CN101379191A - 用于提高植物的氮贮藏容量的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备和利用与野生型植物相比表现出提高的氮贮藏容量的转基因植物的方法和组合物。本发明的方法包括诱导单子叶植物－来源的营养贮藏蛋白(VSP)在植物中，尤其是在单子叶植物中的过度表达。在一些实施方式中，至少一个包括编码ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体的核苷酸序列的核苷酸构建体被引入植物中。依赖于所述目标，所述核苷酸构建体可以可选地包括可操作地连接的液泡类别信号或质体转运肽的编码序列，以便引导ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体分别储存入其中VSP被表达的细胞的液泡区室或质体区室。本发明进一步提供了用于生产具有提高的氮含量和/或提高的营养价值的植物的方法，其在商业作物，包括用于草料、青贮饲料、及谷粒生产的那些作物中是希望的。

Description

用于提高植物的氮贮藏容量的方法和组合物

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域。更具体地，这个发明涉及由营养贮藏蛋白的表达赋予的植物中提高的氮贮藏容量。

背景技术

目前对于用于农业生产的氮肥的全球需求为约9千万公吨，到2050年计划增加到约2亿4千万公吨。在作物生产中应用的大量的氮由于淋失(leaching)和脱氮而流失，这不仅增加了农业生产的成本，而且有助于环境污染。例如，淋失的氮污染地下水，而从富含氮的农田流走的水造成江河和三角洲中的藻类生长。由于高度摄取其硝酸盐形式的氮，地下水和流走的水中的过量氮还可以造成人类和牲畜中的健康问题。

已经提议了许多作物生产技术以减少氮从作物田流失。农业最佳管理实践已经集中在通过提高氮应用技术、采用任选的耕种系统、及利用改进的排水方法来减少氮离去农田的量。然而，这样的实践部分由于缺乏合适的刺激，通常遭受农民中的低顺应性。虽然公共废水处理工厂部分通过将硝酸盐转化为氨降低了氮含量，但是由于高相关成本，另外的去除硝酸盐的处理是不普遍的。天然的湿地也已经用于与常规的处理工厂相比以更低成本和更大的有效性去除营养物，但是这样的应用已经造成非故意的生物学后果，象一些植物物种的选择性生长。

对于上述方法的一个替换方法是开发可以更有效地吸收和利用来自土壤的氮的新型作物品种。已知许多植物通过积聚被称为植物贮藏蛋白(VSP)的一类蛋白而在它们的营养细胞中截留(sequester)过量的氮。VSP的大小范围从约15到约100kDa，并且已经从其他类的蛋白鉴定，如碱性磷酸酶、几丁酶、凝集素、及脂加氧酶。已经报道VSP在多种一年生和多年生植物物种中存在，所述植物物种包括大豆、车轴草(clover)、苜蓿、Medicago、Arabidopsis、芥花(canola)、杨树(poplar)、黑桑(black mulberry)、及桃树。然而，至今仍未确定VSP在单子叶植物(monocot)中的存在。

因此，本发明通过提高单子叶植物-来源的VSP的表达，解决了对于提高植物，尤其是单子叶植物中的氮贮藏容量的需要。

发明内容

提供了用于提高植物的氮贮藏容量，尤其是植物的营养细胞内的氮贮藏容量的方法和组合物。本发明的方法包括提高营养贮藏蛋白(vegetative storage protein，VSP)在植物的细胞内的表达，尤其是单子叶植物-来源的VSP或具有VSP性质的其生物活性片段或其变体的表达。以这种方式，所述方法包括将包含多核苷酸序列的至少一个核苷酸构建体引入感兴趣的植物中，所述多核苷酸序列包含单子叶植物-来源的VSP或其生物活性片段或变体的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子。在一些实施方式中，VSP是SEQ ID NO：2中陈列的玉蜀黍VSP-型脂加氧酶ZmLox6蛋白，所述核苷酸构建体包括SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6的编码序列、编码ZmLox6蛋白的核苷酸序列、或者编码ZmLox6蛋白的生物活性片段或变体的核苷酸序列。依赖于用于VSP的截留的理想的亚细胞定位，核苷酸构建体可以可选地包括液泡类别信号或质体转运肽的编码序列，以引导VSP或其片段或变体分别储存入VSP或其片段或变体被表达的植物细胞的液泡或质体区室内。任何功能性启动子可以用于驱动VSP或其片段或变体的表达，伴随或不伴随液泡类别信号或质体转运肽，包括而不限于组成性、可诱导的、和组织优选的启动子(tissue-preferred promoters)。在一些实施方式中，可操作地连结的启动子是叶子-优选的启动子，以便VSP、更具体地ZmLox6或其片段或变体的水平，优先在植物的叶子组织内提高。所述启动子可以可选地被选择以便提供VSP或其片段或变体以细胞-优选的方式(例如叶肉细胞-优选的或维管束鞘细胞-优选的方式)的表达，以最小化VSP积聚对细胞代谢过程的影响。

