CN101393204A - 血清il-6在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种癌症诊断技术，特别是血清IL－6在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒制备中的应用。该试剂盒可以快速、准确地进行IL－6的检测，从而可以对各期(特别是早期)原发性肝细胞癌作出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。本发明包括建立了基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度大大提高。本发明有益的积极效果是：检测试剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
Description
[技术领域]
本发明涉及一种癌症诊断技术，特别是原发性肝细胞癌诊断试剂盒的制备。
[背景技术]
肝癌是人类最常见恶性肿瘤之一，其发病率在全世界范围内位居第五，而且在肿瘤致死率中位于第三。每年约新增500000病例，经年龄修正后的发病比率为5.5-14.9/10万人。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝脏恶性肿瘤中的最主要类型，高发区域主要集中在东亚，东南亚，中西非等地区。从1990年开始，HCC在中国的肿瘤致死原因中高居第二，乙肝病毒、丙肝病毒感染，黄曲霉素B1的摄入和酗酒等被认为是主要的风险因子。肝细胞肝癌性肿瘤，也是中国华南地区常见恶性肿瘤之一，寻找HCC的早期血清学诊断标志物，对于肝癌的预防和早期治疗均具有重要意义。长期以来，AFP作为原发性肝癌的诊断指标，为临床作出了重大的贡献。但是，AFP的敏感性是有限的；特别是近年来，AFP阴性的HCC患者有上升趋势，因此，寻找AFP之外的肿瘤早期标志物是当务之急。
[发明内容]
自细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是一种促炎症细胞因子，在宿主防疫机制中发挥重要作用。在正常生理状态时，IL-6的水平比较低；但是在创伤、炎症、肿瘤等各种病理情况下，IL-6的表达明显升高。
发明人通过检测正常人、乙肝病毒携带者和HCC患者血清中IL-6的含量，通过统计学分析，根据IL-6含量与HCC的相关性，希望为HCC的临床血清学早期诊断找到新的生物标记物。
本发明公开了一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行IL-6的检测，从而可以对各期(特别是早期)原发性肝细胞癌作出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。本发明包括建立了基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度大大提高。本发明有益的积极效果是：检测试剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
[附图说明]
图1：正常人、HBV携带者、原发性肝细胞癌(HCC)患者血清IL-6浓度直方图。
图2：正常人、HBV急性感染者、HBV慢性感染者、小肝癌、中等大小肝癌及大肝癌患者血清IL-6浓度直方图。
图3：正常人、HBV急性感染者、HBV慢性感染者、AFP阴性肝癌患者及AFP>25μg/L肝癌患者血清IL-6浓度直方图。
[具体实施方式]
材料：
取血清样品，包括30份经临床实验室检测没有感染HBV、HCV、HIV，并没有肿瘤的正常体检人群血清样品；50份HBV携带者血清，其中大三阳患者22名，小三阳患者28名；84份原发性肝细胞癌患者血清样品，其中包括39份小肝癌(直径<5cm)，27份中等大小肝癌(5≤直径≤10cm)，18份大肝癌(直径>10cm)。并且，在全部检测的HCC样品中，AFP≤25μg/L占33份，AFP>25μg/L占51份。
试剂盒内设有：1、包被在固相96孔酶标板上的人IL-6重组单克隆抗体；2、酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记的人IL-6重组单克隆抗体反应液；3、阳性对照为人IL-6标准蛋白，阴性对照为标准阴性血清；4、显色液ABTS底物：ABTS1mg+0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液2ml+3％ H2O24μl(临用时配)；5、洗涤液(0.05％Tween20-PBS)；6、结合物稀释液：0.1％BSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)以及7、终止液(1～2MH2SO4)。
