CN101396357B - 硫辛酰胺在防治胰岛素抵抗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学和医学领域，公开了硫辛酰胺的新用途，用于制备提高胰岛素敏感性或防治胰岛素抵抗的组合物。本发明首次揭示硫辛酰胺对于促进线粒体生成和功能、调节糖脂代谢、促进胰岛素敏感性、防治胰岛素抵抗具有极其优异的效果，并且仅需较低的剂量即可发挥极其显著的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及硫辛酰胺在提高胰岛素敏感性、防治胰岛素抵抗中的用途。
背景技术
2型糖尿病是受多种因素影响的复杂代谢性病症，源于环境因素和遗传易感性之间的相互作用；其可诱发一系列并发症，如心脑血管疾病、高血压、高脂血症、神经系统病变(如脑中风)、肾衰竭和肿瘤等等，成为严重影响人类健康的疾病。糖尿病人以每年6％的速度递增，预计在二十年内将达到三亿之众，在我国目前糖尿病人数已接近3000万，我国糖尿病和糖尿病前期患病率的迅速增长以及由于该病给人民健康和经济发展所带来的沉重负担，已经使糖尿病成为中国严重的公共卫生问题之一。
2型糖尿病的代表性病理特征是肌肉与脂肪等周边组织产生胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能损伤以至胰岛素分泌衰减等。至今本领域对二者的发生机制不详。线粒体是机体消耗氧和产生ATP的主要场所，在能量代谢和自由基代谢中，均占据着十分重要的地位。线粒体的氧化磷酸化是依靠线粒体DNA(mtDNA)编码并在线粒体内表达，线粒体有一套独立的转录和翻译体系是半自主性细胞器。因此，mtDNA及其编码基因的状况直接影响线粒体呼吸和ATP合成。线粒体基因突变和功能异常可引起胰岛素对葡萄糖利用的调节障碍。再者，随着膳食结构的改变，大量摄入高脂、高蛋白食物会导致代谢异常，若游离脂肪酸(FFA)增加超过线粒体β氧化的负荷，可以产生一系列效应：(1)长链脂肪酰CoA(LCA-CoA)和二乙酰甘油(DAGS)升高在骨骼肌中可以引起胰岛素抵抗，人体和动物实验已证实，FFA抑制基础状态和胰岛素刺激的组织对葡萄糖的利用，降低周围组织和肝脏对胰岛素的敏感性；(2)FFA可以上调线粒体内膜上解耦联蛋白2(UCP-2)的表达，随着UCP2的表达可使线粒体氧化磷酸化解耦联，导致线粒体合成ATP的效率降低，线粒体ROS释放增加，引起ATP耗竭，抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)；(3)直接激活炎症细胞释放细胞因子(TNF-α，leptin)；TNF-α可抑制脂肪细胞的IRSβ链和IRS-1的胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化，下调脂肪细胞的葡萄糖转运蛋白4-GLUT-4，也可使参与调节脂肪组织分化和能量储存的PPARγ活性降低。故TNF-α活性增高可导致胰岛素抵抗与高胰岛素血症，后者进一步促进脂肪合成，加重肥胖；但TNF-α本身又可在多方面限制脂肪细胞进一步成熟，形成脂肪堆积，使FFA水平增高。上述事件的发生将会导致促氧化和抗氧化机制的失衡，产生氧化应激和活性氧释放增加，又可引起脂质过氧化增加，脂质过氧化产物又损伤线粒体DNA，从而抑制呼吸链的电子传递，进一步促进活性氧的增多，形成恶性循环。同时脂代谢异常导致的“脂毒性”经历了起病初期对胰岛素抵抗的代偿，到失代偿，直至最后出现β细胞的凋亡和胰岛的结构破坏，β细胞的功能衰退也由可逆转为不可逆。研究资料表明，FFA可能影响前胰岛素原启动子的转录、活化，抑制它的合成速率和mRNA表达，使胰腺内甘油三酯含量增加，持续的细胞内甘油三酯堆积可以导致β细胞功能障碍，结构破坏，细胞数量减少，发生凋亡。而细胞内甘油三酯堆积是引起β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能障碍的重要原因。
因此，线粒体损伤被认为是产生糖脂代谢紊乱，导致胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌缺陷的重要机制。预防线粒体的氧化损伤并促进线粒体修复和生成，改善糖脂代谢是防治胰岛素抵抗和2型糖尿病的一种有效途径。
并且，脂肪组织不再单纯地被认为仅仅是储存能量的组织，而是具有复杂代谢和内分泌功能的器官，参与调控机体的能量代谢。脂肪细胞的糖脂代谢功能紊乱和分化异常可导致胰岛素抵抗，诱发2型糖尿病和心血管疾病的发生和发展。正因为脂肪组织作为内分泌器官对机体的能量代谢发挥调节作用，使其成为治疗肥胖，2型糖尿病和心血管疾病药物的靶组织。
综上，尽管本领域对于糖尿病的发病机制有所了解，然而目前还缺乏防治糖尿病或胰岛素抵抗的有效药物。
发明内容
本发明的目的在于提供硫辛酰胺在提高胰岛素敏感性、防治胰岛素抵抗方面的新用途。
在本发明的第一方面，提供一种硫辛酰胺的用途，用于制备提高胰岛素敏感性或防治胰岛素抵抗的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还用于调节糖代谢或脂代谢。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
提高细胞内过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1α(PGC-1α)的表达；
提高细胞内线粒体转录因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表达；
提高细胞内线粒体DNA生成；
提高细胞线粒体传递链复合物蛋白(包括复合物I、复合物II和/或复合物III)的表达和活性；
增加细胞线粒体的数目和截面积；或
促进细胞的耗氧。
在另一优选例中，所述的线粒体传递链复合物包括：线粒体传递链复合物I、线粒体传递链复合物II和/或线粒体传递链复合物III。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
促进脂肪酸廓清；或
提高过氧化物酶增殖物激活受体-α(PPAR-α)和肉毒碱脂酰转移酶l(L-CPT-1)的表达。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
促进胰岛素刺激的葡萄糖转运；
提高细胞内过氧化氢酶的表达和活性；
抑制细胞内活性氧的产生；
