CN101379396A - 用于检测生物样品中氧化应激生物标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测生物样品中氧化应激的方法，确定氧化损伤累积记录的方法，以及根据生物标志物或其组分的存在或不存在来诊断衰老疾病如心血管疾病的方法。本发明还涉及用于检测生物样品中氧化应激的试剂盒，该试剂盒包括稳定化试剂和抗体。

Description

用于检测生物样品中氧化应激生物标志物的方法

技术领域

本发明涉及用于检测生物样品中氧化应激的方法，确定氧化损伤累积记录的方法，以及根据生物标志物或其组分的存在或不存在来诊断衰老疾病例如心血管疾病的方法。本发明还涉及用于检测生物样品中的氧化应激的试剂盒，其包括稳定化试剂和抗体。

背景技术

在过去的30年中，积累了支持氧化应激与衰老和心血管疾病(CVD)发病有关联的大量实验证据[1-3]。众所周知，“自然抗氧化剂”的随机临床试验令人失望(HOPE，HPS，GISSI-prevention)，并使一些人对氧化应激假说的关联性提出疑问[4-6]。然而，这些研究的大部分没有评价抗氧化剂干预对氧化应激状态的影响，也没有使用备受争议的硫代巴比妥酸反应物质方法(TBARS)[7-9]。这可以通过评估人类研究得到的液体中氧化应激生物标志物的验证方法所遇到的困难，得到部分解释，这些方法通常需要昂贵的和复杂的质谱技术。最近，异构前列腺素快速成为了相对好的体内氧化应激—诱导的脂质过氧化作用标志物[7-9]。然而，单一生物标志物的测定几乎不能提供各种与氧化应激有关的可能对CVD进程有利事件的综合描述。

在过去的10年中，一个氧化应激-相关的分子4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)成为了值得考虑的研究兴趣[10]。HNE是一个醛终产物，它由最大类别的n-6多聚不饱和脂肪酸过氧化产生[11]。近似于自由基，醛类是易与蛋白质氨基酸和脂类的亲核残基反应的亲电子试剂，但是它们相对更长的半衰期使得他们是延长对相邻细胞损伤的候选物。在这些醛类中，像HNE这样的4-羟基-2-烯醛，因为它们的α，β-双键而被认为是最有效的反应物类[11]。

对HNE的兴趣不仅来自于它作为氧化应激-诱导脂质过氧化作用(LPO)生物标志物的潜在用途，还因为有积累的证据表明HNE可以调节在细胞增殖、细胞凋亡和炎症中涉及的信号传导途径，这是CVD的标志[12，13]。然而，对HNE作为在CVD中的氧化应激-相关事件的活性生物标志物的作用还有很多有待研究。因HNE通过还原成1，4-二羟基壬烯(DHN)、氧化成4-羟基壬烯酸或结合谷胱甘肽而快速细胞代谢[14]，最近的研究对测量HNE代谢物，如尿[15]或血浆[16]中二羟基壬烯硫醚氨酸，而不是游离HNE的潜在用途给予重视。

HNE-蛋白质加合物也被确认。有报道指出，在心肌组织中氧化应激的条件下[17-20]，在循环清蛋白[21]和氧化脂蛋白[22]中，由免疫和气相色谱-质谱(GCMS)法测出这些加合物水平上升了。然而，以前没有检验过循环HNE-蛋白质加合物可以反映出加强的系统或组织特异性氧化应激的可能性，并且这些加合物在全血、血浆或其它血衍生物样品中的定量方法，以前也没有被描述过。

因此，虽然衰老造成的许多退化型疾病，包括心血管疾病，涉及氧化应激作用，但是仍需要在这些疾病中，特别是在人类中，鉴定氧化应激-相关事件的生物标志物，例如脂类过氧化反应产物4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)和其蛋白质硫醚加合物。综上所述，产业需要提供通过使用适当生物标志物来检测和定量生物样品中氧化应激的新方法。

发明内容

第一个大的方面，本发明涉及一种使用包含氧化应激生物标志物的生物样品检测氧化应激的方法。该方法包括:获得生物样品，在化学上稳定氧化应激生物标志物，以生产稳定的氧化应激生物标志物；并在使氧化应激生物标志物稳定后，评估样品中被稳定的氧化应激生物标志物的存在。

有利地，该方法允许在评估生物标志物的存在时进行相对复杂和漫长的过程，同时保证样品中生物标志物水平在这一过程中保持大体上恒定。

并且，这种方法相对容易使用标准实验室程序来进行。

在本发明的一些实施方案中，这种方法可以使用试剂盒来进行，这样就允许在相对少数的、相对简单的操作步骤下，相对有效和简单地进行该方法。

为了更清楚，出于本文件的目的，术语氧化应激生物标志物包括氧化应激本身的生物标志物和氧化应激-相关事件的生物标志物，例如但不仅限于在衰老和心血管疾病的发生和发展中涉及的氧化应激诱导的LPO事件的生物标志物。

在本发明的一些实施方案中，氧化应激生物标志物选自醛-蛋白质加合物和醛代谢物-蛋白质加合物。例如，代谢物-蛋白质加合物是代谢物-蛋白质硫醚加合物。在其他的例子中，代谢物共价结合在任何适合的氨基酸上，如组氨酸或赖氨酸等，或任何其它适合的物质。

在本发明的具体实施方案中，醛包括4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)，1，4-二羟基壬烯(DHN)。在这两种情况中，在本发明的一些实施方案中，可测组分可选自DHN和[²H]DHN。在其它实施方案中，氧化应激生物标志物的可测组分是另一个通过脂肪酸过氧化产生的代谢物，例如但不仅限于4-羟基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-羟基己烯醛和4-氧基己烯醛。

在一些实施方案中，可测组分的量使用与质谱偶联的气相色谱测量。

在本发明一些实施方案中，化学稳定样品中的生物标志物包括:还原醛至其醇，例如，通过向生物样品中加入NaB²H₄或NaBH₄。在这些实施方案的变化形式中，还原醛至其醇包括还原HNE为DHN和/或还原HNE为其氘代醇[²H]DHN。

在本发明一些实施方案中，生物样品包含选自HNE、HNE-蛋白质加合物、DHN、DHN-蛋白质加合物、HNE的代谢物及其组合的分子。

在本发明一些实施方案中，分离可测组分包括裂解蛋白质键。例如，裂解蛋白质键的步骤包括使用阮内镍催化裂解蛋白质硫醚键。在一个具体的例子中，阮内镍催化在约45℃至约60℃的温度下进行约5小时至约20小时。

在本发明一些实施方案中，生物样品选自全血、血衍生物及其组合，血衍生物选自例如血浆、清蛋白和氧化脂蛋白等。

第二个大的方面，本发明涉及使用生物样品检测氧化应激的方法，该方法包括:获得含有氧化应激生物标志物的生物样品；化学稳定样品中的生物标志物；使样品与结合稳定的生物标志物的抗体接触；和检测样品中结合抗体的存在。

