始治疗，并且在葡萄糖-NO组中再灌注持续60分钟，且在1，2-丙二醇-NO组中再灌注120分钟。

图12显示亚硝酸丙酯，亚硝酸丙酯-NO，和丙醇-NO的HPLC分析的三个色谱图，相应的实施例中对谱图A，B和C有更详细的描述。

图13显示了在脱氧的情况下(He-吹扫的密封玻璃圆筒)，丙醇(约100％)和NO气体之间的反应的GC-MS分析。通过微量注射器从玻璃圆筒中对丙醇-NO反应混合物取样，与等体积的脱氧的甲苯混合，并且将1微升被稀释的样品在40℃下直接在柱上注入Agilent DB-5MS内径0.25mm，30m气相色谱柱，用恒流He(1ml/分钟)洗脱并且同时以每分钟10℃的温度梯度开始。用HP5973质量选择检测器(四极杆)检测。使用Wiley7n质谱库通过它们的各自的质谱特征检测指示化合物。

图14显示在时间＝0时自动注入(分流分率1:20)0.5微升脱氧的约100％用NO气体处理的1，2-丙二醇以后，使用Agilent DB-1701柱和具有EI质谱检测的气相色谱图，。谱图A显示了m/z范围为20-320的总离子色谱图，并且谱图B显示m/z＝30的提取离子色谱图，其是有机亚硝酸酯的一个常见碎片。所示的峰1和2进一步在图15和图16的质谱表征。代表1，2-丙二醇的峰和在Wiley质谱库里中对应峰是相同的，而在Wiley库中或别处找不到峰1和2的光谱。

图15a和15b显示来自与图14相似色谱的峰1和2的EI质谱的图，支持与对应于图14中的二个峰的推测结构，1，2-丙二醇亚硝酸酯(亚硝酸2-羟基丙酯和亚硝酸2-羟基-1-甲基乙基酯)。

图16a和16b显示脱氧的约100％1，2-丙二醇的反应混合物的质谱分析后得到的质谱，所述反应混合物在使用化学电离(甲烷气体)的AgilentDB-1701柱上用NO气体处理。在谱图中A被显示为对应于图14中峰1的被洗脱峰的光谱，并且在谱图中B被显示为对应于图14中峰2的被洗脱峰的光谱。在两个谱图中都发现质量峰m/z＝104和106，对应于图15中描述的化合物的M-1和M+1。

发明的实施方案的描述

在本发明被公开和描述之前，应该理解本发明不限于这里公开的具体结构、方法步骤和材料，因为所述的结构、方法步骤和材料可以略有变化。也应理解这里所用的术语只是为了用于描述特定实施方案，且不是为了限制本发明的范围，且该范围仅限于附属权利要求及其等同物的范围内。

必需注意的是，说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一(a，an)”，和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地说明不包括。因此，例如，涉及一种有机亚硝酸酯包括涉及一种或多种的这些亚硝酸酯，例如实施根据本发明的方法时形成的亚硝酸酯混合物。

最初，对比实验，发明者使用溶于生理盐水的气体NO，以每公斤体重多达5毫升注射给药。有趣地是，能检测到呼出NO没有或仅有很小的增加。(参见图1)。相似地，观察到血液循环没有变化。这说明当在生理盐水中输注时，NO被迅速分解或被其他方式灭活，使它无法到达肺部或全身血管。这得到在NO生理盐水中输注时，观察到高铁血红蛋白大量形成的支持(参见图2)。高铁血红蛋白形成是非常不希望的作用，因为它减少了血液的携氧能力。

然后发明者发现了给药气体NO的其它的和改良的组合物。在这项工作中，发现NO能被配制成静脉内给药的脂质乳液，并且这种制剂可使NO到达肺。实验表明每公斤体重输注0.1到0.5毫升，在给予L-NAME以抑制内源性NO产生的动物中导致呼出NO明显可辨别的增加。(参见图1)

结果也显示NO输注在肺循环中产生血管舒张作用，和对体循环只有温和的血管舒张作用，或这些作用的组合。

令人惊奇地观察到，在含有NO的脂质乳液输注期间，形成的高铁血红蛋白非常少或没有(参见图2)。进一步的实验，使用其他含羟基化合物(参见下面)，显示出有利地低或不形成高铁血红蛋白。

本发明者接着按照本发明的方法测试了不同的化合物。结果显示在下面的实验部分中，并且概括在表1中。

所述化合物通过先使由有机原料组成或包含有机原料的溶液脱氧制备。脱氧在这里意指使原料基本上不含氧气。这可以通过用惰性气体，或气体，例如氮气、氩气、氦气等的混合物来吹扫(purge)或平衡介质来实现。或者，介质通过气体交换系统，例如用于以反向方式除去氧气的膜式氧合器。当用于制备本发明原料时蒸馏方法也能被使用，当在氮气或另一种惰性气体或气体混合物下进行蒸馏时，产生用于制备有机亚硝酸酯的脱氧的原料。对于挥发性原料，也能通过加热原料来制备脱氧的溶液。

然后用气体NO通过原料得到NO饱和的由原料组成或包含原料的脱氧溶液。这可以在大气压下，或在提高的压力下进行。

用气体NO进行的处理预示着，原料以溶液，或以液体或半固体的形式存在，这使得可能与气体NO充分混合。

意想不到地发现以这种方式制备有机亚硝酸酯，并且所得的有机亚硝酸酯在许多情况下比常规制备的和市售的有机亚硝酸酯的纯度更高。本文制备的一些有机亚硝酸酯以前未被描述过。此外，贮藏实验表明根据本发明制备的有机亚硝酸酯比常规制备的市售制剂更稳定。更进一步，本发明制备的有机亚硝酸酯，更适合于进一步加工成治疗制剂，例如用药学上适合的载体稀释。

所述的载体是例如生理盐水，注射或输注用的溶液或乳液。根据优选的实施方案，在与有机亚硝酸酯混合前，所述的载体被脱氧并用气体NO饱和。这使得可能制备含有给药前不降解的有机亚硝酸酯的药物制剂。认为原料，气体NO和有机亚硝酸酯之间处于平衡状态，稳定该组合物。

因此，本发明涉及有用的合成有机亚硝酸酯的方法和进一步加工有机亚硝酸酯的方法，不论它们按照常规制备或根据本发明合成的。

适于作为用本发明的方法制备有机亚硝酸酯的原料的化合物，优选是至少有一个羟基的水混溶的有机化合物。更优选，所述原料是一元/多元醇或其醛或酮衍生物，包括醇和单糖或多糖。

根据一个实施方案，所述原料是糖(carbohydrate)化合物或其衍生物。根据另一个实施方案，所述原料是单糖或其衍生物。优选地，所述原料选自葡萄糖，果糖，半乳糖，核糖。例如，葡萄糖可优选使用以市售的用于输注的糖溶液形式，例如但不限于林格氏葡萄糖(Ringer-Glucose)(Baxter)，输注用葡萄糖溶液(Baxter，Braun，Fresenius Kabi等制备)。

根据另一种实施方案，所述原料是单糖醇，优先选择山梨糖醇和甘露糖醇。例如甘露糖醇有利地以市售的溶液形式用于输注，例如但不限于MannitolBaxter Viaflo(Baxter)和Mannitol(Fresenius Kabi)。除作为原料的功能之外，这样的输注溶液也能起到有机亚硝酸酯的生理学上可接受的和治疗有效的制剂载体作用。在本发明该实施方案中，载体更适宜也被脱氧并在加入有机亚硝酸酯之前用NO饱和。

