CN101384904A - 抗真菌筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别抗真菌剂及其作用模式的方法。本发明特别涉及破坏细胞壁的抗真菌剂并涉及鉴别其的分析方法。本发明更特别涉及一种鉴别抗真菌化合物的筛选方法，所述方法包括：(i)将潜在的抗真菌化合物与参与细胞壁合成的多肽接触，然后(ii)鉴别所述潜在的抗真菌化合物对所述多肽活性的作用，如果所述多肽活性降低则表明所述潜在的抗真菌化合物具有抗真菌活性。本发明还涉及过表达型宿主细胞及进行所述分析的试剂盒。

Description

抗真菌筛选方法
发明领域
本发明涉及细胞壁相关的抗真菌靶的鉴别以及使用经鉴别的靶鉴别抗真菌剂的方法。特别地，所述靶涉及真菌中的蛋白质糖基化过程。
发明背景
真菌的细胞壁是真菌细胞的基本成分。通过干扰真菌细胞的合成或装配，所述细胞溶解并死亡，因此细胞壁是理想的抗真菌靶。真菌细胞壁含有一些类别的大分子，包括β1，3-葡聚糖、β1，6-葡聚糖、壳多糖、细胞壁半乳甘露聚糖蛋白质，及在一些情况中的α1，3或者α1，3-α1，4-葡聚糖。这些成分在细胞壁中的正常合成、转运和存在以及一些成分彼此交联形成刚性细胞壁是关键性的。因此干扰这些成分之一的合成和转运的抗真菌剂或者干扰这些化合物交联的抗真菌剂是感兴趣的抗真菌剂。抗真菌剂根据其作用部位分为五组：(1)氮杂茂环，其抑制麦角固醇(主要的真菌固醇)的合成；(2)多烯，其结合真菌膜固醇，导致可漏出基本的胞质材料的水性孔的形成；(3)丙烯胺，其阻断麦角固醇的生物合成，导致鲨烯的积聚(鲨烯对于细胞是毒性的)；(4)5-氟胞嘧啶，其抑制蛋白质合成；及(5)candins(真菌细胞壁的抑制剂)，其通过抑制β1，3-葡聚糖(细胞壁的主要结构聚合物)的合成而起作用(Balkis et al.，2002，Drugs 62(7)：1025-1040)。只有后一类型的candins是特异性抑制细胞壁生物合成的抗真菌剂。
尽管candins类是感兴趣的和潜在的有价值的抗真菌药物，但是显然仍需要额外的药物，因为使用酿酒酵母(S.cerevisiae)的实验室试验表明candins抗性突变体可天然出现。尽管近年来葡聚糖合酶抑制剂进入临床试验，但是还缺乏关于患者中candins抗性机制的知识。另外，candins对于一些真菌例如C.neoformans的抗真菌活性不佳，而且其对于非曲霉霉菌的活性迄今还未确定。最后，已经报道了通过激活赋予真菌细胞candins抗性的PKC1信号级联而产生对于candins的耐受性。因此，显然需要另外的抗真菌剂。
干扰真菌细胞壁生物合成并且在细胞外起作用的抗真菌剂是特别优选的，因为真菌细胞具有将抗真菌剂从细胞除去的一些机制，例如通过将其经由位于质膜的转运蛋白而输出，这样也降低抗真菌剂可以发挥的效力。
目前新的抗真菌剂的筛选是基于体外分析，筛选影响细胞壁生物合成的抗真菌化合物。WO2004/048604提出了一种鉴别影响GPI-锚生物合成的化合物的方法，CA2218446提出了一种鉴别抑制1，6-葡聚糖的抗真菌剂的方法。另外，在所述文献中揭示了在体外鉴别抗真菌剂的方法(例如Cercosporamide(Sussman et al.，Eukaryotic Cell3(4)：932-943)。这些体外筛选相对难以进行，很可能仅鉴别在细胞内部起作用的抗真菌化合物，并因此必须穿过细胞膜，在体外抑制反应的分子也许在体内无此作用，这表明了体外筛选的不利方面。
WO03020922和WO2004/057033提出了鉴别细胞壁相关的抗真菌靶的报道菌株的应用及在体内筛选抗真菌化合物。
附图简述
图1：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Afu)、黑曲霉(Aspergillusniger)(Ang)；Caenorhabditis elegans(Nematode)(Cel)；构巢曲霉(Emerciella)(Eni)(Aspergillus(Emerciella)nidulans(Eni))；玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(Gze)；大立什曼原虫(Leishmania major)(原生生物)(Lma)；Magneporthe grisae(Mgr)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)(Ncr)；美洲锥虫(Trypanosoma cruzi)(Protist)(tcr)；Usilago maydis(Uma)的UDP-吡喃半乳糖变位酶的系统发生树。
图2：黑曲霉UDP-吡喃半乳糖变位酶敲除菌株的破坏表型
(A)glfA野生型基因座的示意图，用于破坏的质粒pΔglfa(＝pΔ8660)和缺失的glfA基因座(ΔglfA)。来自glfA ORF的5’区域的0.7kb KpnI片段用作探针。(B)将基因组DNA用HindIII消化。在野生型菌株(N402)中，预期产生一个8.0kb杂交片段，而在glfA缺失菌株中预期产生9.7kb的片段。图中示出了具有合适模式的这两个菌株(#97和#67)。(C)glfA的缺失导致高渗可逆性温度敏感性生长缺陷，以及在所有三个测试温度对0.005％ SDS的敏感性增加和对75μl/ml刚果红(CR)的敏感性增加。将以1x104个孢子作为最高浓度开始的孢子10倍稀释液点在含有SDS或CR的曲霉基本培养基(MM)上。平板在指定温度下生长4天。用于纠正温度敏感性生长缺陷的山梨醇的浓度为1.2M。
发明详述
本发明涉及抗真菌靶的鉴别并揭示了筛选对抗所述靶的抗真菌化合物的方法。本发明还涉及进行所述方法和鉴别抗真菌化合物作用模式的试剂盒。
第一方面，本发明涉及一种鉴别抗真菌化合物的筛选方法。所述方法包括：(i)将潜在的抗真菌化合物与参与细胞壁合成的多肽接触，随后(ii)鉴别所述潜在的抗真菌化合物对所述多肽活性的作用，如果所述多肽活性降低，则表明所述潜在的抗真菌化合物的抗真菌活性。
本发明的筛选方法较其它筛选方法简易，具有可以高通量筛选及可以在活细胞外部例如在简便和易于利用的微量滴定平板中进行筛选的优势。另外，所述筛选方法可以高特异性分离抑制或降低UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的化合物。
筛选方法和多肽
任何潜在的抗真菌化合物均可以与参与细胞壁合成的多肽接触。所述潜在的抗真菌化合物可以是疑似阻止或抑制真菌细胞如酵母或丝状真菌增殖的任何化合物。特别优选疑似阻止或抑制丝状真菌增殖的抗真菌化合物。为了使用本发明的筛选方法分离新的潜在的抗真菌化合物，可以使用微生物、真菌或天然提取物。或者，可以使用化学文库(chemical libraries)。
参与细胞壁合成的多肽或蛋白质可以是已知在细胞壁合成和/或细胞壁重塑中起作用的任何多肽。所述多肽对于细胞壁前体转化为细胞壁成分非常重要。根据本发明的一个优选实施方案，所述多肽是参与细胞壁多糖形成的酶。这个方法中使用的多肽既不是在WO03/020922中鉴别的α1，3-葡聚糖合酶(AgsA)也不是在WO 03/020922中鉴别的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸(GfaA)。令人惊奇地，在更优选的实施方案中，所述多肽是参与细胞壁半乳甘露聚糖合成的酶。在更优选的实施方案中，所述多肽参与呋喃半乳糖的形成，呋喃半乳糖是丝状真菌细胞壁的一种特征性成分。根据本发明的一个更优选的实施方案，所述多肽参与呋喃半乳糖(Galf)的形成。更优选地，所述多肽是UDP-吡喃半乳糖变位酶(EC 5.4.99.9)。这种酶催化UDP-吡喃半乳糖的6元糖环与UDP-呋喃半乳糖的5元糖环的互换。
用于本发明筛选方法中并且是本发明目的的优选的多肽