促进细胞内三磷酸腺苷(ATP)生成；或
抑制c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达。
在另一优选例中，所述的细胞是脂肪细胞。
在本发明的第二方面，提供一种体外(优选非治疗性地)提高细胞对于胰岛素的敏感性的方法，所述方法包括：给予细胞有效量的硫辛酰胺。
在另一优选例中，所述的有效量是1-100μmol/L(μM/L)。
在另一优选例中，所述的有效量是1-10μmol/L。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了硫辛酸或硫辛酰胺处理后脂肪细胞PGC1-α的表达。
A.免疫蛋白印迹分析脂肪细胞PGC1-α的表达。
B.根据图象灰度半定量分析PGC1-α，结果以相对于对照组(不采用硫辛酸或硫辛酰胺处理的脂肪细胞)的百分数表示，以均值±标准误表示(n＝5)。*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比有显著性差异。
图2显示了脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺处理后NRF1和mtTFA的表达。
3T3-L1脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小时后，抽提总RNA，RT-定量PCR分析NRF1(A)和mtTFA(B)在mRNA水平上的表达。18SRNA作为内参基因，以标准曲线进行相对定量，结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误表示(n＝5)。*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比有显著性差异。
图3显示了脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺处理后线粒体DNA的表达。
3T3-L1脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小时后，应用定量PCR的方法分析脂肪细胞中DNA的含量，分别扩增线粒体D-Loop区域与核18S核糖体基因的产物，以标准曲线进行相对定量，以线粒体D-Loop/18SRNA的比值进行分析。结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误表示(n＝5).*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比有显著性差异。
图4显示了脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺处理后线粒体蛋白的表达。
A.3T3-L1脂肪细胞经硫辛酸(10μM)或硫辛酰胺(10μM)刺激24小时后，抽提总蛋白，免疫蛋白印迹分析线粒体电子传递链复合物I，II和III的表达。
B.根据A的结果进行灰度半定量分析，结果以相对于未经硫辛酸或硫辛酰胺处理的对照组的百分数表示，以均值±标准误表示(n＝5)。*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比有显著性差异。
图5显示了电镜分析硫辛酸或硫辛酰胺对于脂肪细胞线粒体的作用。
A.脂肪细胞线粒体的形态(放大倍数10,000)，脂肪细胞分化第8天，应用硫辛酸(10μM)或硫辛酰胺(10μM)处理24小时，对照组未加硫辛酸和硫辛酰胺。
B.线粒体截面积和线粒体密度，取4次试验的结果的均数±标准误作图，*p＜0.05与对照组相比有显著差异。
图6显示了3T3-L1脂肪细胞经硫辛酸或硫辛酰胺处理后耗氧的测定。
细胞氧气消耗的检测应用BD公司的Oxygen Biosensor System。细胞用胰酶消化并重悬于培养基中，转移到96孔的耗氧测定板。在荧光酶标仪(FlexStationII384，Molecμlar Devices)读数1个小时，间隔一分钟，激发波长485nm，发射波长630nm。数据采用荧光变化的最大斜率表示。
图7显示了线粒体复合物I，II和III活性的检测。3T3-L1脂肪细胞经不同浓度的硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小时后，抽提线粒体，分析线粒体电子传递链复合物I，II和III的活性。
A：线粒体复合物I的活性；
B：线粒体复合物II的活性；
C：线粒体复合物III的活性。
结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。*p＜0.05与对照组相比有显著性差异，**p＜0.01与对照组相比有极显著性差异。
图8显示了硫辛酰胺对游离脂肪酸的利用。
分化后的细胞应用TNF-α刺激24小时后，再加入不同浓度的硫辛酰胺作用48小时，收集上清，测定游离脂肪酸含量。结果以相对于对照组(未加TNFα和硫辛酰胺)的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。**p＜0.01与对照组相比有极显著性差异；#p＜0.05与TNF-α组相比有显著性差异，##p＜0.01与TNF-α组相比有极显著性差异。
图9显示了PPAR-α和L-CPT-1的表达。
分化后的细胞应用TNF-α刺激24小时后，再加入硫辛酰胺10μM作用48小时，定量RT-PCR分析PPAR-α和L-CPT-1mRNA的含量。结果以相对于对照组(未加TNFα和硫辛酰胺)的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。*p＜0.05与对照组相比有显著性差异，##p＜0.01与TNF-α组相比有极显著性差异。
图10显示了硫辛酰胺改善胰岛素刺激的葡萄糖转运。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸作用半小时，再应用TNF-α刺激24小时后，测定胰岛素刺激后对2-脱氧-3H葡萄糖转运效率。结果以相对于对照组(未加TNFα、硫辛酰胺和N-乙酰半胱氨酸)的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。*p＜0.05与对照组相比有显著性差异，#p＜0.05与TNF-α组相比有显著性差异。