根据另一种实施方案，所述原料是修饰的单糖，即选自岩藻糖、2-脱氧核糖和1-O-甲基-核糖的化合物。

根据另一种实施方案，所述原料是单糖或其衍生物的二糖或更高级糖聚合物，且优选葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、山梨糖醇、甘露糖醇、岩藻糖、2-脱氧核糖和1-O-甲基-核糖的二糖或更高级多糖，或蔗糖、乳糖酸、菊糖、葡聚糖和岩藻依聚糖之一。

根据得自聚合物化合物的阳性结果，本文用蔗糖，甘露糖醇，菊糖，岩藻依聚糖，和葡聚糖为例，本发明明显是适用于聚合物化合物。因此，复杂糖的不同制剂，例如目前使用的用作血液替代品和输注溶液的那些可用作原料，且落入在本发明的范围内。非限制性的例子包括市售的产品例如Macrodex

Figure 2007800176929100002G2007800176929D0009084741QIETU

和Rheomacrodex

(Meda)，Ringer-Dextran

(Braun)，HAES-Steril、HyperHAES和Voluven

(Fresenius Kabi)和Hemohes

(Braun)。除作为原料的功能之外，这样的产物或其等同物也能起到有机亚硝酸酯的生理上可接受的和治疗有效制剂载体作用。在本发明该实施方案中，载体优选也被脱氧并在加入有机亚硝酸酯之前用NO饱和。

根据另一种实施方案，所述原料是醇或其衍生物。根据该实施方案，所述原料是一元醇，即选自下述的醇：乙醇、丁醇，异丁醇、1-丙醇、2-丙醇、山梨糖醇和甘露糖醇。根据另一种实施方案，所述原料是二元醇，例如1，2-丙二醇(丙二醇)或1，3-丙二醇。根据另一种实施方案，所述原料是三元醇，例如甘油。

根据另一种实施方案，所述原料是醇分子或其衍生物的聚合物，如不同分子量的聚乙二醇。PEG400的初步研究已经显示出了阳性结果。

另一方面，所述原料是白蛋白。因此，根据本发明，以白蛋白为基础的血液替代品，可以使用例如但不限于市售的血浆替代品和血浆蛋白输注溶液。实例包括但不限于白蛋白输注溶液(Baxter，Behring，Octapharma等制备)。除作为原料的之外，这样的白蛋白输注溶液也能起到有机亚硝酸酯的生理学上可接受的和治疗有效制剂载体作用。在本发明该实施方案中，载体也优选被脱氧并在加入有机亚硝酸酯之前用NO饱和。

另一方面，所述原料是脂质溶液，如用于静脉营养的乳液和溶液，这里以Intralipid

(Fresenius Kabi)为例。这些适合的乳液的非限制的例子包括

(Baxter)，

和

(FreseniusKabi)，和

(Braun)和等同产品。除作为原料之外，这样的乳液也能起到有机亚硝酸酯的生理上可接受的和治疗有效制剂载体作用。在本发明该实施方案中，载体优选也被脱气并在加入有机亚硝酸酯之前用NO饱和。

本发明用本发明的方法制备可使用的化合物，以及包含所述化合物的组合物。所述化合物的例子在目前认为是新颖的，包括具有下式I和II的二个新颖的NO供体：

亚硝酸2-羟基丙酯亚硝酸2-羟基-1-甲基乙酯

I II

上述化合物的结构通过质谱分析证实，在说明书的实验部分更细致描述。

使用本发明方法制备的这些和其他化合物能被用于药物组合物或其一部分。

所述组合物任选用根据发明的方法制备或贮存。

根据发明的组合物优选配制成局部、直肠、阴道、子宫内、尿道内、直肠内、膀胱内、宫颈内或经宫颈、子宫内、腹腔内、外科内(intrasurgical)、鼻、眼、舌下、口内、口服、肠内、静脉内、动脉内、气管内、肌肉内或皮下给药，和通过吸入给药。

根据优选的实施方案，本发明的组合物基本上不包含氧。另外，根据另一种优选的实施方案，所述组合物是基本上不含氧的含有有机亚硝酸酯的可注射的水性制剂。为了稳定的目的，进一步预期该组合物存放在被气体NO饱和的环境，例如在以NO饱和的环境中，或存在过量的气体NO或NO顶部空间的环境中。初步结果表明如果有机亚硝酸酯、相应的有机原料和气体NO同时存在，有机亚硝酸酯对于抵抗分解和不希望的反应产物的形成更稳定。

一种优选的实施方案是吸入的水性制剂，其包含有机亚硝酸酯，并适用于使用常规技术例如喷雾、雾化等给药。优选所述制剂包含有机亚硝酸酯、相应的有机原料和气体NO。

另一种优选的实施方案是局部给药的制剂，例如含有有机亚硝酸酯、相应的有机原料和气体NO的凝胶、软膏或溶液。

另一种优选的实施方案是输注制剂，例如含有有机亚硝酸酯、相应的有机原料和气体NO的无菌的溶液或乳液。

此外，本发明涉及有用的治疗，缓解或预防人或动物患者一个器官或多个器官的灌注不足的方法，其中将能递送NO的组合物给予所述患者。灌注不足包括组织或器官中多种病因的灌注不足，包括但不限于局部缺血的肿瘤组织、被移植的组织或器官，包括供移植的组织或器官。

根据发明的一种实施方案，所述灌注不足是由于肺栓塞的肺的一部分或多部分灌注不足。肺栓塞包括多种病因的肺栓塞，包括但不限于肺血栓栓塞和肺气体栓塞。

其他适应症，本发明的组合物单独或与一种或多种药剂组合使用，包括不同病因的急性肺血管收缩、肺栓塞、不同病因的肺动脉高血压，包括原发性高血压和继发性高血压、不同病因的全身高血压、急性心力衰竭、冠心病、心肌梗塞、缺血性心脏病、心绞痛、不稳定心绞痛(instable angina)、心率失常、酸中毒、气管炎、囊性纤维化、COPD、纤毛不能移动综合征(immotilecilia syndrome)、肺炎、肺纤维化、成人呼吸窘迫综合征、急性肺水肿、急性高山症(acute mountain sickness)、哮喘、支气管炎、不同病因的缺氧、中风、胃肠道炎症、IBD、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、膀胱炎或尿道炎、皮炎、糖尿病性溃疡、糖尿病性神经病、牛皮癣、不同病因的炎症、伤口愈合、和需要平滑肌松弛的疾病。

根据优选的实施方案，所述适应症是哮喘，本发明的组合物被配制成吸入的制剂。

所述组合物也可用于希望控制高血压，例如神经外科中控制高血压的情况。

本发明的组合物也优选单独或与一种或多种药剂组合使用，作为血小板(trombocyte)聚集和凝固的抑制剂，例如与血管舒张药(vasodilatation)组合。

本发明的组合物也用作其他药物活性剂的佐剂，为了增强它们的摄取，例如，增强局部给药系统药物的系统摄取；作为希望增加局部循环的注射液的添加剂；作为抗肿瘤药物和/或放射治疗一起的佐剂，其中血管舒张作用可能增加治疗的抗肿瘤作用。另外的应用是伤口愈合，其中考虑抗微生物药、抗生素或类似物，与有机亚硝酸酯组合给药。

根据这个用途的实施方案，所述的在一个器官或多个器官的灌注不足是由于肺栓塞引起的肺的一部分或多个部分的灌注不足。肺栓塞包括多种原因的肺栓塞，包括但不限于肺血栓栓塞和肺气体栓塞。肺动脉高血压，即新生的，或原发性或特发性肺动脉高压或另一种疾病或缺氧引发的继发肺动脉高血压也能通过发明的方法治疗。

