CN101438164A - 量化在人血样中包含的目标细胞群的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供量化在人血样中包含的目标细胞群的方法，其包括步骤：使人血样与混合物接触，所述混合物包含第一组分，所述第一组分包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合于在第一细胞群表面表达的抗原上，所述第一细胞群与第二细胞群不同，所述第二细胞群是所述目标细胞群并且缺乏所述抗原，所述第一组分复合至第二组分，所述第二组分包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异地结合于人红细胞表面；分离血样中包含的抗体标记的细胞和未标记细胞；收集包含所述第二细胞群的上清液；浓缩包含在所述上清液中的第二细胞群并使所述细胞群重悬于能够选择性裂解红细胞的液体中；浓缩得到的细胞，基本除去所有上清液并使所述细胞重悬于确定体积的生理缓冲液中；以及确定在所述样品中包含的第二细胞群的细胞数。此外，本发明提供进行本发明方法的试剂盒。

Description

量化在人血样中包含的目标细胞群的方法
技术领域
[0001]本发明涉及量化在人血样中包含的目标细胞群的方法，其包括步骤：使人血与混合物接触，所述混合物包含第一组分，所述第一组分包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合于在第一细胞群表面表达的抗原上，所述第一细胞群与第二细胞群不同，所述第二细胞群是所述目标细胞群并且缺乏所述抗原，所述第一组分复合至第二组分，所述第二组分包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异地结合于人红细胞表面；分离血样中包含的抗体标记的细胞和未标记细胞；收集包含所述第二细胞群的上清液；浓缩包含在所述上清液中的第二细胞群并使所述细胞群重悬于能够选择性裂解红细胞的液体中；浓缩得到的细胞，基本除去所有上清液并使所述细胞重悬于确定体积的生理缓冲液中；以及确定在所述样品中包含的第二细胞群的细胞数。此外，本发明涉及进行本发明方法的试剂盒。
背景技术
[0002]在本说明书的全文中引用了几篇文献。本文所引用的文献的公开内容(包括任何制造商的说明书、指示说明等)通过引用在此并入。
[0003]不同类型的血细胞的计数通常是疾病的指标。例如，血液中极高的B细胞数可指示B细胞淋巴瘤，比如非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin-lymphoma)。白细胞增多(尤其是嗜中性粒细胞)通常指示各种感染；嗜酸细胞增多可指示猩红热、麻疹、淋病、麻风病、痢疾或过敏症或蠕虫；淋巴细胞增多可指示百日咳、风疹、腮腺炎。类似地，CD4+ T-淋巴细胞绝对计数(CD4计数)起到HIV感染的患者免疫活性的主要临床指标的作用(U.S.Department of Health and HumanServices 2005)，因为CD4+ T-细胞是HIV病毒的天然靶宿主。它被认为是用于监测HIV感染的临床过程的最佳替代标记，因为这些细胞是这种病毒的天然宿主。CD4计数被用于评估免疫退化程度和向AIDS进展的速度，此外，用于确定开始抗逆转录病毒治疗(ART)和机会性感染预防性治疗(OI)的时间，并且还用于当无法获得病毒载量测量值时监测对ART的免疫应答(World Health Organization 2005)。
[0004]自从二十世纪八十年代早期，流式细胞术已经成为被接受的计算CD4+ T-淋巴细胞数的标准参考方法(Donnenberg和Donnenberg2004)。然而，这种方法由于两个因素在资源有限的地区无法得到广泛的应用：第一，流式细胞术要求非常昂贵的实验仪器和试剂以及特别训练的工作人员进行试验。传统的流式细胞术，比如FACSCaliburTM或者Coulter系统，花费50,000美元或更多来建立，并且每次试验花费大约20至30美元(aidsmap 2005)。第二，由于导致仪器相关问题的频繁的电源故障，通常难以进行仪器维护。不同的研究人员已经尝试减少流失细胞术的费用(Chianese等，2003；Janossy等，2002；Pattanapanyasat等，2003；Storie等，2003a；Storie等，2003b)，但是监测过程仍然花费大约每个样品10美元。制造商宣布了最近开发的便携式流式细胞仪，其运行成本为每个样品2美元(CyTecs GmbH2005)。
[0005]最近几年，许多研究团队开发了较低成本和较低技术要求的免疫测定，用于计算CD4+ T-淋巴细胞数，其花费为大约每个样品1-3美元。这些试验基于显微镜，并且使用阳性筛选法，例如Dynal Biotech的
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(Bi等，2005；Diagbouga等，2003)或者Beckman-Coulter的Cyto-Spheres(Balakrishnan等，2004；Carella等，1995)。然而，直到今天，这些方法都没有在资源有限的地区普遍建立(Crowe等，2003)。此外，也没有可行的试验可用来以可接受的成本以及合适的技术设备和实验室经验要求来监测人血样中除CD4+ T-淋巴细胞之外的细胞群的细胞数。
[0006]因此，本发明的技术问题是提供仪器和方法，用于改进从对象获取的样品中细胞群的分析，尤其是在成本以及在资源有限的条件下处理方面。
发明内容
[0007]通过提供在权利要求中描述的实施方式，获得本技术问题的解决方案。因此，本发明涉及量化包含在人血样中的目标细胞群的方法，其包括步骤：
[0008](a)使人血液的样品与混合物接触，所述混合物包含：
(i)第一组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合在第一细胞群表面表达的抗原上，所述第一细胞群不同于第二细胞群，所述第二细胞群是目标细胞群并且缺乏所述抗原，其被复合到
(ii)第二组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合于人红细胞表面；
其中所述接触在允许抗原用它们的关连抗体(cognateantibody)标记的条件下进行；
[0009](b)通过密度离心分离在所述血样中包含的抗体标记的细胞和未标记的细胞，其中介质密度的最小等级是大约1.077g/mL；
[0010](c)收集包含所述第二细胞群的上清液；
