CN101401807A - 选择性jak3抑制剂ⅵ在抗病毒介导的急性肺损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了选择性JAK3抑制剂在抗SARS病毒介导的严重急性呼吸综合征中的应用。通过揭示SARS冠状病毒驱动炎症因子反应所依赖的核心信号转导分子机制，发现并鉴定出关键分子药物靶点为JAK3，从而提供一种选择性JAK3抑制剂VI的新用途，该产品具有显著抗炎效应而无激素的多向毒副反应，由于其选择性强以及分子靶点明确的特点，在抗炎的同时不影响免疫系统发挥正常抗病毒效应；并通过抑制趋化因子反应显著减轻了病毒介导的对免疫系统的损伤，有助于宿主免疫细胞及时产生中和抗体，发挥最直接的抗病毒作用。

Description

选择性JAK3抑制剂VI在抗病毒介导的急性肺损伤中的应用

技术领域

本发明涉及一种选择性JAK3抑制剂VI的新应用，尤其是涉及一种选择性JAK3抑制剂在抗SARS病毒介导的严重急性呼吸综合征中的应用。

背景技术

呼吸系统传染病的传播速度快，流行面广，常呈突发表现，已危及人类生命健康。新近资料显示呼吸道疾病中约有50％由病毒引起，而这些病毒侵犯机体都会导致免疫损伤，引发重症肺炎。其中的典型例子为SARS冠状病毒，它导致的临床后果以重症肺炎为主，进一步导致全身多器官功能衰竭，使患者在较短时间内死亡。临床病理和动物试验表明，SARS冠状病毒感染的靶部位主要是下呼吸道，损伤肺泡上皮细胞以及毛细血管内皮细胞，引起呼吸窘迫综合症(ARDS)的病理生理改变，导致极为凶险的临床过程，是严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)致死的主要原因。

现有的文献报道，弥漫性肺损伤是感染SARS-CoV病毒患者主要的病理特征，是引起病人死亡的主要原因，病毒诱导的细胞因子/趋化因子级链式反应是引起急性肺损伤的主要病理机制。目前，针对SARS冠状病毒导致的急性肺损伤，尚没有特效的治疗药物，临床上多采用糖皮质激素(如：地塞米松)进行治疗，可在一定程度上减轻炎症、缓解症状，但激素治疗的同时也抑制了机体的免疫系统从而影响病毒的清除，并可促进条件致病菌的继发感染，因此，其疗效仍不稳定。

Jak3全称为酪氨酸激酶，是免疫反应细胞信号传导的一个关键的分子，抑制该酶的活性将可避免对其他组织损伤所导致的毒副作用。目前，Jak3抑制剂的研究方兴未艾，已发现了许多有临床应用前景的化合物，根据Jak3抑制剂的化学结构不同可分为很多类型，也有很多代不同的产品，每种化学结构都不一样，具有不同的生物学功能，其对JAK3抑制的特异性也不甚相同，如：

①苯烯酰氨衍生物AG-490，该类化合物主要是Jak2特异性制剂，因抑制Jak2和其下游的Cdk2而具有抑制淋巴细胞分化的能力，随后的研究发现该化合物还能抑制Jak3和其下游Stat5a/b的磷酸化，并能拮抗IL-2对淋巴细胞的活化和增殖作用；

②WHI系列化合物(WHIP154、WHIP131)，这类化合物在酶联免疫(ELISA)试验、Jak3依赖的细胞系(如DAUDI，RAMOS，MOLT-3和HL-60)和Jak3非依赖的细胞系(如BT-20、24-MET等)的细胞毒试验中显示对Jak3激酶有一定的的抑制作用；

③吡咯并嘧啶衍生物(CP352664、CP690550)，该化合物的结构与二级信使的结构非常相似，所以有科学家推测可能为ATP的拮抗剂，通过结构优化使得该类化合物的结构与ATP的结构相似性有所增加，对Jak3选择性增强；