通过提高植物细胞内的氮贮藏容量，可以提高全部的植物对施加的土壤氮的反应，导致可获得的土壤氮的利用提高。本发明的方法还提供用于提高植物的氮含量，尤其是叶子、茎、和种子组织内的氮含量，其有益地提高了草料(forage)和青贮饲料(silage)作物植物的营养价值，以及种子，尤其是农业作物物种的谷粒的营养价值。

本发明的组合物包括核苷酸构建体，其包括可操作地连接的液泡类别信号(vacuolar sorting signal)和玉蜀黍ZmLox6VSP或具有VSP性质的其生物活性片段或变体的编码序列，以及可操作地连接的启动子。所述可操作地连接的启动子可以为驱动植物细胞中的表达的任何启动子，包括而不限于组成性、可诱导的、或组织-优选的启动子。进一步提供的是包含这些核苷酸构建体的植物、植物细胞、植物组织、和转基因种子。这些构建体发现在本发明的方法中的应用，用于提高营养植物细胞的氮贮藏容量、提高植物或其植物部分的氮含量、提高草料和青饲作物植物的营养价值、以及提高种子的营养价值。

附图说明

图1示出了携带在Rubisco小亚单位(SSU)启动子的控制下的ZmLox6编码序列的载体。图1A示出了没有可操作地连接的Zea mays(ZM)proaleurain信号肽(SP)和液泡类别信号(VTS)的编码序列的载体。图1B示出了具有可操作地连接的ZM proaleurain SP和VTS的编码序列的载体。

图2示出了携带在Zea mays(ZM)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)启动子的控制下的ZmLox6编码序列的载体。图2A示出了没有可操作地连接的ZM proaleurain SP和VTS的编码序列的载体。图2B示出了具有可操作地连接的ZM proaleurain SP和VTS的编码序列的载体。

图3示出了携带在组成性Zea mays(ZM)UBI启动子的控制下的ZmLox6编码序列的载体。图3A示出了没有可操作地连接的ZMproaleurain SP和VTS的编码序列的载体。图3B示出了具有可操作地连接的ZM proaleurain SP和VTS的编码序列的载体。

图4示出了从在四种不同的氮水平的存在下生长的植物采集的不同组织的匀浆的可溶部分的SDS-PAGE结果。示出了四个柱的三个组，对应于来自叶子(左手组)、根(中间组)、及茎(右手组)的匀浆的可溶部分。在每组内，所述四个柱对应于来自在没有硝酸盐(＂0＂)、1mM硝酸盐(＂1＂)、100mM硝酸盐(＂100＂)、或50mM铵和50mM硝酸盐的组合(＂50+50＂)的存在下生长的植物的匀浆。叶子组中的箭头指出在叶子组织中在更高水平的氮暴露时鉴定的～100kDa多肽带。

图5示出了在切除图4所示的～100kDa多肽带、消化、及对收集的蛋白水解肽测序后鉴定的12个不同的肽序列。如所示的，这些肽对应于ZmLox6多肽(SEQ ID NO：2)的多个节段。

图6示出了来自玉蜀黍和其它植物物种的ZmLox6到Lox蛋白的系统发生比较。

图7示出了利用Vector NTI的ZmLox6(SEQ ID NO：2)和ZmLox10(SEQ ID NO：4)多肽的序列对准。保守区被阴影化(shaded)，用灰色正文(grey text)示出精确的残基匹配。