[0011](d)浓缩包含在所述上清液中的所述第二细胞群并且在能够选择性裂解红细胞的液体中重悬所述细胞群；
[0012](e)在生理缓冲液中洗涤步骤(d)中得到的细胞，以除去步骤(d)中的缓冲液；
[0013](f)浓缩步骤(e)中得到的细胞，基本上除去所有上清液并重悬所述细胞于确定体积的生理缓冲液中；和
[0014](g)测定步骤(f)中获得的细胞的数量，其中该细胞数对应于包含在所述血样中的所述第二细胞群的细胞数。
[0015]获得人血样的方法是本领域中已知的。
[0016]术语“非人抗体”在本发明中定义为来源于除人之外的生物体的抗体。优选地，非人抗体来源于小鼠、大鼠、羊或兔。相应的抗体可以是，例如，多克隆抗体或者单克隆抗体。所提到的它们的衍生物或片段仍然保留它们所来源的抗体的结合特异性。产生抗体的技术在本领域是熟知的并且描述在，例如，Harlow和Lane＂Antibodies，ALaboratory Manual＂，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988以及Harlow和Lane“Using Antibodies：A Laboratory Manual”Cold SpringHarbor Laboratory Press，1999中。
[0017]术语“抗体、抗体片段或其衍生物”也包括这样的实施方式诸如嵌合抗体和单链抗体，以及抗体片段，例如Fab片段等等。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab＇)2、Fv或者scFv片段；见，例如，上述引文中的Harlow和Lane(1988)和(1999)。各种方法是本领域已知的并且可以被用于生产这类抗体和/或片段/衍生物。因此，(抗体)衍生物可以通过模拟肽学产生。此外，所描述的用于产生单链抗体的技术(见，美国专利4,946,778等)可以适用于产生特异于本发明多肽(一种或多种)和融合蛋白的单链抗体。同样，转基因动物可以用于表达特异于期望的细胞表面抗原的抗体。最优选地，抗体/多种抗体是单克隆抗体/多种单克隆抗体。对于制备单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。这类技术的实例包括杂交瘤技术(
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和Milstein Nature 256(1975)，495-497)、三体瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可以被用于提高结合到本发明多肽的表位的噬菌体抗体的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。在本发明中还考虑，术语“抗体、抗体片段或其衍生物”包括可以在细胞中表达的抗体构建体，例如，可以通过病毒或者质粒载体等被转染和/或转导的抗体构建体。
[0018]在本发明中描述的抗体、抗体片段或其衍生物能够与包含在人血样中的细胞的表面表位特异结合/相互作用。根据本发明所使用的术语“特异结合/相互作用”是指抗体、抗体片段或其衍生物不或者基本上不与相似结构的表位交叉反应。研究中的一系列抗体的交叉反应性可以被测试，例如，通过评价在常规条件下所述系列抗体与目标表位的结合以及与许多(结构上和/或功能上)或多或少密切相关的表位的结合。只有那些在相关环境中(例如蛋白质结构中的特异基序)与目标表位结合但不或者基本上不与其它任何表位结合的抗体被认为是对目标表位特异的并且因此成为根据本发明的抗体。相应的方法被描述在，例如，上述引文中的Harlow和Lane，1988和1999中。
[0019]抗体、抗体片段或其衍生物与本发明多肽或者融合蛋白的独特的构象性表位或连续表位特异结合/相互作用。对于多肽抗原，构象性表位或非连续性表位的特征在于存在两个或更多个不连续的氨基酸残基，其在一级序列中是分离的，但当多肽折叠成天然蛋白质/抗原以形成表位时，在分子表面集合起来(Sela，(1969)Science 166，1365 andLaver，(1990)Cell 61，553-6)。构成该表位的两个或者更多个不连续的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的不同部分。相比而言，连续表位或线性表位由存在于多肽链的单个线性部分中的两个或多个不连续的氨基酸残基组成。
[0020]术语“允许抗原用其关连抗体标记的条件”描述了允许抗体、片段或其衍生物与靶细胞表面的抗原特异性结合发生的条件。进一步，在这些条件下，血样中的细胞凝结被抑制。例如，这些条件可以通过添加合适的试剂来获得。可以被补充到样品中以抑制或避免凝结的这类试剂的实例在下文进行了描述。
[0021]术语“密度离心”在本发明中涉及通过特异细胞群的特异物理特性从样品中分离特异细胞群的熟知方法。由于在本领域中已知免疫系统的不同细胞固有地具有不同的密度和大小，所以可以利用这些参数来分离各个亚群。因为不同大小的细胞将具有不同的沉降速率，在一定程度上它们可以通过密度离心来分开。另一方面，相同大小但不同密度的细胞可以通过使用密度梯度离心来分开。通过仔细选择介质的密度，可以从复杂混合物(例如，淋巴细胞)中产生高度纯化的细胞亚群。
[0022]根据本发明，密度梯度离心被用来分离血样的细胞。表达被至少一种抗体、抗体片段或其衍生物结合的抗原的细胞(分别地，不期望的细胞群(一种或多种))以沉淀进行聚集。上清液由血清相、用于密度离心的介质相和两项之间的相界面组成。在相界面中，红细胞(RBC)和第二细胞群聚集。本发明步骤(c)中的上清液的收集包括这两相和相界面的基本回收。
[0023]根据本发明，“生理缓冲液”是pH在7.0和7.60之间并且盐浓度接近0.85％到0.9％的缓冲液。生理缓冲液的优选实例是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。如本文下面所述，更优选的是，PBS被进一步补充非人血清。为了掩蔽非特异性结合位点而添加所述血清(封闭剂)。PBS被优选地补充大约5％的非人血清，更优选地3％的非人血清，并且最优选地2％的非人血清。非人血清的非限制性实例包括胎牛血清(FCS)、牛血清、小鼠血清、大鼠血清或羊血清。特别优选的是，非人血清是FCS。