④选择性JAK3抑制剂的第六代制剂(CALBIOCHEM Cat.No.420126)，简称选择性JAK3抑制剂VI(JAK3 Inhibitor VI)，它是在分析其他激酶催化活性位点的基础上，根据JAK3激酶结构进行基于结构的药物设计得到的第六代制剂，因此其对JAK3的选择性强且分子靶点明确，具有更专一的JAK3选择性(半数有效抑制浓度IC50为27nM)，它同时具有抑制JAK3/STAT5(Signal transducers and activators of transcription信号传导及转录激活因子)的效果。研究报道：该药能够抑制IL-2介导的JAK3激酶活性及磷酸化，抑制STAT5激活；但未报道其可用于抗SARS病毒介导的急性肺损伤的治疗。

根据既往药物开发报告表明，Jak3和其同家族的Jak2激酶具有非常高的同源性，结构和功能度非常类似，因此，前述①～③的Jak3抑制剂虽然都具有Jak3抑制作用，但是其对JAK3的选择性不强，均存在抑制Jak2的副作用，可能会导致造血系统功能障碍，如血小板减少、白血球减少、贫血等，使药物带来较大的副作用。

发明内容

本发明的目的在于通过揭示SARS冠状病毒驱动炎症因子反应所依赖的核心信号转导分子机制，发现并鉴定出关键分子药物靶点为JAK3，从而提供一种JAK3特异性抑制剂的新用途，即选择性JAK3抑制剂VI在制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的严重急性呼吸综合征药物中的应用。

本发明的另一个目的是采用选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的弥漫性肺损伤药物中的应用。

本发明还涉及选择性JAK3抑制剂VI在制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的急性弥漫性肺损伤药物中的应用。

本发明还涉及选择性JAK3抑制剂VI在制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的免疫系统损伤药物中的应用。

本发明采用选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱发的急性肺损伤药物中的应用是基于本发明人以下的研究成果：

本发明人前期通过对SARS病人发病早、中(进展期)、晚(终末期)和恢复期的血及肺与淋巴组织中的细胞因子表达谱进行动态分析，发现在SARS病人循环血及肺内SARS-CoV感染诱导的gamma-干扰素可诱导的10KDa蛋白(Interferon-gammainducible protein 10，IP-10)的释放，是免疫介导的急性肺损伤与淋巴细胞死亡发生的一个至关重要的事件，而免疫系统的免疫病理损伤导致的继发感染是SARS造成死亡的重要原因(Am J Respir Crit Care Med.2005Apr 15；171(8)：850-7.)。但是，发明人进一步的研究发现，所述gamma-干扰素可诱导的趋化因子高表达，其gamma-干扰素的水平却并不增高。从这一临床表象入手，本发明人应用信号通路发现者芯片、凝胶迁移实验、液相芯片、Western blot、免疫组化、免疫荧光等技术深入研究，获得以下的结果：

1.在细胞水平

(1)通过免疫印记及EMSA检测了IFN-γ和SARS冠状病毒重组S蛋白刺激的原代培养的脐静脉内皮细胞和支气管上皮细胞株16HBE十八条关键信号通路相关基因的表达，比较在gamma-干扰素与SARS-CoV S蛋白分别刺激下对肺上皮细胞信号通路激活的影响，发现SARS冠状病毒S蛋白与IFN-γ诱导了类似的基因表达谱，其突出的特点是IFN-γ特征性激活的JAK-STAT信号通路的标志性基因IRF-1在S蛋白刺激4小时即有明显升高，至12小时仍保持较高表达水平，这证实：

与IFN-γ的刺激相同，S蛋白诱导了JAK/STAT家族成员STAT1及JAK2的磷酸化，产生IP-10和IRF-1，但这种诱导并不依赖于IFN-γ。其调控IRF-1基因转录与IFN-γ刺激下的转录激活分子机制相同；然而在上游激活的其它JAK家族成员中，IFN-γ激活JAK1而S蛋白为JAK3，导致了激活IP-10基因启动子IFN-γ刺激反应元件的新转录复合物形成，以STAT5为标志的STAT1/STAT5/IRF-1转录复合体是其特征。