更优选地，本发明筛选方法中使用的多肽具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性，并具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少48％相同性的氨基酸序列。这种具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性并具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少48％相同性的氨基酸序列的多肽是本发明的一方面。已经分离及部分鉴定了细菌UDP-吡喃半乳糖变位酶(Scherman et al.(2003)Antimicrobial Agents andChemotherapy 47：378-382)。细菌UDP-吡喃半乳糖变位酶与SEQ IDNO：1的相同性低于48％。
黑曲霉的UDP-吡喃半乳糖变位酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：1示出。其衍生自SEQ ID NO：3的第1533-3432位核苷酸表示的基因组序列，其两侧具有启动子和终止子区域。编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的cDNA以SEQ ID NO：2表示。
这种酶的活性优选使用Scherman et al，(2003)AntimicrobialAgents and Chemotherapy 47：378-382所述分析测定。
根据一个更优选的实施方案，所述多肽与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％or或者85％、更优选至少90％、92％、95％、97％、98％或99％的相同性。
根据一个优选的实施方案，所述多肽包含一个片段，所述片段与片段1具有至少50％相同性，片段1由SEQ ID NO：1的第41位氨基酸至第111位氨基酸组成。SEQ ID NO：1的片段1由如下氨基酸划定界限：ETPGG...NNIS。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含一个片段，所述片段与上述片段1具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％、更优选至少90％、92％、95％、97％、98％或99％相同性。
根据另一个优选的实施方案，所述多肽包含一个片段，所述片段与片段2具有至少50％相同性，片段2由SEQ ID NO：1的第301位氨基酸至第335位氨基酸组成。SEQ ID NO：1的片段2由如下氨基酸划定界限：GIRGT...NYS。根据一个更优选的实施方案，所述多肽与上述片段2具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％、更优选至少90％、92％、95％、97％、98％或99％相同性。
根据另一个优选的实施方案，所述多肽包含两个片段，一个片段与上述片段1具有至少50％相同性，另一个片段与上述片段2具有至少50％相同性。根据一个更优选的实施方案，每个片段的相同性为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％，更优选至少90％、92％、95％、97％、98％或99％。最优选地，每个片段的相同性为100％。
在一个优选的实施方案中，本发明的用于本发明筛选方法中的多肽包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。最优选地，本发明的筛选方法中使用的是具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，或者通过以保藏号CBS 120060保藏的大肠杆菌DH5α中存在的cDNA的表达可获得的多肽。因此，具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的多肽，或者通过以保藏号CBS 120060保藏的大肠杆菌DH5α中存在的cDNA的表达可获得的多肽具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的多肽，或者通过以保藏号CBS 120060保藏的大肠杆菌DH5α中存在的cDNA的表达可获得的多肽也是本发明优选的多肽。相同性百分比以排列对比的序列之间相同氨基酸残基数除以减去所有缺口长度的排列对比的序列的长度而计算。使用DNAman 4.0最佳排列对比程序使用默认参数进行多个序列排列对比。
技术人员理解本发明的筛选方法可以使用得自其它真菌生物体例如得自其它丝状真菌的UDP-吡喃半乳糖变位酶进行。优选的真菌生物体是：烟曲霉、黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicilium chrysogenum)、粗糙脉孢酶(Neurospora crassa)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Trichoderma virid ie、Chrysosporium lucknowense、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(anamorph Fusarium graminarium)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、Magneporthe grisae、Ustilago maydis。表达本发明的UDP-吡喃半乳糖变位酶的任何真菌均是本发明的方法中测试的潜在的抗真菌化合物的潜在靶。这种多肽可以使用现有的分子生物学技术获得。更优选地，所用的多肽得自黑曲霉菌株。本发明也涵盖了从单一生物体中分离一些UDP-吡喃半乳糖变位酶。因此，所有这些多肽也是本发明的一部分。图1示出了不同真核生物体的UDP-吡喃半乳糖变位酶的系统发生树。数字表示相同性百分比。相同性百分比通过计算序列中相同氨基酸的数目除以减去所有缺口长度的氨基酸序列的长度的比率而确定。在树的分支处的数字表示相同性百分比。使用DNAman(版本4.0)Optimal Alignment(Full Alignment)程序进行蛋白质多个序列排列对比。
根据另一个优选的实施方案，本发明的也是优选用于本发明的筛选方法中的多肽是上述任一多肽序列的变体。变体多肽可以是所述多肽的非天然发生的形式。可以通过一些工程化方式使得多肽变体与分离自其天然来源的多肽有所不同。变体可以通过定向诱变产生，从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列开始或者从编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SEQ ID NO：2所示核酸序列开始。优选地，所述多肽变体含有不改变编码的多肽的生物学功能的突变。根据一个优选的实施方案，所述多肽变体具有增强的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。具有增强的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的多肽变体是与在指定分析中测定的其野生型对应物的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性相比UDP-吡喃半乳糖变位酶活性增强的一种多肽。优选地，所述分析是Scherman et al，(2003)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47：378-382描述的分析方法。根据一个更优选的实施方案，在上述Sherman分析中，所述多肽变体与具有SEQ ID NO：1序列的多肽相比具有增强的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。根据一个更优选的实施方案，在使用上述Scherman分析中测定所述多肽变体与黑曲霉ATCC9029或CBS 120.49及衍生物的UDP-吡喃半乳糖活性相比具有增强的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。具有增强活性的多肽是非常有益的，因为其可有利地用于本发明的筛选分析中。预期当使用这种变体多肽时，所述筛选分析将更敏感。