图11显示了过氧化氢酶的活性及表达。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺作用半小时，再应用TNF-α刺激24小时后，抽提蛋白分析过氧化氢酶的活性(A)，和免疫蛋白印迹分析过氧化氢酶的表达(B)。结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。*p＜0.05与对照组相比有显著性差异；**p＜0.01与对照组相比有极显著性差异；#p＜0.05与TNF-α组相比有显著性差异。
图12显示了硫辛酰胺抑制TNF-α所致的活性氧产生。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸作用半小时，再应用TNF-α刺激2小时后，DCF染色，应用流式细胞仪测定DCF的荧光。
图13显示了脂肪细胞内线粒体电子传递链的活性。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺作用半小时，再应用TNF-α刺激24小时后，分离线粒体测定线粒体复合物的活性。
A：线粒体复合物I的活性；
B：线粒体复合物II的活性；
C：线粒体复合物III的活性。
结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。*p＜0.05与对照组相比有显著性差异，**p＜0.01与对照组相比有极显著性差异；#p＜0.05与TNF-α组相比有显著性差异，##p＜0.01与TNF-α组相比有极显著性差异。
图14显示了脂肪细胞胞浆内ATP的水平。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺作用半小时，再应用TNF-α刺激24小时后，测定细胞胞浆内ATP的含量。结果以相对于对照组的百分数表示，以均值±标准误示值(n＝5)。**p＜0.01与对照组相比有极显著性差异；#p＜0.05与TNF-α组相比有显著性差异，##p＜0.01与TNF-α组相比有极显著性差异。
图15显示了p-JNK的表达。
分化后的脂肪细胞应用硫辛酰胺作用半小时，再应用TNF-α刺激24小时后，免疫蛋白印迹分析p-JNK的表达。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究，首次揭示硫辛酰胺对于促进胰岛素敏感性和防治胰岛素抵抗具有极其优异的效果。在此基础上完成了本发明。
具体地说，本发明人以脂肪细胞作为研究模型，结果发现，硫辛酰胺可显著增加脂肪细胞线粒体的数量和体积，增加线粒体电子传递链中复合物I，II，III蛋白的表达和酶活性。这些变化伴随着调控线粒体生成的转录因子过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1a(PGC-1α)、线粒体转录因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表达，表明硫辛酰胺可以显著促进脂肪细胞中线粒体生成和功能。进一步在肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)诱导的脂肪细胞脂肪分解的模型中，应用硫辛酰胺干预发现硫辛酰胺通过逆转TNF-α抑制与脂肪酸氧化相关的过氧化物激活酶转录因子-a(PPAR-α)和肉碱脂酰转移酶-1(CPT-1)的表达而改善脂质代谢，促进游离脂肪酸的利用；同时在TNF-α诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗的模型中，应用硫辛酰胺进行早期干预，发现硫辛酰胺可通过上调过氧化氢酶的表达和增加其活性，直接或间接清除由TNF-α所致的活性氧过多产生，修复线粒体传递链复合体的酶活性，增加细胞内三磷酸腺苷(ATP)的合成；同时抑制了TNF-α激活的c-Jμn氨基末端激酶(p-JNK)激酶的活化，改善了胰岛素的信号传导通路，促进了胰岛素刺激的葡萄糖转运，增加了脂肪细胞对胰岛素的敏感性。
硫辛酰胺
硫辛酰胺(Lipoamide，LM)是一种至今被研究很少的化合物，一般被用作维生素类补充剂。并且，硫辛酰胺是硫辛酸的一种衍生物，其具有如下的化学结构式：
本发明人的研究发现，硫辛酰胺的体外清除氧自由基的能力显著强于硫辛酸，并且其在糖尿病的研究中未见有报道。
硫辛酰胺的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体也被包括在本发明中，只要它们具有与硫辛酰胺相同或接近的调节糖脂代谢、促进胰岛素敏感性或防治胰岛素抵抗的功能。所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在哺乳动物体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物或其类似物。
所述的硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可通过化学合成的方式获得。
用途
本发明提供了硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物的用途，用于制备调节糖脂代谢、促进胰岛素敏感性、或防治胰岛素抵抗的组合物。
本发明人比较了硫辛酸与硫辛酰胺在作用于脂肪细胞后，脂肪细胞的线粒体生成情况。首先体外诱导前脂肪细胞分化成为成熟的脂肪细胞，应用不同浓度的硫辛酸或硫辛酰胺处理，然后观察两者对线粒体生成的作用，包括观察线粒体数目，体积，线粒体蛋白及线粒体DNA，线粒体耗氧及电子传递连的酶活性，涉及线粒体生成的转录因子的改变。结果发现，硫辛酰胺可极其显著地提高细胞内过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1α(PGC-1α)的表达、提高细胞内线粒体转录因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表达、提高细胞内线粒体DNA生成、提高细胞线粒体传递链复合物蛋白(包括复合物I、复合物II和/或复合物III)的表达和活性、增加细胞线粒体的数目和截面积、促进细胞的耗氧。并且，硫辛酰胺在非常低的浓度(如约1-10μM)下即可产生显著的效应；而硫辛酸只能在较高的浓度(如约100μM)下上调PGC-1α、mtTFA、NRF1表达，但对于线粒体面积和数目无显著效应、对于线粒体传递链复合物的表达无显著影响，对于线粒体耗氧影响也不明显。因此可见，硫辛酰胺对于促进线粒体生成和功能具有显著意义。