因此，本发明也涉及根据本发明制备的有机亚硝酸酯合适的第一和第二医药用途，以及含有根据本发明制备的有机亚硝酸酯的制剂。概括地说，对于制备治疗得益于NO形成的疾病的药物制剂，本发明使有机亚硝酸酯或含有机亚硝酸酯的组合物可以使用。

在上述的第一或第二医药用途中，所述有机亚硝酸酯是当有机原料进行本发明方法时形成的有机亚硝酸酯，其中所述原料选自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、山梨糖醇、甘露糖醇、岩藻糖、2-脱氧核糖、1-O-甲基-核糖、蔗糖、乳糖酸、菊糖，葡聚糖，岩藻依聚糖，乙醇，丁醇，异丁醇、1-丙醇、2-丙醇、1，2-丙二醇(丙二醇)，1，3-丙二醇、甘油、聚乙二醇、N-乙酰半胱氨酸、白蛋白及其衍生物。

根据本发明，所述疾病选自不同病因的急性肺血管收缩、肺栓塞、不同病因的肺动脉高血压，包括原发性高血压和继发性高血压、不同病因的全身高血压、急性心力衰竭、冠心病、心肌梗塞、缺血性心脏病、心绞痛、不稳定心绞痛、心率失常、酸中毒、气管炎、囊性纤维化、COPD、纤毛不能移动综合征、肺炎、肺纤维化、成人呼吸窘迫综合征、急性肺水肿、急性高山症、哮喘、支气管炎、不同病因的缺氧、中风、胃肠道炎症、IBD、克罗恩病、溃疡性结肠炎、膀胱炎或尿道炎、皮炎、糖尿病性溃疡、糖尿病性神经病、牛皮癣、不同病因的炎症、伤口愈合、和需要平滑肌松弛的疾病。

上述的药物制剂是膏药或绷带，凝胶，乳膏，软膏，溶液，栓剂，其用于局部，直肠或阴道给药；滴加的，或形成鼻或眼给药的气雾剂的溶液；口服或肠道给药的溶液、乳液、滴液、胶囊或片剂；静脉内、动脉内、气管内、肌肉内或皮下给药的可注射的溶液或乳液，或吸入的溶液。

本发明也涉及制备有机亚硝酸酯的方法，其中水溶液，适用于局部、直肠，阴道，尿道内、膀胱内，直肠内、鼻、眼、舌下、口内、经口、肠内、静脉内，动脉内，气管内，肌肉内或皮下给药，和通过吸入给药；脱氧直到充分除去氧，然后用纯的NO气净化直至达到理想的NO浓度。

根据本发明的方法中，所述的制备有机亚硝酸酯的原料，优选至少有一个羟基的水混溶性有机化合物。优选所述原料是一元醇/多元醇或其醛或酮的衍生物。

根据一种实施方案，所述原料是糖化合物或其衍生物。根据另一种实施方案，所述原料是单糖或其衍生物。优选地，所述原料选自葡萄糖，果糖，半乳糖，核糖。

根据另一种实施方案，所述原料是单糖醇，优选选自山梨糖醇和甘露糖醇。

根据另一种实施方案，所述原料是修饰的单糖，如选自岩藻糖、2-脱氧核糖和1-O-甲基-核糖的化合物。

根据另一种实施方案，所述原料是单糖或其衍生物的二糖或更高级的糖聚合物，以及优选葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、山梨糖醇、甘露糖醇、岩藻糖、2-脱氧核糖和1-O-甲基-核糖的二糖或更高级的多糖，或蔗糖、乳糖酸、菊糖、葡聚糖和岩藻依聚糖之一。

如上所述，基于用聚合的糖得到的阳性结果，这里用蔗糖，甘露糖醇，菊糖，岩藻依聚糖，和葡聚糖为例子，显然复杂糖的不同制剂(目前用作血液替代品和输注溶液)，都在本发明范围内。非限制性的例子包括

和

(Meda)，

(Braun)，HAES-Steril，HyperHAES，and

(Fresenius Kabi)和

(Braun)。

根据另一种实施方案，所述原料是醇或其衍生物。根据该实施方案，所述原料是一元醇，如醇，选自乙醇、丁醇，异丁醇、1-丙醇、2-丙醇、山梨糖醇和甘露糖醇。根据另一种实施方案，所述原料是二元醇，例如1，2-丙二醇(丙二醇)或1，3-丙二醇。根据另一种实施方案，所述原料是三元醇，例如甘油。

根据另一种实施方案，所述原料是醇分子或其衍生物的聚合物，例如不同分子量的聚乙二醇。PEG400的初步研究已经显示出了阳性结果。

另一方面，所述原料是白蛋白。因此，根据本发明，以白蛋白为基础的血液替代品，例如可以使用但不限于到市售的血浆替代品和血浆蛋白输注溶液。非限制性实例包括白蛋白输注溶液(Baxter，Behring，Octapharma等制备)。

另一方面，所述原料是脂质溶液，例如用于静脉营养的乳液和溶液，这里以

(Fresenius Kabi)为例子。这些适合的乳液的非限制性的例子包括

(Baxter)，

和

(FreseniusKabi)，and

(Braun)和等效产品。

本发明也用如上所述方法获得NO饱和的，基本上不含氧的和生理上可接受的组合物。

根据发明的组合物优先被制剂成膏药或绷带，凝胶，乳膏，软膏，溶液，栓剂，其用于局部，尿道内，直肠内，或膀胱内给药；优选配制成滴入的，形成鼻或眼给药的气雾剂的溶液；优选配制成口服或肠道给药的溶液、乳液、滴液、胶囊或片剂；优选配制成静脉内，动脉内，气管内，直肠内，肌肉内或皮下给药的可注射的溶液或乳液，或吸入的制剂。

当制备根据本发明的有机亚硝酸酯或含有有机亚硝酸酯的制剂时，重要的是原料和/或反应介质在添加NO之前脱氧。该术语“脱氧”意指使原料基本上不含氧。这可以通过用惰性气体例如氮气、氩气，氦气等或其混合物，吹扫或平衡介质来达到。可选地，介质通过气体交换系统，例如用于以反向方式除去氧气的膜式氧合器。当用于制备本发明原料时蒸馏方法也可使用，当在氮气或另一种惰性气体或气体混合物下进行蒸馏时，产生制备被脱氧的用来制备有机亚硝酸酯的原料。对于挥发性原料，也能通过加热原料来制备脱氧的溶液。

根据优选的实施方案，有机亚硝酸酯被存放在NO饱和环境中，或在NO顶部空间下。

实际上，贮藏容器、小瓶、注射器、瓶子或袋子，以及管和套管应当对氧气是非渗透性的或至少已经降低了对氧气的渗透性。普通技术人员能容易地鉴别适当的包装材料。除了这点考虑，可以使用常规器材和药物给药实践。

优点

本发明的一个重要的临床优点是有机亚硝酸酯的效果，当给予患者根据发明的组合物时，将有绝大部分在缺氧组织中。当静脉内输注给予生成NO的化合物时，能避免所谓的近端窃取(proximal steal)，即在周围健康血管中血流增加的风险。这是舒张血管物质的常见副作用，它会导致血压下降和相关的全身症状。