根据第一个优选的实施方案，在体外在简便的容器如微量滴定平板中将多肽与潜在的抗真菌化合物接触。或者，根据本发明的第二个优选的实施方案，在宿主细胞体内将多肽与潜在的抗真菌化合物进行接触，这种方案在后文描述。
在所述方法的第二个步骤中，鉴别所述潜在的抗真菌化合物对多肽的活性的作用，如果所述多肽活性降低则表明所述潜在抗真菌化合物的抗真菌活性。多肽活性可以是任何可检测及可测量的多肽活性，例如酶活性、抑制活性、生物合成活性、转运活性、细胞分化活性、转录活性或者翻译活性。根据一个优选的实施方案，所述多肽的活性是指酶活性。
根据参与细胞壁合成的多肽，技术人员将知晓哪个分析最适于评价选择的多肽的活性。潜在的抗真菌化合物的作用可以通过使用一种分析、优选微量滴定平板分析而确定，其中所述多肽的活性是使用技术人员已知的任何简便分析方法确定，例如基于放射性、荧光的分析方法或者通过HPLC确定。
当多肽活性是指酶活性时，优选通过使用检测UDP-吡喃半乳糖转化为UDP-呋喃半乳糖的分析方法评价酶活性，特别是在如果所用的多肽是UDP-吡喃半乳糖变位酶的情况中。用于检测UDP-吡喃半乳糖变位酶的一个优选的分析方法是Scherman et al，(2003)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47：378-382所述方法。
其它优选的分析包括使用Galf特异性抗体通过抗体标记(有条件地)筛选Galf残基水平降低的突变体的分析方法，使用放射性标记的Galf的自杀选择方法。这些方法可以鉴别与向O-或N-连接的甘露糖链加入GalF相关的其它潜在的抗真菌靶。优选的使用放射性标记的Galf的自杀选择方法根据在分离甘露糖化突变体的描述中所述的方法进行(Huffaker，T.C.，and Robbins，P.W.(1982)J.Biol.Chem.257，3203-3210)。
多肽活性的降低通过在有和无所述潜在的抗真菌化合物的条件下检测所述多肽活性而评价。优选地，所述多肽的活性在存在所述潜在的抗真菌化合物时与在不存在所述潜在的抗真菌化合物时相比降低。所述多肽活性可以完全降低即降低100％，或者部分降低。例如多肽活性可降低10％、20％、30％、40％、50％，、60％或70％以上，或者降低75％、80％、85％或90％或者92％、94％、96％、98％或99％以上。
根据一个优选的实施方案，所述多肽的活性在存在所述潜在的抗真菌化合物时与在不存在所述潜在的抗真菌化合物时相比降低至少20％，表明所述潜在的抗真菌化合物的抗真菌活性。
根据一个更优选的实施方案，所述多肽的活性在存在所述潜在的抗真菌化合物时与在不存在所述潜在的抗真菌化合物时相比降低至少30％、更优选至少40％、最优选至少50％，表明所述潜在的抗真菌化合物的抗真菌活性。
核酸序列
另一方面，本发明涉及编码在上文题目为“用于本发明筛选方法中并且是本发明目的的优选的多肽”的段落中所描述所有优选多肽的核酸序列，所述多肽例如
-具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性，及
-具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少48％相同性的氨基酸序列。
根据一个优选的实施方案，所述核酸序列选自：
(a)与SEQ ID NO：2所示核酸序列具有至少50％相同性的核酸序列，
(b)(a)的变体。
相同性百分比是通过计算序列中相同核苷酸的数目除以总核苷酸长度减去所有缺口长度的差值所得比率而确定。使用DNAman(版本4.0)Optimal Alignment(Full Alignment)进行多个序列排列对比。示出505％或更高相同性的相关DNA序列的最小长度应为40个核苷酸或更长。优选地，所述相同性为至少55％、60％、65％、70％、75％，、80％、85％、90％、95％、98％及更优选至少99％。最优选地，所述核酸序列具有SEQ ID NO：2所示核酸序列。
根据一个优选的实施方案，所述核酸序列包含一个片段，所述片段与由SEQ ID NO：2的第121位碱基对至第334位碱基对组成的片段具有至少50％相同性。SEQ ID NO：2的这个片段称作片段I。片段I编码先前所述的多肽的片段1。优选地，与片段I的相同性为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％及更优选至少99％。最优选地，与片段I的相同性为100％。
根据一个优选的实施方案，所述核酸序列包含一个片段，所述片段与由SEQ ID NO：2的第901位碱基对至第1006位碱基对组成的片段具有至少50％相同性。SEQ ID NO：2的这个片段称作片段II。片段II编码先前所述的多肽的片段2。优选地，与片段II的相同性为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％及更优选至少99％。最优选地，与片段II的相同性为100％。
根据一个优选的实施方案，所述核酸序列包含两个片段，一个片段与片段I具有至少50％相同性，另一个片段与片段II具有至少50％相同性。更优选地，与每个片段的相同性为至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％及更优选至少99％。最优选地，与每个片段的相同性为100％。
根据另一个优选的实施方案，本发明的核酸序列是上述核酸序列的变体。核酸序列变体可用于制备上文所述的多肽变体。核酸变体可以是上述任何核酸序列的片段。核酸变体也可以是通过遗传密码的简并而与SEQ ID NO：2不同的核酸序列。核酸变体也可以是SEQ ID NO：2的等位基因变体。等位基因变体是指占据相同染色体基因座的基因的任两或多种可选择形式。优选的核酸变体是含有沉默突变的核酸序列。或者或组合，核酸变体也可以通过导入取代而获得，所述取代不导致由所述核酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列的产生、但是其相应于意欲生产本发明多肽的宿主生物的密码子应用。根据一个优选的实施方案，所述核酸变体编码仍具有其生物学功能的多肽。更优选地，所述核酸变体编码具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的多肽。更优选地，所述核酸变体编码具有如前述增强的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的多肽。编码具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的多肽的核酸序列可以分离自任何微生物。
所有这些变体均可以通过使用本领域技术人员已知的技术获得，例如在对于可用于设计探针的SEQ ID NO：2核酸序列或其变体而言低度至中度至高度严格杂交条件下通过杂交(Southern印迹法)筛选文库而获得。低度至中度至高度严格条件是指在42℃在5XSSPE、0.3％ SDS、200pg/ml剪切和变性的鲑精DNA及对于低度至中度至高度严格性而言分别为25％、35％或50％的甲酰胺中预杂交和杂交。随后，将杂交反应物洗涤3次30分钟，每次使用2XSSC、0.2％SDS洗涤，对于低度至中度至高度严格性分别在55℃、65℃或75℃进行。
本文提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括错误鉴别的碱基。技术人员能鉴别这种错误鉴别的碱基，并知道怎样校正这种错误。在序列错误的情况中，以通过含有编码本发明多肽的核酸序列且保藏号为CBS 120060的大肠杆菌DH5α中存在的cDNA的表达而可获得的多肽的序列为准。
核酸构建体，表达载体