方法：
1.包被：包被缓冲液(0.05M，pH9.6 Na2 CO3-NaHCO3缓冲液)稀释IL-6单克隆抗体粗提蛋白至1μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，放4℃，36小时。
2.封闭：洗涤液冲洗96孔板5次，加结合物稀释液200μl/孔，放37℃，2小时。
3.加待检样品：洗涤液冲洗96孔板5次，加待检样品及结合物稀释液稀释的标准品100μl/孔，放37℃，2小时。
4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板5次，结合物稀释液稀释酶标抗体至1∶800，加入96孔板，100μl/孔，放37℃，2小时。
5.显色：洗涤液冲洗96孔板5次，显色液ABTS底物，加入96孔板，100μl/孔，加终止液室温下或37℃显色15～30分钟。
6.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量。
7.数据统计：所有的统计均使用SPSS 13.0软件包((Statisticat Package for theSocial Sciences，Chicago，IL，USA)。数据采用均值±S表示；所有P值均取两位小数，P<0.05被认为具有统计学意义，P<0.01被认为具有显著意义。
结果和讨论：
原发性肝细胞癌是一个在东亚和南亚地区高发的恶性肿瘤，每年大概有25万到100万人会得肝癌，每年因为肝癌而死亡的人口在20万左右。造成肝癌发病的原因很复杂，从环境影响和生活习惯角度说，摄入了黄曲霉污染的食物、酗酒、以及乙型、丙型肝炎的感染等等都会提高肝癌发生的可能性。
研究发现，在HIV、呼吸道合胞病毒、仙台病毒、HBV感染者等多种病毒感染者及肺癌、口腔癌、结直肠癌等肿瘤患者血清中IL-6的水平升高。较高水平的IL-6也反应了机体对内毒素的高度敏感性。
研究发现，HBV携带者血清中IL-6的水平虽然比正常对照组有轻微的升高，但是没有统计学意义(p>0.05)；而HCC患者平均的IL-6水平明显高于正常对照组(p<0.01)和HBV携带者(p<0.01)，其中小肝癌与正常对照组(p<0.05)及HBV组(p<0.05)也有统计学意义，提示HCC患者细胞大量分泌IL-6。此外，我们发现AFP≤25μg/L及AFP>25μg/L与正常对照组(p<0.01)和HBV组(p<0.01)比较，均有显著统计学意义，提示我们，在AFP阴性HCC患者中，IL-6也许是一个较好的检测指标。
由于肝细胞癌具有较高的异质性，同时检测2种或以上的肿瘤生物标记物被认为是肿瘤早期诊断的较好选择。我们的结果清楚表明，IL-6可以作为HCC的早期血清学诊断生物标志物，特别是当IL-6与经典标志物AFP相结合检测原发性肝细胞癌时，大大提高了HCC的早期诊断率，弥补了单纯检测AFP的不足。不仅如此，由于IL-6和AFP都与原发性肝细胞癌有高度相关性，这就使得两者联合检测，对原发性肝细胞癌具有早期诊断意义。
表1：正常人、HBV急性感染及携带者及原发性肝细胞癌患者血清中IL-6浓度及其统计学意义
急性感染：HBsAg +，HBeAg +，HBcAb +；慢性感染：HBsAg +，HBeAb +，HBcAb +；
小肝癌：直径≤5cm；中等大小肝癌：5cm<直径<10cm；大肝癌：直径≥10cm；
HBV患者：正常人p>0.05
HCC患者：正常人(或HBV携带者)◆p<0.01
其中，小肝癌患者：正常人(或HBV携带者)*p<0.05
中等大小或者大肝癌患者：正常人(或HBV携带者)◆p<0.01
表2：AFP相关的原发性肝细胞癌患者中血清IL-6浓度与正常人和HBV感染者的统计学比较
急性：HBsAg +，HBeAg +，HBcAb +；慢性：HBsAg +，HBeAb +，HBcAb +；*p<0.05 ◆p<0.01HCC患者：正常人(或HBV携带者)◆p<0.01
其中，不论AFP＝25μg/L或者AFP>25μg/L肝癌患者：正常人(或HBV携带者)◆p<0.01。
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1、血清IL-6在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090325 |