第三个大的方面，本发明涉及用于确定哺乳动物中氧化损伤随时间的累积记录的方法，该方法包括:在第一时间点从哺乳动物获得第一血液样品，其中血液样品包含醛代谢物-蛋白质加合物；根据醛代谢物的量检测在第一血液样品中氧化应激的水平；在第二时间点从哺乳动物中获得第二血液样品，其中血液样品包含醛代谢物-蛋白质硫醚加合物；根据醛代谢物的量检测第二血液样品中氧化应激的水平；和用在第一和第二血液样品中测量的醛代谢物的量确定在此哺乳动物中氧化损伤的累积记录。

第四个大的方面，本发明涉及用于评估哺乳动物患心血管疾病风险的方法，包括:从哺乳动物中获得包含HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的生物样品；测量样品中HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的量；确定HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物之间的预定关系；根据所述预定关系评估哺乳动物患心血管疾病的风险。

第五个大的方面，本发明涉及用于诊断哺乳动物例如人类心血管疾病或其风险的方法，包括:从哺乳动物获得包含醛代谢物-蛋白质加合物的生物样品；测量样品中醛代谢物-蛋白质加合物的量；以及如果生物样品中存在的醛代谢物-蛋白质硫醚加合物的量高于预定阈值，则诊断此哺乳动物为有心血管疾病或其风险。例如，心血管疾病或其风险因素选自高血压、胰岛素抵抗、高血糖、高血脂、舒张功能障碍、心肌纤维化和心律不齐、心脏肥大和心动过速。并且，出于本说明书目的，术语风险在指心血管疾病时包括心血管疾病是其并发症的其他疾病或病症，如糖尿病、肥胖和代谢综合征。

第六个大的方面，本发明涉及用于诊断哺乳动物心血管疾病或其风险的方法，包括:从哺乳动物获得包含HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的生物样品；和如果HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的量之间的比例高于预定比例，则诊断此哺乳动物为有心血管疾病或其风险。

在本发明其它的实施方案中，HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的量之间任何其它适当的关系被用于诊断心血管疾病或其风险，所述关系例如这两个量的和。

第七个大的方面，本发明涉及用生物样品检测氧化应激相关事件的试剂盒，其中生物样品选自全血和血衍生物，还包含醛，并且试剂盒包括:稳定化试剂，该稳定化试剂将醛稳定化为其醇；和抗体，该抗体特异性结合稳定的醇。例如，稳定化试剂适合将醛转化成其醇。

第八个大的方面，本发明涉及减缓或阻止人类受治疗者中心血管疾病进程的方法，包括:根据权利要求28所述方法诊断人类受治疗者中的心血管疾病或其风险；和施用已知减缓或阻止心血管疾病进程的预定治疗。例如，预定治疗包括:施用治疗有效量的普罗布考(Probucol)，推荐有效减缓或阻止心血管疾病进程的锻练计划，和施用有效减缓或阻止心血管疾病进程的膳食，等等。

第九个大的方面，本发明涉及用于确定哺乳动物氧化损伤随时间的累积记录的方法，包括:从哺乳动物获得血液样品，其中血液样品包含醛代谢物-蛋白质加合物；根据血液样品中存在的醛代谢物的量用血液样品检测氧化应激的水平；及用血液样品中测量的醛代谢物的量和醛代谢物的预定参考量来确定哺乳动物氧化损伤的累积记录。

第十个大的方面，本发明涉及评估人类受治疗者中心血管疾病进程对预定治疗的响应的方法，包括:从哺乳动物获得包含醛代谢物-蛋白质加合物的生物样品；测量样品中醛代谢物-蛋白质加合物的量；及根据样品中测量的醛代谢物-蛋白质加合物的量评估心血管疾病进程对预定治疗的响应。

例如，评估心血管疾病进程对预定治疗的响应包括评估拟定治疗的可能结果或评估响应预定治疗的心血管疾病的进程。

本发明的其他目的、优点和特征将在阅读下述对本发明优选实施方案的非限制性描述后变得显而易见，所述优选实施方案参考附图、仅作为实施例给出。

附图说明

图1，是示意图，展示根据本发明实施方案，通过同位素稀释液GCMS定量血液中通过硫醚键与蛋白质结合的HNE和其代谢物DHN的实验步骤概述，符号^*表示测量的分子。

图2，是X-Y图，展示了针对DHN获得的标准曲线，表示出了GCMS测验的线性；对1pmol到500pmol的DHN标准溶液进行重复分析；表现出了包括95％的置信区间的回归线(斜率:1.079±0.009；y-轴截距:2.2±1.6；p<0.0001；R2＝0.999)。

图3，是X-Y图，展示了在渐增体积的(A图)血和(B图)血浆中，蛋白质衍生的HNE和DHN的GCMS测验得到的校准曲线，所述测验根据本发明实施方案进行；各种体积的样品进行重复分析；展示了95％的置信区间的回归线:(A图)HNE:斜率＝0.23±0.02，y-轴截距:12±5，R2＝0.944，p<0.0001；DHN:斜率＝0.26±0.03，y-轴截距:34±8，R2＝0.922，p<0.0001；(B图)HNE:斜率＝0.008±0.004，y-轴截距:4±1，R2＝0,346，NS；DHN:斜率＝0.19±0.02，y-轴截距:26±7，R2＝0.891，p<0.0001。

图4，是X-Y图，展示了分别对应于从30周大的原发性高血压大鼠(SHR)的代表血样的处理中获得的DHN、HNE和氘代内标[²H₁₁]DHN的离子m/z 257(上边色谱图)、m/z 258(中间色谱图)和m/z 268(下边色谱图)的选定离子监测色谱图，所述处理根据本发明的实施方案进行。

图5，是柱状图，展示了用根据本发明的方法获得的HNE信号的特异性，该特异性通过用NaBH₄和NaB²H₄处理平行血样来证明，NaBH₄和NaB²H₄将HNE分别转化成DHN(离子m/z 257)和[²H]DHN(离子m/z258)；NaBH₄处理后没有检测到任何量的蛋白质衍生HNE信号，而NaB²H₄处理后的蛋白质衍生DHN的测定量对应于所评估的DHN+HNE的量；数据是重复三次测定的平均值±SE。

图6，是柱状图，展示了用根据本发明实施方案的方法获得的不同年龄SHR和Wistar大鼠血液中HNE-蛋白质硫醚加合物的水平，从7-，15-，22-和30-周大的SHR和Wistar大鼠采集的血液样品(400ml)经处理用于GCMS分析；数据是8-13只大鼠的平均值±SE；统计学:双向ANOVA，接着是Bonferroni验后多重-比较；疾病效应:SHR比Wistar，

