CN101435817B - 一种向木本植物中引入荧光示踪剂的方法及其专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种向木本植物中引入荧光示踪剂的方法及其专用装置。本发明所提供的用于引入荧光示踪剂的装置，包括针、用于输导示踪溶液的具有吸水性质的线、用于吸附示踪溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料的底部密封的容器；所述具有吸水性质的线的一端穿过所述针的针孔，所述针连带所述具有吸水性质的线穿过所述容器底部，所述具有吸水性质的线的另一端缠绕在所述吸水性材料上，所述吸水性材料设于所述容器底部。本发明的用于引入荧光示踪剂的装置结构简单，成本低廉，操作方便。本发明的利用向木本植物中引入荧光示踪剂的方法，实现了木本植物中引入荧光物质，且操作简单、耗时短，具有较大的实际应用价值。

Description

一种向木本植物中引入荧光示踪剂的方法及其专用装置

技术领域

本发明涉及一种向木本植物中引入荧光示踪剂的方法及其专用装置。

背景技术

光合同化物的分配和运输是决定作物产量和品质的重要因素，因而研究同化物在库组织中的转运和转移过程就成为一个重要的研究领域。关于有重要经济性状的库中的同化物代谢的研究，已经取得重大进展，但是同化物从筛分子卸出到库细胞及其后的一系列过程，至今还不清楚。一个重大的障碍就是库中维管束深埋在组织内部，同库组织在结构上很难分离，致使活体卸载体系很难建立。

5(6)CF(Carboxyfluorescein，5，6碳氧羧基荧光素)是5-和6-羧基代替的荧光素混合物，对细胞无毒，化学惰性且量子产率高，可长距离运输，是一个比较理想的共质体标记物。这在一年生作物库器官同化物卸载研究上已成功应用。作物类果实同化物卸载的研究一般可以从叶片引入CF，例如通过摩擦叶片表皮或通过叶片压力注射等将CF引入叶片韧皮部，然后随着韧皮部流进入果实，进而实时追踪模拟同化物在果实内的卸载和运输情况。荧光素结合激光共聚焦扫描显微镜的使用，大大推进了作物、蔬菜和草本类果树果实同化物运输和卸载的研究。但木本果树像苹果、枣、核桃等，叶肉细胞小而紧密，细胞间隙小，而且叶表皮上面有一层蜡质，通过叶片很难将荧光素物质引入。另外，由于木本果树代谢复杂，韧皮部流相对于一年生作物要缓慢得多，导致荧光素因长时间引入而淬灭，从而影响同化物的追踪。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于引入荧光示踪剂的装置。

本发明所提供的一种用于引入荧光示踪剂的装置，包括针、用于输导示踪溶液的具有吸水性质的线、用于吸附示踪溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料的底部密封的容器；

所述具有吸水性质的线的一端穿过所述针的针孔，所述针连带所述具有吸水性质的线穿过所述容器底部，所述具有吸水性质的线的另一端缠绕在所述吸水性材料上，所述吸水性材料设于所述容器底部。

其中，所述容器的顶部可以设有带有通气孔的盖。

所述针要细，以免造成枝或柄劈裂或者伤及其木质部。

所述具有吸水性质的线具体可为棉线。棉线的粗细以紧密穿过枝或柄的韧皮部但不划伤其木质部为宜。

所述吸水性材料是用于吸附示踪溶液，以持续地缓慢地为植物提供荧光示踪剂。现有的吸水性材料均可，如各种棉制品，具体可如脱脂棉或海棉等。

所述容器具体可为离心管。

所述吸水性材料具体可占据所述容器体积的2/3。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述任一种装置向木本植物中引入荧光示踪剂的方法。

本发明所提供的利用上述任一种装置向木本植物中引入荧光示踪剂的方法，包括如下步骤：

1)利用上述任一种装置的所述针带着所述具有吸水性质的线穿过木本植物的靠近待检测器官的枝或柄的韧皮部；

2)将荧光示踪剂注入上述任一种装置的所述容器中，同时将所述容器用避光性材料包好。

为了对穿过所述韧皮部的线进行固定，可以将穿过所述韧皮部的线缠绕于所述枝或柄四周。

为了防止胼胝质的形成而阻塞筛板进而阻碍运输，在本发明方法中，用所述针带着所述具有吸水性质的线穿过所述枝或柄的韧皮部后，在所述针穿过的所述枝或柄的韧皮部孔内滴加EDTA。

