CN101430336A - 利用电化学检测血红素或血比容的方法及检测试片 - Google Patents

Abstract

一种利用电化学检测血红素或血比容的方法及检测试片，该检测方法包括(i)使检体与试剂接触，该试剂包括缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯电子传递物；(ii)在定电位条件下，测量检体中血红素与电子传递物进行反应所产生的电流；以及(iii)根据所测量的电流换算检体中的血红素浓度。该方法是利用经环状糊精改质的四硫富瓦烯作为电子传递物，在定电位条件下直接与检体中的血红素进行反应，利用电流或电流与时间积分的电量值与血红素浓度的反比关系，可以快速地检测全血检体中的血红素浓度，或进一步用于计算血液检体的血比容。

Description

利用电化学检测血红素或血比容的方法及检测试片

技术领域

本发明涉及一种利用电化学检测血红素浓度的方法及检测试片，特别是有关于一种利用电化学检测全血检体的血红素浓度的方法及检测试片。

背景技术

血液检测中，除了血糖与胆固醇之外，血红素亦为一项重要的生化检测标的。目前用于检测血红素的方法包括测量全血的比重的硫酸铜比重法；利用血红素中的部分结构Heme具有过氧化酶活性，而进行氧化还原反应的化学法；利用HbAl的抗体侦侧粪便中血红素的免疫法；利用一氧化碳与血红素结合进行检测的气测法；利用铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆)将血红素转成变性血红素，再与氰化钠(NaCN)或氰化钾(KCN)形成氰基变性血红素，于特定波长条件下测量吸光质的氰化高铁血红素法等，上述方法仍有诸多缺点。

例如，采用光学仪器设备进行检测，由于需要大量检体，且检体样品在进行检测仪器检测前还需经过预处理，以免后续分析受吸光值的干扰等而影响检测结果。上述检测方法不仅费时、需要大量检体或非血液检体，另一方面，氰化高铁血红素的不稳定性，常影响准确性，而氰化钾的剧毒性则会造成健康危害问题。

电化学检测，特别是电化学检测片，由于其制造简单、价格低廉、使用广泛且携带方便等，已逐渐成为生化检测的重要方法。美国第7,138,041专利揭示一种利用电化学进行检测的感测试片，然而，该专利并未揭示如何改善电子传递物质的溶解特性，而直接用于血红素检测。

因此，仍需要一种利用电化学，使用少量检体即可快速且精确检测血红素的检测方法与检测试片

发明内容

本发明的主要目的是提供一种利用电化学方法检测血液或水溶液检体中血红素浓度的方法及检测试片。

本发明的另一目的是提供一种利用电化学方法快速地检测血液或水溶液检体中血红素浓度的方法及检测试片。

本发明的另一目的是提供一种利用电流与血红素浓度的反比关系检测检体中血红素浓度或血比容的方法及检测试片。

本发明的又一目的是提供一种利用电流与时间积分的电量值与血红素浓度的反比关系检测检体中血红素浓度或血比容的方法及检测试片。

为达到上述及其他目的，本发明提供一种利用电化学检测血红素或血比容的方法，包括(i)使检体与试剂接触，该试剂包括缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁等电子传递物；(ii)在定电位条件下，测量检体中血红素与电子传递物进行反应所产生的电流；以及(iii)根据所测量的电流换算检体中的血红素浓度。

本发明的检测方法是利用经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁作为电子传递物，在定电位条件下直接与检体中的血红素进行反应，利用电流或电流与时间积分的电量值与血红素浓度的反比关系，可以快速地检测血液或水溶液检体中的血红素浓度，或进一步用于计算血液检体的血比容。

本发明还提供一种用于检测血红素的试片，包括具有第一表面与相对第二表面的绝缘基材；形成于该绝缘基材第一表面的电极组，该电极组包括形成于该绝缘基材第一表面与阴极接头连接的工作电极，以及与阳极接头连接的参考电极；局部覆盖于该绝缘基材第一表面，且至少暴露出部分电极组形成电极反应区之间隔层；以及形成于该电极反应区的试剂层，该试剂层包括缓冲溶液、介面活性剂、及电子传递物质，其中，该电子传递物质是经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁。