；

年龄效应，对比7周，^*p<0.05，^**P<0.01，^***p<0.001。

图7，是柱状图，展示了不同年龄SHR和Wistar大鼠血液中DHN-蛋白质硫醚加合物的水平，该水平用根据本发明实施方案的方法获得；数据是平均值±SE；统计学:NS；双向ANOVA，接着是Bonferroni验后多重-比较。

图8，是柱状图，展示了在4周内接受普罗布考或媒介物后的SHR中舒张功能(图A和B)和心率(图C)的变化；LV顺应性(EDT:E波减速时间)和舒张(Vp:二尖瓣血流传播速率)的指标下降反映了舒张功能障碍；结果描述为预治疗值百分比；治疗效应:^*p<0.05；和

图9，是X-Y图，展示了在4周内接受普罗布考(●)或媒介物(○)后的SHR中循环HNE-P与舒张功能衰减(由EDT反映)(A)和心率增加(B)的相关性。

详细描述

以下例子展示了以上提到的用于检测生物样品中氧化应激的方法，并表明这种方法可以对例如通过脂肪酸过氧化产生的醛进行。在这些实施方案的一些变化形式中，稳定氧化应激生物标志物包括把醛转化为其醇。

在本发明的一些实施方案中，样品包括全血或血衍生物。如本文所使用的术语“血液”通常是指全血和血衍生物(例如，血浆、清蛋白，等等)。这些样品相对容易得到，并发现其包含适合用于本发明的氧化应激生物标志物。

适用于拟定方法的一些氧化应激生物标志物的例子是:4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)、1，4-二羟基壬烯(DHN)、4-羟基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-羟基己烯醛和4-氧基己烯醛。在本发明的一些实施方案中，这些生物标志物为醛代谢物-蛋白质加合物的形式，如醛代谢物-蛋白质硫醚加合物。在这些实施方案的一些变化形式中，所述方法包括从醛代谢物-蛋白质硫醚加合物中冲击(cliving)醛代谢物，然后从生物样品中提取醛代谢物-蛋白质硫醚加合物。

在本发明的一些实施方案中，合适的分析技术，例如气相色谱，被用来评估样品中氧化应激生物标志物的存在，以及在一些实施方案中测量或定量样品中存在的氧化应激生物标志物的量。在另一些实施方案中，评估样品中氧化应激生物标志物的存在包括在允许稳定的氧化应激生物标志物与抗体结合的条件下，使样品与结合于稳定的氧化应激生物标志物的抗体接触，和检测样品中结合的抗体的存在。

本发明还涉及通过根据这里描述的方法诊断心血管疾病或其风险并施用已知能减缓或阻止心血管疾病进程的预定治疗来减缓或阻止哺乳动物(优选人类)心血管疾病进程的方法。这类预定治疗的适当例子包括:施用治疗有效量的普罗布考，推荐有效减缓或阻止心血管疾病进程的锻练计划和施用有效减缓或阻止心血管疾病进程的膳食并施用治疗有效量的普罗布考。

动物模型实例

本发明接下来通过以下使用动物模型进行的实施例来描述。这些实例和本说明书任何地方的其他实例只是用于说明，并不限制本发明或任何示例形式的范围和含义。同样，本发明并不限于这里描述的任何特定的优选实施方案。实际上，本发明的修改和变化对于阅读了本说明书的本领域技术人员来说是显而易见的，并且可不脱离其精神和范围而被做出。因此，本发明只受所附权利要求以及所要求保护的权利要求的等同物的全部范围所限制。

进行实验来评估HNE-蛋白质加合物的循环水平(i)是否可用GCMS精确评估和(ii)是否随表现出增强的氧化应激的心肌症模型中的疾病进程和衰老而变化，该模型即原发性高血压大鼠(SHR)。

当在大鼠中进行实验时，这里描述的实验被认为可预测在人类或其他的哺乳动物中的生物学效应和/或用作本发明在人类或其他哺乳动物中使用的模型。这些实施例说明了以上提到的方法，如检测生物样品中氧化应激、确定氧化损伤的累积记录、诊断心血管疾病和表征心血管疾病活动。

实施例1

进行试验以定量用NaB²H₄和阮内镍处理后与硫醇蛋白质加合物结合的HNE和其非活性代谢物1，4-二羟基壬烯(DHN)。测量从7，15，22和30周大的SHR和对照Wistar大鼠收集的血液、血浆中这些加合物的水平。疾病(SHR)和年龄(二者均p<0.0001)使在血液而不是血浆中以纳摩尔级相对高精确度定量的蛋白质-结合HNE的水平显著提高。与Wistar大鼠相比，22和30周大的SHR显示出更高的HNE-蛋白质加合物血液水平。在血液和血浆中检测的蛋白质结合的DHN水平不受疾病或年龄的影响。总的来说，在心肌症动物模型中进行的该项研究的结果说明，血液HNE-蛋白质硫醚加合物随疾病进展和衰老的变化可以通过所述的GCMS方法高精确度评估。期望这种方法将用于评估在衰老疾病例如特别是人类心血管疾病中涉及生物活性HNE的氧化应激-相关事件发生和影响。

实施例2

进行了另一项实验来评估4-羟基壬烯醛(HNE)在氧化应激相关疾病中的作用。进一步，根据在原发性高血压大鼠(SHR)中发现高循环的HNE-蛋白质硫醚加合物(HNE-P)，这项研究的目的是找出HNE-P和心脏功能间的相关性及检测抗氧化剂治疗的效果。

18周大的SHR(9只大鼠/组)每日施用(i.p.)脂质过氧化抑制剂普罗布考(10mg/kg/天)或媒介物(玉米油)4周。心脏功能由超声波心动图和用GCMS测HNE-P来评估。

左心室舒张(增加的等容舒张时间)和顺应(增加的E波减速率，EDR)指标的变化(p<0.05)反映出接受媒介物的SHR中恶化的舒张功能障碍。高循环的HNE-P与舒张功能障碍(EDR:R2＝0.518；p<0.001)和心率(R2＝0.225；p<0.05)相关。普罗布考阻止了舒张功能的退化，同时使循环HNE-P的平均值和中值分别降低了21％和35％。总的来说，这些结果支持了HNE在和SHR中疾病进程相关的病理生理事件中的作用。

实施例3

在下一个实施例中，为能够精确且可重复地连续评估血液样品中低水平的这些加合物，对使用定量GCMS测定心肌组织中蛋白质-结合HNE的方法[18]做了改进。特别的，这种方法定量了与硫醇蛋白质结合的HNE及其非活性代谢物DHN。然而，在本发明备选的实施方案中，氧化应激可用任何其他合适的物质，如任何其它的由脂肪酸过氧化产生的醛的代谢物来定量。HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物被认为是醛-蛋白质加合物和醛代谢物-蛋白质加合物类的代表。