[0024]据理解，可被包含在步骤(a)描述的混合物的第一组分中的不同非人抗体、抗体片段或其衍生物的数目，确定第二细胞群的同质性或异质性。在此情况下，仅仅只有一种具有一种特异性的抗体、抗体片段或其衍生物被包含在混合物的第一组分中时，仅仅单一抗原的结合成分与人血样接触。在这种情况下，分离的第二细胞群包含原先包含在血样中的、除红细胞和在细胞表面表达第一组分抗体、抗体片段或其衍生物的特异性抗原的细胞群之外的所有类型的细胞。如本文下面所述的本发明的优选实施方式，一些包含具有不同特异性的抗体、抗体片段或其衍生物的混合物允许分离均一的或者基本上均一的第二细胞群(即，具有90％以上的一种细胞类型的细胞群，例如95％以上或者98％以上，或者甚至99％以上，例如100％)。这通过选择抗体、抗体片段或其衍生物来实现，所述抗体、抗体片段或其衍生物对于包包含在样品中的除第二细胞群/目标细胞群之外的每种(不期望的)细胞群的抗原特征具有特异性。
[0025]本领域普通技术人员知晓确定通过本发明方法得到的样品中的细胞数的不同替代方法。这些替代方法包括使用ELISA的方法(例如，用过氧化物酶或者碱性磷酸酶作为活性酶)、使用胶体金的测定、使用带刻度的毛细管测量沉淀大小的分析、在光学显微镜下用血细胞计数器(例如，Neubauer型)进行手动计数、在血细胞计数器(如，Sysmex型)或者电子细胞计数器(如，casy型)中自动计数。本文下面描述了确定样品中细胞数的方法的优选实施方式。
[0026]令人惊奇地发现，与熟知的确定血液样品中特定细胞群的细胞数的实验方法相比，本发明的方法可以在有限的实验室仪器要求和降低的成本下使用。所选定的细胞群的数目或者不同的选定细胞群之间的比例的确定在疾病诊断和疾病分期中是特别令人感兴趣的。可以通过本发明方法分析的疾病的优选实例是HIV感染。如今，记录3940万人感染了HIV，其中所有的新HIV感染的95％发生在发展中国家人群中(UNAIDS 2005)。尽管抗逆转录病毒治疗越来越负担得起并可以得到，监测感染和其治疗两者所必需的实验室试验却不是(Balakrishnan等，2005)。本发明提供了简易的手动和低成本技术，用于定量特定细胞群，例如从人对象例如HIV感染个体取出的血液样品中的CD4+T-细胞。本发明的方法被开发来可在资源有限环境中操作。
[0027]本领域中已知的负选择法(例如，RosetteSepTM)被设计为高纯度细胞富集的定性技术。直到今天，它仅仅被用作定性分析(Busch等，2004；Bischoff等，2002)。根据制造商，这种技术显示了非常好的纯度(90±5％)但不良的回收率(59±24％)，以致其不能被用作定量分析。此外，制造商建议使用相当高的量的血液(1-15mL)，其因此需要高量的抗体混合物(50-750μL)，因此使得此方法相对昂贵(5-70
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/样品)。根据本发明的方法，新开发的“改良型负选择(modified negativeselection)”(MNS)技术提供回收率并减小了试剂用量以便可以被用作例如确定CD4计数的定量分析。在本发明的一种实施方式中，与制造商的方案相比，温育时间从20分钟增加到30分钟，以确保完全清除所有不需要的细胞。为了实现更高的回收率，在梯度离心之后转移整个上清液，因此保证收获所有富集的CD4+ T-细胞。此外，增添了裂解步骤，以除去残留的RBC(红细胞)。在最后的离心步骤之后，从微管中(优选地完全地)除去剩余的液体。这可以通过例如使用棉签完成。当富集的细胞(此处是CD4+ T-细胞)被重悬时，优选的残留液体的完全去除避免不正确的稀释。
[0028]本研究中引入的MNS方法显示出与流式细胞术的高相关性(r＝0.91)。15.35±12.45％的平均差代表了分析样品中特定细胞群的量的可接受偏差。在分离CD4+ T-细胞的示例实施方式中，通过在梯度离心之后将含有期望的CD4+ T-细胞的全部上清液转移到新的微管中以收获所有的CD4+ T-细胞，回收率被进一步提高。因此，在本发明进一步优选的实施方式中，基本上全部含有第二细胞群的上清液在本方法的步骤(c)中被收集/回收。术语“基本上全部”描述了收集率/回收率在上清液的90％以上，例如上清液的95％以上或者98％以上或者甚至99％以上，诸如100％。这也适用本方法的其它实施方式。本发明允许在优选的实施方式中收获所有目标细胞。根据本发明的教导，仅仅从例如当用微管和小试剂量工作时血浆和
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之间的相界面中收集富集的细胞不是有利的。因此，例如，对于RosetteSepTM，通过本发明的方法，回收率从原来的59±24％提高到79.36±19.13％，纯度从90±5％稍微下降到81.10±10.78％。不希望被理论限制，可以理解的是：较低的纯度也是由于商业上可获得的抗体混合物的组成所导致。可能的是，这种特定混合物不适合从任何血液样品中清除所有不需要的细胞，特别是从病理血液(其可能包含，例如，数目增加的NK-细胞、γδ-淋巴细胞、单核细胞)中清除。该混合物可以容易地被更好地适应本发明目的的不同混合物代替。此外，本领域已知的是，在光学显微镜下这些细胞有时难以与CD4+ T-细胞中区分开，并且可能被误算为假阳性。这方面解释了几种其它现象：
-表2中所见的回收率>100％，
-HIV血液和非HIV血液之间纯度和回收率值的差异，
-HIV样品中较低的相关性。
[0029]为了本发明方法的效率，几个步骤必须非常小心地进行。第一个是在梯度离心之后转移(全部)上清液。该转移的精确实施非常重要，因为其对纯度和回收率都有影响：如果上清液没有完全被转移，回收率将下降；如果RBC沉淀被混入，纯度将减小。另一关键步骤是在本发明方法的步骤(f)中上清液的去除。该去除的效率可影响目标细胞(例如，CD4+ T-细胞)的回收。当例如通过使用棉签干燥沉淀时，细胞沉淀必须不被破坏，否则目标细胞的回收率可能下降，导致不准确的结果。在将获得的细胞铺层于例如血细胞计数器上之前，样品最好被彻底地涡旋，以避免回收率的下降。
[0030]手动计数过程中的“视觉门控”可以由本领域技术人员容易地进行。优选的是，本发明的方法在取出人血样之后很短的时间内进行，优选地在取出血液之后24小时，更优选地在取出血液之后12小时，甚至更优选地在取出血液之后8、6、4或2小时。
[0031]本发明方法相对于本领域已知方法进一步的优势来源于这样的事实：仅仅需要少数几件仪器：例如，光学显微镜(优选地具有40x物镜)、计数室(例如，Neubauer型血细胞计数器)、微量离心机和漩涡器(vortexer)。通过将初始血液体积降低至仅仅100μL，所有试剂的需要量，其高于所有的抗体混合物，也得到降低。因此，分析一个样品的成本被缩减。商业上可获得的抗体混合物瓶(10mL)花费180美元，1L密度介质花费60美元。一次MNS-分析的总成本，包括一次性材料例如管和枪头，可被分别估算为：当使用5μL混合物时每个样品大约0.50美元，以及当使用2μL混合物时每个样品0.30美元。