为了防止荧光示踪剂流失，在本发明方法中，用所述针带着所述具有吸水性质的线穿过所述枝或柄的韧皮部后，在所述枝或柄上针穿出的部位涂抹凡士林。

为了便于荧光示踪剂的流动，最好将所述容器竖直放置。

所述引入的时间一般为24-72小时，可以根据具体的植物的特性而定。

上述任一种方法在检测植物内同化物卸载中的应用。

所述应用具体可以为检测木本植物果实内的同化物卸载；所述木本植物具体可为苹果、核桃、葡萄、冬枣或梨枣。

在实际应用中，可以根据植物自身特点及实验目的选择引入部位，如当要检测果实内同化物卸载时，可以选择在果柄或者靠近果柄的短枝上进行引入，具体可如

苹果或葡萄、核桃果柄较长、韧性较好，可以作为引入的操作点，而冬枣、梨枣果柄很短、质脆、易断裂和落果，一般选择靠近果柄的短枝作为引入的操作点。

本发明的用于引入荧光示踪剂的装置结构简单，成本低廉，操作方便。本发明的向木本植物中引入荧光示踪剂的方法，是用“穿针引线法”把荧光染料引入，克服了由于木本植物器官中维管束深埋在组织内部，同库组织在结构上很难分离的障碍，也克服了木本植物由于叶肉细胞小而紧密、细胞间隙小，而无法通过叶片细胞间隙引入荧光素物质的限制，实现了木本植物中荧光物质的引入，同时本发明方法通过柄或枝引入，大大缩短了引入时间。

本发明方法与激光共聚焦扫描显微镜技术相结合，可实现木本植物内同化物卸载路径的荧光示踪检测，标记效果好，可信度高，扫描得到的图像能实时地反映同化物在果实内的卸载情况。

附图说明

图1为在短枝处引入荧光示踪剂的示意图。

图2为苹果果实内一个分支的维管束韧皮部中荧光分布图及透射图，a为荧光分布图，b为投射图。

图3为核桃果皮和种皮中韧皮部中荧光分布图。

图4为冬枣果实发育后期内一个纵切的维管束韧皮部中荧光分布图及透射图，a为荧光分布图，b为投射图。

具体实施方式

下述实施例中用到的荧光素CFDA(5，6-碳氧羧基荧光素酯)购自Sigma公司。

下述实施例中用到的引入荧光示踪剂的装置，包括针、棉线(棉线粗度以紧密穿过柄或枝的韧皮部但不使韧皮部断裂且不划伤其木质部为宜)、脱脂棉和1.5mlEppendorf微量离心管；其中，Eppendorf管的盖上打一小孔，使之与外界大气压相通，便于液体流动；

棉线的一端穿过针的针孔，将针连带棉线穿过1.5ml Eppendorf微量离心管底部，棉线的另一端缠绕在所述脱脂棉周围5-6圈，脱脂棉位于1.5ml Eppendorf微量离心管底部，占据管体积的2/3。

下面以用该装置检测木本植物的果实内同化物卸载为例，阐明本发明的向木本植物中引入荧光示踪剂的方法。

实施例1、苹果果实内同化物卸载的荧光示踪检测

配制荧光素CFDA母液：用丙酮溶解荧光素CFDA，使得荧光素CFDA母液的浓度为25mg/mL。贮存在-20℃。

稀释母液：用含有5mM Mes-Tris和300mM山梨醇、pH值为5.5的溶液稀释荧光素母液，使荧光素的浓度为1mg/mL，得到荧光素稀释液，备用。其中山梨醇可以调节渗透压、维持细胞膨压。

利用上述装置进行实验的方法如下：

因为苹果的果柄较长、韧性较好，便于操作，因此选择果柄作为引入荧光素的操作点。

选取健康向阳树冠，将果柄冲洗干净，用针穿过果柄韧皮部，不划伤木质部，将棉线缠绕于果柄四周对该棉线进行固定，迅速在针穿进和穿出的部位滴加EDTA(2.5mM)，防止胼胝质形成，阻碍运输。在针穿出部位涂抹凡士林，防止CFDA溶液流失。将Eppendorf管固定，保持竖直。向Eppendorf管中注入100μL CFDA稀释液，迅速合上盖子，并用锡箔纸包好，防止CFDA见光分解。处理72小时。

采摘果实，放在冰壶带回实验室进行徒手切片。用体积百分含量为80％的甘油封片(既可防止荧光的快速泯灭，同时价格低廉节省材料)，低温避光保存。用激光共聚焦扫描显微镜观察CF荧光并拍照片。