总的来说，所述方法包括:(i)通过还原成其氘代醇[²H]DHN来稳定HNE，(ii)用阮内镍处理来裂解硫醚键，释放蛋白质结合的DHN和[²H]DHN(HNE)，和(iii)使用氘代内标[²H₁₁]DHN，可实现DHN色谱峰的阳性鉴定和定量。在这里使用的术语“[²H]DHN(HNE)”指HNE的稳定的氘代醇。使用改进后的方法，对7，15，22和30周大的原发性高血压大鼠(SHR)和对照的Wistar大鼠的循环蛋白质-结合HNE和DHN的水平进行评估。

SHR是完善的遗传高血压模型，其展示了早在4周大时在血管壁和心肌中响应抗氧化剂治疗[23，24]的增强的氧化应激，[25-27]包括HNE-蛋白质加合物的累积[19]。总的来说，这个实施例的结果显示了在SHR中与蛋白质硫醇结合的循环HNE而非DHN随疾病进程和衰老而增加。这些结果表明这些加合物作为与生物活性HNE有关的氧化应激-相关事件循环标志物的潜质。

材料和方法(实施例3)

化学品

化学品，阮内镍、2，6-叔-丁基-4-甲酚(BHT)，有机溶剂和酸分别从MAT实验室(Quebec，Quebec，Canada)、Sigma Chemical Co(St-Louis，MO，USA)、Bio-Rad(Hercules，CA，USA)和Fisher Scientific(Nepean，Ontario，Canada)获得。用于化学离子化的无水氨气(Cl；99.99％最低纯度)和氦气(UHP)从Matheson Gas Product Canada(Montreal，Quebec，Canada)获得。未标记的HNE是从BIOMOL(Plymouth Meeting，PA，USA)买来的，衍生试剂N-甲基-N-(叔-丁基二甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺(TBDMS)是从RegisChemical(Morton Grove，IL，USA)买来的。硼氘化钠(NaB²H₄)和反式-4-羟基-2-壬烯醛-([5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-2H11]([²H₁₁]HNE)二乙基缩醛由Cambridge Isotope(Andover，MA，USA)和CDN Isotope(Pointe-Claire，Quebec，Canada)提供。出版物[18]提供了关于储液[²H₁₁]DHN和DHN的制备细节，和通过在用NaBH₄还原之前测量HNE溶液在223nm处吸光率来测定它们浓度的细节。所有的水溶液用milli-Q系统(Millipore，St-Laurent，Quebec，Canada)纯化的水配制。所有其它试剂均为分析级。

动物和样品收集

动物实验遵照加拿大动物保护委员会规定由当地动物保护协会批准。大鼠在有12-h光照/12-h黑暗的循环装置中圈养至少7天，不限制水和标准食物，然后处死。雄性SHR和相当年龄的对照Wistar大鼠(Charles River，St-Constant，Quebec，Canada)在7(n＝11)，15(n＝13)，22(n＝8)和30(n＝8)周大时处死。SHR在处死时体重分别是:187±13，332±22，375±9和406±15g，Wistar大鼠分别是:239±28，442±31，533±32和612±15g。在戊巴比妥钠麻醉(65mg/g，腹膜内；MTC Pharmaceuticals)下，用经EDTA(10.8mg)和BHT(0.0496mg)预涂渍的10-ml注射器心刺取血。全血样品(500μl)立即被放入液氮中冷冻起来。剩余的体积在1,500g下离心10min，所收集的血浆样品也立即被放入液氮中冷冻起来。所有样品在分析前都保存于-80℃。

分析步骤

图1概述了样品制备和血液和血浆中的HNE-和DHN-蛋白质加合物GCMS分析的过程。为了使灵敏度提高至20倍以便能够检测血液和血浆样品中存在的更低量的蛋白质衍生HNE和DHN，并且为了改善检测的重现性和效能，对以前描述的用于检测心肌组织中蛋白质结合的HNE的方法做了改进。常规地，血液和血浆样品(400μl)各自与1ml含39mMHepes、0.4mM EDTA和0.9mM BHT的冷缓冲液(pH7.0)混合以最小化处理过程中的脂质过氧化，迅速用200μl的1M NaB²H₄处理以还原HNE成其化学稳定的醇衍生物[²H]DHN，然后放在冰上30min。

然后，蛋白质通过添加饱和的磺基水杨酸(最终浓度8％(v/v))而被沉淀。在冰上30分钟后，样品以5,000g离心45分钟。蛋白质沉淀(pellets)用3ml甲醇:氯仿(2:1)洗涤以除去脂质且用水洗涤三次，并重悬浮于500μl含8M胍、13mM Tris(pH7.2)和133mM EDTA的溶液中，并用0.1nmol氘代内标[²H₁₁]DHN形成峰值。溶液进行声处理(3 x 20sec)以优化蛋白质溶解，添加1ml水，然后用2.5g阮内镍在55℃催化处理20h。因为该处理裂解硫醚键并还原C＝C键，所以游离的[²H]DHN和DHN饱和衍生物被释放入溶液，并接着被处理用于GCMS分析。这样，在室温下1700g离心3min两次后，用浓HCl使水性上清液的pH<2，用氯化钠饱和，并用10ml乙酸乙酯通过涡旋3min而提取两次。提取物在氮中蒸发，残留物用50ml TBDMS处理。为优化衍生化，样品在90℃加热4小时。通过Bradford测定[28]用牛血清清蛋白(Fraction V，Sigma)为标准品来进行蛋白质测定。根据上清液中的蛋白质测定，估计蛋白质用饱和硫代水杨酸沉淀后的回收率为>99％。

GCMS测定

所有的样品都在Agilent Technologies的试验台标准仪器上操作，所述仪器由在PCI模式下操作的与5973质量选择检测器偶联的6890N型气相色谱组成，使用氨气为反应气体，并配有7683型系列注射器。注射(1μ1)在300℃下以脉冲-不分流(pulsed-splitless)模式(注射脉冲压力35psi)进行。载体气体是高纯氦气，恒定流速为0.7ml/min。Agilent Technologies-HP-5型毛细管柱(50m x 0.2mm内径x 0.5μm相厚度)在如下条件下使用:170℃1min，以10℃/min升至210℃，以5℃/min升至280℃和以20℃/min升至325℃。每轮结束时，温度在325℃保持8min，以清洁柱子。GCMS传输线(transfer line)在300℃，离子源和四极杆(quadrupole)的温度分别在300℃和176℃。电子能量和发射电流分别是65eV和242mA，以1ml/min维持氨气的压力(10托)。为分析DHN，[²H]DHN(还原的HNE)和内标[²H₁₁]DHN，用每离子50ms的停留时间来监测随后的离子集合，m/z分别为257、258和268。或者，为确认峰身份，还可以使用更低的离子源温度[18]来监测对应于M+H+离子的离子集合389，390和400。然而在这个实施例中，用前一种离子得到了更好的MS信号。