经上述筛选，初步推测SARS冠状病毒通过其表面结构蛋白S蛋白与宿主细胞膜相应受体结合，模拟gamma-干扰素激活了相同的JAK-STAT信号通路。SARS冠状病毒通过利用宿主抗感染天然免疫反应的保守信号通路，激活了与gamma-干扰素可诱导的JAK/STAT信号通路有重叠但又不完全一致的JAK2/JAK3-STAT1/STAT5/IRF-1信号转导，启动了以IP-10为代表gamma-干扰素可诱导的细胞因子/趋化因子炎症反应。

(2)应用JAK总、JAK2、JAK3以及STAT1信号分子靶向抑制剂鉴定证实：JAK3是SARS冠状病毒S蛋白介导以IP-10为代表的免疫炎症反应所依赖的上述核心信号转导通路的关键信号靶点，选择性JAK3抑制剂VI能够特异性阻断S蛋白诱导的IP-10表达。

2.在整体水平

(1)采纳JAK3基因敲除小鼠及活病毒，进一步证实缺失JAK3具有对病毒介导的急性肺损伤的保护作用，其主要机制是减少了病毒诱导下的STAT1/STAT5的磷酸化激活，钝化了IP-10的诱导。

(2)验证了选择性JAK3抑制剂VI能够有效防治重组S蛋白或活病毒导致的实验小鼠急性肺损伤，提高存活率，抗损伤的疗效与其下调IP-10诱导的信号转导分子机制完全一致。

表明SARS-CoV激活了一条类似gamma-干扰素诱导的、但又不完全一样的JAK/STAT信号通路，即SARS-CoV通过激活JAK2/JAK3一STAT1/STAT5/IRF-1信号转导产生以IP-10为代表的gamma-干扰素可诱导的细胞因子/趋化因子瀑布，导致了弥漫性肺损伤及免疫系统损伤，JAK3则是病毒介导炎症反应依赖的这一信号通路的特异性关键靶点，并验证了已有的选择性JAK3抑制剂VI具有防治SARS冠状病毒相关急性肺损伤的新用途，它可成为有效控制病毒介导的免疫炎性损伤的选择性靶向小分子广谱抗炎制剂，能够显著减轻SARS-CoV S蛋白及活病毒诱导的急性肺损伤及免疫系统损伤，提高存活率。与现有技术相比，它具有显著抗炎效应而无激素的多向毒副反应，由于其选择性强以及分子靶点明确的特点，在抗炎的同时不影响免疫系统发挥正常抗病毒效应；并通过抑制趋化因子反应显著减轻了病毒介导的对免疫系统的损伤，有助于宿主免疫细胞及时产生中和抗体，发挥最直接的抗病毒作用。

所述的选择性JAK3抑制剂VI的治疗有效量是为个体给药后产生抑制JAK3活性作用的剂量。而给予个体单剂或多剂量时，给药剂量根据多种因素而不同，包括选择性JAK3抑制剂的药代动力学性质、给药途径、患者情况何特性(性别、年龄、体重、健康情况、体型)、症状程度、并存的治疗、治疗频率和期望的效果。

通常情况下，所述的选择性JAK3抑制剂VI单独用药即可达到治疗的效果。所述的选择性JAK3抑制剂VI对于个体的活性成分的每日剂量为每公斤体重3～30mg/kg。一般每日每公斤体重5-10mg/kg，就可达到显著减轻SARS-CoV S蛋白及活病毒诱导的急性肺损伤及免疫系统损伤，提高存活率的期望的有效治疗效果。

所述的选择性JAK3特异性抑制剂VI可由多种途径进行个体给药，给药途径包括口服、静脉注射等。

附图说明

图1是RT-PCR和LiquiChip方法检测JAK-STAT通路抑制剂对于S蛋白或IFN-γ处理的16HBE细胞IP-10表达的影响

A：RT-PCR方法检测JAK-STAT通路抑制剂对于S蛋白处理的16HBE细胞IP-10表达的影响；

B：RT-PCR方法检测JAK-STAT通路抑制剂对于IFN-γ处理的16HBE细胞IP-10表达的影响；

C：LiquiChip方法检测JAK-STAT通路抑制剂对于S蛋白处理的16HBE细胞IP-10表达的影响；

D：LiquiChip方法检测JAK-STAT通路抑制剂对于IFN-γ处理的16HBE细胞IP-10表达的影响。

图2是经S蛋白或S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理的小鼠生存曲线分析

A：Kaplan-Meier生存分析S蛋白或S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理的BALB/c小鼠的生存率；