另一个优点是有机亚硝酸酯的制备容易，可重复，并且不需要可改变或损坏任选存在于组合物中的其他组分的苛刻条件。

另一个优点是根据发明制备的有机亚硝酸酯，明显更稳定和更适于与生理载体或载体混合。

还有另外的优点是：根据灌注肺模型实验，NO的释放好象是非酶催化的。非酶催化的释放机制表明根据发明的组合物能避免常规NO供体的组合物相关的耐受性发生。

还有另外的优点是：尤其与只给药在生理盐水或二氧化碳中的NO相比，高铁血红蛋白的形成显著降低。

对普通技术人员而言，其他优点将在研究说明书和实施例后变得明显。

实施例

1.溶解在液体介质中的NO的静脉内输注

实验经由动物实验地方道德委员会批准。雄性新西兰白兔按实施例2中所提出的方案麻醉，准备并检测。该兔子用L-NAME(30毫克每公斤)预处理，并输注在生理盐水中溶解NO气体的溶液一次和在脂质乳液(INTRALIPID

，Fresenius Kabi)中溶解NO气体的溶液一次，通过在颈静脉内的导管输注，不用载体流。两种液体的输注速率都是0.5毫升每分钟每公斤。二次输注之间的恢复期大约为200分钟。

输注液用同样的方法制备。首先在充满惰性气体的有橡胶膜的气密玻璃容器中将液体脱氧20分钟；在这种情况下使用氦气，但也能用氮气，氩气等。此后，在下面的过程中不允许氧气进入所述溶液。然后用纯净的NO吹扫该液体几分钟。然后用带针头的气密注射器通过橡胶膜采集该液体，并通过注射泵(864注射泵，Univentor LTD.，Zejtun，马耳他)由这个注射器经由颈静脉导管输注。

药物

肝素购自KabiVitrum，Stcokholm，瑞典，泮库溴铵(PAVULON

)购自Organon，Oss，荷兰，戊巴比妥钠购自Apoteksbolaget，斯德哥尔摩，瑞典，葡聚糖70(MACRODEX

)购自Pharmalink，

，瑞典。L-NAME(N^G-硝基-L-精氨酸甲酯)和常规化学制品购自Sigma Chemical Company，St Louis，密苏里，美国。

输注L-NAME的作用

输注L-NAME(30毫克每公斤)10分钟减少了呼出一氧化氮(从19ppb到<1ppb，图1)，增加了全身平均动脉血压(MAP，从103cm H₂O到128cmH₂O(数据没有显示在图上))和降低心率(HR，从274次每分钟到258次每分钟(数据没有显示在图上))。呼气末二氧化碳和相关的血液气体参数是正常的。

溶解在生理盐水中的NO气体溶液的输注

NO气体溶于生理盐水中的的溶液快速输注(在30分钟内0.5毫升每分钟每公斤)降低了MAP(从128cmH₂O到75cmH₂O(数据没有显示在图上))，增加了HR(从258次每分钟到295次每分钟(数据没有显示在图上))，并且轻微增加呼出一氧化氮(从0ppb到2.5ppb，图1)。高铁血红蛋白(metHb)成分显著增加(从0.1％到20％，图2)。在输注后约200分钟，动物几乎完全地恢复了，并且呼出的NO、MAP、HR和metHb分别为0.8ppb、123cmH₂O，313次每分钟和2.5％。

溶解在脂质乳液中的NO气体溶液的输注

在溶解于脂质乳液的NO气体溶液输注(在30分钟分钟内0.5毫升每分钟每公斤)时，呼出NO增加(从0.8ppb到32.5ppb，图1)，MAP从106cmH₂O下降到55cmH₂O，而HR和metHb成分(图2)几乎不受影响。

溶解在液体介质中的NO溶液静脉内输注的讨论

结果清楚地表明，当NO溶于脂质乳液时与溶于生理盐水相比，NO的给药经过血液循环到肺，监测呼出NO得到很大的增加(约15倍)。本发明者指出溶于生理盐水的NO与溶于脂质乳液的相比，一个显著的缺点是metHb有很大的增加。如果动脉氧的饱和度减少(例如在肺动脉高血压如肺栓塞的情况下)，metHb的产生可能是严重的。在这个实验中，本发明者使用了非常高的输注率并且因此MAP显著减少，但相信缓慢得多的输注速率也足以在肺中在肺动脉高血压或血栓栓塞的情况下产生有益作用，可以达到这样的效果而不引起全身动脉血压的显著降低。注意到呼出NO从1ppb增加到32.5ppb，且在混合呼出的气体中NO的正常水平是约20ppb。另外，因为有益作用可能作用在脉管，产生在呼出气体中的这些水平也许不是必要的。MAP的很大降低也部分地由于抑制内源性NO的产生。

在另一个实验中，本发明者用溶解在脂质乳液中的NO成功地治疗在抑制NO产生的动物中的静脉气体栓塞，而在同一个实验设置中用吸入一氧化氮治疗相同病症是不可能的。有益作用可以为诱导肺脉管系统的血管舒张，抑制血小板聚集和/或整体或部分体循环中(例如在冠状循环中)的较小血管舒张。

2.评价递送NO能力的的动物研究

进行了一系列的动物实验以评价不同的化合物的NO递送能力。实验由地方动物道德委员会批准。给予雄性新西兰白兔(n＝12)不同剂量的NO替代溶液的静脉内输注。在实验期间测量了几个生理参数，包括在混合呼出的气体(FENO)中的NO浓度。

麻醉和最初的外科手术

动物用每毫升生理盐水中6毫克戊巴比妥钠，以40-60毫克每公斤，通过耳缘静脉麻醉。通过连接着恒温器的加热垫，将体温维持在38-38.5℃。动物仰卧放置，切开气管并使用恒定体积呼吸机(683型，Harvard Apparatus，South Natick，MA，美国)给它进行机械通气。使用活性碳过滤器(110x11厘米)，提供给呼吸机没有NO的空气。呼吸频率是每分钟40次，并且在起始时调整呼气量(tidal volume)以保持呼气末二氧化碳(ETCO₂)在4.5-5.3％(通过气体分析仪(Oscar-Oxy，Datex，Helsinki，Finland)测定)，样品气体(150毫升每分钟，每分钟通气量为15-20％)来自连接在气管插管上的两侧臂中的一只，且使用NAPHION

采样导管。另一侧臂连接压力传感器(Statham、Hato Rey，Puerto Rico)以监测通气压力(IP)。气体从呼吸机出口出来，通过开关阀到二个容器之一，产生1-2cmH₂O或4-5cmH₂O的呼气末端正压(PEEP)。在实验期间，气流在较低的PEEP(9分钟)和较高的PEEP(1分钟)之间变化，间隔时间为总共10分钟以使通气最佳并预防肺不张的形成。将含有葡萄糖(24.3克每升)，葡聚糖70(MACRODEX

Figure 2007800176929100002G2007800176929D0018085330QIETU

26.5克每升)，NaHCO₃(6.2克每升)，戊巴比妥钠(4.1克每升)，和泮库溴铵(98毫克每升)的连续输注液以5毫升每公斤每小时的速率通过同一耳缘静脉通过Terumo STC-521注射泵(Terumo Corp.，东京，日本)给药。将肝素化的导管插入左颈总动脉以纪录平均血压(MAP)和心率(HR)(Statham压力传感器)并对动脉血采样。另一支导管插入右颈静脉以给药输注液。使动物有30-60分钟无干预期以得到稳定的循环情况和稳定的FENO值。