本研究报告的DHN-和HNE-蛋白质加合物的量是两次或三次重复样品注射的平均值。计算机积分测定的DHN和[²H]DHN峰的GC峰面积分别根据内标[²H₁₁]DHN轻的同位素杂质和天然存在的重的同位素作了修正。DHN和[²H]DHN的量由修正的面积及如之前描述的加入各个样品中的内标的量来计算[29]。

方法验证

确定了以下方法验证参数。(i)准确度由[1-(GCMS测量量/标准量)]x 100算出。(ii)精确度或相对标准偏差(RSD)由SD*100/平均值算出。(iii)检测限(LOD)代表可被处理并相当准确和精确评估的标准DHN溶液的最低量。(iv)定量限(LOQ)代表血液或血浆样品中可以适当精确度被测定的蛋白质衍生DHN和HNE的最低量。它通过分析两次重复样本的血液和血浆中体积增加(50，100，250，400和500μl)来确定。(v)分别通过在同一天注射同一个样品八次和在不同的三天注射五个样品来确定GCMS分析的测定内和测定间的RSD。整个分析过程的测定内和测定间的RSD通过处理以下确定:(a)在同一天从Wistar大鼠收集的血液样品库获得的九个样品，以及(b)在不同的三天，从五只Wistar大鼠中采集的血样，并分成等份冷冻。测定间RSD值还可以由来自Wistar大鼠的在-80℃冷冻样品9个月前后的四种不同的血液样品分析获得。最后，为检测对应于HNE的信号的特异性，储存血样并将其分成6份，3份用NaBH₄处理，3份用NaB²H₄处理。

统计分析

数据用平均值±SD或SE来表示。双向ANOVA用于检验以下效应的显著区别:(i)SHR中疾病的发生和进程，(ii)年龄，和(iii)疾病和年龄的相互影响，然后进行Bonferroni验后多重比较。

结果(实施例3)

方法验证

用以下参数评价图1中描述的GCMS方法:LOD、LOQ、精确度、重现性和稳定性(robustness)。根据当分析的量低于50pmol时获得的较差的精确度16％至76％，与在50pmol至500pmol的量的准确度值>90％(表1)相比较，估计用DHN标准溶液测定的检测限(LOD)为50pmol。校准曲线在这个测试的DHN浓度范围内是线性的(图2)，RSD值<4％。

表1:在根据本发明实施方案用于检测生物样品的氧化应激生物标志物的方法中所用的DHN标准溶液的GCMS测定获得的校准数据。

 

加入量(pmol)	测量量(pmol；平均值±SD)	准确度(％)	精确度(RSD％)
				1	6.3±0.7	16	12
10	13.1±0.8	76	6.3
				25	37.1±2.9	67	7.8
50	50.7±0.3	99	0.6
				100	110±2	91	1.8
250	266±0.4	94	0.2
				500	545±17	92	3.2

标准溶液为1pmol至500pmol DHN，其被处理用于GCMS测定，重复两次。

对于方法的LOQ，分析得出全血中蛋白质-结合HNE和DHN是线性关系(图3A)，尽管在LOD范围内的y-轴截距正值显示出恒定的偏差。这样，y-轴截距值只被当作背景值并被从所有计算的实验测定值中减去。与其类似的是分析血浆中蛋白质-结合DHN所获得的结果(图3B)，但是血浆中蛋白质-结合HNE的值在方法的LOD之下。血液中蛋白质-结合HNE和DHN和血浆中DHN的测量值达到了高精确度(RSD<12％)。方法的LOQ被估计为60pmol，对应于约250μl样品。然而，在常规应用中，实际方法的选定LOQ为≥80pmol，对应于400μl样品，以保证得到最佳精确度。

表2总结了400μl血液中蛋白质-结合HNE和DHN测验的重现性数据。图4表示从30周大的SHR中采集的代表性400μl血液样品的典型SIM色谱。全血样品中，GCMS分析中，测定内和测定间的RSD≤11％，对于整个方法其范围为10％至20％。最后，下述其他数据也支持我们方法的稳定性。首先，9个月后从Wistar大鼠采集的血样中蛋白质-结合HNE和DHN的分析获得的RSD值显示了这些加合物在冷冻于-80℃样品中的稳定性。第二，用NaBH₄和NaB²H₄处理平行样品，使HNE分别转化成为DHN(离子m/z 257)和[²H]DHN(离子m/z 258)，来说明HNE信号(离子258)的特异性。经NaBH₄处理后，我们没有检测到任何量的蛋白质衍生HNE信号(离子258)，蛋白质衍生DHN(离子m/z 257)的测量量对应于用NaB²H₄处理后所评估的DHN+HNE的测量量(图5)。

表2:根据本发明实施方案的400μl血液中HNE-和DHN-蛋白质硫醚加合物GCMS检测的重现性数据总结。

针对不同天全血样品的处理和GCMS进样的测定内和测定间RSD按材料和方法中描述来测定。如所示的，数据是4-9个独立测定的平均值±SD。

SHR和Wistar大鼠中HNE-和DHN-蛋白质加合物的循环水平

图6展示了从不同年龄SHR和Wistar大鼠中采集的血液中评估的蛋白质-结合HNE水平的数据。根据双向ANOVA，HNE-蛋白质加合物的血液水平随疾病进程和年龄而明显提高。与Wistar大鼠相比，从22周起，SHR表现出明显更高的HNE-蛋白质加合物血液水平。所观察到的蛋白质-结合HNE循环水平随年龄的差异或在SHR和Wistar大鼠之间的差异不能归因于血液蛋白质水平的变化，血液蛋白质水平在任何时候都是类似的(在230mg/ml和274mg/ml之间)。与蛋白质-结合HNE相反，血液中(图7)或血浆中(数据未显示)蛋白质-结合DHN的水平不随疾病或年龄而变化。