[0032]术语“负选择”根据其在本领域中的含义描述了一种选择方法，其通过特异性清除不期望的细胞从样本中聚集/分离细胞。根据本发明方法的负选择考虑与流式细胞术的高相关性(r＝0.91，p<0.0001)。因此，MNS方法表现出例如足够的精确度，给予主治医师可靠的CD4计数，使他能够就ART的起始或机会性感染预防作出决定。花费0.30美元-0.50美元，甚至对于居住在发展中国家的患者也可以负担。作为可靠的、简易的且不昂贵的CD4+ T-细胞计数方法，其代表着非常有吸引力的流式细胞术替代方法，尤其对于资源有限的条件下的小实验室而言。对于CD4+ T-细胞计数的优选实施方式所述的优势当然也适用于本发明方法的其它实施方式。
[0033]同样优选的是，根据本发明的方法在不同步骤中进行一个或者多个洗涤步骤。特别优选的是，本方法包括在步骤(c)之后且在步骤(d)之前的步骤(c’)：
(c’)在生理缓冲液中洗涤步骤(c)中获得的细胞。
[0034]在本发明方法优选的实施方式中，所述第一组分和第二组分如下进行复合：
(i)形成抗体-蛋白A复合物、抗体-蛋白G复合物或抗体-蛋白L复合物(其中抗体-蛋白G复合物是优选的)；或
(ii)使所述第一组分和第二组分与能够特异结合所述第一组分和第二组分的抗体温育。
[0035]蛋白A、蛋白G或蛋白L可以在固体载体上固定。这类固体载体的例子包括琼脂糖或者琼脂糖凝胶珠(例如，四琼脂糖凝胶珠(tetra-sepharose beads))。
[0036]对于本发明的方法优选的是，所述第二细胞群(目标细胞群)选自CD4+细胞群、CD8+细胞群、CD14+细胞群和CD19+细胞群。更优选地，目标细胞群是CD4+或CD8+细胞群。
[0037]进一步优选的是，所述第一组分包含：
(i)至少5种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD8、CD16、CD19、CD36和CD56；或者
(ii)至少5种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD4、CD16、CD19、CD36和CD56。
在本方法优选的实施方式中，第一组分中至少5种非人类抗体、抗体片段或其衍生物的量是相等的。
[0038]根据本发明的方法同样优选的是，能够特异结合人红细胞表面的抗体、抗体片段或其衍生物是：
(i)抗血型糖蛋白(例如CD235a、CD235b、CD236或CD236R)的抗体、抗体片段或其衍生物；
(ii)抗Kell抗原(例如CD238)的抗体、抗体片段或其衍生物；
(iii)抗Rhesus抗原(例如CD240CE、CD240D或CD241)的抗体、抗体片段或其衍生物；
(iv)抗B-CAM(例如CD239)的抗体、抗体片段或其衍生物；或
(v)抗ICAM-4(例如CD242)的抗体、抗体片段或其衍生物。
[0039]在可选的实施方式中，本发明涉及与血液中目标细胞群的细胞数相关的疾病诊断或分期的方法，所述方法包括用于量化目标细胞群的本发明方法的步骤，以及在第二细胞群(目标细胞群)的具体细胞数的基础上确定：
(i)从中获取血样的人是否被疾病感染；和/或
(ii)疾病的特征阶段。
术语“分期疾病(staging a disease)”在本发明中描述了确定疾病发展阶段的方法。这类确定对于确定一种或者多种合适药物组合物的有希望的给药方案是重要的。
[0040]优选的是，由本发明方法分期的疾病是HIV感染。分类(即，诊断)，尤其是HIV疾病的分类，可以由于几种目的而进行并且应当区别于疾病分期。分期是这样的疾病分类，其目的主要在于对不同预后进行分组并可以用于指导治疗决定。分期旨在从最轻到最重的进展顺序对疾病进行分类，比起前一阶段，每一在后阶段具有更差的预后或者不同的医学管理。因此，疾病的进展，例如，从HIV感染的不同阶段到AIDS的表现，可以通过本发明的方法进行评价。对于HIV感染的分期，熟知的WHO标准可以被使用。
[0041]对于本发明的方法优选的是，目标细胞群是CD4+细胞群或者CD8+/CD38+细胞群。
[0042]在本发明方法的进一步优选的实施方式中，血液是已经用能够抑制凝固的试剂处理的血液。相应试剂的实例包括，但不限于，柠檬酸盐、EDTA和肝素。
[0043]对于本发明的方法进一步优选的是，
(i)在本发明方法的步骤(a)中，高达100μl的血液用5μl的混合物处理，和
(ii)在本发明方法的步骤(a)之后和步骤(b)之前，所述样品
(a’)用100μl生理缓冲液稀释，和
(a”)在RT(室温)下温育至少30分钟。
[0044]按照本发明方法，优选的是，密度介质选自蔗糖基密度介质或者碘克沙醇(iodixanol)。特别优选的蔗糖基密度介质的实例包括和PercollTM。
[0045]对于本发明的方法同样优选的是，能够选择性裂解步骤(d)中红细胞的液体(其可以是缓冲液体)选自：BD FACS细胞裂解液、蒸馏水和NH4Cl-溶液。优选地，NH4Cl-溶液特征如下：pH 7.3；8.29g NH4Cl；0.037g二钠-EDTA-2-水合物；0.839g NaHCO3或1.0g KHCO3；H2O蒸馏水加至1升。
[0046]本方法的步骤可以在任何溶解体积的液体中进行。对于本发明的方法特别优选的是，步骤(f)的确定体积高达100μl。
[0047]如本文上面所述，对于本发明的方法优选的是，生理缓冲液是含有至少5％非人血清的磷酸缓冲盐溶液。PBS优选是如下的溶液：pH7.4；8.77g NaCl；1.57g Na2HPO4×2H2O；0.163g KH2PO4；H2O蒸馏水加至1升。FCS的优选浓度在上文中已经描述。因此，PBS优选地补充有大约5％非人血清，更优选的3％非人血清，以及最优选的2％非人血清。非人血清的非限制性例子包括胎牛血清(FCS)、牛血清、小鼠血清、大鼠血清或羊血清。特别优选的是，非人血清是FCS。
[0048]按照本发明，一种方法是优选的，其中目标细胞的数目通过对所述细胞进行染色和/或计数来确定。对所述细胞进行染色和/或计数的方法包括但不限于使用ELISA(例如，使用过氧化物酶或者碱性磷酸酶作为活性酶)的方法、免疫-层析法(例如，使用胶体金或者胶体碳)、使用带刻度的毛细管测量沉淀大小、在光学显微镜下于血细胞计数器中手动计数(例如Neubauer型)、在血细胞计数器(例如，Sysmex型)或电子细胞计数器(例如，casy型)中自动计数。