附图说明

图1为显示本发明检测试片的第一具体实施例；

图2为显示本发明检测试片的第二具体实施例；

图3为显示本发明检测试片的第三具体实施例；

图4为显示本发明检测试片的第四具体实施例；

图5显示测试例2的结果；以及

图6显示测试例3的结果。

主要元件符号说明

100、200、300、400              检测试片

101、201、301、401              绝缘基材

101a、401a                      第一表面

101b、401b                      第二表面

102、202、302、402              电极组

102a、202a、302a                工作电极

102a’、202a’                  阴极接头

102b、202b、302b                参考电极

102b’、202b’                  阳极接头

103、203、303、403              间隔层

103a                            开孔

104、204、304、404              反应区

204’                           导电区

105、205、305、405              试剂层

203a、303a、403a                检体导流槽

206、306、406                   第二间隔层

206’、306’、406’             开孔

207、307、407                   上盖层

302’                           导电层

302c                            辅助电极

303b、403b                      排气沟槽

402’                           银胶导电层

402”                           碳胶

402”’                         银/氯化银胶

403’                 绝缘胶

404                   反应区

405                   试剂层

406                   第二间隔层

406’                 开孔

407                   上盖层

具体实施方式

本发明利用电化学检测血红素的方法，先使检体与至少包括缓冲溶液、介面活性剂及电子传递物的试剂接触。本发明的方法可使用血液检体或水溶液检体进行检测，该血液检体包括全血检体、血浆检体、或血清检体。在一具体实施例中，使用全血检体进行检测，全血检体与试剂接触后，试剂中的介面活性剂会与红血球作用，使红血球中的血红素释放出来。接着，在定电位条件下，释放出来的血红素会氧化试剂中的电子传递物，直接与电子传递物进行反应。

本发明方法所使用的试剂中，该缓冲溶液主要用于维持特定范围的pH值，通常用于维持4至9的pH值，较佳维持6至8的pH值。该缓冲溶液的实施例包括，但非限于磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、及柠檬酸盐缓冲溶液等。一般而言，缓冲溶剂的浓度介于10至1000毫摩尔，较佳介于30至200毫摩尔。

该试剂中的介面活性剂实施例包括，但非限于Tween-20、Tween-80、Triton X-100、Surfynol、及Mega8等。通常，该介面活性剂的浓度介于0.001％(w/v)至10％(w/v)，较佳介于0.1至5％(w/v)。本发明所使用的试剂中，可进一步含有湿润剂，例如纤维素、羟乙基纤维素、聚乙醇、聚乙烯醇、乙烯聚合物、吡咯烷酮、或明胶等。

本发明的方法是使用环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁作为电子传递物。该环状糊精的实施例包括，但非限于经1至6个碳原子的烷基取代、经1至6个碳原子的羟烷基取代、及/或经麦芽糖基取代、或未经取代的α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精或其水溶性改质衍生物。由于经改质的四硫富瓦烯在常温下亦具有优异的溶解性，在定电位条件下能直接与检体中的血红素进行氧化反应，通过测量反应所产生电流检测血红素。

在该具体实施例中，在介于0至1.5伏特范围内的定电位条件下，较佳介于0.3至1.2伏特范围内的定电位条件下，测量检体中血红素与电子传递物进行反应所产生的电流。根据血红素与改质的四硫富瓦烯电子传递物所产生的稳定态电流或电流与时间积分的电量值与检体中的血红素浓度之间的反比关系，通过测量改质四硫富瓦烯电子传递物的氧化反应稳定态电流或电流与时间积分的电量值即可换算检体中的血红素浓度或进一步计算血比容。

图1显示本发明用于检测血红素试片的第一具体实施例。在该具体实施例中，该检测试片100包括绝缘基材101，具有第一表面101a与相对第二表面101b；电极组102，包括形成于该绝缘基材第一表面101a与阴极接头102a’连接的工作电极102a，以及与阳极接头102b’连接的参考电极102b；局部覆盖于该绝缘基材第一表面101a的第一间隔层103，该第一间隔层103暴露出部分电极组102，形成电极反应区104；以及形成于该电极反应区的试剂层105，该试剂层包括缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁电子传递物质。

