CN101398426A - 金鱼卵黄原蛋白酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和应用。制备时，首先制备金鱼卵黄原蛋白纯品；其次制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；再制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；然后将金鱼卵黄原蛋白纯品、兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体、鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体各1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒。本发明的试剂盒可以应用到内分泌扰乱化学物质的调查中，能够灵敏、准确、方便的定量检测金鱼血液中、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白。

Description

金鱼卵黄原蛋白酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

目前大量的污染物进入水环境中，造成了严重的水环境污染问题。这些化学物质对野生生物造成了严重的危害；更重要的是，这些化学物质能够随着食物链进入人类的食物系统，严重危害人类的健康。越来越多的研究表明，野生生物生殖能力的降低、鱼类的雌性化、人类癌症的增加及精子数量和质量的降低都与内分泌扰乱化学物质的暴露密切相关。这一类能够扰乱人类及野生生物内分泌系统的污染物统称为内分泌扰乱化学物质，能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢，以及激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物的内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至对生物生殖功能也能产生危害。所以需要开发筛选和检测内分泌扰乱化学物质的试剂盒，并借助试剂盒开展实验室研究、野外调查和内分泌扰乱化学物质的生态安全风险评价。

鱼类卵黄原蛋白(Vitellogenin，VTG)是卵黄蛋白的前体，是一种大分子量的脂磷聚糖蛋白(Glycolipophosphoprotein)。卵黄形成期，在雌激素的刺激下卵黄原蛋白由肝脏合成，并通过血液运输到卵巢中，被卵巢吸收；在卵巢内，卵黄原蛋白裂解成为两种卵黄蛋白：卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin)和卵黄高磷蛋白(Phosvitin)，这两种蛋白贮存在卵中，作为胚胎发育的营养源。卵黄原蛋白是雌鱼的特异性蛋白，只能在雌鱼卵黄形成期检测到。但是由于雄鱼的肝脏中也有卵黄原蛋白基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏合成和分泌卵黄原蛋白。除内源雌激素外，某些具有环境雌激素活性的内分泌扰乱化学物质，即使在低浓度也能诱导雄鱼卵黄原蛋白的产生，起到类似于内源雌激素的作用。因而，卵黄原蛋白是内分泌扰乱化学物质筛选和检测的理想生物标志物。此外卵黄原蛋白还可以用于鉴定鱼类个体的性别和雌鱼的性成熟期。

目前国内外已建立了几种硬骨鱼类卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒和放射性免疫试剂盒，但是由于鱼类卵黄原蛋白具有较强的种间特异性和鱼类地理分布的差异，因此需要针对在我国广泛分布的本土鱼类的卵黄原蛋白，制备有关的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和应用，它能满足现有技术的上述需求。

一种检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒，包括一个盒体，空白96孔酶标板1块，阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、金鱼卵黄原蛋白纯品1支。

上述检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒的制备方法，其特征在于由下述步骤组成：1)制备金鱼卵黄原蛋白纯品；2)制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；3)制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；4)将步骤1)中得到的金鱼卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)中得到的兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支和步骤3)中得到的鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支放到盒体内，得到检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒。

上述检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒在内分泌扰乱化学物质调查中的应用。

本发明的检测试剂盒根据双抗体夹心酶联免疫吸附法的检测原理，可灵敏、准确、方便地检测金鱼卵黄原蛋白，其最低检测限为0.2ng mL^-1，线性工作范围为2ngmL^-1—300ng mL^-1，比现有试剂盒的检测限更低，线性工作范围更广，为内分泌扰乱化学物质筛选、检测和生态环境风险评价提供了一种有效手段。

具体实施方式

制备检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒时分为以下步骤：

(1)制备金鱼卵黄原蛋白纯品

将10mg17β-雌二醇(17β-estradiol，E₂)溶于0.5mL无水乙醇，再加入0.5mL花生油，充分混匀，配制17β-雌二醇乳状液。用17β-雌二醇乳状液进行金鱼腹腔注射，诱导金鱼分泌卵黄原蛋白，注射剂量为0.1mL/条，10天后再进行尾静脉取血，4℃8000g离心5min，获得含卵黄原蛋白的血浆。取该血浆1mL加入分子筛层析柱，填料为Sephacryl S-300，用含0.07M NaCl的25mM Tris-HCl(pH7.5)洗脱，收集含金鱼卵黄原蛋白的样品用于离子交换层析，填料为DEAE Sepharose Fast Flow，用含0.1M和0.2M NaCl的25mM Tris-HCl进行不连续洗脱，采用部份收集器收集洗脱液，电泳鉴定后把含有金鱼卵黄原蛋白纯品的等分试样-80℃保存。