图8示出了比较在创伤后V5发育阶段V5玉米叶子中ZmLox6基因表达的诱导的图。表达的诱导(以ppm测量)在创伤后0、3、12、及24小时随时间示出。

图9示出了比较在创伤后V5发育阶段的玉米节根(nodal root)中ZmLox6基因的表达的诱导的图。表达的诱导(以ppm测量)在创伤后后(“W”组)0、3、12、及24小时随时间示出，与未受伤的实验对照比较(“U”组)。

图10示出了ZmLox10在B73、ILP、及IHP的叶子中的表达水平。

图11示出了Rosetta细胞的载体pET28A中ZmLox6蛋白的表达和纯化。注意在～100kDa的蛋白高水平表达。

图12A和12B示出了不同的叶子部分、源自叶鞘的维管束和叶肉细胞的SDS凝胶(左侧)和相应的Western blot(右侧)。注意到ZmLox6蛋白主要在叶肉细胞中表达。

图13：用于ELISA实验发展的抗-Lox6抗体的滴定。给出了用于Lox6蛋白的对于抗体稀释的滴定，其中吸光度从1：15,000到1：40,000稀释是线性的。

图14：Lox6蛋白在玉蜀黍叶子中的表达。来自To代的转基因植物表达ZmLox6基因。从六个不同的构建体获得多个转基因事件(对于载体构建信息，参见图2)。缩写：Ubi-Intron，玉蜀黍泛素启动子连通一个内含子；PEPC，玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子；SSU，玉蜀黍Rubisco小亚单位启动子；VTS，来自玉蜀黍aleurain的液泡靶向信号。仅示出了具有单一拷贝转基因插入的那些事件(event)。插入物表明借助抗-Lox6抗体在用星号标志(identified)的一些事件上获得的Western blot。Western结果确认了ELISA结果。在非转基因系中平均表达是在Y轴上所用的尺度上的25。

图15：来自借助PEPC1-LOX6基因构建体获得的To转基因植物的叶子的不同蛋白的重新流通。缩写：Rubisco，Ribulose二磷酸核酮糖羧化酶(bisphosphate carboxylase)；NR，硝酸还原酶(nitrate reductase)；PEP-C，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

图16：源自PEPC1PRO-Lox6构建体的田地-生长的T1事件中ZmLox6的表达(图2A)。包含在表达由PEPC1驱动的ZmLox6的转基因事件中玉蜀黍中开花后不同蛋白的重新流通。对于每个组，表示与用于转化的对照近交系相关的数据。每个条代表来自跨越多个事件的128个植物的数据。还示出了通过ELISA定量的PEPC、Rubisco、及硝酸还原酶蛋白的表达水平。后缀E代表来自用于转化的近交系的结果，其用作对照。来自16个田地生长的植物的每个的耳穗叶(ear leaf)以一周的间隔取样，跨越8个事件，起始于开花前两周，结束于四周后叶子衰老时。提取后，利用针对ZmLox6，ZmPEPC，Chlamydomonas Rubisco(我们已经显示其特异性识别玉蜀黍Rubisco蛋白和玉蜀黍硝酸还原酶)的抗体，对来自叶子样品的蛋白进行ELISA。ELISA结果表示为相对于跨越转基因或对照植物的最大值(为100)的相对比例。结果清楚地表明在转基因事件中仅Lox6蛋白的表达为5倍高的水平。

具体实施方式

本发明提供了用于提高植物的氮贮藏容量的方法和组合物，由此与野生型或对照植物可获得的氮含量相比，提高植物或其植物部分的氮含量。本发明的方法包括遗传性地改变植物以表达或过度表达单子叶植物-来源的营养贮藏蛋白(VSP)或其生物活性片段或变体。提高植物的细胞内，尤其是营养细胞内单子叶植物-来源的VSP或其片段或变体的表达，导致植物具有提高的对施加的土壤氮的反应性和提高的可获得的土壤氮的应用。根据本文披露的方法遗传修饰的农作物植物有益地减轻与以肥料形式供应给土壤的氮的淋失和脱氮相关的问题。通过提高植物的细胞内的氮贮藏容量，本发明的方法提供了具有提高的氮含量的植物，尤其是在叶子、茎、及种子内。因此本发明的方法可以用于产生具有提高的营养价值的草料和青饲作物植物，以及用于产生具有提高的营养价值的种子，尤其是谷粒。