测量呼出气体中的NO

通过基于化学发光体系(NIOX，Aerocrine AB，Solna，瑞典)，连续测量FENO，在连接到呼吸机排气的混合容器的末端每分钟采样100毫升。呼出气体的完全混合通过监测在同一个容器中的CO₂浓度间歇地检查。用在氮气中的已鉴定的NO标准气体来校准(AGA Specialgas、

，瑞典)。

NO替代溶液的制备

用生理盐水或水溶解并稀释不同的原料或载体介质溶液(表1)，以获得不同浓度的溶液。然后将所述溶液放置在气密容器中，并通过鼓入氦气10分钟来脱氧。然后对玻璃容器通纯净的一氧化氮气体3-4分钟。

实验方案

稳定期后，以不同的输注速率通过颈静脉导管静脉内输注于动物在100毫升每公斤每分钟生理盐水载体流中的不同的溶液(CMA/100，CarnegieMedicin AB，斯德哥尔摩，瑞典)，(864注射泵，Univentor LTD，Zejtun，马耳他)。采集血液样本并分析血液中气体和酸-碱的状态(ABL300，辐射计A/S，哥本哈根，丹麦)。在实验期间FENO、ETCO₂、HR、MAP和IP在Grass Polygraph(Grass Instruments Co，Quincy，Mass，美国)上被连续监测。

药物

肝素(Kabi Vitrum，Stcokholm，瑞典)，泮库溴铵(PAVULON，Organon，Oss，荷兰)，葡聚糖70(MACRODEX

Figure 2007800176929100002G2007800176929D0019085506QIETU

，Pharmalink，，瑞典)，和戊巴比妥钠(Apoteksbolaget)，购自Apoteksbodaget，斯德哥尔摩，瑞典。其他化学制品购自Sigma Chemical Company，St Louis，密苏里，美国。

统计学分析

所给出的数据为平均值±SEM。

表1.人工通气的戊巴比妥麻醉的兔子(n＝1-4)。由于用纯净的一氧化氮气体饱和的不同载体溶液的静脉内输注液(100μL每公斤每分钟)，混合呼出一氧化氮和平均动脉血压(MAP)的变化。

载体	浓度(M)	剂量(mmol kg^-1min^-1)	输注前值	输注值	变化(绝对值)	变化(％)	动物数
								生理盐水	0.153	0.0153					2
呼出的NO(ppb)			11.7	11.7	0	0
								MAP(cmH₂O)			96.1	87.2	-8.9	-7.8

								葡萄糖(60％)	3.33	0.333					2
呼出的NO(ppb)			15.5	21.7	6.3	40
								MAP(cmH₂O)			100	47.5	-52.5	-51

								果糖(60％)	3.33	0.333					1

呼出的NO(ppb)	14.9	28.0	13.1	88
					MAP(cmH₂O)			115.2	59.1	-56.1	-49

					半乳糖(60％)	3.33	0.333					1
呼出的NO(ppb)	7.9	11.2	3.3	41
					MAP(cmH₂O)			142.4	72.7	-69.7	-48.9

					氨基葡萄糖	3.33	0.333					1
呼出的NO(ppb)	10.3	9.3	-0.9	-9
					MAP(cmH₂O)			125.7	121.2	-4.5	-4

					精氨酸	2.0	0.2					1
呼出的NO(ppb)	21.2	21.8	0.6	3
					MAP(cmH₂O)			111.8	102.9	-8.8	-8

表1.继续

山梨糖醇(60％)	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	7.0	11.2	4.2	60
MAP(cmH₂O)			130.3	66.7	-63.6	-48.8

甘露糖醇(20％)	1.11	0.111					1
								呼出的NO(ppb)	8.4	13.1	4.7	55.6
MAP(cmH₂O)			127.3	66.7	-60.6	-48

葡萄糖醛酸	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	12.5	12.5	0	0
MAP(cmH₂O)			82.4	64.7	-17.6	-21

岩藻糖	0.609	0.0609					1

呼出的NO(ppb)	18.8	22.9	4.1	22
					MAP(cmH₂O)			91.2	58.9	-32.4	-35

					核糖(50％)	3.33	0.333					2
呼出的NO(ppb)	12.1±2.8	20.3±0.2	8.2±3.0	77±43
					MAP(cmH₂O)			118.2	69.7	-48.5	-41

					2-脱氧-核糖	3.33	0.333					1
呼出的NO(ppb)	12.1	44.8	32.7	269
					MAP(cmH₂O)			115.2	48.5	-66.7	-57.9

					1-O-甲基-核糖	3.33	0.333					1
呼出的NO(ppb)	12.1	168	155.9	1284
					MAP(cmH₂O)			100.0	50.0	-50.0	-50

表1.继续

N-乙酰半胱氨酸	1.23	0.123					1
								呼出的NO(ppb)	21.2	25.3	4.1	19
MAP(cmH₂O)			102.9	73.5	-29.4	-29

甘油	3.33	0.333					4
								呼出的NO(ppb)	14.1±1.3	77.4±9.8	63.3±10.5	475±120
MAP(cmH₂O)			110.3±9.7	66.5±6.8	-43.7±11.9	-38±7.7

1，2-丙二醇	3.33	0.333					1
								(丙二醇)
呼出的NO(ppb)			12.9	40.7	27.9	217
								MAP(cmH₂O)	94.1	79.4	-14.7	-16

1，3-丙二醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	13.9	92.1	78.2	562
MAP(cmH₂O)			114.7	76.5	-38.2	-33

1-丙醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	12.9	107.1	94.3	733
MAP(cmH₂O)			92.6	82.4	-10.3	-11

2-丙醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	12.9	192.9	180	1400
MAP(cmH₂O)			98.5	83.8	-14.7	-15

丙氨酸	1.11	0.111					1
								呼出的NO(ppb)	20.8	20.8	0	0
MMAP(cmH₂O)			97.1	97.1	0	0

表1.继续

2-氨基-1，3-丙二醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	17.3	19.6	2.4	14
MAP(cm H₂O)			77.9	64.7	-13.2	-17.0

3-氨基-1，2-丙二醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	20.2	20.2	0	0
MAP(cmH₂O)			73.5	73.5	0	0

乳酸	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	16.7	16.7	0	0
MAP(cmH₂O)			88.2	86.8	-1.5	-2

乙醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	17.1	17.1	0	0
MAP(cmH₂O)			82.4	82.4	0	0

甘氨酸	1.23	0.123					1
								呼出的NO(ppb)	16.2	15.6	-0.6	-4
MAP(cmH₂O)			105.9	108.8	2.9	3

蔗糖(60％)	1.67	0.167					1
								呼出的NO(ppb)	14.9	26.1	11.2	75
MAP(cmH₂O)			127.3	71.2	-56.1	-44

乳糖酸	1.11	0.111					1
								呼出的NO(ppb)	19.6	28.0	8.3	42
MAP(cmH₂O)			91.2	58.8	-32.4	-35

表1.继续

聚乙二醇	3.33	0.333					1
								呼出的NO(ppb)	18.2	29.4	11.2	61
MAP(cmH₂O)			91.2	73.5	-17.6	-19

菊糖(15％)	0.03	0.003					1
								呼出的NO(ppb)	14.9	16.7	1.8	12
MAP(cmH₂O)			85.3	58.8	-26.5	-31

葡聚糖(15％)	0.00093	0.000093					1
								呼出的NO(ppb)	11.7	14.5	2.8	24
MAP(cmH₂O)			131.8	86.4	-45.5	-34

肝素(15000IU/ml，10％)	0.0056	0.00056					1
								呼出的NO(ppb)	12.5	11.9	-0.6	-5
MAP(cmH₂O)			72.1	63.2	-8.8	-12