(2)制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体

取150mg纯化的金鱼卵黄原蛋白，加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对新西兰大白兔背部皮下多点注射，进行初次免疫。第3、4、5周加强免疫，免疫量为100mg/只，用弗氏不完全佐剂充分乳化后，采用初次免疫的方法注射。第6周由兔耳缘静脉取血，用双向免疫扩散法测定效价后，颈动脉取血，获得抗血清用于制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。采用亲和层析法制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体，所用的亲和层析填料为CNBr-activated Sepharose 4B，取上述纯化的金鱼卵黄原蛋白与之结合；将兔抗血清用PBS(由0.14M NaCl、0.015M KH₂PO₄、0.075MNa₂HPO₄、0.027M KCl所组成，pH7.3)稀释后，加入层析柱中循环过夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱抗体，收集兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体加入保存剂，-80℃保存。

(3)制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体

取纯化的金鱼卵黄原蛋白50mg与0.1mL弗氏完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹腔注射进行第1次免疫。两周后进行第2次免疫，取纯化的金鱼卵黄原蛋白10mg与0.1mL弗氏不完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹腔注射。以后每周注射1次，注射液的剂量与第2次相同。于第5次注射后，在1周内连续注射两次，以加强免疫效果，注射液的剂量均与第2次相同。小鼠尾静脉取血，采用双向扩散法测定抗血清效价。小鼠眼眶动脉取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。小鼠眼眶动脉取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。所用的亲和层析填料为CNBr-activated Sepharose 4B，取上述纯化的金鱼卵黄原蛋白与之结合；将鼠抗血清用PBS(由0.14M NaCl、0.015M KH₂PO₄、0.075M Na₂HPO₄、0.027MKCl所组成，pH7.3)稀释后，加入层析柱中循环过夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱抗体，收集鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体加入保存剂，-80℃保存。

(4)将制备的金鱼卵黄原蛋白纯品1支、兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支装入盒体，构成本发明的试剂盒。其具体组成如下：

1)空白96孔酶标板1块；

2)金鱼卵黄原蛋白纯品1支，使用前用样品稀释液稀释到所需浓度；

3)阴性对照组血清1支，使用前用样品稀释液按1:200的体积比稀释；

4)兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，使用前用包被液按1:500的体积比稀释；

5)鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，使用前用样品稀释液按1:500的体积比稀释；

6)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支，使用前用样品稀释液按1:1000的体积比稀释；

7)包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂各1支，所述的包被液为50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6；封闭液为含1％BSA和0.1％ Tween-20的150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4；样品稀释液为含0.1％ Tween-20的150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4；洗涤液为含0.05％ Tween-20的150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4；显色液为用碳酸盐-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)配置的0.4mg mL^-1的邻苯二胺(OPD)溶液，使用前加入H₂O₂ 0.015mL；终止剂为0.5M的H₂SO₄水溶液。

本发明的检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒可用于内分泌扰乱化学物质的调查。使用时分为以下步骤：

1)在空白96孔酶标板中加入用包被液稀释了的试剂盒中的兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体，100μl/孔，室温下孵育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤96孔酶标板4次。

2)在96孔酶标板中加入封闭液，300μL/孔，室温下孵育0.5小时。弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤96孔酶标板4次。

3)在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的金鱼卵黄原蛋白纯品、待测血浆样品、阴性对照组血清，100μL/孔，室温孵育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤96孔酶标板4次。

4)在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体，100μL/孔，4℃静置过夜。次日弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤96孔酶标板4次。

5)在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，100μL/孔，室温孵育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤液和三蒸水各洗涤96孔酶标板2次。

6)在96孔酶标板中加入新鲜配制的显色液，100μL/孔，于室温暗处反应5～30min。

7)待呈现明显的黄色后加终止剂，50μL/孔。

8)用酶标仪测定492nm波长下各孔的吸光值。

9)根据样品的光吸收强度在标准曲线上计算出相应的卵黄原蛋白浓度。

10)根据测定的雄性金鱼血浆中里卵黄原蛋白浓度的高低，可以判定该鱼生活水域内分泌扰乱化学物质污染的程度。

Claims (4)

1、一种检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒，它包括一个盒体，盒体内有空白96孔酶标板1块，阴性对照组血清、封闭液、包被液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，金鱼卵黄原蛋白纯品1支。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金鱼卵黄原蛋白纯品为标准浓度的金鱼卵黄原蛋白。

3、权利要求1所述的定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在于由下述步骤组成：1)制备金鱼卵黄原蛋白纯品；2)制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；3)制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；4)将步骤1)中得到的金鱼卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、步骤3)得到的鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒。

4、利要求1所述的检测金鱼卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒在内分泌扰乱化学物质调查中的应用。