另一方面，本发明涉及一种包含前文描述的核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性并具有与SEQ ID NO：1所示序列具有至少65％相同性的氨基酸序列的多肽。
任选地，所述核酸构建体中存在的核酸序列与一或多个控制序列可操纵地连接，所述控制序列指导所述多肽在合适的表达宿主中产生。
可操纵地连接在本文是指一种构型，其中控制序列合适地位于编码本发明多肽的核酸序列的相关位置，由此所述控制序列指导本发明多肽的产生。
表达是指包括参与多肽产生的所有步骤，包括但非限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
核酸构建体是指一种核酸分子，其分离自天然发生的基因或者已经修饰为天然不存在的含有组合或并列方式的核酸节段。
控制序列在本文是指包括为多肽的表达所需或有利的所有成分。所述控制序列最低限度包括启动子及转录和翻译终止信号。
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的表达载体。优选地，所述表达载体包含与一或多个控制序列可操纵地连接的本发明的核酸序列，所述控制序列指导所编码的多肽在适当的表达宿主中产生。控制序列最低限度包括启动子及转录和翻译终止信号。所述表达载体可以看作是一种重组表达载体。所述表达载体可以是任何载体(例如质粒、病毒)，其可以方便地进行重组DNA方法并且可以使得编码所述多肽的核酸序列表达。根据将导入这种表达载体的宿主及根据本发明核酸序列的来源，技术人员将了解怎样选择最合适的表达载体和控制序列。
宿主细胞
另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含前文描述的本发明的核酸构建体或表达载体。所述宿主细胞表达具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性及具有与SEQ ID NO：1具有至少65％相同性的氨基酸序列的本发明多肽。所述宿主细胞的选择很大程度上依赖于本发明核酸序列的来源。根据所述宿主细胞，技术人员将已知怎样将其用本发明的构建体或载体转化。
所述宿主细胞可以是适于表达本发明多肽的任何微生物、原核或真核细胞。优选使用细菌、酵母、真菌或者哺乳动物宿主细胞。更优选使用埃希氏菌(Escherichia)、糖酵母(Saccharomyces)、曲霉。更优选使用本领域熟知的过表达多肽的大肠杆菌、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、黑曲霉的菌株。在“用于本发明筛选方法中并且是本发明目的的优选的多肽”段落中列出的细胞也是优选的宿主细胞。所述宿主细胞可以认为是重组宿主细胞。或者，其它优选的宿主细胞是昆虫、CHO细胞系、PER.C6细胞。
转化丝状真菌的合适方法可包括这样一种方法，即包括技术人员已知方式的原生质体形成、原生质体转化及细胞壁再生。对于曲霉而言合适的转化方法是Yelton et al，1984，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA，81：1470-1474.描述的方法。
根据一个优选的实施方案，在相同条件下培养和/或分析时，因此获得的宿主细胞过表达即产生比正常量更多的本发明UDP-吡喃半乳糖变位酶多肽和/或与衍生出所述宿主细胞的亲代宿主细胞相比具有更高的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
“产生比正常量更多的量”在本文是指当细胞(亲代细胞和转化的细胞)在相同条件下培养时，转化的宿主细胞与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞相比产生更多的本发明多肽。优选地，当在相同条件下培养时，本发明的宿主细胞与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞相比产生多出至少3％、6％、10％或15％的本发明多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶。
优选与亲代细胞相比产生多出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或150％所述多肽的宿主。根据另一个优选的实施方案，将本发明的宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶的生产水平与作为对照的CBS 120.49或ATCC9029菌株的生产水平进行对比。根据一个更优选的实施方案，当本发明的宿主细胞是黑曲霉菌株时，将本发明宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶的生产水平与用作对照的CBS 120.49或ATCC9029菌株的生产水平进行对比。
所述多肽的生产水平的评价在mRNA水平可以通过Northern印迹或阵列分析进行，和/或在多肽水平通过Western印迹进行。所有这些方法均为技术人员所熟知。
“显示更高的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性”在本文是指与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞之一相比显示更高的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性，其中使用特异于UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的分析方法确定所述活性。优选地，所述分析是本文已经描述的Scherman所述方法。优选地，本发明的宿主细胞与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞相比显示高出至少3％、6％、10％或15％的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性，其中使用特异于UDP-吡喃半乳糖变位酶的分析方法、优选Scherman分析确定所述活性。优选与亲代细胞相比显示高出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或150％所述活性的宿主。根据另一个优选的实施方案，将本发明的宿主细胞的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性水平与用作对照的CBS 120.49或ATCC 9029菌株的相应活性进行比较。根据一个更优选的实施方案，当本发明的宿主细胞是黑曲霉菌株时，将本发明宿主细胞的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性水平与用作对照的CBS 120.49或ATCC 9029菌株的相应活性水平进行比较。
所述过表达可以通过本领域已知的常规方法完成，如通过将非天然存在的更多拷贝的UDP-吡喃半乳糖变位酶编码基因在载体上或在染色体中导入宿主中。或者，所述UDP-吡喃半乳糖变位酶编码基因可以通过将其与适于在选择的生物体中高水平表达蛋白质的高表达型或强启动子融合或者组合这两种方法而得以过表达。或者或组合，具有如前述增强活性的UDP-吡喃半乳糖变位酶多肽可以在本发明的宿主细胞中被过表达。这可以使用强启动子和/或通过将多个拷贝的编码基因导入宿主中而实现。技术人员根据宿主细胞的相同性将已知哪个强启动子是最合适的。优选地，当宿主细胞是黑曲霉菌株时，所述强启动子是葡糖淀粉酶启动子或gpdA启动子。
过表达宿主细胞可用于产生大量的UDP-吡喃半乳糖变位酶，其随后可用于上述本发明方法中。
-在第一个实施方案中，首先使用本发明的宿主细胞产生本发明多肽。因此，另一方面，本发明涉及一种通过将本发明的宿主细胞在合适的培养条件下培养产生上述本发明多肽的方法。随后，将产生的多肽在体外与先前所述的潜在的抗真菌化合物接触(在后文称作体外方法)。