结果如图2，荧光物质被限制在韧皮部中，没有卸出，表明苹果果实内同化物主要采取质外体卸载模式。

实施例2、核桃果实内同化物卸载的荧光示踪检测。

配制荧光素CFDA母液、稀释母液及制作引荧光装置的方法同实施例1所述一致，荧光素稀释液的浓度为1mg/mL。

利用上述装置进行实验的方法如下：

因为核桃果柄较长、韧性较好，便于操作，因此选择果柄作为引入荧光素的操作点。

选取健康向阳树冠，将果柄冲洗干净，用针从上向下穿过果柄韧皮部，不划伤木质部，将棉线缠绕于果柄四周对该棉线进行固定，迅速在针穿进和穿出的部位滴加EDTA(2.5mM)，防止胼胝质形成，阻碍运输。在针穿出部位涂抹凡士林，防止CFDA溶液流失。将Eppendorf管固定，保持竖直。向Eppendorf管中注入200μL CFDA稀释液，迅速合上盖子，并用锡箔纸包好，防止CFDA见光分解。处理24-36小时。

采摘果实，放在冰壶带回实验室进行徒手切片。用体积百分含量为80％的甘油封片(既可防止荧光的快速泯灭，同时价格低廉节省材料)，低温避光保存。用激光共聚焦扫描显微镜观察CF荧光并拍照片。

结果如图3所示，图3a显示了在核桃种皮中CF从韧皮部卸出到周围薄壁细胞中，图3b显示在果皮中CF被限制在韧皮部中。表明核桃果皮处同化物主要采取质外体卸载模式(即荧光染料被限制在韧皮部中，没有卸出)，而在种皮处主要采取共质体卸出模式。

实施例3、冬枣果实内同化物卸载的荧光示踪检测。

配制荧光素CFDA母液、稀释母液及制作引荧光装置的方法同实施例1所述一致，荧光素稀释液的浓度为100μg/mL。

利用上述装置进行实验的方法如下：

因为冬枣或梨枣等的果柄较短、质脆、易断裂造成果脱落，因此选取靠近果柄的短枝作为引入荧光素的操作点。

选取健康向阳树冠，将靠近果柄的短枝冲洗干净，用针从上向下穿过短枝韧皮部(图1)，不要划伤木质部，将棉线缠绕于短枝四周对该棉线进行固定，迅速在针穿进和穿出的部位滴加EDTA(2.5mM)，防止胼胝质形成，阻碍运输。在针穿出部位涂抹凡士林，防止CFDA溶液流失。将Eppendorf管固定，保持竖直。向Eppendorf管中注入200μL CFDA稀释液，迅速合上盖子，并用锡箔纸包好，防止CFDA见光分解。用剪刀剪掉短枝前端的枝条和叶片。处理24-36小时。

采摘果实，放在冰壶带回实验室进行徒手切片。用体积百分含量为80％的甘油封片(既可防止荧光的快速泯灭，同时价格低廉节省材料)，低温避光保存。用激光共聚焦扫描显微镜观察CF荧光并拍照片。

因为短枝前端的枝条和叶片，特别是非功能叶片作为库存在，能和果实竞争而固定一部分荧光染料，使得果实内荧光染料减少，不能达到最佳效果。如果通过加大荧光染料用量来实现，一方面对果实有害，另一方面造成不必要的浪费。所以在操作时剪掉短枝前端的枝条和叶片的方法来避免这一情况。

结果如图4所示，表明荧光染料被限制在韧皮部中，没有卸出，表明冬枣果实内同化物后期主要采取质外体卸载模式。

本实施例的方法同样适合于葡萄、梨枣果实内同化物卸载的荧光示踪检测。

Claims (8)

1.一种用于引入荧光示踪剂的装置，包括针、用于输导示踪溶液的具有吸水性质的线、用于吸附示踪溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料的底部密封的容器；

所述具有吸水性质的线的一端穿过所述针的针孔，所述针连带所述具有吸水性质的线穿过所述容器底部，所述具有吸水性质的线的另一端缠绕在所述吸水性材料上，所述吸水性材料设于所述容器底部；

所述容器的顶部设有带有通气孔的盖。

2.一种利用权利要求1所述装置向木本植物中引入荧光示踪剂的方法，包括如下步骤：

1)利用权利要求1所述装置中所述针带着所述具有吸水性质的线穿过木本植物的靠近待检测器官的枝或柄的韧皮部；在所述针穿过的所述枝或柄的韧皮部孔内滴加EDTA；

2)将荧光示踪剂注入权利要求1所述装置的所述容器中，同时将所述容器用避光性材料包好。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将穿过所述韧皮部的线进行固定。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，用所述针带着所述具有吸水性质的线穿过所述枝或柄的韧皮部后，在所述针穿出的部位涂抹凡士林。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述容器竖直放置。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述引入的时间为24-72小时。

7.权利要求2-6中任一所述方法在检测木本植物的同化物卸载中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用为检测木本植物果实内的同化物卸载；所述木本植物为苹果、核桃、冬枣或梨枣。

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