岩藻依聚糖(10％)							1
								呼出的NO(ppb)	20.6	25.3	4.7	23
MAP(cmH₂O)			107.4	51.5	-55.9	-52

白蛋白(20％)							1
								呼出的NO(ppb)	16.2	16.7	0.6	4
MAP(cmH₂O)			105.9	73.5	-32.4	-31

结果显示，许多被测试的化合物具有作为NO来源和支持在权利要求书中提出的概括的功能。与生理盐水对照相比，葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、山梨糖醇、甘露糖醇、岩藻糖、2-脱氧核糖、1-O-甲基-核糖、蔗糖、乳糖酸、菊糖，葡聚糖，岩藻依聚糖，1-丙醇、2-丙醇、1，2-丙二醇(丙二醇)，1，3-丙二醇、甘油、聚乙二醇、N-乙酰基半胱氨酸和白蛋白显示出了引人注目的作用。

当未被取代的L-半胱氨酸被脱氧并暴露在NO气体中时，形成很多沉淀物，不适合输注。

当测试短链醇时，记录到1-丙醇和2-丙醇有明显的作用。化合物1，2-丙二醇和1，3-丙二醇在实验中也显示出递送NO能力。

此外，蔗糖，菊糖，葡聚糖和岩藻依聚糖得到的结果表明发明适用于聚合化合物。

3.用肺动脉高压模型评价丙二醇-NO和甘油-NO

麻醉和外科手术

本实验经过地方动物道德委员会批准。雄性新西兰白兔(n＝2)按实施例2中的方案麻醉，准备并检测呼出NO。将含有葡萄糖(25.9克每升)，葡聚糖70(

28.2克每升)，NaHCO₃(6.6克每升)，戊巴比妥钠(2.1克每升)，和泮库溴铵(40毫克每升)的连续输注液以10毫升每公斤每小时的速率经由所述耳缘静脉通过Terumo STC-521注射泵(Terumo Corp.，东京，日本)给药。将肝素化的导管插入左颈总动脉以纪录平均血压(MAP)和心率(HR)(Statham压力传感器)并对动脉血采样。另一支导管插入右颈静脉以给药药物。做中部开胸手术，并且将流量探头(连接到T2012-通道超声波血流仪，Transonic Systems Inc.)安置在升主动脉附近以测量心输出量。一支导管穿过右心室壁而进入，并且被放入肺动脉以通过单向流动的压力传感器(Baxter)测量肺动脉压。另一支导管通过左心房壁被插入了左心房，并用压力传感器(Statham、Hato Rey，Puerto Rico)测量左心房的压力。在实验期间，有低流量(3毫升每小时)生理盐水通过注射泵(Perfusor Secure，B.BraunMelsungen AG，德国)通过这些导管以防止血液凝结。肺血管阻力用通用公式计算。在手术后，使动物有30-60分钟无干预期以得到稳定的循环情况和稳定的FENO值。

NO溶液的制备

将1，2-丙二醇溶于水中得到25％(v/v)溶液，以及将甘油溶于水中得到25％(v/v)溶液，并放置于气密的圆筒中。溶液通过鼓入氦气10分钟以脱氧，然后用纯净的一氧化氮气体处理3分钟。将溶液从气密的圆筒中转移到静脉输注液注射器中。

实验方案

在两只动物中，肺动脉高血压是通过血栓素受体激动剂U46619(9，11-二脱氧-11α，9α-环氧桥亚甲基前列腺素F2α；Larodan Fine Chemicals AB，Malmo，瑞典)静脉内输注(CMA/100，Carnegie Medicin AB，斯德哥尔摩，瑞典)诱导的。储备溶液是10毫克每毫升的MH55669-33-乙酸甲酯，并且，在输注前用生理盐水稀释至10μg每毫升。将在100毫升每分钟的载体流中的U46619溶液经由颈静脉导管输注(30μl每公斤每分钟)，使肺动脉压增加到约40cmH₂O，并且在整个实验过程中该输注是连续的。在U446619输注期间，用不同的药量(10，30和100μl每公斤每分钟)给予二只动物甘油-NO输注液或1，2-丙二醇-NO输注液，以研究NO溶液对抗肺动脉高血压的能力。将在生理盐水载体流中的NO溶液通过输注泵(CMA/100，Carnegie Medicin AB，斯德哥尔摩，瑞典)经由颈静脉导管输注。在实验期间间断地采集动脉血液样本并分析血液中气体和酸-碱的状况(ABL300，辐射计A/S，哥本哈根，丹麦)。在实验期间，呼吸和血液动力学的参数在Grass Polygraph(GrassInstruments Co，Quincy，Mass，美国)上连续监测。

药物

所购买的药物是：肝素(Kabi Vitrum，斯德哥尔摩，瑞典)，泮库溴铵(Pavulon

，Organon，Oss，荷兰)，葡聚糖70(Macrodex、Pharmalink、

，瑞典)和戊巴比妥钠(Apoteksbolaget、斯德哥尔摩，瑞典)。常规化学制品购自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，美国。

结果

甘油-NO和1，2-丙二醇-NO输注液以剂量依赖的方式降低了U46619导致的肺动脉高压(图8和9)，并且最高剂量(100μl每公斤每分钟)几乎使肺血管阻力正常了。

4.用肺栓塞模型评价甘油-NO

方法

麻醉和外科手术

本实验由地方动物道德委员会批准。雄性新西兰白兔(n＝4)按实施例3中的方案麻醉，准备并检测呼出NO。导管插入右颈静脉以给予药物和肺栓塞材料。做中部开胸手术，并且将流量探头(连接到T2012-通道超声波血流仪，Transonic Systems Inc.)安置在升主动脉附近以测量心输出量。将肝素化的导管经由左颈静脉插入肺动脉和左心房以分别测量肺动脉压力(Statham压力传感器，Statham，Hato Rey，Puerto Rico)和左心房压力(Statham，supra)。肺血管阻力用通用公式计算。从右下后肢前面割下肌肉，并放入生理盐水中。在手术后，使动物有30-60分钟无干预期以得到稳定的循环情况和稳定的FENO值。

NO溶液的制备

将甘油溶于水中得到25％(v/v)溶液，并放置于气密的圆筒中。溶液通过鼓入氦气10分钟以脱氧，然后用纯净的一氧化氮气体处理3分钟。将溶液从气密的圆筒中转移到静脉输注的注射器中。

肌肉栓子的制备

肌肉组织肺栓塞(MPE)的材料通过改进以前描述过的技术来制备。因此，从可见的结缔组织清除切下的前胫骨骨骼肌，然后用生理盐水均浆并溶解至浓度为0.1克肌肉每毫升，并且将50IE肝素每毫升加入到混合物中。将均浆通过0.5mm滤网以防止堵塞静脉导管的三通阀。

实验方案

在所有组中，肺栓塞是以150μl每公斤每分钟的流速通过静脉内输注(CMA/100，Carnegie Medicin AB，斯德哥尔摩，瑞典)在150μl每公斤每分钟的载体流中的MPE材料(300μl每公斤，即30毫克每公斤)诱导的(864注射泵，Univentor LTD，Zejtun，马耳他)。三只动物没有接受任何治疗(对照组)，而一只动物接受了静脉内输注的甘油-NO(100μl每公斤每分钟)30分钟，在肺栓塞后20分钟开始。在100毫升每公斤每分钟生理盐水载体中的NO溶液通过输注泵(CMA/100，Carnegie Medicin AB，斯德哥尔摩，瑞典)经由颈静脉导管输注(864注射泵，Univentor LTD，Zejtun，马耳他)。在实验期间间断地采集动脉血液样本并分析血液中气体和酸-碱的状况(ABL300，辐射计A/S，哥本哈根，丹麦)。在实验期间，呼吸和血液动力学的参数在GrassPolygraph上(Grass Instruments Co，Quincy，MA，美国)连续监测。