B：Kaplan-Meier生存分析SARS-CoV或SARS-CoV加选择性JAK3抑制剂VI处理的C57B6小鼠的生存率。

图3是S蛋白或S蛋白加JAK3抑制剂处理组小鼠肺组织HE染色

A：尾静脉注射PBS组小鼠肺组织HE染色结果；

B：S蛋白处理组小鼠肺组织HE染色结果；

C：S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理小鼠肺组织H&E染色结果。

图4是SARS-CoV蛋白或SARS-CoV蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理组小鼠肺组织HE染色

A：尾静脉注射PBS组小鼠肺组织HE染色结果；

B：S蛋白处理组小鼠肺组织HE染色结果；

C：S蛋白加JAK3抑制剂处理小鼠肺组织H&E染色结果。

图5是S蛋白或S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色

A：尾静脉注射PBS组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果；

B：S蛋白处理组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果；

C：S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果。

图6是SARS-CoV蛋白或SARS-CoV蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色

A：尾静脉注射PBS组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果；

B：S蛋白处理组小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果；

C：S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI处理小鼠肺组织IP-10免疫荧光染色结果。

图7是JAK3+/+对照小鼠(A、B)与JAK3-/-基因敲除小鼠(C、D)分别经气管内滴注生理盐水(A、C)或气管内滴注SARS病毒(B、D)处理后肺组织HE染色。

图8是JAK3+/+对照小鼠(A、B)与JAK3-/-基因敲除小鼠(C、D)分别经气管内滴注生理盐水(A、C)或气管内滴注SARS病毒(B、D)处理后肺组织IP-10表达的免疫荧光检测。

图9是小鼠脾脏病理改变(×400)BALB/c小鼠分别经尾静脉注射PBS(D、J)、S蛋白(E、K)及S蛋白+JAK3Inhibitor VI(F、L)后肾脏病理切片分别进行羊抗小鼠IP-10抗体(D-F)和兔抗小鼠CD68抗体(J-L)免疫组织化学染色。注射S蛋白组小鼠脾脏淋巴细胞减少，生发中心局部有结构破坏、有空泡样改变，单核巨噬细胞IP-10的表达显著增加(E)，白髓CD68+单核巨噬细胞明显浸润、增多、聚集(K)。S蛋白加入JAK3抑制剂组较同样剂量的S蛋白组病理有所减轻(F、L)。箭头所指为阳染细胞。

图10是小鼠脾脏淋巴流式细胞检测结果

A：小鼠脾脏淋巴细胞凋亡检测，右下象限为AnnexinV阳染细胞，PBS组、S蛋白组及S蛋白加JAK3抑制剂组比例分别是4.1％、9.5％、8.3％。

B：小鼠脾脏CD3+、CD4+淋巴细胞亚群检测，右上象限为CD3+、CD4+阳染细胞，PBS组、S蛋白组及S蛋白加选择性JAK3抑制剂VI组比例分别是14.8％、9.4％、12.8％。

具体实施方式

以下通过实施例进行说明选择性JAK3抑制剂在医药领域中的新用途，但是以下实施例仅用于说明本发明的目的，并不限制本发明的保护范围。

实施例一：选择性JAK3抑制剂VI对人支气管上皮细胞IP-10的抑制作用

材料及方法：

主要实验材料

1、sf9昆虫细胞、sf-900 II SFM昆虫细胞培养基：美国invitrogen公司

2、人支气管上皮细胞株16HBE：由英国南安普顿(Southampton)大学Steven.Holgate教授惠赠。

3、蛋白纯化试剂盒MagneHis^TM Protein Purification System：Promega公司

4、Super Script^TMIII Reverse Transcripase试剂盒  invitrogen公司

5、选择性JAK3Inhibitor VI(选择性JAK3抑制剂VI)(Cat.No.420126；C₁₈H₁₃N₃O·MeSO₃H)美国calbiochem公司