本发明人还建立了脂肪分解的体外模型，分化后的细胞用含有TNF-α的培养基培养，诱导并建立了脂肪细胞脂肪分解模型。应用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸干预实验，先应用TNF-α刺激，再加入不同浓度的硫辛酰胺作用，然后观察游离脂肪酸的变化，及涉及与脂肪酸氧化相关的转录因子的改变。结果发现，硫辛酰胺可极其显著地促进脂肪酸廓清效应，以及提高过氧化物酶增殖物激活受体-α(PPAR-α)和L-CPT-1的表达。因此可见，硫辛酰胺对于调节细胞的脂代谢是有用的。
本发明人还建立了脂肪细胞胰岛素抵抗模型，分化后的脂肪细胞用含有TNF-α培养基培养，诱导并建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。应用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸干预实验，先将药物与脂肪细胞孵育，再应用TNF-α处理24小时，然后观察药物干预前后，脂肪细胞对2-脱氧-D-[1-3H]葡萄糖的转运，线粒体电子传递链复合体的活性，活性氧，过氧化氢酶的表达及活性，以及胞浆内ATP的水平。结果发现，硫辛酰胺可极其显著地促进胰岛素刺激的葡萄糖转运，提高细胞内过氧化氢酶的表达和活性，抑制细胞内活性氧的产生，促进细胞内ATP生成，抑制c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达。因此可见，硫辛酰胺对于调节细胞的糖代谢是有用的，并且，硫辛酰胺可促进胰岛素敏感性，防止胰岛素抵抗。
组合物
如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物和饮食补充剂(如保健品组合物)，只要它们含有硫辛酰胺作为促进胰岛素敏感性、防治胰岛素抵抗或调节糖脂代谢的活性成分。
通常，所述的饮食补充剂含有0.000001-20wt％(优选的为0.00005-10wt％；更优选0.00001-5wt％)的硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物；(b)食品上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量(如0.000001-20wt％；优选的为0.00005-10wt％；更优选0.00001-5wt％)的硫辛酰胺或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中硫辛酰胺可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。
从易于制备和给药的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。组合物的口服给药是优选的。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式或待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物每天以约0.1-100mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.1-1000mg，较佳地约为1-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1-200mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少或增加。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示硫辛酰胺对于调节糖脂代谢、促进胰岛素敏感性或防治胰岛素抵抗具有极其优异的效果，并且其效果明显优于硫辛酸等其它化合物。
(2)仅需要较低剂量的硫辛酰胺就可发挥良好的效应，成本低廉，从而为糖脂代谢紊乱相关药物、糖尿病药物的开发提供了新的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料与方法
1.试剂
地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；抗PGC-1α抗体购于美国Santa Cruz公司；抗微管蛋白(tubulin)抗体购于美国Sigma公司；TRIzol购于美国Invitrogen公司；抗复合物I，II，III的抗体购自美国Invitrogen公司；逆转录酶试剂盒购于美国Promega公司；游离脂肪酸测定试剂盒购自南京建成生物试剂公司；热启动Taq酶购于日本TaKaRa公司；D-loop，PPAR-α，L-CPT1，NRF1；mtTFA和18SRNA引物由上海博亚公司合成；硫辛酰胺购自于Fluka公司，N-乙酰半胱氨酸购自德国Calbiochem公司；实时定量PCR测定试剂盒购自大连宝生物(Takara Bio)公司；p-JNK抗体购自美国Cell SignalingTechnology公司；小鼠肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)购自美国R&D公司；2-脱氧-D-[1-3H]葡萄糖(2-DOG)购自英国Amersham公司；BCA蛋白测定试盒和West Pico chemiluminescent发光底物来自美国PIERCE公司；R-硫辛酸(简称硫辛酸)由德国K.Wessel博士赠送(或也可商购，如可购自上海新嵩巍有限公司)；其余的细胞培养的试剂均购自于美国Invitrogen公司。
2.方法
细胞培养和脂肪细胞分化
3T3-L1前脂肪细胞(购自ATCC，Cat.No.CL-173)用完全培养液(DMEM+10％胎牛血清+青、链霉素各100u/ml)，在37℃孵箱(5％二氧化碳，95％空气)中培养，每2天换液1次。待细胞生长至完全融合后2天(第0天)，开始诱导分化，具体步骤为：将培养液换成含0.5mM IBMX、0.25μM地塞米松和1μM胰岛素的完全培养液；48h后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培养液中只含有1μM胰岛素；2天后换液，撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基；以后每2天换液1次，直至第8天95％以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞。