药物

，Organon，Oss，荷兰)，葡聚糖70(Macrodex、Pharmalink、Sp

nga，瑞典)和戊巴比妥钠(Apoteksbolaget、斯德哥尔摩，瑞典)。常规化学制品购自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，美国。

结果

肺栓塞导致在所有动物中肺血管阻力增加至相似水平。甘油-NO输注液明显地减少了被治疗动物的肺血管阻力，显示NO溶液在肺栓塞中降低肺动脉高压的潜力。参见图10。

5.心肌缺血再灌注损伤

麻醉和外科手术

本实验由地方动物道德委员会批准。雄性新西兰白兔(n＝10)按实施例3中的方案麻醉，准备并检测呼出NO。将含有葡萄糖(25.9克每升)，葡聚糖70(MACRODEX28.2克每升)，NaHCO₃(6.6克每升)，戊巴比妥钠(3.1克每升)的连续输注液，以7.5毫升每公斤每小时的速率经由所述耳缘静脉通过Terumo STC-521注射泵(Terumo Corp.，东京，日本)给药。将肝素化的导管插入左股动脉以纪录平均血压(MAP)和心率(Statham压力传感器)并对动脉血采样。另一支导管插入右颈静脉给药药物。将肝素化的导管通过左颈总动脉插入左心室以测量左心室压力(Statham压力传感器)，并在线计算左心室dP/dt。显示在实验时呈现表示导联II的表面ECG。左胸开胸手术通过第四肋间隙完成，并且冠状结扎线被设置在离心脏底部约1厘米的左心室壁上的circumflexa动脉的一个大的前下降段附近，使用的是外科缝合材料(5-0Vicryl

Figure 2007800176929100002G2007800176929D0028090757QIETU

，ETHICON，manufacturer Johnson & Johnson Jutl，Brussels，Belgium)。能被拉紧和松开的冠状动脉环是用结扎线和PE管制备的。在手术后，使动物有30-60分钟无干预期以得到稳定的循环情况和稳定的FENO值。

NO溶液的制备

将1，2-丙二醇溶于水中得到25％(v/v)溶液，以及将D-葡萄糖溶于水中(60％，w/v)，并放置于气密的圆筒中。溶液通过鼓入氦气10分钟以脱氧，然后用纯净的一氧化氮气体处理3分钟。将溶液从气密的圆筒中转移到静脉输注液注射器中。

实验方案

在所有组中，冠状动脉环在无干扰期后被拉紧，导致缺血，其用ECG上的ST提高证实。在局部缺血30分钟后，再打开冠状动脉环，开始120分钟的再灌注，然后实验完成。将动物分成三组：(1)对照，(2)从局部缺血15分钟开始用静脉输注30μl每公斤每分钟葡萄糖-NO治疗，并在再灌注60分钟后停止，(3)从局部缺血15分钟后开始用静脉输注10μl每公斤每分钟1，2-丙二醇-NO来治疗，并在再灌注120分钟后停止。将在100毫升每公斤每分钟的生理盐水载体流中的NO溶液通过输注泵(CMA/100，Carnegie MedicinAB，斯德哥尔摩，瑞典)经由颈静脉导管输注(864注射泵，Univentor LTD，Zejtun，马耳他)。在实验期间间断地采集动脉血液样本并分析血液中气体和酸-碱的状况(ABL300，辐射计A/S，哥本哈根，丹麦)。在实验期间，呼吸和血液动力学的参数，以及ECG的导联II以每个通道1000Hz的频率通过基于计算机的获得系统(Biopac，BIOPAC Systems Inc.，Goleta，加州，美国)连续监测和采集。

心率失常的分析

实验后，分析了各组在再灌注期间的心率失常。检测再灌注的每分钟中心率失常的心跳，并且如果某分钟包含了这样的心跳，这分钟就被定义为心率失常的分钟。在再灌注期间这些心率失常的分钟相加产生在每个组中的累积心率失常的分钟，然后标准化每个组的样本量值。

药物

所购买的药物是：肝素(Kabi Vitrum，斯德哥尔摩，瑞典)，葡聚糖70(Macrodex、Pharmalink、

，瑞典)和戊巴比妥钠(Apoteksbolaget、斯德哥尔摩，瑞典)。常规化学制品购自Sigma Chemical Co(St.Louis，MO，美国)。

结果

在所有组中再灌注诱导心率失常。然而，在表11中能看出，与对照(n＝4)相比，用葡萄糖-NO(n＝3)或1，2-丙二醇-NO(n＝3)的治疗能明显减少心率失常的发生率。

6.NO与含羟基化合物(醇，糖)之间相互作用的反应产物的化学分析

所有反应混合物和标准品的稀释液是在有TEFLON

涂层的橡胶隔板的玻璃圆筒中制备的，隔板分别用于注射反应物和采样。

HPLC

反应混合物和商品有机亚硝酸酯和硝酸酯的分析是通过使用在C8、C18或CN柱(Waters Inc.NOVAPAK^TM4μm粒径8x100mm径向加压柱)上的反相色谱的高效液相色谱(HPLC)进行的，通过二个LDC定量泵传输总流速恒定为每分钟1毫升，通过计算机化梯度控制系统控制，33分钟内产生0-100％的甲醇的线性梯度(洗脱溶剂B)，在进样后1分钟后开始，样品溶解于含有5mM的甲酸铵pH6的含水起始洗脱溶剂(溶剂A)中。洗脱化合物的分离通过LDC色谱检测仪可变UV检测器(设置在210nm处)来检测，随后用产生UV的Pharmacia Wavescan波长扫描检测器在190nm到370nm之间以4秒为间隔扫描，结果贮存在计算机里，并在每次HPLC操作之后进行分析。从LDC色谱检测仪的输出不断地纪录在长条纸记录仪上。

进样2.5-100ul的反应混合物是通过装备了2毫升环的Rheodyne注射器进行的。为了收集供进一步通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析的峰，在A到B的梯度洗脱开始前，进行了重复进样，高达10毫升反应混合物。在无氧条件下分级采样，是在Wavescan检测器后，立刻通过一个三通阀，用连通洗脱液流的Luer连接器进行的。使用玻璃注射器收集洗脱液，以防止空气进入所收集的样品，在用记录在210nm的峰确定的相应洗脱化合物被洗脱后，关闭活塞密封。

在一些实验中，Agilent1100色谱系统带Agilent二相泵+二极管阵列检测设备，和Thermo3um C18柱(2.1x100mm)一起使用，用来分析反应产物。溶剂流为0.5毫升每分钟，且洗脱溶剂A是2mM乙酸铵。梯度到100％甲醇运行15分钟。脱氧样品如上述那样洗脱化合物。

GC-MS

提取样品实验：

在一个小的密封样品瓶里，用等体积的甲苯提取洗脱峰，简单摇晃，并且如有必要，用离心快速分离。甲苯层被放置在一个自动进样器小瓶里，进样1微升的该样品到起始温度是40℃的Agilent DB-5MS(0.25mm内径，30m长，内部涂层：95％甲基硅酮和5％苯(phenyl))气相色谱柱上，然后柱温每分钟被提高10℃，直至温度达到200或250℃。洗脱化合物的检测用HewlettPackard5973质量选择检测器(四极杆MS)进行。气相色谱是Hewlett Packard6890系列GC系统，搭配Hewlett Packard Enhanced Parameters进样系统。用Wiley7n质谱数据库以Enhanced Chemstation G1701BA计算机程序收集和分析数据。