根据本发明，VSP或其生物活性片段或变体是具有VSP性质的多肽，即，用作储库以贮藏过量氮的多肽，所述过量氮随后可以被释放和在植物内重新流通(remobilized)，以便在例如，瞬时应激(如营养和/或水分亏缺)的周期期间支持现存植物组织的代谢，和/或支持新的组织的生长和发育。具有VSP性质的多肽被称为“VSP”、“VSP多肽”、或“VSP蛋白”，并且编码具有VSP性质的多肽的多核苷酸被称为“VSP多核苷酸”。“单子叶植物-来源的”VSP或VSP多核苷酸指的是天然存在于单子叶植物物种内的VSP或VSP多核苷酸，或者已经从天然存在于单子叶植物物种内的VSP或VSP多核苷酸获得的VSP或VSP多核苷酸，其中获得是通过单子叶植物VSP或VSP多核苷酸的遗传性操作和/或单子叶植物VSP多核苷酸的应用以从其它植物物种分离编码同源VSP的VSP多核苷酸。

尤其是，用在本发明的方法中的单子叶植物-来源的VSP多核苷酸包括，例如，SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的玉蜀黍(maize)VSP-型脂加氧酶ZmLox6基因的编码序列、编码SEQIDNO：2中陈列的ZmLox6蛋白的序列、以及下面限定的其片段和变体。本发明的单子叶植物-来源的VSP多肽包括，例如，SEQ ID NO：2中陈列的ZmLox6蛋白以及本文下面限定的其生物活性片段和变体。

如本文其他地方的实验部分中更充分描述的，ZmLox6蛋白表现出VSP的特征，因此代表VSP-型脂加氧酶。例如，ZmLox6蛋白在生长培养基中供应高水平的N后被诱导，并且在叶子中表达最高，方式类似于被称为VLX-D的大豆VSP(Tranbarger，et al.，(1991)Plant Cell3：973-988)。考虑到其VSP性质，ZmLox6在本文中被称为VSP，并且编码ZmLox6的序列被认为是VSP多核苷酸。虽然ZmLox6蛋白表现出VSP性质并且因此为VSP-型脂加氧酶，但是认为ZmLox6蛋白或其变体还可以表现出与蛋白的脂加氧酶家族的其他成员相关的其它生物学活性(参见，例如，美国专利No.6,921,847；其全部内容以引用方式并入本文)。

根据本发明，植物、或其植物部分或植物细胞的“提高氮贮藏容量”指的是所述植物、或其植物部分或植物细胞的总可溶蛋白部分相对于分别用野生型或对照植物、或其植物部分或植物细胞观察到的，提高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。通过提高氮贮藏容量，尤其是叶子和茎组织内的氮贮藏容量，可以提高草料作物或青饲作物植物的氮含量，并由此提高营养价值。

草料是由食草动物吃的草本植物材料(包括稻科植物类和豆类)，而青贮饲料是通常供应给反刍类动物的发酵的、高湿气的草料。用在青贮饲料生产中的植物包括：玉米(corn)、高粱(Milo)、多年生稻科植物类(如狗牙根(Bermudagrass)、星草(Stargrass)、及牛鞭草(Limpograss)(牛鞭草属(Hemarthria)))、一年生稻科植物类(如饲草高粱(forage sorghum)、高粱-苏丹草杂种(sorghum-sudan hybrids)、珍珠栗(pearlmillet)、及小粒谷类作物和麦草)、豆类(legumes)(如苜蓿、红三叶草和其它冷季豆类、及夏季豆类，包括毛槐蓝(hairy indigo)、链荚豆、合萌(aeschynomene)、及根茎多年生花生(rhizome perennialpeanut))、甘蔗、燕麦、及作物组合，如高粱和大豆或燕麦和豌豆。

虽然玉米是用于牛和乳牛饲料的青贮饲料的主要来源，但是玉米青贮饲料的蛋白含量较低，必须补充以较高蛋白含量的饲料，如来自大豆粉的饲料。虽然大豆产生具有比玉米中发现的高得多的氮水平的营养植物组织，但是大豆不适于青贮饲料生产。因此，开发具有提高的VSP多肽(如ZmLox6或其生物活性变体)的表达的单子叶植物将提高氮截留和草料和青饲作物的营养价值。