[0049]进一步优选的是，本发明的方法包括在步骤(f)之后和步骤(g)之前的附加步骤(f’)：
(f’)通过使用另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物，从所述第二细胞群(目标细胞群)正选择在细胞表面表达进一步的特征抗原的亚群，所述非人抗体、抗体片段或其衍生物特异结合到所述抗原。
[0050]任选的附加步骤(f’)考虑了细胞亚群的分离，该细胞亚群一方面在细胞表面表达在本方法的前面步骤中负选择的抗原，另一方面在细胞表面表达进一步的抗原。为了实现该附加选择，步骤f中获得的细胞(第二细胞群)可以按照制造商的方案与例如染色珠或顺磁珠一起温育。这些珠，例如，包被有另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物，例如，通过使用硼酸盐缓冲液或者通过聚合物表面进行。任选地，一个或多个另外的洗涤步骤在步骤(g)之前进行。因此，优选的实施方式考虑了在细胞表面表达两种不同抗原的细胞群(双阳性细胞)的分离。
[0050a]按照本发明，另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物可以在固体载体上固定。固体载体的非限制性实例包括胶乳或者琼脂糖或者(顺)磁珠、微量滴定板以及培养皿。
[0051]对于本发明的方法进一步优选的是，第二细胞群(目标细胞群)是CD8+细胞群，并且所述另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物特异结合CD38。因此，根据本发明的该优选实施方式，CD8+/CD38+分离自人血样。CD8+/CD38+双阳性细胞的数目的确定(CD8+/CD38+计数)通常在常规抗逆转录病毒治疗中被用作替代标记。通过在治疗过程中降低病毒载量，活动过度的患者免疫系统得到缓和。病毒载量下降之后，CD8+细胞毒性T细胞上的激活标记CD38被下调。这种下调是由病毒感染的循环细胞诱导的T细胞激活下降的指示。
[0052]在进一步的可选实施方式中，本发明涉及进行本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)第一组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合在第一细胞群表面上表达的抗原，所述第一细胞群不同于第二细胞群，所述第二细胞群是目标细胞群并且缺乏所述抗原，
(b)第二组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合于人红细胞表面；
(c)任选地，能够交联所述抗体的试剂；和
(d)使用说明。
[0053]能够交联所描述的抗体、抗体片段或其衍生物的试剂的实例包括，但不限于，特异于所述非人抗体的恒定区的抗体、抗体片段或其衍生物(例如山羊抗小鼠抗体或大鼠抗小鼠抗体)或者用于化学交联所述抗体的试剂。
[0054]优选地，本发明的试剂盒是这样的试剂盒，其中所述第一组分包含：
(a)至少五种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD8、CD16、CD19、CD36和CD56；和/或
(b)至少五种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD4、CD16、CD19、CD36和CD56。
[0055]更优选地，本发明的试剂盒进一步包括：
(a)抗体，其特异结合在γδ-淋巴细胞和/或单核细胞表面上表达但不在CD4+细胞表面上表达的蛋白质，和/或
(b)抗体，其特异结合在γδ-淋巴细胞和/或单核细胞表面上表达但不在CD8+细胞表面上表达的蛋白。
附图说明
[0056]图1：通过流式细胞术(FACS)和通过MNS-技术测定的CD4+T-细胞计数的相关性图
从23个HIV-患者和28个健康献血者获得的51个样本的数据。相关性系数(r)是0.91(p<0.0001)。连续蓝色线是回归线，红色虚线表示100％相关性。
[0057]图2：分别由流式细胞术和MNS-技术测定的CD4计数的绝对差的Bland-Altman图
从23个HIV-患者和28个健康献血者获得的51个样本的数据。总平均差是106.588.5个细胞(中值68个细胞，范围：4-367个细胞；n＝51)。
[0058]图3：“视觉门控(Visual gating)”
在手动计数中，不需要的细胞被肉眼排除在外。从左到右：总体照片、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、碎片。
[0059]图4：由流式细胞术测定的、MNS之后的CD4+ T-细胞纯度左：散射门控(scatter gate)(R1)包括所有的淋巴细胞并且排除粒细胞、单核细胞、红细胞以及碎片。
中间：整个样品中CD4+纯度的柱状图(无门控)。总无门控纯度是72.56 15.72％
右：淋巴细胞门控(R1)内CD4+纯度的柱状图。总淋巴细胞门控纯度是81.10 10.79％
具体实施方式
[0060]通过下面的实施例对本发明进行了阐述，但不应当理解为本发明限制于此。
实施例1：材料和方法
研究设计和临床方案
[0061]该研究由通过改良的负选择方案(MNS)和流式细胞术(FCM)进行双重CD4 T-淋巴细胞计数组成。它于2005年8月到10月之间在Leipzig市进行，其主要目的是比较MNS与FCM，特别是在两种方法的精确度和成本方面。研究参与者包括25例感染HIV的患者和29例健康供血者。患者年龄范围在20到71岁(平均41.79±15.11岁)。在Leipzig，HIV-患者定期参加Clinic for Dermatology and Venereal Diseases(皮肤病和性病诊所)或Clinic for Infectious and Tropical Diseases(传染病和热带病诊所)的AIDS会诊时间。所有都是CD4计数在96和1037个细胞/μL的无症状患者，有或没有抗逆转录病毒治疗史。健康供血者是CD4计数在429和1696个细胞/μL的正式供血者。
[0061a]外周静脉血液被抽取到小Monovettes(Sarstedt、Nümbrecht、Germany)中，以四乙酸乙二胺(EDTA)作为抗凝剂，并且在8小时内处理。研究以盲式进行并且按照Ethic Committee on Human Researchof the University of Leipzig的规定进行。
通过流式细胞术进行CD4+ T-细胞计数