在该具体实施例中，使用绝缘基材作为检测试片的底板。该绝缘基材可为软性材料，例如绝缘性高分子材料；或刚性材料，例如陶瓷材料、玻璃、或玻璃纤维等。该绝缘基材的实例包括，但非限于聚碳酸酯、聚酯、聚醚、聚酰胺、聚胺酯、聚亚胺、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、玻璃、玻璃纤维、二氧化硅、二氧化铝等。一般而言，该绝缘基材底板的宽度通常介于3至15毫米的范围内，较佳介于5至10毫米的范围内；该基材底板的厚度通常介于50至800微米的范围内，较佳介于200至400微米的范围内；该基材底板的长度通常介于1至8厘米的范围内，较佳介于2至5厘米的范围内。

本发明的件测试片100中，该导电性材料，例如银胶，是利用网版印刷的方式形成于该绝缘基材的第一表面，形成导线区，用以连接电极与基材底板，刷上碳胶以及银/氯化银胶形成包括工作电极与参考电极的电极组。接着，在该形成有电极的绝缘基材第一表面粘设间隔层103，该间隔层具有一开孔103a，暴露出部分电极组，形成电极反应区104。含有缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯电子传递物质的试剂层105，则被设置于该电极反应区104，与检体接触后会使红血球中的血红素释放出来。在定电位条件下，释放出来的血红素会氧化试剂中的电子传递物，直接与试剂中的电子传递物进行氧化反应，产生电流。

在该具体实施例中，在介于0至1.5伏特范围内的定电位条件下，较佳介于0.3至1.2伏特范围内的定电位条件下，测量检体中血红素与电子传递物进行反应所产生的电流。根据血红素与改质的四硫富瓦烯电子传递物所产生的稳定态电流或电流与时间积分的电量值与检体中的血红素浓度之间的反比关系，通过测量改质四硫富瓦烯电子传递物与血红素进行氧化反应的稳定态电流或电流与时间积分的电量值，即可换算检体中的血红素浓度或进一步计算血比容。

图2为显示本发明用于检测血红素试片的第二具体实施例。在此具体实施例中，该检测试片200包括具有第一表面与相对第二表面的绝缘基材201；通过导电层202’形成于该绝缘基材第一表面的电极组202，该电极组包括与阴极接头202a’连接的工作电极202a以及与阳极接头202b’连接的参考电极202b；局部覆盖于该绝缘基材第一表面的间隔层203，该间隔层203除露出部分电极组202形成电极反应区204之外，同时暴露出阴极接头202a’与阳极接头202b’形成导电区204’；试剂层205设置于该电极反应区204，该试剂层205含有缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯电子传递物质；第二间隔层206设置于试剂层上；以及用以覆盖试片200的上盖层207。

于此具体实例中，该间隔层203对应反应区204部分形成有检体导流槽203a，允许检体通过毛细与虹吸作用填满电极反应区204，与试剂层205中的电子传递物质进行反应。该第二间隔层206对应反应区204部分则形成有开孔206’与上盖层207以及电极反应区204形成内部体积0.5至5微升的封闭空间，较佳形成内部体积0.5至4微升的封闭空间，更佳形成内部体积约1至2微升的封闭空间，该封闭空间可用以控制检体体积，具有检体填充定位以及防止污染的功能。

此外，根据检体流动方向设计电极分布，使检体在进入反应区时，工作电极最先与检体接触，辅助电极则最后与检体接触，当检体尚未填满两个电极时阻抗值无限大，检体填满两个电极时阻抗值急剧减小，运用电流、电位、或电阻值的监控，确认检体是否填满反应区的封闭空间。确定检体已确实填满反应区的封闭空间后，再进行分析。