-在第二个优选的实施方案中，本发明多肽与潜在的抗真菌化合物之间的接触步骤(步骤(i))是在体内在本发明的宿主细胞中进行。因此，步骤(i)中所述多肽通过其在本发明宿主细胞中的表达与潜在的抗真菌化合物接触。
体内方法
因此，过表达本发明宿主细胞可本身用于本发明的方法中(后文称作体内方法)。因此，一种鉴别抗真菌化合物的筛选方法包括：
(i)将本发明的宿主细胞、优选过表达的本发明的宿主细胞与潜在的抗真菌化合物接触，然后
(ii)鉴别所述潜在的抗真菌化合物对所述多肽活性的作用，如果所述多肽活性降低，则表明抗真菌活性，这也涵盖在本发明内。
所述潜在的抗真菌化合物的相同性及细胞与潜在的抗真菌剂的接触方式与前述体外方法相同。
当使用细胞代替多肽时，技术人员已知有许多方式评价所述潜在抗真菌化合物怎样影响细胞行为和/或多肽活性。优选使用前述方法评价对于所述多肽活性的影响或降低。
优选地，在发明的体内方法的步骤(ii)中，进一步加入至少一种细胞壁应激诱导剂，所述潜在的抗真菌化合物对多肽活性的作用通过与用相同的细胞壁应激诱导剂在不存在所述潜在的抗真菌化合物时处理的相似细胞的情况相比，在存在至少一种细胞壁应激诱导剂的条件下出现更为严重的(severe)表型而表明。细胞壁应激诱导剂的加入是在本发明的多肽和/或细胞上传感所述潜在的抗真菌化合物的潜在抗真菌活性的另外的和/或可供选择的一种方式。
细胞表型的严重度优选通过测定其生长能力(测定光密度)和/或通过显微镜观测其形态学方面而加以评价。通过使用特定波长、优选560—620nm之间的波长在小容器(微量滴定平板孔)中测定光密度可易于监测真菌生长。显微镜观察显示真菌的生长方面的形态学异常和缺陷以及可能的真菌溶解。
本领域技术人员已知一些细胞壁应激诱导剂。优选所述细胞壁应激诱导剂选自Calcofluor白(CFW)、刚果红、caspofungin、衣霉素、SDS，及升高的温度。
优选如实施例所述加入至少一种所述细胞壁应激诱导剂(在“二级筛选”章节中描述)。更优选如下文所述。将2×104个孢子接种于含有100μl 2X完全培养基的96孔光学玻璃底微量滴定平板的每个孔中，在37℃生长6小时。技术人员已知根据宿主细胞的相同性选择完全培养基。优选地，当宿主细胞是曲霉菌株时，完全培养基包含Bennett J.W.and Lasure L.L.((1991)，More gene manipulations in fungi.pages 441-447，Academic Press，San Diego所述的曲霉基本培养基，补加了10μg/l酵母提取物和5μg/l酪蛋白氨基酸。在孢子萌生之后，将10μl每种细胞壁应激诱导剂的两倍稀释液加入各个孔中。优选测试至少三种不同浓度、更优选至少七种不同浓度的每种细胞壁应激诱导剂的作用。在加入所述细胞壁应激诱导剂之后，将微量滴定平板在37℃保温大约3小时以上。通过倒转该微量滴定平板弃去培养基之后，观测附于每个孔底部的幼体。菌株ATCC9029或CBS 120.49及化合物CFW的系列稀释液可用作阴性对照。用装备DKC-5000(Sony)数码相机的Axioplan 2(Zeiss)取光图像。优选地，使用的caspofungin浓度范围是0.4—26μg/ml。对于衣霉素，优选使用的浓度范围是3—176μg/ml。优选如实施例所述加入CFW和/或SDS。更优选地，加入0.001—0.01％w/v SDS和/或0.01—0.1mg/ml CFW和/或70—500μg/ml刚果红。更优选地，加入大约0.005％w/v SDS和/或0.01—0.1mg/ml CFW和/或大约75μg/ml刚果红。
升高的温度的含义如实施例所述，即细胞在大约30℃或在升高的温度(大约42℃)下生长。如果发现如下述的温度敏感性生长缺陷，则优选加入渗透压稳定剂如0.5—1.5μM山梨醇，以测试温度-生长缺陷表型的抑制力，其可以表明抗真菌化合物的效力。更优选地，加入大约1.2μM山梨醇。
根据一个优选的实施方案，与在不存在所述潜在抗真菌化合物的条件下用相同细胞壁应激诱导剂处理相似的细胞相比，本发明所述细胞的更严重的生长表型在存在所述潜在抗真菌化合物的条件下导致该细胞的生长低至少10％，则表明所述潜在抗真菌化合物的抗真菌活性。
根据一个更优选的实施方案，在存在所述潜在的抗真菌化合物时，所述细胞的更严重的生长表型导致生长低至少20％、30％、40％、50％、60％、80％、100％。
试剂盒
另一方面，本发明涉及一种进行本发明体外筛选方法的试剂盒。所述试剂盒在单独的容器中包含(i)参与细胞壁合成的多肽，及(ii)所述多肽的底物。试剂盒可进一步含有标记物和对照物。优选地，所述试剂盒中存在的多肽是前文描述的任一优选的多肽。因此，另一方面，本发明涉及这种试剂盒进行所述体外筛选方法的应用。
抗真菌化合物
再一方面，本发明涉及通过本发明的任何方法鉴别的一种抗真菌化合物，及涉及包含本发明抗真菌化合物的组合物。
产生更少的本发明多肽和/或具有更低UDP-吡喃半乳糖变位酶活性 的宿主细胞
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，当在相同条件下培养和/或分析这两种细胞(亲代细胞和宿主细胞)时，所述宿主细胞与衍生出该宿主细胞的亲代细胞相比产生更少的本发明多肽和/或具有更低的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
宿主细胞的相同性及本发明多肽与前文所述一样。本文已经描述了测定UDP-吡喃半乳糖变位酶的分析方法。产生更少的多肽和/或具有更低活性的解释与细胞产生更多的多肽和/或具有更高活性的解释方式一样。
优选地，当在相同条件下培养这两种细胞(亲代细胞和转化的细胞)时，本发明的宿主细胞与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞相比产生低至少3％、6％、10％或15％的本发明多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶。优选与亲代细胞相比产生低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的所述多肽的宿主细胞。
根据另一个优选的实施方案，将本发明宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶的生产水平与CBS 120.49或ATCC 9029的生产水平相对比。根据另一个优选的实施方案，特别是当本发明的宿主细胞是黑曲霉菌株时，本发明宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶的生产水平与CBS 120.49或ATCC 9029的生产水平相对比。
所述多肽的生产水平的评价在mRNA水平通过Northern印迹或阵列分析进行，在多肽水平通过Western印迹进行。所有这些方法为技术人员所熟知。
优选地，本发明的宿主细胞与衍生出所述转化的宿主细胞的亲代宿主细胞相比具有低至少3％、6％、10％或15％的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性，其中所述活性使用特异于UDP-吡喃半乳糖变位酶的分析方法、优选使用Scherman分析来确定。优选与亲代细胞相比具有低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％所述活性的宿主。根据另一个优选的实施方案，将本发明宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶活性与CBS 120.49或ATCC 9029的相应活性相对比。
根据另一个优选的实施方案，特别是当本发明的宿主细胞是黑曲霉菌株时，将本发明宿主细胞的多肽UDP-吡喃半乳糖变位酶活性与CBS 120.49或ATCC 9029的相应活性相对比。
根据一个更优选的实施方案，所述宿主细胞不产生任何可监测量的本发明多肽和/或不具有任何可检测的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。优选地，所述宿主细胞不产生或完全不产生UDP-吡喃半乳糖变位酶。