根据本发明，用于草料和青贮饲料的“提高植物、或其植物部分的氮含量”指的是相对于野生型或对照植物、或其植物部分观察到的，基于干重测量的植物或其植物部分内的％总氮增加至少1％、2％、5％、10％、20％或50％。当种子是农艺学感兴趣时，如在谷类作物中，本发明的方法可以相对于从天然对照植物获得的种子提高种子产量、和/或提高种子的氮含量、和/或提高种子的营养价值，因为叶子和茎组织内以ZmLox6蛋白或其变体形式截留的过量的氮可以被重新流通以支持更大的种子生产和种子填充，尤其是在土壤氮水平限于再生库(reproductivesink)发育时。根据本发明，“提高种子的氮含量”指的是相对于野生型或对照植物的种子观察到的，种子内基于种子干重测量的％氮提高至少1％、2％、5％、10％、20％、或50％。

本发明的方法包括提高单子叶植物-来源的VSP在植物中的表达，尤其是玉蜀黍VSP-型脂加氧酶ZmLox6或具有VSP性质的其生物活性片段或变体的表达。因此，在一些实施方式中，所述方法包括将至少一个核苷酸构建体引入感兴趣的植物，所述构建体包含可操作地连接至驱动在植物细胞中的表达的启动子的编码ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体的核苷酸序列。所述核苷酸构建体可以可选地包括用于液泡类别信号(vacuolar sorting signal)或质体转运肽(plastid transit peptide)的可操作地连结的编码序列，以便将ZmLox6蛋白或其片段或变体分别引导入这个蛋白在其中表达的植物细胞的液泡区室或质体区室。在特别地实施方式中，VSP为ZmLox6或其生物活性片段或变体，所述植物为单子叶植物，如玉蜀黍。

任何启动子可以用于驱动单子叶植物-来源的VSP的表达，所述单子叶植物-来源的VSP例如ZmLox6蛋白或其具有VSP性质的生物活性片段或变体，所述启动子包括而不限于下文描述的启动子。因此，例如，在一些实施方式中，VSP，例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体的表达，由组成性启动子驱动，以提供在整个植物的细胞中在多数时间和多数组织中的表达，或者由可诱导的启动子驱动，以便表达响应于刺激而被诱导，例如响应于创伤、外部施加的化学制品、或环境应激。在另外的实施方式中，VSP，例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体的表达，由组织-优选的启动子驱动，以便表达优先发生在希望的组织内。在一个这样的实施方式中，启动子为叶子-优选的启动子，以提供在叶子组织的细胞内的优先表达。

在另外的实施方式中，选择启动子以提供VSP，例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体优先在特定的叶子细胞内(如在叶肉细胞或维管束鞘细胞内)的表达，以提供VSP或其片段或变体在叶子组织的这些细胞内的局部积聚。这样的启动子在本文中被称为“叶肉细胞-优选的启动子”或“维管束鞘细胞-优选的启动子”，并且包括本文其他地方描述的那些启动子。虽然C3植物的叶子组织通常包括松散组织的维管束鞘细胞，但是大部分光合作用酶和相关的光合作用机器被包含在更丰富的叶肉细胞的叶绿体内。当VSP或其生物活性片段或变体的优先表达在C3植物的叶子的叶肉细胞内被靶向时，包含可操作地连接到叶肉细胞-优选的启动子的感兴趣的VSP或其片段或变体的编码序列的核苷酸构建体可以可选地包含液泡类别信号，以便将表达的VSP或其片段或变体引导入这些细胞的液泡区室以最小化对叶绿体和细胞功能的影响。

C4植物的叶肉细胞和维管束鞘细胞之间的光合功能的明显区别表示可以被有利地操作以提高这些植物的氮贮藏容量的不同的氮储库机会。C4植物如玉蜀黍的叶肉细胞内的较少丰富的叶绿体包含少量Rubisco或不包含Rubisco，其在维管束鞘细胞的丰富的叶绿体内浓集。不限于理论，C4植物的叶子内的叶肉细胞的质体区室可以被预期为以单子叶植物-来源的VSP或其片段或变体形式的氮的贮藏提供额外的储库(除了由C4植物叶子组织的叶肉细胞和维管束鞘细胞中均存在的细胞质和液泡区室提供的储库以外)，同时最小限度地影响叶绿体功能。