图3为显示本发明用于检测血红素试片的第三具体实施例。在此具体实施例中，该检测试片300包括具有第一表面与相对第二表面的绝缘基材301；通过导电层302’形成于该绝缘基材第一表面的电极组302，包括工作电极302a、参考电极302b、与辅助电极302c；局部覆盖于该绝缘基材第一表面的间隔层303，该间隔层303露出部分电极组302形成电极反应区304；位于该电极反应区304的试剂层305，该试剂层305含有缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯电子传递物质；设置于试剂层305上的第二间隔层306；以及用以覆盖试片300的上盖层307。

在此具体实施例中，该间隔层303对应反应区304部分形成有检体导流槽303a以及排气沟槽303b，允许检体通过毛细与虹吸作用填满电极反应区304，与试剂层305中的电子传递物质进行反应。该第二间隔层306对应反应区304部分则形成有开孔306’与上盖层307以及电极反应区304形成封闭空间，该封闭空间可用以控制检体体积，具有检体填充定位以及防止污染的功能。

图4为显示本发明用于检测血红素试片的第四具体实施例。在此具体实施例中，该检测试片400系包括绝缘基材401，具有第一表面401a与相对第二表面401b；电极组402，该电极组包括依序形成于该绝缘基材第一表面401a的银胶导电层402’、碳胶402”与银/氯化银胶402”’所组成的工作电极与参考电极；通过绝缘胶403’局部覆盖于该绝缘基材第一表面的间隔层403，该间隔层403露出部分电极组402形成电极反应区404；位于该电极反应区404的试剂层405，该试剂层405含有缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯电子传递物质；设置于试剂层405上的第二间隔层406；以及用以覆盖试片400的上盖层407。

在此具体实例中，该间隔层403对应反应区404部分系形成有检体导流槽403a以及排气沟槽403b，允许检体通过毛细与虹吸作用填满电极反应区404，与试剂层405中的电子传递物质进行反应。该第二间隔层406对应反应区404部分则形成有开孔406’与上盖层407以及电极反应区404形成封闭空间，该封闭空间可用以控制检体体积，具有检体填充定位以及防止污染的功能。

本发明的检测试片仅需使用至少约0.5微升的少量检体，5至10秒的反应时间，即可快速且准确地检测血红素，或进一步计算血比容。

以下通过具体实施例进一步说明本发明的特点与功效，但并非用于限制本发明的范畴。

实施例

制备例1

将0.102克(0.5毫摩尔)的四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene，TTF)、2.555克(1.75毫摩尔)的羟丙基甲基-β-环状糊精、及10毫升的去离子水加入避光的深色容器内，在室温下搅拌过夜。然后，以6000转的转速离心10分钟，取上清液，获得包括50mM的TTF以及175mM的羟丙基甲基-β-环状糊精的电子传递物溶液。

制备例2

使用聚对苯二甲酸酯底板基材，利用网板印刷将导电银胶印制于基材表面，在60℃条件下干燥5分钟，形成导电银胶层。接着，利用网板印刷方式刷上碳胶，在60℃条件下干燥5分钟，形成工作电极；再利用网板印刷方式刷上银/氯化银胶，在60℃条件下干燥5分钟，形成参考电极。然后，刷上绝缘胶，在105℃条件下干燥5分钟，再贴上具有检体导流槽以及排气沟槽的间隔薄片。将5微升的反应试剂涂覆于检体导流槽，该反应试剂含有10mM的电子传递物溶液(制备例1)、2％的聚乙烯基吡咯烷酮、50mM的磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)、10-100mM的氯化钾、1％的Triton X-100、及0.5％的碳酸甲基纤维，在50℃的条件下干燥15分钟后，贴上第二间隔薄片，再用透明上盖片压合固着即为试片样品1。

制备例3

重复制备例2，将反应试剂中的电子传递物溶液改为5mM，即为试片样品2。

制备例4

重复制备例2，将反应试剂中的10mM电子传递物溶液(制备例1)改为5mM的四硫富瓦烯溶液，即为试片样品3。

测试例1

取新鲜静脉血，经离心重新调整为0至26.6g/dL不同血红素的检体样品，分别使用试片样品1进行测试。每次测试时，注入2微升的检体，使用电化学分析仪(CHInstrument Co.，Model 620A)在测试电位900毫伏的条件下进行试片样品测试，测试时间5秒钟，同时以参考仪器Sysmex K-800分析结果，结果如表1所示。