讨论

在本研究中，验证了相对精确地定量与循环含硫醇蛋白质结合的HNE和DHN的GCMS方法。该方法包括:通过还原成其氘代醇[²H]DHN而稳定HNE，用阮内镍处理样品，以及使用氘代内标[²H₁₁]DHN。对提议的方法表征了以下参数:LOD、LOQ、精确度、重现性和稳定性。就像这里描述的，一位技术员一周可以处理约80-100个样品。不同测定间的差别(10-20％)比受治疗者间的差别(30-40％)小。进一步，LOQ测定中观测到的精确度与血浆异前列烷[30]或硝基酪氨酸[31]的GC/LC-MS测定相符，它们分别被用作氧化应激和亚硝化应激的标志物。而且，虽然生物样品中的LPO衍生产物的稳定性通常被认为是一个主要的问题[32]，但我们发现，HNE-和DHN-蛋白质加合物的水平几乎不受样品在-80℃储藏了9个月的影响(表2)。尽管这可以归因于这些蛋白质加合物与游离HNE相比更加稳定，但Spies-Martin等(2002)报告了储藏之前和在-80℃存放了22个月的组织样品中相似水平的游离HNE[33]。不过，我们认为在EDTA中冷冻或立刻处理所有采集到的血液样品，以及快速用NaB²H₄处理样品来稳定HNE是相对重要的。

在本研究中，经改进了的GCMS方法被成功地运用于大鼠中循环HNE-和DHN-蛋白质加合物的分析。在血液、但是没有在血浆样品中检测到HNE-蛋白质加合物。这一发现同时出现在Kinter等[36]的观察中，他用GCMS评估了作为肟衍生物的希夫碱残基中游离或结合的HNE。还有Oliver等说明了红血球中氧化修饰蛋白质的累积[37]。最后，主要在生物膜而不是在水相中被测出的HNE[14]，在体外与来自红血球膜蛋白质的半胱氨酸残基的巯基快速反应，生成Michael-型加合物。对血液HNE-修饰的蛋白质的半衰期知之甚少，但其很可能比游离的HNE长。事实上，HNE-修饰的蛋白质可能反映该LPO产物的流量，而不是循环水平[22]。这种氧化损伤的累积记录可能提供对生物活性HNE的氧化应激-相关事件的灵敏测量。通过分析，糖基化血红蛋白反映长期血糖控制[38]。

血液样品中测定的蛋白质-结合HNE的浓度在0.07-0.22mM之间变化。这些值落入血浆游离HNE(0.026-0.85mM)报道的浓度范围内[32，33，36，39]，但是低于HNE衍生的2-戊基吡咯的值(8-35mM)[22]，而高于异前列烷(35-356pg/ml)[40-42]或硝基酪氨酸的值(2-5nM)[31，43，44]。根据平均蛋白质含量250mg/ml，并假定平均蛋白质分子量是30,000，血液中蛋白质-结合HNE浓度是0.07-0.25mM，这说明0.0008-0.003％的血蛋白质被HNE修饰了。这个百分比比从以前测定的局部缺血心脏中HNE-蛋白质加合物的水平(大约0.025％)[18]计算出的百分比低。然而，如果考虑到循环游离HNE的浓度<1μM，则这与当哺乳动物细胞用100μM HNE孵育后体外观测到的1至8％蛋白质修饰是一致的[45]。

本研究的结果展示了随病程和衰老而提高的SHR血液中HNE-蛋白质加合物水平，该发现表明，这些蛋白质加合物是这个动物模型中涉及生物活性HNE的氧化应激-相关事件的循环生物标志物。SHR在9至14周时发生了高血压和左心室肥大[46，47]。15周时，肥大是补偿性的，而30周时，SHR显出凋亡引起的心肌细胞死亡率的增加，后者与从补偿性肥大到非补偿性肥大的转变有关[48]。在SHR中发现的循环HNE-蛋白质加合物的增加与增强氧化应激的出现同时发生，这在4周大的SHR中就有记录[27]。这种增加归因于由于机能障碍型氮氧化物合成酶活性[27]和/或血管壁内的血管紧张素II-刺激的NAD(P)H氧化酶活性[49]而增加的超氧化物阴离子生成。与对照的大鼠相比，还发现SHR中持续更多的心肌HNE-蛋白质加合物累积，这是受疾病进程和年龄影响的后果[19]。更大年龄时产生HNE-蛋白质加合物在血液中比在血管壁或心脏内的有所增加的事实(22周对7周)可能暗示，在SHR中，HNE生成主要发生在细胞内部位。有人报道[13]，HNE-蛋白质加合物的浓度在组织中比间隙液中高，这说明，循环HNE-蛋白质加合物的累积可能反映出HNE产物的球形状态与其在全身组织和器官中的解毒作用。在这个问题上发现，蛋白质-结合DHN的循环水平，不受疾病或年龄的影响，它可能起源于在醛糖还原酶作用下HNE-蛋白质加合物的酶催化还原作用[50]。这样，与循环硫醇蛋白质结合的HNE与DHN的比例的增加，暗示HNE生成与疾病的进程和衰老的解毒之间是不平衡的，有利于前一过程。

总结一下，这里的GCMS方法描述并相对精确和重复地鉴定了血液中HNE-蛋白质硫醚加合物的量。使用这种方法显示，在表现增强的氧化应激的心肌症动物模型SHR中，循环HNE-蛋白质加合物随病程和年龄而增加[19，26]。总的来说，本研究的结果显示了在全血中测量的HNE-蛋白质硫醚加合物作为心脏病和衰老中涉及生物活性HNE的氧化应激诱导的LPO事件的标志物的潜在用途。

假设，可使用评估样品中氧化应激生物标志物存在的试剂盒替代以上描述的方法。同样的，假设可使用替代方法来检测氧化应激生物标志物。该方法的一个实施例中，该方法包括在允许稳定的氧化应激生物标志物结合到抗体的条件下，使样品与结合于稳定的氧化应激生物标志物的抗体接触，并检测样品中结合的抗体的存在。

实施例4

在原发性高血压大鼠中进行了一系列研究[55-57]，提供了体内研究HNE和心功能之间潜在联系的基础。SHR是完善的与胰岛素抵抗相关的遗传高血压心肌症模型(58)。其在9至12周大时患高血压和左心室肥大(59)。15周大时，心肌肥大得到补偿，且补偿不全的功能症状出现在18-24月大之后。SHR显出了血管壁中氧化应激的加剧(60)，这是对抗氧化剂治疗的反应(61)。从7周开始的SHR中心肌HNE-蛋白质加合物的累积的进一步发现(57)，GCMS方法被验证用于定量血液中的HNE-蛋白质硫醚加合物(HNE-P)，并且发现从22周开始，SHR中相对高的循环HNE-P。这样，在这个实施例中，循环HNE-P与体内心功能有关，且检验评价用普罗布考抗氧化剂治疗的影响(62)。

方法(实施例4)

动物

实验经由当地动物保护协会遵照加拿大动物保护委员会规定批准。适应环境一周后，18周大的雄性SHR(Charles River，St.Constant，Canada)被随机分配，每日接受腹腔内膜注射10mg/kg体重的溶解在玉米油或媒介物(V)中的普罗布考(P)。每日测量体重。大鼠22周大时被处死。在开他敏/甲苯噻嗪麻醉(87.5mg/12.5mg/kg，i.m.)下，颈静脉用5ml的用EDTA(10.8mg)和丁基化羟基甲苯(0.0496mg)涂渍过的注射器穿刺取血，立即冷冻于液氮中。