[0062]对于每个样品，用4-色、2-平台流式细胞仪(FACSCaliburTM；Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Heidelberg，Germany)，按照我们的内部实验室规程，进行CD4+ T-淋巴细胞计数。
[0062a]100μL的EDTA-抗凝的外周全血用2μL抗-CD4-PE(Immunotech；Beckman-Coulter，Krefeld，Germany)在室温下(RT)温育15分钟。通过在室温下与2mL的BD裂解液(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)一起温育10分钟，除去红细胞。离心(在250xg、RT下5分钟)之后，用3mL的PBS洗涤细胞，再次离心(在250xg、RT下5分钟)，并重悬于250μL的PBS/1％甲醛(FA)中。所述细胞然后在FACSCaliburTM上分选CD4+ T-细胞。最后，通过由FACSCaliburTM测定的CD4+细胞在所有淋巴细胞中的百分比以及通过常规血球计(Sysmex
Figure A200780016194D0020085908QIETU
，Norderstedt，Germany)获得的TLC计算绝对CD4计数。
MNS方法计算CD4+ T-细胞计数
[0063]通过改良的基于密度的负选择方案(RosetteSepTM；CellSystems，St.Katharinen，Germany)进行CD4+ T-细胞的富集，其使用特殊抗体混合物进行全血细胞的富集。“RosetteSepTM Human CD4+ T CellEnrichment Cocktail”由抗人谱系抗原(human lineage antigens)(CD8、CD16、CD19、CD36和CD56)的小鼠IgG1抗体组成，其依靠大鼠抗小鼠IgG1二抗交联到小鼠IgG1抗人血型糖蛋白抗体，从而形成双特异性四聚抗体复合物(tetrameric antibody complexes)(TAC)。这些TAC通过在被靶向的有核细胞(NC)周围形成RBC玫瑰花状簇而交联所有的不需要NC到多个红细胞(RBC)上，从而提高不需要的(玫瑰花状簇)细胞的密度，使得当在密度介质内离心时它们与游离的RBC一起沉淀。期望的CD4+ T-细胞保持未用抗体标记并且可以作为富集的群在血浆和密度介质的相界面处进行收集(StemCell Technologies Inc.2005)。
[0064]使用1.5mL微管以加入5μL混合物到100μL EDTA-抗凝的静脉全血中。该样品用100μL的PBS/2％ FCS稀释，轻轻涡旋，然后RT下摇动30分钟。对于梯度离心，该混合物用150μL Ficoll-Paque
Figure A200780016194D0020085908QIETU
PLUS密度介质(CellSystems，St.Katharinen，Germany)置于下层，并且在微量离心机(Eppendorf，Hamburg，Germany)中离心(1000xg，5min，RT)。为了确保所有的CD4+ T-细胞均被收集，全部上清液被转移进入新的微管，非常小心地避免混合入含有不需要的细胞的RBC沉淀。所述转移的上清液用1mL PBS/2％ FCS洗涤，再次离心(5分钟，1200xg，RT)，用100μL FACS细胞裂解缓冲液(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)温育，以除去残余的红细胞。混合物在RT下轻轻摇晃10分钟，然后用1mL PBS/2％ FCS洗涤，并且离心(5分钟，1200xg，RT)。为了获得干细胞沉淀，使用棉签将所有剩余的液体小心地从微管中移去，小心避免破坏细胞沉淀。在100μL PBS/2％ FCS(与原始血样相同的量)中重悬细胞。最后，在充分涡旋之后，将10μLCD4+ T-细胞悬浮液铺层于Neubauer型血球计(Feinoptik GmbH，Blankenburg，Germany)上，并且在40倍放大率的光学显微镜下，按照肉眼排除所有的粒细胞、红细胞、血小板和碎片的严格计数规则进行计数，以保证仅仅淋巴细胞被计数。就流式细胞术所使用的术语方式而言，我们称之为“视觉门控(visual gating)”(见图4)。
纯度和收率分析
[0065]通过在用抗-CD4-PE(Immunotech；Beckman-Coulter，Krefeld，Germany)染色后于FACSCaliburTM流式细胞仪(Becton DickinsonImmunocytometry Systems，Heidelberg，Germany)上分析富集的CD4+ T-细胞，评价由MNS技术测定的每种样本的纯度。对于每个样本，我们评估两个CD4+ T-细胞纯度值：a)散射门控中的CD4+细胞百分比，其包括淋巴细胞并排除粒细胞、单核细胞、红细胞和碎片，b)样品中CD4+细胞占所有细胞的百分比(无门控，见图4)。因为对手动计数设置了严格的规则(“视觉门控”，见上文)，在流式细胞术分析过程中淋巴细胞门控内获得的CD4+纯度必须被认为是相应的值，从而是显著的值。因此，所有的进一步分析和计算都引用该纯度值。
[0065a]对于收率(回收率)的评估，在通过MNS分析的每个样本中CD4+ T-细胞的真实数目被计算，然后被表示为通过流式细胞术(FC)所获得的CD4+ T-细胞数目的百分数。
真实CD4-计数＝手动细胞计数×门控纯度[％]/100
回收率[％]＝真实CD4数/FC CD4计数×100
非CD4+ T-细胞的分析
[0066]通过在用荧光染料(Immunotech；Beckman-Coulter，Krefeld，Germany)复染色之后在FACSCaliburTM(Becton-Dickinson，Heidelberg，Germany)上分析双重测定的血液样本(1 x 2μL抗体混合物和1 x 5μL抗体混合物)，评价MNS之后剩余的非-CD4+ T-细胞的百分数。
染色1：CD4-APC，CD3-FITC，CD45-PerCP，CD8-PE
染色2：CD3-FITC，CD16，56-PE，CD45-PerCP，CD19-APC
染色3：CD11b-FITC，CD4-PE，CD45-PerCP，CD14-APC
染色4：CD235a-PE，CD236-FITC，CD4-PE CY5
染色5：CD3-PE，抗-TCR-γδ-FITC
统计分析