认识到在C4植物的叶肉细胞和维管束鞘细胞内的优先表达可以是希望的。这可以通过例如将作为单个的核苷酸构建体或作为多个核苷酸构建体的下列多核苷酸引入植物而实现：包含可操作地连接到优先驱动VSP或其片段或变体在叶肉细胞内的表达的启动子的感兴趣的VSP或其片段或变体的编码序列的至少一个多核苷酸、以及包含可操作地连接到驱动VSP或其片段或变体在维管束鞘细胞内表达的启动子的感兴趣的VSP或其片段或变体的编码序列的至少另一多核苷酸。当VSP或其片段或变体要被优先在C4植物如玉蜀黍的叶肉和/或维管束鞘细胞内表达时，所述核苷酸构建体可以可选地包含可操作地连接的液泡类别信号的编码序列，以引导表达的VSP或其片段或变体进入叶肉或维管束鞘细胞的液泡区室内。当VSP或其片段或变体要在C4植物的叶肉细胞内优先表达时(单独或与在维管束鞘细胞内的优先表达结合)，要被引入植物中的核苷酸构建体可以被设计以便所述多核苷酸编码上述可操作地连接的液泡转运肽，或者可以被设计以便所述多核苷酸编码可操作地连接的质体转运肽，如叶绿体转运肽，以便引导表达的VSP或其片段或变体进入叶肉细胞的质体区室内。

通过提高单子叶植物-来源的VSP，如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体在植物中的表达，可以提高植物内的氮贮藏容量，产生了在感兴趣的一个或多个组织中总植物氮含量的全面提高。以这种方式，本发明的方法发现了在提高用于草料和青贮饲料的植物的总氮含量和营养价值中的应用，以及在提高种子(如谷类作物中的种子)的总氮含量和营养价值中的应用。

虽然本文描述的单子叶植物-来源的VSP极其生物活性片段和变体的编码序列可以用于提高任何感兴趣的植物的氮贮藏容量，但是发现ZmLox6编码序列及其片段和变体在提高单子叶植物如玉蜀黍的氮贮藏容量、组织氮含量、及营养价值中的特别应用，因为这个VSP已经发展到在单子叶植物细胞环境内起作用。进一步认识到提高植物的氮贮藏容量可以有益地提供来自环境的更有效的氮应用，同时为所述植物提供过量氮储量，其可以在随后的植物发育周期期间被流通，如在结实(seedset)和种子填充期间，尤其是在所述植物遭受水和/或营养应激时。

本发明的方法包括分离的或基本上纯化的VSP多核苷酸或蛋白组合物(包括ZmLox6编码序列和蛋白)的应用，以便提高植物的氮贮藏容量、提高草料或青饲作物植物的氮含量和营养价值、提高种子(尤其是农作物植物的谷粒)的氮含量和营养价值。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白，或其生物活性部分，实质上或基本上不含有通常伴随其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白或与天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上不含其它细胞物质、或通过重组技术产生时的培养基、或基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学成分(chemicals)。最佳地，“分离的”多核苷酸不含天然地位于多核苷酸来源的有机体的基因组DNA中的多核苷酸(即，位于多核苷酸的5’和3’端的序列)的侧翼的序列(最佳地蛋白编码序列)。例如，在多个实施方式中，分离的多核苷酸可以包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其天然地位于多核苷酸来源的细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计算)的污染蛋白的蛋白的制备。当重组产生本发明的蛋白或其生物活性部分时，最佳的培养基显示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计算)的化学前体或非感兴趣的蛋白的化学成分。

单子叶植物-来源的VSP多核苷酸和由其编码的多肽的片段和变体的应用也由本发明包括。依赖于上下文，“片段”指的是多核苷酸的部分或由其编码的氨基酸序列和由此的蛋白的部分。多核苷酸的片段可以编码保留原始蛋白的生物学活性并因此提供VSP性质的蛋白片段。因此，核苷酸序列的片段的范围可以从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸一直到编码VSP多肽的全长多核苷酸。