电镜
脂肪细胞分化第8天应用硫辛酰胺(10μm)或/硫辛酸(10μm)作用24小时后，2.5％戊二醛过夜固定，细胞经10g/L锇酸后固定、丙酮脱水、浸透、树脂包埋、超薄切片、铀-铅复染、透射电镜下观察，计数并观察10个脂肪细胞，定量分析线粒体数目和线粒体的截面积。
线粒体DNA含量的测定：
总DNA使用DNA提取试剂盒提取(U-gene Biotech Co.LTD，China)。实时定量PCR使用Master Premix(TOYOBO CO.，LTD Osaka，日本)。引物序列如表1。
表1
| 序列 | SEQ ID NO： | ||
| 线粒体D-loop | 上游序列 | 5′-AATCTACCATCCTCCGTG-3′ | 1 |
| 下游序列 | 5′-GACTAATGATTCTTCACCGT-3′ | 2 | |
| 18S RNA | 上游序列 | 5′-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3′ | 3 |
| 下游序列 | 5′-CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3′ | 4 |
PCR条件：95℃，10min，然后进行40循环为95℃，1min，55℃，1min，72℃，1min。应用标准曲线分别进行相对定量，以线粒体D-loop/18SRNA的比值进行比较。
总RNA抽提和RT-PCR
按试剂盒说明，用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA的纯度和含量。常规方法设计引物序列，由上海赛百盛公司合成。引物序列如表2。
表2
| 序列 | SEQ ID NO： | ||
| NRF1 | 上游序列 | 5′-GCAAACGCAAACACAGGCC-3′ | 5 |
| 下游序列 | 5-CTGCATCTCCCTGAGAAGC-3′ | 6 | |
| mtTFA | 上游序列 | 5′-AAAAAGGAAAGCTATGAC-3′ | 7 |
| 下游序列 | 5′-AGCACCATATTTTCGTTG-3′ | 8 | |
| PPAR-α | 上游序列 | 5′-TCACACAATGCAATCCGTTT-3′ | 9 |
| 下游序列 | 5′-GGCCTTGACCTTGTTCATGT-3′ | 10 | |
| L-CPT-1 | 上游序列 | 5′-TGTCCAAGTATCTGGCAGTCG-3′ | 11 |
| 下游序列 | 5′-CATAGCCGTCATCAGCAACC-3′ | 12 | |
| 18S RNA | 上游序列 | 5′-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3′ | 13 |
| 下游序列 | 5′-CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3′ | 14 |
RT-PCR反应：1μg总RNA合成cDNA。总体积20μl，42℃反应60min，95℃反应5min。合成的cDNA，使用Takara公司的DDR305A Ex Taq(Hot startversion)进行PCR扩增，PCR条件：95℃，10min，然后进行40循环95℃，1min，55℃，1min，72℃，1min。
数据表示为：2-ΔCt，ΔCt＝Ct-Ct18S。
免疫蛋白印迹
各种处理因素作用后，弃去培养液，用PBS充分清洗，加入细胞裂解液，用细胞刮匙刮下细胞，冰上孵育30分钟，1,3000r/min 4℃离心10分钟，收集上清即为细胞蛋白提取液。应用Bradford法进行总蛋白定量，-80℃保存。蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转移至固相支持体硝酸纤维素膜上，室温下封闭1小时，加入一抗PGC-1α(1∶1000)，微管蛋白(tubulin，1∶5000)，复合物I(1∶1000)，复合物II(1∶1000)，复合物III(1∶1000)，4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的抗体)，室温孵育1小时，ECL发光，X线胶片感光。应用NIH Image图像分析软件对蛋白条带的密度进行半定量分析。
细胞耗氧的检测
应用BD公司的Oxygen Biosensor System(BD Biosciences)的耗氧板检测细胞耗氧。细胞用胰酶消化并重悬于培养基中，转移到96孔的耗氧测定板。在荧光酶标仪(Flex StationII384，Molecμlar Devices)读数1小时，每间隔1分钟收集荧光，激发波长485nm，发射波长630nm(参见Schieke，S.M.等，(2006)，The mammalian target of rapamycin(mTOR)pathway regulatesmitochondrial oxygen consumption and oxidative capacity.J Biol Chem281，27643-27652)。数据采用荧光变化的最大斜率表示。
线粒体复合物I，II和III活性的检测
细胞培养在100mm细胞培养板中，经上述处理后，用PBS洗一次，刮下细胞，在低渗溶液中用玻璃匀浆器手动研磨20次，800g rcf，4℃离心5分钟，收取上清，1,1000g、4℃离心30分钟，所得沉淀为线粒体，用于复合物的活性测定。
复合物I的测定方法为：
在反应液(50mM Tris pH8.1，0.I％BSA，1μM Antimycin A，0.2mM NaN3，0.05mM CoQ1，0.4mM DCPIP)中加入终浓度为50μg/ml的线粒体，用终浓度为0.2mM的NADH启动反应，于600nm测定吸光度的降低速度，以此作为活性的反映。
复合物II的测定方法为：
在反应液(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.8，2mM EDTA，0.1％BSA，3μM鱼藤酮，1μM Antimycin A，0.2mM NaN3，0.05mM CoQ1，0.2mM ATP，0.4mM DCPIP)中加入终浓度为100μg/ml的线粒体，于600nm测定吸光度的降低速度，以此作为活性的反映。