表1

 

血红素浓度(g/dL)	电流*(μA)
		0	50.4
33	45.4
		6.6	41.9
10.0	37.1
		133	32.7
16.6	26.5
		20.0	17.7
233	14.7
		26.6	11.8

^*n＝18

测试例2

取新鲜静脉血，经离心重新调整为0至26.6g/dL不同血红素的检体样品，分别使用试片样品2与试片样品3(比较例)进行测试。每次测试时，注入2微升的检体，使用电化学分析仪(CHInstrument Co.，Model620A)在测试电位900毫伏的条件下进行试片样品测试，测试时间5秒钟，同时以参考仪器Sysmex K-800分析结果，结果如图5所示。

根据图5结果显示，使用未经羟丙基甲基-β-环状糊精改质的四硫富瓦烯作为电子传递物的血红素试片无法顺利区别6.6至27g/dL的血红素浓度，而使用经羟丙基甲基-β-环状糊精改质的四硫富瓦烯作为电子传递物的血红素试片则有很高的电流信号与良好的检量性，显示使用环状糊精改质的四硫富瓦烯作为电子传递物，在血红素检测方面具有无法预期的增进功效。

测试例3

使用实施例1的试片样品，以虹吸的原理吸入不同体积静脉血检体，重复测试例1的步骤进行检测。如图6所示，本发明的试片确实具有控制检体体积的功效，注入2微升的大量检体进行检测，仍可测出正确血红素浓度。

Claims (11)

1、一种利用电化学检测血红素或血比容的方法，包括下列步骤：

使检体与试剂接触，该试剂包括缓冲溶液、介面活性剂、及经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁电子传递物；

在定电位条件下，测量检体中血红素与电子传递物进行反应所产生的电流；以及

根据所测量的电流换算检体中的血红素浓度。

2、根据权利要求1所述的方法，其中，该缓冲溶液用于使pH值维持在4至9的范围。

3、根据权利要求1所述的方法，其中，该环状糊精选自经过具有1至6个碳原子的烷基取代、经过具有1至6个碳原子的羟烷基取代、及/或经过麦芽糖基取代或未经取代的α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精及其改质衍生物所构成的组群。

4、根据权利要求1所述的方法，其中，该检体中血红素与电子传递物在介于0至1.5伏特的定电位条件下进行反应。

5、一种用于检测血红素的试片，包括：

绝缘基材，具有第一表面与相对第二表面；

电极组，包括形成于该绝缘基材第一表面与阴极接头连接的工作电极，以及与阳极接头连接的参考电极；

间隔层，局部覆盖于该绝缘基材第一表面，至少暴露出部分电极组，形成电极反应区；以及

试剂层，设置于该电极反应区，该试剂层包括缓冲溶液、介面活性剂、及电子传递物质，其中，该电子传递物质系经环状糊精改质的四硫富瓦烯或二甲基二茂铁。

6、根据权利要求5所述的试片，其中，该电极组还包括辅助电极。

7、根据权利要求5所述的方法，其中，该缓冲溶液用于使pH值维持在4至9的范围。

8、根据权利要求5所述的试片，其中，该环状糊精选自经过具有1至6个碳原子的烷基取代、经过具有1至6个碳原子的羟烷基取代、及/或经过麦芽糖基取代或未经取代的α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精及其改质衍生物所构成的组群。

9、根据权利要求5所述的试片，还包括设置于试剂层上的第二间隔层以及用以覆盖试片的上盖层，其中，该第二间隔层对应反应区部分形成有开孔与上盖层以及电极反应区形成内部体积0.5至5微升的封闭空间。

10、根据权利要求5所述的试片，其中，该第二间隔层形成有检体导流槽。

11、根据权利要求5所述的试片，其中，该第二间隔层形成有排气沟槽。

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