编码VSP多肽的生物活性部分的VSP多核苷酸的片段将编码全长VSP多肽(例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6多肽的892个氨基酸)中存在的至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或875个相邻氨基酸，或最多全部数量的氨基酸。可以携带完整蛋白的特征的VSP多肽的部分可以通过分离VSP多核苷酸的部分、表达VSP多肽的编码的部分(如，通过体外重组表达)、以及评估VSP多肽的编码的部分的活性而制备。作为VSP多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600或2,650个相邻核苷酸、或至多全长VSP多核苷酸中存在的核苷酸的数量(如，对于SEQ IDNO：1的ZmLox6核苷酸序列的2,909个相邻核苷酸，或者对于SEQ IDNO：3的ZmLox6编码序列的2,676个相邻核苷酸)。

术语“变体”指的是基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包括具有这样的多核苷酸，其具有在5′和/或3′端的缺失(即，截短)；一个或多个核苷酸在天然多核苷酸的一个或多个内部位点的缺失和/或添加；和/或一个或多个核苷酸在天然多核苷酸中的一个或多个位点的替换。如本文所用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括因为遗传密码的简并性而编码VSP多肽，如SEQ ID NO：2的ZmLox6的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体，如可以利用熟知的分子生物学技术鉴定的这些变体，例如，借助聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，如，例如通过利用位点-引导的诱变或“改组(shuffling)”产生的那些。通常，特定多核苷酸(例如SEQID NO：1中陈列的ZmLox6序列，或者SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列)的变体具有与那个特定多核苷酸至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过本文其它地方描述的序列对准程序和参数确定的。

还可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参考多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性评估特定多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体。因此，例如，在一个实施方式中，VSP多核苷酸的变体是编码具有与SEQ ID NO：2的ZmLox6多肽具有给定的百分比同一性的VSP多肽的分离的多核苷酸。任何两个多肽之间的百分比序列同一性可以利用本文其他地方所述的序列对准程序和参数计算。当任何给定的用于实施本发明的多核苷酸对通过比较它们编码的两个多肽分享的百分比序列同一性来评估时，所述两个编码的多肽之间的百分比序列同一性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。

“变体”蛋白意图意味着通过以下从天然和/或原始蛋白获得的蛋白：通过在所述蛋白的N-末端和/或C-末端缺失(所谓的截短)一个或多个氨基酸；在所述蛋白中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；或者在所述蛋白中的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸。本发明包括的变体蛋白是生物活性的，即，它们继续具有本文所述的希望的VSP性质。VSP多肽(例如SEQ ID NO：2所示的ZmLox6蛋白)的生物活性变体，将具有与天然蛋白的氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其通过本文其他地方所述的序列对准程序和参数确定。VSP多肽(例如，ZMLox6蛋白)的生物活性变体，可以不同于那个多肽，不同之处为少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个、如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。

用于实施本发明的单子叶植物-来源的VSP多肽可以以各种途径被改变，所述途径包括氨基酸替换、缺失、截短、和插入。用于这样的操作的方法在本领域是公知的。例如，可以通过编码多核苷酸中的突变制备SEQ ID NO：2的ZmLox6蛋白的氨基酸序列变体和片段，所述编码多核苷酸如SEQ ID NO：1中陈列的序列，或者SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的编码序列。用于诱变和多核苷酸改变的方法在本领域是熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)及其中引用的参考文献。关于不影响感兴趣的蛋白的生物活性的氨基酸替换的指导可以在Dayhoff，et al.，(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型中找到，其以引用方式并入本文。可以进行保守的替换，如一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸交换。

单子叶植物-来源的VSP多肽，例如ZMLox6蛋白，或其生物活性片段和变体，还可以通过修饰编码多核苷酸而被改变，以表达富含必需氨基酸的VSP多肽(相对于在天然蛋白中这样的氨基酸的平均水平)，所述必需氨基酸包括赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、及异亮氨酸。在一个实施方式中，编码ZMLox6蛋白、或其生物活性片段或变体的多核苷酸被修饰以便所述蛋白的赖氨酸含量丰富。用于改变蛋白的营养氨基酸含量的方法是已知的(参见，例如，美国专利No.6,905,877，其全部内容以引用方式并入本文中)。因此这样的方法提供这样的应用：提高本文所述的VSP多肽的营养价值、以及提高植物或其植物部分的营养价值、表达这样的营养提高的VSP多肽。