复合物III的测定方法为：
在反应液(50mM Tris-HCl，pH7.8，0.2mM NaN3，0.08％tween-20，0.1％BSA，0.2mM还原性泛醌(decylubiquinol)中加入终浓度为15μg/ml的线粒体，用终浓度为40uM的细胞色素c启动反应，于550nm测定吸光度的降低速度，以此作为活性的反映。
建立脂肪分解的体外模型
分化后的细胞用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养72小时，诱导并建立脂肪细胞脂肪分解的模型。
游离脂肪酸测定
参照南京建成公司说明书操作，诱导8-10天后的3T3-L1成熟脂肪细胞，0.2％BSA-DMEM孵育过夜，PBS洗两遍，加入含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养72小时；或应用TNF-α处理24小时后，加入不同浓度的硫辛酰胺再共同孵育48小时，收集上清。用改良比色法测定游离脂肪酸，经抽提和铜皂化，显色反应，用酶标仪测定550nm光密度进行比色定量。
建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型
分化后的细胞用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养24小时，诱导并建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。
胰岛素抵抗的特征：胰岛素刺激的葡萄糖摄取下降，抑制胰岛素受体及受体底物(IRS)-1/(IRS)-2酪氨酸磷酸化，而促进丝氨酸、苏氨酸磷酸化，从而干扰胰岛素受体及其下游IRS-磷酯酰肌醇3激酶(PI-3K)通路的信号传导、下调脂肪细胞细胞葡萄糖转运体(GLUT)-4的基因表达及(GLUT)-4由细胞内向细胞膜转位。
葡萄糖转运测定
在24孔板中，诱导后8天的细胞经过24小时0.2％BSA-DMEM孵育过夜后，PBS洗两遍，用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养24小时；或应用硫辛酰胺，N-乙酰半胱氨酸预先处理半小时后，再加入TNF-α共同培养24小时后，用预热37℃的PBS洗三遍，加入不含有或含有100nM胰岛素的Krebs-Ringer磷酸缓冲液(KRP，1.32mM氯化钠，4.71mM氯化钾，47mM氯化钙，1.24mM硫酸镁，2.48mM磷酸三钠，10mM HEPES，pH7.4)0.5ml，孵育30min后，加入终浓度为0.5μCi/ml的用KRP配制的2-DOG50μl，孵育10min，吸出上清，用含有10mM葡萄糖的冰冷PBS洗三遍。细胞用0.1N氢氧化钠溶液1ml裂解，吸取0.5ml加入预先配制的3.5ml闪烁液(以1份曲吹通X-100与2.5份甲苯，混合摇匀，1000ml中加入2.5-二苯基噁唑(PPO)6.0g；1.4-双-2-(5-苯基噁唑)苯(POPOP)0.30g，摇匀后避光保存)中，振荡混匀，静置隔夜，用液闪计数仪(Beckman Instruments)测定d.p.m值，并用裂解液的蛋白含量校正d.p.m值。
过氧化氢酶活性的测定
在24孔板中，诱导后8天的细胞经过24小时0.2％BSA-DMEM孵育过夜后，PBS洗两遍，用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养24小时；或应用不同浓度的硫辛酰胺预先处理半小时后，再加入TNF-α共同培养24小时后，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sμlfonate-p-benzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm。用过氧化氢标准品，制作标准曲线，计算样品中过氧化氢酶的酶活力。
过氧化氢酶表达的测定采用常规的免疫蛋白印迹法。抗过氧化氢酶的抗体购自德国calbiochem公司。
细胞胞浆内ATP的含量
胞浆内ATP的测定应用ATP荧光酶的分析测定试剂盒测定。细胞生长于96孔板中，诱导后8天的细胞经过24小时0.2％BSA-DMEM孵育过夜后，PBS洗两遍，用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养24小时；或应用不同浓度的硫辛酰胺预先处理半小时后，再加入TNF-α共同培养24小时后。吸弃上清，裂解细胞，取80μl裂解上清液与100μl的含有荧光酶的反应液(10mg/ml)作用，应用酶标仪读取数值。
活性氧的测定
应用分子探针2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(H2DCF-DA)标记脂肪细胞，H2DCFDA能自由透过细胞膜，在胞浆内被酯酶分解成二氢-二氯荧光黄，后者被过氧化氢转化为发荧光的2′，7′-二氯荧光黄(DCF)，通过流式细胞仪测定荧光产物的荧光强度，进行相对定量分析。
脂肪细胞用含有TNF-α(20ng/ml)培养基培养24小时；或应用不同浓度的硫辛酰胺预先处理半小时，再加入TNF-α共同培养24小时后，与H2DCFDA(10μM)孵育30分钟后，胰酶消化，收集后，计数10,000个活细胞，再加入TNF-α共同培养24小时后流式细胞仪检测和分析(FACS Calibur Becton Dickinson)。
统计分析
所有数值以均数±标准误表示，进行t检验或者方差分析(ANOVA)，当P＜0.05时，认为处理组和对照组之间有显著性差异，p＜0.01被认为具有极显著性差异。
II.具体实施例
实施例1硫辛酸或硫辛酰胺诱导脂肪细胞线粒体生成基因的表达
过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1α(PGC-1α)是能够促进线粒体生成和线粒体脂肪酸氧化的辅助增强子，脂肪细胞与硫辛酸(LA)或/硫辛酰胺作用24小时后，应用免疫蛋白印迹的方法观察PGC-1α的表达。
图1显示，硫辛酸能够上调PGC-1α，并呈现剂量依赖效应，100μM硫辛酸产生最大效应，与对照组相比有显著性差异。然而，硫辛酰胺能够从0.1-100μM上调PGC-1α的表达，显示出钟形曲线，1.0-10μM与对照组相比有统计学差异，最大效应发生在10μM。