实验方法

1、采用昆虫-杆状病毒表达系统表达SARS-COV全长重组S蛋白，并经镍亲和磁珠法纯化。将SARS冠状病毒S蛋白的全长cDNA从pEE-14b/S质粒中亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac^TM1上，将构建成功的pFastBac^TM1/S质粒转化DH10BAC感受态细胞，经同源重组将目的基因S cDNA插入到Bacmid DNA中，鉴定正确后转染Sf9昆虫细胞，表达并纯化目的蛋白，并利用抗SARS病毒人血清行western blot分析S蛋白表达是否正确。

2、气道上皮细胞16HBE的培养：

细胞常规培养于含10％胎牛血清的MEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔2天换液一次；待细胞长至基本汇合状态时以0.25％胰蛋白酶消化按照1∶3数量比传代，分别根据实验需要种于培养板中。

3、RT-PCR检测

细胞分组：将16HBE分成两组，接种于6孔培养板，待细胞长满后分别加入S蛋白(40ug/ml)或IFN-γ(500U/ml)，然后分别于加入S蛋白或IFN-γ后0min、30min、1h、2h、4h和6h提取RNA。

同上，将16HBE分成两组，接种于6孔培养板，待细胞长满后分别加入S蛋白(40ug/ml)或S蛋白和选择性JAK3 Inhibitor VI的混合液(760nM/L)，在刺激4h后提取RNA，然后以IP-10引物进行RT-PCR检测。

人IP-10引物：正义链序列：5’-AGGAACCTCCAGTCTCAGCA

反义链序列：5’-GGCAGTGGAAGTCCATGAAG

人GAPDH引物：正义链序列：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′

反义链序列：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′

反应体系：(50ul)

10×PCR Buffer        5ul

2.5mM dNTPmix         4ul

上游引物(10um)        1ul

下游引物(10um)        1ul

Exq酶(5U/ul)          0.25ul

cDNA第一链            2ul

ddH2O                 36.75ul

吹打→94℃×2min变性

反应条件：

94℃×30sec→55℃×50sec→72℃×1min共30个循环

试验结果：S蛋白(40ug/ml)和IFN-γ(500U/ml)刺激16HBE细胞后均诱导了IRF-1和IP-10基因的表达，并随时间延长表达水平有增强的趋势(图1A)，S蛋白介导的IP-10和IRF-1的表达不依赖于IFN-γ。S蛋白刺激组加入STAT1及JAK2、JAK3、JAK总抑制剂作用于16HBE细胞后可以完全阻断IP-10基因水平的表达；而IFN-γ作用于16HBE后IP-10的表达可以被STAT1及JAK2、JAK总抑制剂阻断，而不能被JAK3抑制剂阻断(图1B)。

结论：JAK3是S蛋白诱导IP-10表达的信号通路分子的关键靶标。

实施例二：选择性JAK3抑制剂VI可显著降低S蛋白或有活性的SARS-CoV处理的小鼠的死亡率

一、主要材料与试剂

1、SARS-CoV毒株：PUMC-01株，分离自中国北京协和医院SARS病人，在Vero细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒，病毒TCID₅₀为10⁵～10⁶pfu/ml。

2、动物：20只SPF级C57BL/6J小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。6只B6129S4-Jak3^tm1Ljb小鼠[JAK3(-/-)]，6只B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]，购自美国Jackson实验室。