[0067]使用(Medcalc software，Mariakerke，Belgium)，通过Bland-Altman-Plot和Passing/Bablok-回归法，确定分别用FCM和MNS评估的CD4计数之间的关系。Windows Excel 2000软件被用于分析和描述所有的评估数据。所分析的变量是CD4+ T-细胞的数目、CD4-纯度以及CD4-回收率。所有的数据被计算为平均值±SD。然而，由于诊断学试验的特点，数据被表示为中值、范围和置信区间。
实施例2：结果
CD4计数范围和阈值
[0068]在该研究中，通过流式细胞术和MNS方法从51个血液样本(23例HIV感染的患者和28例健康供血者)产生51对CD4计数值。分析47个样品(19个HIV样本和28个健康供血者样本)的纯度和回收率。由于运输问题，MNS分析不能用1个健康供血者样品和2个HIV样品进行。由于技术问题，纯度分析不能用另外4个HIV样品进行。总平均CD计4数是707±315个细胞/μL(中值：664，范围：96—1696，n＝51)。
相关性
[0068a]对于两种方法，图1描述了所有分析数据的相关性图。对于所有的分析数据，相关性系数(r)是0.91(p<0.0001)，对于HIV患者是0.86(p<0.0001)，对于非HIV患者是0.90(p<0.0001)。
MNS-方法和流式细胞术之间的差异
[0069]绝对平均差是106.5±88.5个细胞(中值为68个细胞，范围：4-367个细胞，n＝51，见图2)。以百分比计的平均差是15.35±12.45％(中值：11.11％，范围0.77％-49.13％，n＝51)。
纯度和回收率
[0070]表1和表2说明了纯度和回收值。对于健康供血者血液，原始负选择方法据报道产生90±5％纯的CD4+ T-细胞，回收率为59±24％(StemCell Technologies Inc.2005)。对于改良的方法，我们达到稍微低的总纯度，分别为：81.10±10.78％(中值：83.40％，范围：38.64-95.55％，n＝47，在淋巴细胞门控内)和72.56±15.72％(中值：76.82％，范围：24.97％-91.11％，n＝47，无门控)。比较而言，CD4+ T-细胞的总回收率可被提高到79.36±19.13％(中值：82.43％，范围：38.94％-125.27％，n＝47)。
[0070a]对于健康血液供血者(n＝28)，CD4+纯度是84.35±5.10％(中值：85.38％，范围46.23％-92.51％，在淋巴细胞门控内)和76.68±12.51％(中值：78.65％，范围：27.27％-90.19％；无门控)。对于HIV-患者(n＝19)，CD4+纯度是76.31±14.53％(中值：79.93％，范围：38.64-95.55％，在淋巴细胞门控内)和66.50±17.86％(中值：71.03％，范围：24.97％-91.11％，无门控)。
[0070b]对于健康供血者血液，CD4+T-细胞的回收率是86.61％±12.44％(中值：86.25％，范围：60.4％-111.30％)，对于HIV患者血液是68.68±22.04％(中值：63.47％，范围：38.94％-125.27％)。
非CD4+ T-细胞分析
[0071]MNS之后剩余的非CD4+ T-细胞的分析(见表3)表明，所分析的样品中所有细胞的大约10％是红细胞。3-4％是粒细胞，2-4％是单核细胞。这些加起来达可区分细胞的15-18％。
[0071a]1-2％是CD8+ T-淋巴细胞，1％是B-淋巴细胞，7％是γδ-T-淋巴细胞，4-7％是NK-细胞，加起来达难区分细胞的13-17％。
混合物量的评估
[0072]对3个样品进行附加实验，以评估用较少量的抗体混合物是否可以达到相似的精确度。使用2、3和4μL抗体混合物量，通过MNS技术分析CD4计数中值为547个细胞/μL的样品(流式细胞术示出细胞)。当改变抗体混合物的量时，未发现CD4+ T-细胞计数结果的显著差异(数据未显示)。
可重复性
[0073]在特定的一组实验中评估MNS技术的可重复性，其中5个平行样品(2个HIV样品和3个健康供血者样品)使用MNS技术分析两次。差异系数是4.05％。
操作者与操作者的差异
[0074]在另一个单独的实验中，操作者与操作者的差异被分析。无MNS技术经验的人员中的五位被指导来按照改良的MNS方案各进行一次测定(都来自相同的血样)。差异系数是14.45％。由五位人员测定的平均CD4计数是357个细胞/μL，流式细胞术显示为352个细胞/μL。
[0074a]此外，两位具有良好的MNS经验的人员对5个样品进行另外的实验。差异系数是7.19％。
样品处理的延迟
[0075]样品处理延迟的影响在5个样品(2个HIV样品和3个健康供血者样品)中进行评估，其通过MNS方法在抽取血液之后的第2、8、12和24小时下进行分析。在第2小时下中值是590细胞/μL，在第8小时下中值是590个细胞/μL，在第12小时下中值是560个细胞/μL，在第24小时下中值是640个细胞/μL。在第2小时下平均值是520个细胞/μL，在第8小时下平均值是528个细胞/μL，在第12小时下平均值是520个细胞/μL，在第24小时下平均值是604个细胞/μL。在12小时内平均值和中值差异不显著。
进一步的差异
[0076]因为越来越多的HIV感染患者被报道为儿童，本发明的方法可以被调整用于从婴儿血液进行CD4+定量。4个婴儿血样的第一次实验显示出与流式细胞术的相关性，r＝0.89，(数据未显示)。此外，如上面所描述，可容易地使mMNS方法适合于其它细胞(例如CD8+或者CD19+)的靶向，以及其它免疫诊断目的。
[0076a]为了对非洲、印度和欧洲患者群体进一步改进所述混合物，可能需要确定HIV血液中细胞组分的区域特异性。
列表
Figure A200780016194D00261
[0077]表1.通过MNS分析的47个样品的箱图(Boxplot)CD4+纯度。LG表示“淋巴细胞门控”，NG表示“无门控”。因为在手动计数过程中细胞被视觉门控，淋巴细胞门控内的CD4+纯度必须被认为是相应的值并因此是显著的值。
[0078]表2.通过MNS分析的47个样品的总平均CD4+回收率是79.36±19.13％(中值：82.43％，范围：38.94％—125.27％)。
 
标记 细胞类型 2μl抗体混合物 5μl抗体混合物
CD8 细胞毒性T-细 <1％ 2％
CD3 T-淋巴细胞 未染色 7％
CD14 单核细胞 4％ 2％
CD11b 粒细胞 3％ 4％
CD16/56 NK-细胞 7％ 4％
CD19 B-淋巴细胞 1％ <1％
CD235/236 RBC ～10％ ～10％
[0079]表3.在用荧光染料复染色之后，通过在FACSCaliburTM上分析双重测定的血样(1 x 2μL抗体混合物和1 x 5μL抗体混合物)，评估MNS之后剩余的非CD4+ T-细胞的百分比。