或者，根据其它优选的实施方案，所述宿主细胞产生可诱导的本发明多肽和/或具有可诱导的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
本发明多肽的表达水平降低和/或其活性水平降低可以通过本领域已知的常规方法实现，例如通过使内源UDP-吡喃半乳糖变位酶编码基因失活或对其进行负调节。这种失活或负调节可以通过缺失编码基因中的一或多个核苷酸而实现。在另一个实施方案中，本发明涉及一种宿主，优选在其UDP-吡喃半乳糖变位酶编码基因中具有突变的丝状真菌。为了构建具有失活的UDP-吡喃半乳糖变位酶基因的宿主，优选制备置换或失活载体，随后通过转化将其导入宿主中。本领域技术人员已知怎样构建这种载体。
可选或与内源基因的失活组合，UDP-吡喃半乳糖变位酶基因的表达可以通过将其与适于在选择的生物体中低水平表达蛋白质的弱启动子融合而降低。优选当所述宿主细胞是黑曲霉菌株时，弱启动子是构巢曲霉的trpC启动子或者黑曲霉的pyrG启动子。
可选或与内源基因的失活组合，UDP-吡喃半乳糖变位酶基因的表达可以通过将其与适于在选择的生物体中使蛋白质可诱导地表达的可诱导启动子融合而使其可被诱导。
优选当宿主细胞是黑曲霉菌株时，所述可诱导的启动子是葡糖淀粉酶启动子，其可以被淀粉诱导(Fowler T，et al.，1990.Regulationof the glaA gene of A.niger.Curr Genet.18：537-545)，或者inuE启动子，其可以被蔗糖诱导(Moriyama S et al.，2003.Molecular cloningand characterization of an exoinulinase gene from A.niger strain 12 andits expression in Pichia pastoris.J Biosci Bioeng.96：324-331)。
另一方面，本发明涉及当在相同条件下培养两种细胞(亲代和宿主细胞)时，与衍生出宿主细胞的亲代细胞相比产生更少的本发明多肽和/或具有更低UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的这种宿主细胞的应用。这种宿主细胞可用于产生感兴趣的多肽。使用这种宿主可以产生任何多肽。优选地，产生糖蛋白。预期与由仍表达UDP-吡喃半乳糖变位酶多肽的相似宿主细胞产生的相同糖蛋白相比，这种宿主细胞产生具有更少的半乳甘露聚糖和/或呋喃半乳糖的糖蛋白。优选地，产生的糖蛋白基本上没有半乳甘露聚糖和/或呋喃半乳糖。这些糖是真菌细胞壁多肽的主要成分，但是在哺乳动物糖蛋白中不存在。因此预期产生的这些糖蛋白对将对其给予这些糖蛋白的哺乳动物宿主不产生任何显著的过敏反应。
本发明通过如下实施例得以进一步描述，这些实施例无限制本发明范围之意。
实施例
构建一种报道菌株，其中将agsA启动子与乙酰胺酶(amdS)选择标记及与WO 03/20922所述的核靶向的GFP(H2B-GFP)报道构建体融合，允许选择激活细胞壁完整性应答的反式激活突变并因此提供组成型增加的agsA启动子活性。初次筛选产生240个mia突变体(具有诱导的agsA启动子活性的突变体)，对其进行各种二次筛选(例如渗透性可逆温度敏感性，Calcofluor白和SDS敏感性)。互补分析示出miaA、miaB和miaC突变体由具有重叠插入体的粘粒互补，表明其突变可能是等位基因性的。菌株、转化及生长条件
在这项研究中使用黑曲霉N402(ATCC9029的cspA1衍生物，Bos et al.，1988)和AB4.1(N402的pyrG衍生物，van Hartingsveldt etal.，1987)。所述菌株在含有1％(w/v)葡萄糖和0.1％(w/v)酪蛋白氨基酸的基本培养基(MM)(Bennett and Lasure，1991)上或者在除了含有MM之外还含有0.5％(w/v)酵母提取物的完全培养基(CM)上生长。当需要时，为平板补加尿苷(10mM)或潮霉素(100μg/ml)。在30℃生长4—6天后，用0.9％(w/v)NaCl从CM平板中分离分生孢子。如(Kelly and Hynes，1985)所述制成含有乙酰胺作为唯一氮源的MM琼脂平板。如Punt and van den Hondel(1992)所述进行黑曲霉的转化，使用40mg溶菌酶(Sigma，L-1412)/g新鲜菌丝体。为了使用潮霉素选择标记进行共转化，使用pAN7-1(登记号Z32698)。根据厂商指导将大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)通过电穿孔转化以使得粘粒增殖和扩增。使用Inoue et al.(1990)所述热激方案转化XL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)，并将其用于质粒扩增。大肠杆菌在Sambrook et al.(1989)所述LB中生长，如果需要则加入50μg/ml氨苄青霉素。
分子技术
如Kolar et al.(1988)所述分离真菌染色体DNA。根据厂商指导使用Rediprime II DNA标记系统(Amersham Pharmacia Biotech)合成32P dCTP标记的探针。如Sambrook et al.(1989)所述使用HybondN+(Amersham Pharmacia Biotech)进行Southern印迹分析，杂交信号使用Phosphor Imager(Molecular Dynamics)检测。限制酶得自Invitrogen，根据供应商指导进行使用。DNA片段的连接使用快速DNA连接试剂盒(Roche)进行。当需要时，将片段用虾碱性磷酸酶(Roche)去磷酸化。通过ServiceXS(Leiden，Netherlands)进行测序。诱变和初次突变体筛选
如下构建用于诱变的菌株。将AB4.1(pyrG-)菌株用PagsA-amdS-TamdS-pyrG*或PagsA-H2B-GFP-TtrpC-pyrG*(WO03020922)转化。对于这两种菌株，基于Southern分析(数据未示出)选择具有整合在pyrG基因座上的单个拷贝的所述构建体的转化体，将其分别称作RD1.7和RD5.43。接着，将菌株RD1.7用PagsA-H2B-GFP-TtrpC共转化，将菌株RD5.43用PagsA-amdS-TamdS共转化，在这两种情况中均使用pAN7-1。通过PCR分析转化体中完整报道构建体的存在，产生菌株RD6.13和RD6.47(含有靶向于pyrG基因座的PagsA-amdS-TamdS及共转化的PagsA-H2B-GFP-TtrpC)及菌株RD15.4和RD15.8(含有靶向于pyrG基因座的PagsA-H2B-GFP-TtrpC及共转化的PagsA-amdS-TamdS)。将所有四种菌株均进行UV诱变。将新鲜收获的孢子稀释为1×107个孢子/ml，将15ml孢子溶液在Bio-Radcross linker(最大能量输出λ＝254nm，UV剂量为60J s-1m2)中以10秒间隔诱变0—100秒。在不同时间点的存活率通过将诱变的分生孢子悬浮液的稀释液铺板于CM平板上而确定。对具有大约66％存活率的来自孢子悬浮液的分生孢子进行初次筛选。将这四种菌株的每一种菌株以1×104个分生孢子的密度均接种于以乙酰胺为唯一氮源的60个MM平板中，在30℃保温。5天后，将每个平板的单个处于快速生长中的菌落转移至CM平板，纯化两次，产生240个初次突变体。
二次筛选
在乙酰胺上生长
对纯化的突变体再次测试其在30℃在乙酰胺平板上的生长能力。将等量的分生孢子(～5×102个)点于以乙酰胺作为唯一氮源的MM平板上，3天后照相。
核GFP水平