3、乙醚                       北京化学试剂公司

4、中性甲醛                   Sigma公司

5、戊巴比妥钠                 广州化学试剂二厂

6、苏木素                     广州化学试剂二厂

7、伊红                       广州化学试剂二厂

8、选择性JAK3 Inhibitor VI(JAK3抑制剂VI)(Cat.No.420126；C₁₈H₁₃N₃O·MeSO₃H)美国calbiochem公司

二、主要仪器

1、Citadel 1000组织脱水机     英国Shandon公司

2、BM-II水浴式生物组织包埋机  深圳新安毅达电子厂

3、光学显微镜                 日本Olympus公司

4、数码摄影一体化系统         日本Nikon公司

5、荧光倒置显微镜             德国Leica公司

6、微量移液器                 德国Eppendorf公司

三、实验方法

1、实验动物分组及模型制作：

1)S蛋白处理小鼠

健康C57小鼠20只，随机分为PBS对照组、S蛋白组和JAK3抑制剂组三组。将小鼠置入尾静脉注射专用的笼子，37℃温水浸泡小鼠尾部1min使血管扩张，75％酒精擦拭消毒尾静脉，4.5号头皮针刺入尾静脉见有回血则进行尾静脉注射。PBS对照组注射300μl PBS，S蛋白组将120μg S蛋白稀释于PBS中总体积300μl给小鼠进行尾静脉注射，JAK3抑制剂组将120μg S蛋白与选择性JAK3抑制剂VI(760nmol/L)混合稀释于PBS中总体积300μl给小鼠进行尾静脉注射。

2)SARS病毒感染小鼠：

实验在中国医学科学院实验动物研究所P3实验室生物安全柜中进行。第一天进行预实验：3只C57BL/6J小鼠分别气管内滴注20μl、30μl、50μl 10⁵TCID₅₀的SARS-CoV，小鼠感染病毒后留在P3实验室生物安全柜24h观察其生存状态，以确定下一步实验攻毒剂量。第二天12只C57BL/6J小鼠分三组，每组四只，第一组给生理盐水对照、第二组腹腔注射100μl生理盐水，每只小鼠再气管内滴注约40μl病毒、第三组先腹腔注射选择性JAK3抑制剂VI(约10mg/kg，稀释在100μl生理盐水中)，然后在小鼠气管内滴注约40μl病毒。6只B6129S4-Jak3^tm1Ljb和6只B6129SF2/J小鼠各自分成两组分别气管内滴注生理盐水和40μl病毒。以上小鼠感染病毒后留在P3实验室生物安全柜观察10小时后处死。

2、临床生存状态观察：所有处理过的小鼠观察其有无咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存及死亡时间进行详细记录。

实验结果：

空白对照组无异常表现，存活率100％。S蛋白组均出现呼吸急促，于注射后72h内不等时间死亡6只，存活2只，存活率25％(2/8)；抑制剂组同样出现呼吸急促，72h内2只死亡，6只存活，存活率75％(6/8)；但存活小鼠仍有呼吸系统症状，活动减少。Kaplan-Meier生存曲线分析显示S蛋白组与抑制剂组生存率有显著差异(P＝0.0206)(图2A)。

12只C57BL/6J小鼠分三组分别进行处理，结果气管滴注生理盐水组4只小鼠一般情况好；气管内滴注病毒组4只小鼠在滴注后均出现呼吸困难的表现，10h内死亡2只，其余2只仍有呼吸急促、活动减少、耸毛等表现；腹腔注射选择性JAK3抑制剂VI组4只小鼠在气管滴注病毒后也出现呼吸困难的表现，10h内全部存活。

3只JAK3+/+对照小鼠和3只JAK3-/-基因敲除小鼠气管滴注生理盐水手术中及手术后一般情况良好；3只JAK3+/+对照小鼠气管滴注SARS-CoV后均出现呼吸急促的表现，10h内死亡2只，其余1只活动减少；3只JAK3-/-基因敲除小鼠气管滴注SARS-CoV感染后10h内全部存活，其中1只有呼吸急促的表现，其余2只一般情况良好。

Kaplan-Meier生存曲线分析显示SARS-CoV感染组小鼠与抑制剂组小鼠生存率有显著差异(P＝0.0221)。(图2B)

实施例三：选择性JAK3抑制剂VI可明显减轻S蛋白或有活性的SARS-CoV介导的急性肺损伤

主要实验材料(同实施例二)

实验方法

1、实验动物分组及模型制作：(同实施例二)