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Claims (21)

1.一种量化包含在人血样中的目标细胞群的方法，其包括步骤：
(a)使人血液的样品与混合物接触，所述混合物包含：
(i)第一组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合在第一细胞群表面表达的抗原上，所述第一细胞群不同于第二细胞群，所述第二细胞群是目标细胞群并且缺乏所述抗原，
其被复合到
(ii)第二组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合于人红细胞表面；
其中所述接触在允许抗原用它们的关连抗体标记的条件下进行；
(b)通过密度离心分离在所述血样中包含的抗体标记的细胞和未标记的细胞，其中所述介质的密度的最小等级是大约1.077g/mL；；
(c)收集包含所述第二种细胞群的上清液；
(d)浓缩包含在所述上清液中的所述第二细胞群并且在能够选择性裂解红细胞的液体中重悬所述细胞群；
(e)在生理缓冲液中洗涤步骤(d)中得到的细胞，以除去步骤(d)中的缓冲液；
(f)浓缩步骤(e)中获得的细胞，基本上除去所有上清液并重悬所述细胞于确定体积的生理缓冲液中；和
(g)测定步骤(f)中获得的细胞的数量，其中该细胞数对应于包含在所述血样中的所述第二细胞群的细胞数。
2.权利要求1所述的方法，另外包括在步骤(c)之后且在步骤(d)之前的步骤(c’)：
(c’)：在生理缓冲液中洗涤步骤(c)中获得的细胞。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一组分和第二组分如下进行复合：
(i)形成抗体-蛋白A复合物；或
(ii)使所述第一组分和第二组分与能够特异结合所述第一组分和第二组分的抗体温育。
4.权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述第二细胞群选自：CD4+细胞群、CD8+细胞群、CD14+细胞群以及CD19+细胞群。
5.权利要求1到4任一项所述的方法，其中所述第一种组分包含：
(i)至少5种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合人CD8、CD16、CD19、CD36和CD56；或者
(ii)至少5种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合人CD4、CD16、CD19、CD36和CD56。
6.权利要求1到5任一项所述的方法，其中所述能够特异结合于人红细胞表面的抗体、抗体片段或其衍生物是：
(i)抗血型糖蛋白的抗体、抗体片段或其衍生物；
(ii)抗Kell抗原的抗体、抗体片段或其衍生物；
(iii)抗Rhesus抗原的抗体、抗体片段或其衍生物；
(iv)抗B-CAM的抗体、抗体片段或其衍生物；或
(v)抗ICAM-4的抗体、抗体片段或其衍生物。
7.与血液中目标细胞群的细胞数相关的疾病诊断或分期的方法，所述方法包括权利要求1到6任一项所述方法的步骤，以及在所述第二细胞群(目标细胞群)的具体细胞数的基础上确定：
(i)从中获取血样的人是否被疾病感染；和/或
(ii)所述疾病的特征阶段。
8.权利要求7所述的方法，其中所述疾病是HIV感染。
9.根据权利要求8所述方法，其中所述目标细胞群是CD4+细胞群或者CD8+/CD38+细胞群。
10.权利要求1到9任一项所述的方法，其中所述血液是已经用能够抑制凝固的试剂处理的血液。
11.权利要求1到10任一项所述的方法，其中
(i)在权利要求1的步骤(a)中，高达100μl的血液用5μl的混合物处理，和
(ii)在权利要求1的步骤(a)之后和步骤(b)之前，所述样品(a’)用100μl生理缓冲液稀释，和
(a”)在室温下温育至少30分钟。
12.权利要求1到11任一项所述的方法，其中所述密度介质选自蔗糖基密度介质或者碘克沙醇。
13.权利要求1到12任一项所述的方法，其中所述能够选择性溶解步骤(d)中红细胞的液体选自：BD FACS裂解液、蒸馏水和NH4Cl-溶液。
14.权利要求1到13任一项所述的方法，其中权利要求(1)的步骤(f)的所述确定体积达100μl。
15.权利要求1到14任一项所述的方法，其中所述生理缓冲液是含有至少5％非人血清的磷酸缓冲盐溶液。
16.权利要求1到15任一项所述的方法，其中所述目标细胞的数目通过对所述细胞进行染色和/或计数来确定。
17.权利要求1到16任一项所述的方法，包括在步骤(f)之后和步骤(g)之前的附加步骤(f’)：
(f’)通过使用另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物，从所述第二细胞群正选择在所述细胞表面表达进一步的特征抗原的亚群，所述非人抗体、抗体片段或其衍生物特异结合到所述进一步的抗原。
18.权利要求17所述的方法，其中所述第二细胞群是CD8+细胞群，并且所述另外的非人抗体、抗体片段或其衍生物特异结合CD38。
19.进行权利要求1到18任一项所述方法的试剂盒，其包含：
(a)第一组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合在第一细胞群表面上表达的抗原，所述第一细胞群不同于第二细胞群，所述第二细胞群是目标细胞群并且缺乏所述抗原，
(b)第二组分，其包含至少一种非人抗体、抗体片段或其衍生物，能够特异结合于人红细胞表面；
(c)任选地，能够交联所述抗体的试剂；和
(d)使用说明。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述第一组分包含：
(a)至少五种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD8、CD16、CD19、CD36和CD56；和/或
(b)至少五种非人抗体、抗体片段或其衍生物，其能够特异结合人CD4、CD16、CD19、CD36和CD56。
21.权利要求19或20所述的试剂盒，进一步包括：
(a)抗体，其特异结合在γδ-淋巴细胞和/或单核细胞表面上表达但不在CD4+细胞表面上表达的蛋白质，和/或
(b)抗体，其特异结合在γδ-淋巴细胞和/或单核细胞表面上表达但不在CD8+细胞表面上表达的蛋白质。
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