为了进行显微镜成像，将分生孢子在具有酪蛋白氨基酸的MM中的载玻片上在30℃生长18小时。将附着分生孢子的载玻片置于显微镜载物片上，在装备了DKC-5000(Sony)数码相机的Axioplan 2(Zeiss)上使用1秒钟固定曝光时间摄取显微镜GFP图像。N402作为阴性对照，PgpdA-H2B-GFP(+)为阳性对照，使用未诱变的亲代菌株(PagsA-H2B-GFP)的基础水平。使用Qwin Pro(LEICA，v2.2)分析GFP图像。简而言之，图像的绿色道通过选择所有绿色像素进行分析，像素值>130，正如所预期的那样其相应于细胞核。针对这些选择确定平均GFP值(平均Grn)和最大GFP值(最大Grn)并与未诱变的数值进行对比。其中当与未诱变的菌株对比时其平均或最大GFP值较高的突变体被认为是促进从启动子表达GFP的突变体。
温度敏感性
将浓度从1×104个孢子开始的亲代和突变菌株孢子的10倍稀释液在30℃、37℃或42℃在MM平板上生长4天。对比两个平板的菌落形态(例如孢子形成情况和直径)。
在30℃和42℃渗透可逆性
检测加入渗透性稳定剂山梨醇的作用。如上述，将菌株在有或未加入1.2M山梨醇的MM上在30℃或42℃生长4天。
SDS刚果红和CFW敏感性
用亲代和突变菌株的孢子接种含有0.005％(w/v)SDS、75μg/ml刚果红和0.1mg/ml CFW或者0.01mg/ml CFW的MM平板，在30℃、37℃、42℃温度生长4天。将菌落大小和形态与在相同条件下生长的无添加剂的MM平板的菌落大小和形态进行对比。
细胞壁突变体的互补
miaA、miaB和miaC突变体的pyrG衍生物通过将1×105个孢子铺板于MM-5-FAO-平板(0.75μg/l5-氟-乳清酸(5-FOA，USBiological)上而获得，其中用10mM脯氨酸代替NaNO3作为氮源。另外，所述培养基进一步含有10mM尿苷。将分生孢子菌落在补加10mM尿苷的MM平板上纯化两次，基于其在有和无尿苷的含有0.005％(w/v)SDS的MM平板上的表型进行分析。因此，在pyrE(乳清酸磷酸核糖转移酶，OPRTase；EC 2.4.2.10))和pyrG(乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，OMPdecase；EC 4.1.1.23))中的突变可赋予5-FOA(Boeke et al.，1984，Takeno et al.，2004)抗性，将抗性菌株用含有pyrE(pMApyrE)或pyrG(pAB4.1)的质粒转化，基于在无尿苷的条件下的生长分析其互补情况。将仅可由pyrG互补的5-FOA抗性菌株用于进一步分析。pyrE的序列提交给DDBJ/EMBL/GenBank数据库，登记号为AY840014。
将pyrG突变体用基因组粘粒文库(由Dr.F.Schuren and Dr.P.Punt，TNO Nutrition，The Netherlands惠赠)转化。在转化平板上基于在无尿苷条件下的生长能力选择转化体(pyrG互补)。突变体表型的互补通过筛选已经获得在42℃亲代SDS敏感性的菌株进行分析。在用基因组粘粒文库转化后，将孢子从转化平板中分离，转移至含有具有0.005％(w/v)SDS的基本培养基的平板中，在42℃生长4天。使用分离基因组DNA的方案(Kolar et al.，1988)，从推定互补的黑曲霉菌株中分离粘粒。用所述粘粒转化大肠杆菌(DH5α)并在具有氨苄青霉素的LB平板上生长。随后使用如Sambrook et al.(1989)所述小规模DNA分离方法从40ml过夜培养物中分离粘粒。在大肠杆菌中扩增后，将所述粘粒进行限制分析。对于每种单独获得的互补转化体，获得粘粒的至少四种限制模式。将不相同的粘粒反过来转化其相应mia(pyrG-)菌株，基于恢复野生型温度敏感性和SDS敏感性而分析其与突变互补的能力。基于限制模式和互补测试，发现一个miaA的互补粘粒。获得与miaB突变体互补的三个不同但重叠的粘粒。miaA和miaB的限制模式相似，表明它们也是重叠的。获得miaC的四个互补粘粒。遗憾的是这些miaC粘粒对于限制酶消化和末端测序有抗性(见下文)，这样妨碍了进一步分析。对通过miaA和miaB互补粘粒的限制分析获得的可能重叠情况通过对粘粒的插入体末端进行测序而证实。使用引物cosT7和cosUL对插入体的末端进行测序。黑曲霉基因组序列粘粒彼此的对比示出miaA互补粘粒和三个miaB互补粘粒都有含有至少9个预知ORF的35kb区域。进一步的亚克隆和互补分析针对两个候选ORF(8650和8660)。这些ORF是分别使用引物对8650P1/8650P2和8660P3/8660P2从野生型菌株(N402)的基因组DNA中经PCR扩增的。用这两个基因的PCR片段转化miaA、miaB和miaC突变体。仅是具有8660 ORF的PCR片段与突变体的所有表型均互补(在42℃的温度敏感性生长缺陷，SDS和CFW超敏性)。因此，可以鉴别与miaA、miaB和miaC突变体互补的基因，看起来是8660。所述蛋白质显示与UDP-吡喃半乳糖变位酶编码基因的显著序列相似性，我们将这个基因称作glfA。其基因组序列示作SEQ ID NO：3，推导的cDNA和蛋白质序列分别示作SEQ ID NO：2和1。
对miaA和miaC突变体的glfA等位基因进行测序证实编码GlfA的基因中的突变。所述miaA菌株中的glfA基因座在第1756位含有一个点突变(T突变为C)(起始密码子的核苷酸ATG＝1)，导致在第462位氨基酸改变(F转变为S)。所述miaC菌株的glfA基因座在第725和727位含有两个突变(均为T突变为C)，导致在第157和158位的两个氨基酸改变(分别为L改变为P及F改变为L)。
缺少glfA的菌株的构建
构建完整glfA基因的缺失突变体。为此，构建一种质粒，其含有米曲霉的pyrG选择标记，两侧具有glfA基因的5’和3’侧翼区(图2A)。如下产生所述构建体：使用引物8660P7和8660P8(见下表1)扩增含有glfA的5’侧翼区的一个1.2kb片段，用XbaI和NotI消化，随后克隆进XbaI和NotI消化的pBluescript-KS中。由此获得构建体p5-8660。使用引物8660P9和8660P10扩增glfA基因座的1.0kb的3’侧翼区。将该片段用XbaI和NotI消化，克隆进XbaI和EcoRI消化的pBluescript-KS片段中，产生p3-8660。米曲霉pyrG基因作为3.4kb Xba片段从pAO4-13(de Ruiter-Jacobs et al.，1989)中分离。将p5-8660用XbaI和EcoRI切开，将p3-8660的AopyrG片段和XbaI-EcoRI片段克隆进这个质粒中产生pΔ8660。随后将这个质粒用NotI线性化并转化AB4.1。在无尿苷的MM上将原代转化体纯化两次。少数(140个中有6个)转化体在高温下生长不良。将这些突变体和其它一些进行Southern印迹分析。预期通过同源重组缺失8660基因座导致在用HindIII消化后出现9.7kb的片段并丧失预期在野生型菌株中的8.0kb杂交片段。图2B中的Southern印迹分析证实glfA基因在菌株#67和#97中已经缺失。对敲除体进一步进行以下分析：温度敏感性生长、通过高渗透性条件对温度敏感性生长的抑制、对于SDS和刚果红的超敏性(图2C)。所述miaA、miaB和Δ8660菌株的生长表型(温度敏感性生长缺陷及刚果红敏感性)的对比表明所述miaA和miaB突变体的严重性与敲除菌株相同(数据未示出)。Δ8660菌株的表型由具有启动子和终止子序列的含有8660基因的PCR片段(用引物8660P3和8660P2获得)的再转化而再次互补(数据未示出)。
表1：使用的引物列表
使用缺少glfA基因的菌株产生哺乳动物组织血纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)并对其进行分析
制备生产t-PA的表达载体：构建pgpdA-Tpa并分离，如WiebeMG，et al(Wiebe MG，et al Production of tissue plasminogen activator(t-PA)in Aspergillus niger.Biotechnol Bioeng.2001 Sep；76(2)：164-74.)所述进行。.