由图1还可知，硫辛酰胺在较低剂量即可显著上调PGC-1α，而达到相同效应需要硫辛酸的剂量大大提高。
转录因子NRF1和mtTFA都涉及到调控核基因编码线粒体蛋白表达和线粒体DNA的转录和复制。应用RT-定量PCR来检测NRF1和mtTFA在mRNA水平上的表达，脂肪细胞分别与浓度为0.1-100μM的硫辛酸或硫辛酰胺作用24小时，结果观察到硫辛酸能够上调NRF1和mtTFA的表达，并呈现剂量依赖关系，硫辛酸在100μM时能够显著增加NRF1的表达(是对照组的151±15.8％，p＜0.05)(见图2A)；同时能够显著增加mtTFA的表达(是对照组的123±9.2％，p＜0.05)(见图2B)。硫辛酰胺能够从0.1-100μM上调NRF1和mtTFA的表达，显示出钟形曲线的效应，1.0-10μM显著上调NRF1的表达(是对照组的150±11.2％，p＜0.01；是对照组的152±21.3％，p＜0.05)；10μM硫辛酰胺显著上调mtTFA的表达(是对照组的128±4.9％，p＜0.01)。
实施例2硫辛酸或硫辛酰胺诱导脂肪细胞线粒体DNA的生成
线粒体D-loop是调控线粒体DNA重链和轻链转录起始部位，应用定量PCR的方法检测硫辛酸或硫辛酰胺对脂肪细胞线粒体DNA的作用。
结果发现，硫辛酰胺在1.0-10μM时显著增加了mtD-loop/18SRNA的比值(分别是对照组的164±23.7％，p＜0.05和191±0.5％，p＜0.01)；硫辛酸在100μM时显著增加了mtD-loop/18SRNA的比值(是对照组的153±9.6％，p＜0.01)，见图3。
实施例3硫辛酸或硫辛酰胺诱导脂肪细胞线粒体传递链复合物蛋白表达
免疫蛋白印迹分析脂肪细胞经应用10μM硫辛酸或硫辛酰胺作用后线粒体传递链复合物蛋白的表达，10μM的硫辛酰胺可显著增加线粒体传递链复合物蛋白I的表达(是对照组的202±26.3％，p＜0.05)；显著增加线粒体传递链复合物蛋白II的表达(是对照组的176±6.3％，p＜0.01)；显著增加线粒体传递链复合物蛋白III的表达(是对照组的167±6.3％，p＜0.01)；然而，10μM的硫辛酸未显示出任何效应，见图4A和图4B。
实施例4电镜观察脂肪细胞的线粒体
本发明人应用电镜观察硫辛酸(10μM)或硫辛酰胺(10μM)对脂肪细胞线粒体的数目及结构的改变。
结果见图5A和图5B，定量分析显示，10μM的硫辛酸未能增加线粒体的面积和数目；10μM的硫辛酰胺显著增加了脂肪细胞线粒体的截面积(是对照组的178±22％，P＜0.05)，亦同时增加了线粒体的数目(是对照组的165±18％，p＜0.05)。
实施例5硫辛酸或硫辛酰胺促进细胞的耗氧
本发明人进一步观察脂肪细胞的线粒体生成是否伴随耗氧的变化。脂肪细胞分别与10μM的硫辛酸或10μM的硫辛酰胺作用24小时后，测定细胞的耗氧情况。
结果见图6，10μM的硫辛酰胺显著增加了脂肪细胞的基础耗氧，10μM的硫辛酸没有产生效应。
实施例6硫辛酸或硫辛酰胺促进脂肪细胞线粒体传递链复合物的活性
本发明人还测定了硫辛酸或硫辛酰胺对于脂肪细胞线粒体传递链复合物活性的影响。
硫辛酰胺在1.0-10μM时显著增加了线粒体传递链复合物I的活性(分别是对照组的117±6.2％，p＜0.05；120±7.4％，p＜0.05)；而硫辛酸(0.1-100μM)没有产生显著影响，见图7A。
硫辛酰胺在1.0-10μM时显著增了线粒体传递链复合物II的活性(分别是对照组的114±3.9％，p＜0.05和125±2.9％，p＜0.01)；而硫辛酸在100μM显著增加了线粒体传递链复合物II的活性(是对照组116±3.4％，p＜0.05)，见图7B。
10μM的硫辛酰胺显著增加了线粒体传递链复合物III的活性(是对照组的120±6.4％，p＜0.05)，见图7C；而硫辛酸(0.1-100μM)对于线粒体电子传递链III的活性没有显著影响。
实施例7硫辛酰胺促进脂肪酸廓清效应
将脂肪细胞经TNF-α作用24小时后，加入不同浓度的硫辛酰胺再作用48小时，检测培养细胞上清中脂肪酸的含量。
结果见图8，由图可见，TNF-a可以促进脂肪细胞分解，上清中游离脂肪酸含量明显增加，是对照组的238％(p＜0.01)；加入硫辛酰胺后可显著降低上清中游离脂肪酸的含量，10μM硫辛酰胺处理后，脂肪酸是对照组的128％(与TNF-α组相比，p＜0.05)，100μM硫辛酰胺处理后，脂肪酸显著下降，是对照组的116％(与TNF-α组相比，p＜0.01)。
实施例8硫辛酰胺上调TNF-α抑制的PPAR-α和L-CPT-1 mRNA的表达
将脂肪细胞经TNF-α作用24小时后，加入100μM的硫辛酰胺再作用48小时，抽提RNA，进行定量RT-PCR分析。
结果显示，TNF-α可以显著抑制脂肪细胞中PPAR-α和L-CPT-1 mRNA(p＜0.05)的表达，100μM的硫辛酰胺干预后可以明显上调PPAR-α和L-CPT-1mRNA(p＜0.01)的表达，见图9。
实施例9硫辛酰胺改善TNF-α抑制的胰岛素刺激的葡萄糖转运
将脂肪细胞用10μM硫辛酰胺预处理半小时后，再加入TNF-α20ng/ml孵育24小时，观察对于胰岛素刺激的葡萄糖转运的效应。同时还设立加入N-乙酰半胱氨酸(NAC)的实验组作为对比。
结果表明：TNF-α显著抑制了胰岛素刺激的葡萄糖转运，与对照组相比，仅是对照组的40.5±5.9％(p＜0.05)；应用硫辛酰胺10μM预处理后，可以显著逆转TNF-α的抑制效应，胰岛素刺激的葡萄糖转运增加为对照组的63.6±3.7％(与TNF-α组相比p＜0.05)；而应用50μM N-乙酰半胱氨酸预处理后，并没有显著改善TNF-α的效应，见图10。
实施例10硫辛酰胺修复TNF-α抑制的过氧化氢酶的表达和活性测定
过氧化氢酶是机体内重要的抗氧化酶，可以催化过氧化氢产生水和氧气，从而清除体内过多的过氧化氢。本发明人测定了经硫辛酰胺处理后细胞的过氧化氢酶的活性以及表达，
结果发现，脂肪细胞应用TNF-α作用24小时后，过氧化氢酶的活性及表达都同时下降，与对照组相比有显著性差异，见图11A；应用不同浓度的硫辛酰胺预处理半小时后，再加入TNF-α作用24小时，结果显示：硫辛酰胺可以上调过氧化氢酶的活性和表达，上调的最大效应发生在100μM时(与TNF-α组相比，P＜0.05)，见图11B。
实施例11硫辛酰胺抑制TNF-α诱导的活性氧产生