直接进样实验：

在一个实验中，用气密的微注射器，通过提取步骤和自动取样系统，直接进样的1毫升由约100％丙醇和NO气体组成的反应混合物，被直接进样到气相色谱柱中。用甲苯稀释商品亚硝酸丙酯，以相同的方式进样作为对比。

进一步分析，包括化学电离：

25％的或接近100％的1，2-丙二醇的样品，用NO处理后进样入现在装上了Agilent DB-1701柱的GC-MS系统，总量为0.5微升，在每分钟30毫升的氦中，分流分率1:20。温度梯度如上。质谱或使用电子轰击(EI)模式，或使用提供甲烷气体化学电离界面的化学电离模式(CI)。

化学分析的结果

HPLC：

在所有三种Novapak柱上和Thermo柱上，产物的单峰来自在丙醇和NO气体之间的反应，用浓度70-80％的甲醇梯度洗脱。在NOVAPAK C18系统中，对应的洗脱时间约是28分钟(图12，谱图C)。在HPLC洗脱液中，用Wavescan检测器检测，28分钟的峰有在225nm处有单个的UV吸收最大值。当亚硝酸丙酯的标准样品(KarlIndustries Inc.，Aurora，OH，USA)在气密容器中用脱氧(氦气净化10分钟)的水以1:1000稀释后进样，在28分钟得到一个小峰(图12，谱图A)，在225nm处有同样的UV吸收最大值。如果亚硝酸丙酯用NO气体饱和的水溶液稀释(图12，谱图B)，28分钟的峰会大5-10倍，仍然显示出同样的UV特征。在C8和CN柱中也得到相似的结果，丙醇和NO组成的反应混合物得到单一的保留峰，虽然与C18系统相比，保留时间稍短。在这些体系中，亚硝酸丙酯商业样品也产生了与丙醇+NO反应产物保留时间一致的峰，显示出与上述同样的UV特征，但大小较小。亚硝酸丙酯商业样品也被研究作为CN柱HPLC体系的参照物，并且洗脱时间与亚硝酸丙酯的洗脱时间显著不同，与28分钟的峰或丙醇-NO或亚硝酸丙酯色谱图的任何其他峰不一致。

通过GC-MS分析HPLC纯化和提取的样品：

当来自C18HPLC色谱的28分钟峰取样，用甲苯提取，并进样到GC-MS系统时，洗脱了几个峰。在前面(1.5分钟)观察到期望的气体峰(例如，二氧化碳和氧-18)与NO峰。通过MS鉴定，在3分钟一个峰显示了亚硝酸丙酯的质谱特征。在GC-MS系统中，在3.5分钟洗脱并鉴定出了丙醇，随后是在5.5分钟的小量的苯(甲苯的分解产物)，然后是在8分钟的大量的甲苯峰。

GC-MS分析的直接进样：

商品亚硝酸丙酯的直接柱进样确定洗脱时间(3分钟)，且在丙醇+NO气体反应混合物的提取峰中观察到亚硝酸丙酯的质谱特征，在C18HPLC中洗脱并收集。丙醇+NO混合物(得自气密的反应容器)的直接柱进样，立刻用脱氧的甲苯稀释并进样到GC-MS中，在洗脱前端含有NO气体的初始峰，在3分钟是亚硝酸丙酯，在3.2分钟有个非常大的丙醇的洗脱峰，并且在几分钟后是甲苯的峰(图13)。

总之，通过HPLC并与商品标准品比较，和通过分析HPLC运行中的纯峰或在直接进样丙醇+NO气体反应混合物于GC-MS系统之后通过GC-MS，鉴别亚硝酸丙酯。

通过GC-MS进一步分析：

使用自动进样在Agilent DB-1701柱上，相似地分析了丙二醇和丙二醇-NO。图14，15a和15b显示的结果支持根据本发明方法的反应混合物包括1，2-丙二醇亚硝酸酯和未反应的丙二醇两种异构体的假设。图14b显示质谱碎片30，一种有机亚硝酸酯的常见碎片的主要碎片，在化合物1和2的2色谱峰中都能找到。显示在图16a和b中的使用化学电离法的质谱表示在化合物的1和2的质谱中的M-1和M+1分子离子，可从图15a和b中质谱显示的结构看出。

其他醇和NO的反应混合物与有机亚硝酸酯商品样品的比较

亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯和亚硝酸异丁酯(Sigma-Aldrich)的商品样品被如上所述无氧稀释，并进样到使用Novapak C8或CN柱的HPLC系统。所有样品都得到UV吸收最大值约为225nm的峰，但是在不同的保留时间对应于由化合物的亲脂链的长度判断的预期差异。如果有机亚硝酸酯溶液已经被脱氧NO饱和的溶液稀释，所有这些峰会更大。在225nm UV最大值的各个峰与用NO气体处理相应醇(乙醇，丁醇，异丁醇)得到的单个相似的峰一致。这是相应的有机单亚硝酸酯已经形成的证据。

葡萄糖、蔗糖和甘油与NO气体的反应产物的HPLC分析

当25-100％(重量/体积)的葡萄糖、甘油、或蔗糖的水溶液被脱氧并用NO气体处理时，通过反相色谱鉴别HPLC色谱图中的几个峰。这些峰中的一些显示225nmUV特征吸收，说明形成了有机亚硝酸酯。

确定醇-NO和糖-NO反应产物的NO供给能力：

通过注射入含有在热乙酸中的1％碘化钠的反应容器中，收集并分析来自HPLC体系的洗脱液样品的NO/亚硝酸酯含量。将释放的一氧化氮吹扫(purge)进入通过与臭氧化学发光反应优化用于检测一氧化氮的化学发光分析器系统，并用通过对发射的光子计数确定NO+臭氧产生的NO2产物。

结果

反应产物以HPLC的保留峰鉴定，通过这种相对温和的反应处理，对葡萄糖和丙醇的处理都显示产生了NO。硝酸甘油(三硝酸甘油酯)在这些条件下不产生NO的释放，证实了甘油和NO之间的反应混合物含有有机亚硝酸酯而不是有机硝酸酯。

虽然本发明已经对它的优选实施方案(其构成本发明者已知的最优实施方案)，进行了说明，但应当理解对于本领域普通技术人员各种变化和改进是显而易见的，而没有脱离在所附的权利要求书中所表示的本发明的范围。

参考文献

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Cederqvist B.et al.，Direct demonstration of NO formation in vivo fromorganic nitrites and nitrates，and correlation to effects on blood pressure and to invitro effects，Biochemical Pharmacology，Vol.47，No.6，pp.1047-1053，1994.

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Claims

1.化合物，选自具有下述式I和II的化合物：

亚硝酸2-羟基丙酯亚硝酸2-羟基-1-甲基乙酯

I II。

2.包含生理上可接受的且治疗上有效的组合物的治疗制剂，所述组合物含有根据权利要求1的化合物，且在过量的NO存在下储存。

3.包含生理上可接受的且治疗上有效的组合物的治疗制剂，所述组合物含有根据权利要求1的化合物。

4.药盒，包含生理上可接受的且治疗上有效的组合物，该组合物含有根据权利要求1的化合物，该化合物处于用气体NO饱和的环境中。