2、小鼠组织病理学研究：肺组织常规病理学切片处理，进行HE染色，显微镜下观察。

病理标本的制备如下：

72h内小鼠摘眼球放血处死动物，称取小鼠全肺湿重，取右下肺组织置于4％的多聚甲醛固定。

1)脱水：70％乙醇2h→80％乙醇1h→95％乙醇1h→95％乙醇1h→无水乙醇2h→无水乙醇1.5h→无水乙醇1.5h

2)透明：二甲苯0.5h→二甲苯1h→二甲苯0.5h

3)浸蜡：低温(50℃)浸蜡1h→浸蜡1h

4)包埋：浸蜡后的组织放入60℃石蜡中包埋

5)切片：4um连续切片

6)摊片：49℃温水中摊片

7)烘片：55℃烘20min

8)透明和水化：

二甲苯10min→二甲苯10min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→95％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→流水冲洗10min

9)HE染色：

苏木素染色1min→流水冲洗1min→1％盐酸酒精脱色10sec→流水冲洗10min→伊红染色10sec→流水冲洗10min→55℃烘20min→中性树胶封片

实验结果：

1)小鼠分别经PBS、S蛋白及S蛋白+选择性JAK3抑制剂VI处理后肺脏病理改变

PBS对照组肺组织结构表现正常(图3A)。S蛋白组小鼠肺泡间隔增宽，间质可见有淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润，毛细血管充血；高倍镜下还可见有细支气管上皮的脱落，血管内皮细胞肿胀(图3B)；而尾静脉注射S蛋白加入选择性JAK3抑制剂VI组较同样剂量的S蛋白组病理表现有所减轻(图3C)。

2)小鼠分别经PBS、SARS病毒及SARS病毒+选择性JAK3抑制剂VI处理后肺脏病理改变。

C57BL/6J小鼠分别进行腹腔注射生理盐水+气管内滴注生理盐水、或腹腔注射生理盐水+气管内滴注SARS病毒、以及先腹腔注射生理盐水+气管内滴注SARS病毒后肺组织的HE染色显示：气管滴注生理盐水组结构表现正常(图4A)；SARS-CoV处理组呈现明显的免疫炎症损伤，包括肺泡上皮的脱落，肺泡间隔增宽，大量淋巴、单核巨噬细胞浸润，毛细血管充血以及肺泡腔渗出(图4B)；腹腔注射选择性JAK3抑制剂VI组较单独气管内滴注病毒相比较肺部炎症反应明显减轻(图4C)。

实施例四：靶向性抑制JAK3显著下调了S蛋白或有活性的SARS-CoV介导的IP-10表达

主要实验材料(同实施例二)

实验方法

1、实验动物分组及模型制作：(同实施例二)

2、免疫荧光检测小鼠肺组织IP-10的表达：肺组织常规病理学切片处理(方法同实例三)，进行免疫组织化学和免疫荧光检测。免疫荧光简单步骤：石蜡切片常规脱蜡，水化，抗原修复，用含0.01％Tween-20的0.05mol/L TBS缓冲液(pH7.5)洗二次，每次5min；置3％BSA湿盒中常温封闭30min，加稀释好的一抗(山羊抗小鼠IP-10单克隆抗体)，4℃过夜；TBS洗三次，每次5min；加入荧光二抗(FITC标记的兔抗山羊IgG)，室温下湿盒中避光孵育45min，DAPI复染，80％的甘油封片，盖上盖玻片荧光显微镜下观察。

实验结果：

1.小鼠分别经尾静脉注射PBS(图5A)S蛋白(图5B)及S蛋白+选择性JAK3抑制剂VI(图5C)后肺脏病理切片经IP-10的免疫荧光检测

免疫荧光染色显示小鼠肺部细支气管的上皮细胞和血管内皮细胞都有IP-10的显著阳性表达；而尾静脉注射S蛋白加入选择性JAK3抑制剂VI组较同样剂量的S蛋白组病理表现有所减轻，肺组织IP-10表达明显受抑制。

2.C57BL/6J小鼠分别进行腹腔注射生理盐水+气管内滴注生理盐水(图6A)、或腹腔注射生理盐水+气管内滴注SARS病毒(图6B)、以及先腹腔注射生理盐水+气管内滴注SARS病毒(图6C)后肺组织经IP-10的免疫荧光检测。