如Punt and van den Hondel(1992)所述，将如先前所述获得的黑曲霉N402和黑曲霉glfA缺失菌株#67用pgpdA-Tpa和pAN7-1转化。通过PCR分析转化体中载体pgpdA-Tpa的存在。
将含有pgpdA-Tpa的这两种菌株的两个转化体如Wiebe et al.(2001)所述生长，如Wiebe et al.(2001)所述从上清中获得部分纯化的t-PA。如Teotia S et al(Teotia S et al One-step purification ofglucoamylase by affinity precipitation with alginate.J Mol Recognit.2001Sep-Oct；14(5)：295-9.)所述从上清中纯化胞外葡糖淀粉酶。
如Wallis GL et al.(Wallis GL et al，Galactofuranoic-oligomannoseN-linked glycans of alpha-galactosidase A from Aspergillus niger.Eur JBiochem.2001 Aug；268(15)：4134-43)针对α-半乳糖苷酶所述的方法分析t-PA和葡糖淀粉酶的N连接的多糖。通过Leitao EA et al(LeitaoEA，et al，Beta-galactofuranose-containing O-linked oligosaccharidespresent in the cell wall peptidogalactomannan of Aspergillus fumigatuscontain immunodominant epitopes.Glycobiology.2003 Oct；13(10)：681-92.0)所述方法，对得自烟曲霉菌丝体细胞壁的糖蛋白进行分析。
分析示出得自黑曲霉glfA缺失菌株#67产生的t-PA和葡糖淀粉酶的N连接的多糖与得自黑曲霉N402菌株产生的蛋白质的相应N-连接的多糖相比，前者含有的Galf低至少20％。
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序列表
<110>莱顿大学(Hondel van den，Cornelis)
<120>抗真菌筛选方法
<130>P6003711
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>510
<212>PRT
<213>Aspergillus niger
<400>1
Figure A200680033941Q00371
Figure A200680033941Q00381
Figure A200680033941Q00391
Figure A200680033941Q00401
<210>2
<211>1533
<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<400>2
Figure A200680033941Q00402
Figure A200680033941Q00411
<210>3
<211>6001
<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<400>3
Figure A200680033941Q00412
Figure A200680033941Q00431
Figure A200680033941Q00461
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>sequence primer
<400>4
Figure A200680033941Q00462
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<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<220>
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<211>19
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<213>artificial
<220>
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<400>6
Figure A200680033941Q00464
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<211>18
<212>DNA
<213>artificial
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<400>7
Figure A200680033941Q00471
<210>8
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<213>artificial
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<400>8
Figure A200680033941Q00472
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>sequence primer
<400>9
Figure A200680033941Q00473
<210>10
<211>36
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<213>artificial
<220>
<223>sequence primer
<400>10
Figure A200680033941Q00481
<210>11
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<213>artificial
<220>
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<213>artificial
<220>
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Figure A200680033941Q00483
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>sequence primer
<400>13
Figure A200680033941Q00484

Claims (30)

1.一种鉴别抗真菌化合物的筛选方法，所述方法包括：
(a)将潜在的抗真菌化合物与参与细胞壁合成的多肽接触，随后
(b)鉴别所述潜在的抗真菌化合物对所述多肽活性的作用，
如果所述多肽活性降低，则表明所述潜在抗真菌化合物的抗真菌活性。
2.权利要求1的筛选方法，其中所述多肽是UDP-吡喃半乳糖变位酶。
3.权利要求1或2的筛选方法，其中所述多肽具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少大约48％相同性。
4.前述权利要求任一项的筛选方法，其中所述多肽的活性是指酶活性。
5.权利要求4的筛选方法，其中所述酶活性是使UDP-吡喃半乳糖转化为UDP-呋喃半乳糖。
6.前述权利要求任一项的筛选方法，其中与在不存在所述抗真菌化合物时所述多肽的活性相比，在存在所述潜在的抗真菌化合物时所述多肽的活性降低至少20％，表明所述潜在的抗真菌化合物的抗真菌活性。
7.前述任一项权利要求的筛选方法，其中所述多肽的活性是使用基于放射性、荧光的微量滴定平板或者通过HPLC确定的。
8.一种具有UDP-吡喃半乳糖变位酶活性的多肽，其中所述多肽具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少48％相同性。
9.权利要求8的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
10.权利要求8或9的多肽，其中所述多肽得自真菌菌株，优选得自丝状真菌菌株。
11.权利要求10的多肽，其中所述多肽得自黑曲霉菌株。
12.一种核酸序列，其编码权利要求8—11任一项描述的多肽。
13.权利要求12的核酸序列，其中所述核酸序列选自如下序列：
(a)与SEQ ID NO:2所示核酸序列具有至少50％相同性的核酸序列；和
(b)(a)的变体。
14.权利要求12或13的核酸序列，其中所述核酸序列具有SEQID NO:2所示核酸序列。
15.一种包含权利要求12—14任一项的核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码权利要求8—11任一项的多肽。
16.一种包含权利要求15的核酸构建体的表达载体。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的核酸构建体或者权利要求16的表达载体。
18.权利要求17的宿主细胞，其中当均在相同条件下培养和/或分析时，与衍生出所述宿主细胞的亲代细胞相比，所述宿主细胞产生更多的权利要求8—11任一项描述的多肽和/或显示更高的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
19.一种生产权利要求8—11任一项描述的多肽的方法，所述方法是通过在合适的培养条件下培养权利要求17或18的宿主细胞而进行。
20.权利要求1—7任一项的筛选方法，其中步骤(i)中所述多肽通过其在权利要求17或18描述的宿主细胞中的表达与潜在的抗真菌化合物接触。
21.权利要求20的筛选方法，其中步骤(ii)中另外加入至少一种细胞壁应激诱导剂，其中所述潜在的抗真菌化合物对所述多肽活性的影响通过与用相同细胞壁应激诱导剂在不存在所述潜在的抗真菌化合物时处理相似细胞时相比，与至少一种细胞壁应激诱导剂的存在相关的更严重的细胞表型而表明。
22.权利要求21的筛选方法，其中所述细胞壁应激诱导剂选自CFW、caspofungin、衣霉素、SDS、及升高的温度组成的组。
23.权利要求1或22的筛选方法，其中所述细胞表型的严重性通过测定其生长能力而评价。
24.权利要求23的筛选方法，其中在存在潜在的抗真菌化合物的条件下更严重的细胞生长表型导致与在不存在所述潜在的抗真菌化合物时用相同的细胞壁应激诱导剂处理的相似细胞的生长相比其生长低至少10％，表明所述潜在抗真菌化合物的抗真菌活性。
23.一种试剂盒，其在各独立的容器中包含：
(a)权利要求8—11任一项描述的多肽；和
(b)所述多肽的底物。
24.一种抗真菌组合物，其包含：
(a)一种潜在的抗真菌化合物，其降低权利要求8—11任一项描述的多肽的活性；和
(b)一种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
25.权利要求17的宿主细胞，其中当在相同条件下培养或分析时，所述宿主细胞与衍生出所述宿主细胞的亲代细胞相比产生更少的权利要求8—11任一项描述的多肽和/或显示更低的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞不产生任何可检测量的权利要求8—11任一项描述的多肽和/或不显示可检测的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
27.权利要求25或26的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生可诱导量的权利要求8—11任一项描述的多肽和/或显示可诱导的UDP-吡喃半乳糖变位酶活性。
28.权利要求25—27任一项的宿主细胞在产生感兴趣的多肽中的应用。
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