血压和心功能

在治疗开始和结束时，在异氟烷麻醉剂作用下，使用尾袖法和带有标准超声心动图系统(Sonos 5500，Hewlett-Packard，Andover，Mass)的S12相控阵换能器，分别测量非侵入性动脉收缩压并进行经胸超声心动图评价。我们这里仅报告反映出心舒张功能的超声心动图参数，因据报道心脏收缩功能在18-22周大的SHR中不改变。在心尖四腔切面图像中，用脉冲波Doppler测定跨二尖瓣E波减速时间(EDT)和减速率(EDR)，通过彩色M-模式光谱研究二尖瓣传播速率(Vp)。在心尖五腔切面图像中，用连续-波Doppler测定LV等容舒张时间(IVRT)，并用通过同步记录ECG的R-R间隔进行修正(IVRTc)。M-模式在胸骨旁长轴图像中的大动脉瓣水平上，用来在心舒张(LADd)和收缩(LADs)时测量左心房(LA)维数，从中我们计算出LA缩短分数(LAFS)。每次测量都是三个连续心循环的平均值。

循环HNE-P。用实施例1中描述的GCMS对治疗后采集的400μl全血中的HNE-P定量。

数据报告和统计分析

数据是平均值±SEM。各种被测参数(体重、收缩压和心功能)的值报告为治疗前值的百分比。分别用配对和不配对的t-检验评价组内和组间差异的统计学显著性(治疗前和治疗后)。用线性回归分析来计算相关系数。认为p≤0.05的值是显著的。

结果(实施例4)

血液动力学和心功能

4周治疗中，两组SHR得到相似的7-8％的体重增长和心收缩压(分别为V:7.6±0.2，P:7.9±0.7；和V:8.2±2.4，P:8.3±2.0％；p<0.05)。然而，接受媒介物的SHR表现出心收缩功能指数的恶化。(i)EDT(下降；图9A)和EDR(上升；18±6％；p<0，05)的变化反映了LV顺应性的缺失或僵硬度上升，而(ii)Vp(下降；图9B)和IVRTc(上升:8.9±7.0％；p<0,05)的变化反映了削弱的LV舒张。心率也增加了20％(图9C)。所有这些有害的功能变化在普罗布考组中均未出现。在这组中，LV心舒张功能得到维持，导致减少的LA结构及功能重塑；LADd(下降:-17.9±6.4％；p≤0.05)和LAFS(上升；16.1±5.4％；p≤0.05)的变化反映了这一现象。

循环HNE-P

在22周大的SHR治疗结束时对循环HNE-P进行评估，其与心舒张功能障碍的指标(EDR:R2＝0.518，p<0.001；EDT:R2＝0.371，p<0.01(图8A))和心率(图8B)相关。普罗布考治疗使循环HNE-P中值[最小-最大](P:170.5[122.5-376.0]；V:261.3[157.0-441.5])及平均值(P:208.2±34.1；V:263.8±27.4)分别降低了35％和21％(p＝0.1)。

讨论

在这个实施例中，在SHR中检验了循环HNE-P水平和心功能之间的联系，并测试了普罗布考治疗的效果。根据18-22周大的大鼠中的高循环HNE-P结果，使用了18-22周大的SHR(55，实施例1)。18-22周大的SHR有高血压，且表现出补偿性心脏肥大(64)。发现18周大SHR接受4周媒介物后心功能恶化，这与Slama等(2004)(63)提供的数据是一致的。这个研究中，用普罗布考治疗SHR削弱了心舒张功能退化，并改善了左心房功能，其为独立于血压的效应。

治疗后评估的循环HNE-P水平与SHR中心舒张功能退化，特别是与LV顺应性的下降正相关。进一步，观测到了循环HNE-P和心率加快的正相关。心率加快是冠状动脉疾病患者发病率和死亡率相联系的因素(68)。最近报道了由免疫组化检测确定的心肌肥大患者右心室HNE-蛋白质加合物和心功能障碍的指标相关(69)。普罗布考降低了循环HNE-P水平，但该结果中仅观测到了相对小的统计学显著性。考虑到每组动物数过少，推断这是由II型误差产生的。

上文提出的相关数据显示HNE在心功能障碍病变中和在SHR调节心率中的潜在作用。以下提出了可能解释这一结果的假设机制。暴露于HNE的离体心脏显示出血管舒张、心收缩功能的下降和不能收缩(70)。在离体的大鼠心室肌细胞中，HNE发挥致心律失常作用，这可能是由于离子通道蛋白质的半胱氨酸残基的修饰作用(71)。可能通过促细胞分裂素活化的蛋白质激酶作用，它还可降低收缩(72)。在许多潜在的病变机制中，一个显现出与本研究有特殊的相关性的机制是纤维化。这个过程显现出对LV僵硬的决定因素，包括在SHR中(73-75)，它可由HNE通过TGFb1发送信号激活(53)，但普罗布考可使其减少(65)。

总结一下，这个实施例的结果说明在18至22周大的对照SHR中左心室舒张功能恶化，导致了舒张功能障碍的限制形式，这可以通过普罗布考治疗而得以改善。观察到的HNE-P与心功能障碍和心率之间的相关性，提供了支持该醛在SHR疾病进程相关的病理生理事件中作用的又一证据。最后，循环HNE-P可能与特定病变事件相关，其可能成为抗氧化剂治疗的靶点。

人类实施例

实施例5

如上所述，评价了71例患慢性心脏衰竭的人类受治疗者中的HNE-蛋白质加合物血液水平。HNE-蛋白质的平均浓度是214±67nM。这一水平与纽约心脏协会分类(New York Heart Association Class)相关(R²＝0.33；p<0.05)，显示了其与疾病严重程度有关。

尽管上文已经通过优选实施方案描述了本发明，但它可以被修改，且不脱离所附权利要求所限定的本发明精神、范围和性质。

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本说明书中引用和/或讨论的所有参考文献都通过引用整体结合入本文，程度如同每篇参考文献单独通过引用结合入本文一样。

Claims (41)

1.一种使用生物样品检测氧化应激的方法，该方法包括:

(a)获得包含氧化应激生物标志物的生物样品，所述生物标志物含有可测组分；

(b)化学上稳定所述样品中的所述生物标志物；

(c)分离所述可测组分；

(d)提取所述可测组分；和

(e)测量所述可测组分的量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化应激生物标志物选自醛-蛋白质加合物和醛代谢物-蛋白质加合物。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述醛是4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述醛代谢物是1，4-二羟基壬烯(DHN)。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述可测组分选自DHN和[²H]DHN。