免疫荧光检测肺组织IP-10表达发现：C57BL/6J小鼠气管滴注生理盐水后一般情况好，肺组织结构表现正常；C57BL/6J小鼠气管内滴注病毒后IP-10表达呈强阳性；C57BL/6J小鼠腹腔注射选择性JAK3抑制剂VI较单独气管内滴注病毒相比较IP-10表达明显降低。

实施例五：选择性JAK3抑制剂VI对SARS-CoVS蛋白介导的免疫系统损伤治疗有效

主要试剂与材料

1、小鼠IP-10蛋白             Biosource公司

2、BABL/C小鼠(七周)          中山大学实验动物中心提供

3、山羊抗小鼠IP-10抗体       SantoCruzBiotech公司

4、FITC标记的兔抗山羊抗体    中杉金桥公司

5、多聚甲醛                  Sigma公司

6、戊巴比妥钠                广州化学试剂二厂

7、苏木素                    广州化学试剂二厂

8、伊红                      广州化学试剂二厂

9、选择性JAK3Inhibitor VI(JAK3抑制剂VI)(Cat.No.420126；C₁₈H₁₃N₃O·MeSO₃H)美国calbiochem公司

二、实验方法：

1、实验动物分组及模型制作：(同实例二)

2、免疫组织化学(同实例四)

3、流式细胞分析

1)小鼠脾脏淋巴细胞的提取在小鼠尾静脉注射的第3天将小鼠摘眼球放血处死，解剖分离脾脏。无菌培养皿内预置5ml RPM1640培养基，将分离出的脾脏放置于内，眼科弯镊钝端在脾脏一端轻轻研磨，然后逐渐向脾脏的另外一端研磨，直至把整个脾脏研磨成末状，将培养皿内的脾脏悬液用200目不锈钢网过滤，取滤液再用400目不锈钢网过滤，制备成脾脏单细胞悬液，用Tris-NH4Cl溶液去除脾细胞悬液中的红细胞，用10％FCS的RPM1640培养基终止，1500rpm离心5min，重悬后计数。

2)脾脏淋巴凋亡检测调整细胞浓度为1×10⁶个，用冷PBS洗1次后置0℃水浴中，加结合缓冲液，轻轻混匀细胞先后加入5ul FITC-AnnexinV和5ul PI，室温各反应10min后，上流式细胞仪检测。

3)脾脏淋巴细胞CD3+、CD4+亚群的检测调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml。用含PBS洗1次后，调细胞悬液至100ul。分别加CD3、CD4单抗及各自同型对照5ul，室温反应20min后加PBS 5ml，上流式细胞仪检测。

实验结果：

1、脾脏病理改变PBS组脾脏结构表现正常，尾静脉注射S蛋白后小鼠脾脏有肿胀，生发中心局部有结构破坏、有空泡样改变，淋巴细胞减少，血管单核巨噬细胞和内皮细胞IP-10的表达显著增加，免疫组织化学染色显示白髓CD68染色阳性单核巨噬细胞明显浸润、增多、聚集。JAK3抑制剂组较同样剂量的S蛋白组病理有所减轻，脾脏血管内皮细胞IP-10表达明显减少。[图9]

2、流式细胞检测结果AnnexinV检测S蛋白组小鼠脾细胞的阳性表达为9.5％，与PBS空白对照组6.1％比较，凋亡率均显著升高，JAK3抑制剂组小鼠脾T细胞的AnnexinV阳性细胞为8.3％，较S蛋白组显著降低(P＜0.05)。脾脏淋巴细胞CD4+亚群分析S蛋白组CD4+细胞为9.4％，较PBS空白对照组14.8％显著降低，JAK3抑制剂组CD4+T细胞12.8％较S蛋白组有显著增加，结果有显著性差异。(P＜0.05)[图10]

Claims (5)

1、一种选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的急性肺损伤药物中的应用。

2、一种选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的弥漫性肺损伤药物中的应用。

3、一种选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的急性弥漫性肺损伤药物中的应用。

4、一种选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的严重急性呼吸综合征药物中的应用。

5、一种选择性JAK3抑制剂VI作为制备治疗和/或预防SARS冠状病毒诱导的免疫系统损伤药物中的应用。

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