应用TNF-α刺激脂肪细胞后，脂肪细胞经DCF染色，流式细胞仪测定DCF的荧光。
结果见图12。结果表明，TNF-α可以显著刺激脂肪细胞活性氧的产生，是对照组的152％(p＜0.05)，脂肪细胞经应用硫辛酰胺10μM预处理后，可以显著抑制TNF-α刺激的活性氧产生，仅为对照组的97％。
实施例12硫辛酰胺修复TNF-α抑制的线粒体传递链复合物的活性
脂肪细胞应用硫辛酰胺10μM预处理半小时后，再加入TNF-α20ng/ml孵育24小时后，测定线粒体传递链复合物的活性。
TNF-α处理后细胞的复合物I的活性显著下降，是对照组的84％(p＜0.05)，10μM的硫辛酰胺处理后可以显著提高复合物I的活性，是对照组的105％(与TNF-α组相比，p＜0.05)，见图13A；
TNF-α可以显著降低复合物II的活性，是对照组的74％(p＜0.05)，10μM的硫辛酰胺可以显著提高复合物II的活性，是对照组的103％(与TNF-α组相比，p＜0.05)，见图13B；
TNF-α可以显著降低复合物III的活性，是对照组的83％(p＜0.01)，10μM的硫辛酰胺可以显著提高复合物II的活性，是对照组的110％(与TNF-α组相比，p＜0.05)，见图13C。
实施例13硫辛酰胺逆转TNF-α抑制的ATP生成
脂肪细胞应用硫辛酰胺10μM预处理半小时后，再加入TNF-α20ng/ml孵育24小时后，测定细胞胞浆内ATP的含量，TNF-α可显著降低ATP的含量(与对照组相比p＜0.01)；硫辛酰胺可以增加细胞胞浆内ATP的含量，呈剂量依赖效应，10-100μM硫辛酰胺可显著逆转TNF-α抑制的ATP生成，结果如图14所示。
实施例14硫辛酰胺抑制TNF-α诱导p-JNK的活化
TNF-α可以激活c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达，应用硫辛酰胺10μM预处理半小时后，可以显著抑制p-JNK的活化；而应用N-乙酰半胱氨酸未显示出抑制效应，结果见图15。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>硫辛酰胺在防治胰岛素抵抗中的用途
<130>074893
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
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Claims (10)
1.一种硫辛酰胺的用途，其特征在于，用于制备提高胰岛素敏感性或防治胰岛素抵抗的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于调节糖代谢或脂代谢。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物通过以下途径发挥作用：
提高细胞内过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1α的表达；
提高细胞内线粒体转录因子A和核呼吸因子1的表达；
提高细胞内线粒体DNA生成；
提高细胞线粒体传递链复合物蛋白的表达和活性；
增加细胞线粒体的数目和截面积；或
促进细胞的耗氧。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的线粒体传递链复合物包括：线粒体传递链复合物I、线粒体传递链复合物II和/或线粒体传递链复合物III。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物通过以下途径发挥作用：
促进脂肪酸廓清；或
提高过氧化物酶增殖物激活受体-α和肉毒碱脂酰转移酶1的表达。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物通过以下途径发挥作用：
促进胰岛素刺激的葡萄糖转运；
提高细胞内过氧化氢酶的表达和活性；
抑制细胞内活性氧的产生；
促进细胞内三磷酸腺苷生成；或
抑制c-Jun氨基末端激酶的表达。
7.如权利要求3-6任一所述的用途，其特征在于，所述的细胞是脂肪细胞。
8.一种体外非治疗性地提高细胞对于胰岛素的敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括：给予细胞有效量的硫辛酰胺。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有效量是1-100μmol/L。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有效量是1-10μmol/L。
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| CN107028938B (zh) * | 2017-04-17 | 2020-09-15 | 上海慈瑞医药科技股份有限公司 | 硫辛酰胺在制备延缓和治疗糖尿病肾病的组合物中的应用 |
Citations (1)
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| CN1455670A (zh) * | 2000-09-12 | 2003-11-12 | 巴斯福股份公司 | 用于治疗糖尿病的硫辛酸和共轭酸的组合 |
-
2007
- 2007-09-29 CN CN2007100466158A patent/CN101396357B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| CN1455670A (zh) * | 2000-09-12 | 2003-11-12 | 巴斯福股份公司 | 用于治疗糖尿病的硫辛酸和共轭酸的组合 |
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| 刘聪等.代谢综合症小鼠肝脏过氧化物增殖体受体γ共同作用因子-1的表达.世界华人消化杂志15 18.2007,15(18),第1992页左栏25-31行. |
| 刘聪等.代谢综合症小鼠肝脏过氧化物增殖体受体γ共同作用因子-1的表达.世界华人消化杂志15 18.2007,15(18),第1992页左栏25-31行. * |
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