6.如权利要求2所述的方法，该方法包括通过还原醛成其醇而化学上稳定所述样品中的所述生物标志物。

7.如权利要求6所述的方法，其中还原醛成其醇的所述步骤包括向所述生物样品添加NaBH₄和NaB²H₄之一。

8.如权利要求3所述的方法，其中还原醛成其醇的所述步骤包括还原HNE成DHN和/或还原HNE成其氘代醇[²H]DHN。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包含选自HNE、HNE-蛋白质加合物、DHN、DHN-蛋白质加合物、HNE代谢物及其组合的分子。

10.如权利要求1所述的方法，其包括通过裂解蛋白质键而分离所述可测组分。

11.如权利要求10所述的方法，其中裂解蛋白质键的所述步骤包括使用阮内镍催化裂解蛋白质硫醚键。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述阮内镍催化在约45℃至约60℃进行约5小时至约20小时。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化应激生物标志物的所述可测组分是脂肪酸过氧化产生的代谢物。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化应激生物标志物的所述可测组分选自:4-羟基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-羟基己烯醛和4-氧基己烯醛。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品选自全血、血衍生物及其组合。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述血衍生物选自血浆、清蛋白和氧化脂蛋白。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述可测组分的量使用与质谱偶联的气相色谱测量。

18.一种使用生物样品检测氧化应激的方法，该方法包括:

(a)获得包含氧化应激生物标志物的生物样品；

(b)化学上稳定所述样品中的所述生物标志物；

(c)使所述样品与结合被稳定的生物标志物的抗体接触；和

(d)检测所述样品中结合抗体的存在。

19.一种用于确定哺乳动物中氧化损伤随时间累积记录的方法，该方法包括:

(a)在第一时间点从哺乳动物获得第一血液样品，其中所述血液样品包含醛代谢物-蛋白质加合物；

(b)根据所述第一血液样品中存在的醛代谢物的量来检测所述第一血液样品中氧化应激的水平；

(c)在第二时间点从哺乳动物获得第二血液样品，其中所述血液样品包含醛代谢物-蛋白质硫醚加合物；

(d)根据所述第二血液样品中存在的醛代谢物的量来检测所述第二血液样品中氧化应激的水平；和

(e)使用在所述第一血液样品和所述第二血液样品中所测的醛代谢物的量来确定所述哺乳动物中氧化损伤的累积记录。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述醛代谢物选自4-羟基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-羟基己烯醛、4-氧基己烯醛、4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)和1，4-二羟基壬烯(DHN)。

21.一种用于评估哺乳动物患心血管疾病的风险的方法，该方法包括:

(a)从哺乳动物获得包含HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的生物样品；

(b)测量所述样品中HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的量；

(c)确定所述HNE-蛋白质加合物和所述DHN-蛋白质加合物之间的预定关系；

(d)根据所述预定关系来评估所述哺乳动物患心血管疾病的风险。

22.如权利要求21所述的方法，其包括根据HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的量的比例及根据权利要求19的方法测量的所述哺乳动物中氧化损伤的累积记录来评估所述哺乳动物患心血管疾病的风险。

23.一种用于诊断哺乳动物心血管疾病或其风险的方法，该方法包括:

(a)从哺乳动物获得包含醛代谢物-蛋白质加合物的生物样品；

(b)测量所述样品中所述醛代谢物-蛋白质加合物的量；

(c)若醛代谢物-蛋白质硫醚加合物的量高于预定阈值，则诊断所述哺乳动物为有心血管疾病或其风险。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述心血管疾病或其风险因素选自高血压、胰岛素抵抗、高血糖、高血脂、舒张功能障碍、心肌纤维化、和心律不齐、心脏肥大、心动过速、糖尿病、肥胖和代谢综合征。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述醛代谢物-蛋白质加合物是醛代谢物-蛋白质硫醚加合物。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述醛代谢物选自4-羟基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-羟基己烯醛、4-氧基己烯醛、4-羟基-2，3-壬烯醛(HNE)和1，4-二羟基壬烯(DHN)。

27.如权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

28.一种用于诊断哺乳动物心血管疾病或其风险的方法，该方法包括:

(a)从所述哺乳动物获得包含HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的生物样品；

(b)测量所述生物样品中HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的量；和

(c)若存在的HNE-蛋白质硫醚加合物和DHN-蛋白质硫醚加合物的量的比例高于预定比例，则诊断所述哺乳动物为有心血管疾病或其风险。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述心血管疾病或其风险因素选自高血压、胰岛素抵抗、高血糖、高血脂、舒张功能障碍、心肌纤维化、和心律不齐、心脏肥大、心动过速、糖尿病、肥胖和代谢综合征。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

31.一种使用生物样品检测氧化应激相关事件的试剂盒，其中所述生物样品选自全血和血衍生物，还包含醛，并且所述试剂盒包括:

(a)稳定化试剂，该稳定化试剂用于稳定所述醛成其醇；和

(b)抗体，该抗体特异性结合稳定的醇。

32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述稳定化试剂适合把所述醛转化成其醇。

33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述稳定化试剂包括NaB²H₄和NaB²H₄之一。

34.一种减缓或阻止人类受治疗者心血管疾病进程的方法，该方法包括:

(a)根据权利要求28所述方法诊断人类受治疗者心血管疾病或其风险；

(b)施用已知能减缓或阻止心血管疾病进程的预定治疗。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述预定治疗包括施用治疗有效量的普罗布考。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述预定治疗包括推荐有效减缓或阻止心血管疾病进程的锻练计划。

37.如权利要求34所述的方法，其中施用所述预定治疗包括施用有效减缓或阻止心血管疾病进程的膳食。

38.一种评估人类受治疗者中心血管疾病进程对预定治疗的响应的方法，该方法包括:

(a)从哺乳动物获得包含醛代谢物-蛋白质加合物的生物样品；

(b)测量所述样品中所述醛代谢物-蛋白质加合物的量；和

(c)根据所述样品中测量的所述醛代谢物-蛋白质加合物的量，评估所述心血管疾病进程对所述预定治疗的响应。

39.如权利要求38所述的方法，其中评估所述心血管疾病进程对所述预定治疗的响应包括评估拟定治疗的可能结果。

40.如权利要求38所述的方法，其中评估所述心血管疾病进程对所述预定治疗的响应包括评估响应所述预定治疗的心血管疾病的进程。

41.一种用于确定哺乳动物中氧化损伤的累积记录的方法，该方法包括:

(a)从哺乳动物获得血液样品，其中所述血液样品包含醛代谢物-蛋白质加合物；

(b)根据按权利要求1所述方法测量的醛代谢物的量，使用所述血液样品检测氧化应激的水平；和

(c)使用所述血液样品中测量的醛代谢物的量和所述醛代谢物的预定参考量来确定所述哺乳动物中氧化损伤的累积记录。

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