用在本发明的方法中的变体VSP多核苷酸和VSP还包括从诱变和重组过程如DNA改组获得的序列和蛋白。采用这样的过程，一个或多个不同的VSP多肽编码序列可以被处理以形成具有希望的性质的新的VSP多肽。以这种方式，可以从包含具有基本的序列同一性并且可以在体外或体内被同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸的文库。例如，利用这个方法，编码感兴趣的结构域的序列基序可以在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的ZMLox6序列和其它已知的Lox基因之间被改组，以获得编码具有改进的感兴趣的性质(如提高的必需氨基酸的含量)的VSP蛋白的新的基因。用于这样的DNA改组的策略在本领域是已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利Nos.5,605,793和5,837,458。

用在本发明的方法中的ZmLox6多核苷酸可以用于从其它植物(包括其它单子叶植物)分离相应的VSP序列。以这种方式，如PCR、杂交等方法可以用于基于它们与SEQ ID NO：1中陈列的ZmLox6序列、或SEQ ID NO：1的核苷酸62-2470中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列的序列同源性鉴定这样的序列。基于与本文陈述的完整ZmLox6核苷酸序列或与其变体和片段的它们的序列同一性分离的序列被本发明包括。这样的序列包括作为所披露的序列的直系同源体(orthologs)的序列。“直系同源体”意图意味着从共同的祖先基因获得并且由于物种形成在不同的物种中发现的基因。在不同的物种中发现的基因，当它们的核苷酸序列和/或它们的编码的蛋白序列分享至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性时，被认为是直系同源体。直系同源体的功能在物种中通常是高度保守的。因此，编码VSP多肽，并且在严格条件下杂交到SEQ ID NO：1的ZmLox6序列、或SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或其变体或片段的分离的多核苷酸可以用于实施本发明。

在PCR方法中，寡核苷酸引物可以被设计用于PCR反应以扩增来自cDNA或从任何感兴趣的植物提取的基因组DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常在本领域是已知的，并且披露在Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。还参见，Innis，et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)中。PCR的已知方法包括而不限于利用配对引物、巢式引物(nested primer)、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等的方法。

在杂交技术中，全部或部分的已知的多核苷酸被用作探针，其选择性地杂交到来自所选有机体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群(即，基因组或cDNA文库)中存在的其它相应多核苷酸。杂交探针可以为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可检测的基团如³²P，或任何其它可检测的标记物标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于SEQ ID NO：1的ZmLox6核苷酸序列、或SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列的合成寡核苷酸来制备。用于制备用于杂交和用于cDNA和基因组文库的构建的探针的方法通常在本领域是已知的，并且披露在Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)中。

例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737、或SEQID NO：3中披露的完整ZmLox6多核苷酸、或其一个或多个部分，可以用作能够特异性杂交到相应VSP多核苷酸和信使RNA的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括这样的序列，其在VSP多核苷酸序列中是独特的，最佳为约10个核苷酸的长度、最佳为至少约20个核苷酸的长度。这样的探针可以用于通过PCR扩增来自所选植物的相应VSP多核苷酸。这个技术可以用于从希望的植物分离另外的VSP编码序列或者作为诊断试样(assay)以确定植物中VSP编码序列的存在。杂交技术包括平铺的(plated)DNA文库的杂交筛选(斑块或集落；参见，例如，Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格的条件”或“严格的杂交条件”指的是这样的条件，在这样的条件下探针将以比其它序列更大的可检测地程度杂交到其靶序列(例如，至少2倍于背景)。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的情况下将是不同的。通过控制杂交和/或冲洗条件的严格性，100％互补于所述探针的靶序列可以被鉴定(同源探测)。可选地，可以调整严格性条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针为少于约1000个核苷酸的长度，最佳为少于500个核苷酸的长度。

典型地，严格的条件将是那些条件，其中盐浓度少于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，pH为7.0-8.3，对于短探针(例如，10到50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。严格地条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺实现。示例性的低严格性条件包括用30-35％的甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，以及在50-55℃的1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中冲洗。示例性的中等严格性条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在55-60℃的0.5X-1XSSC中冲洗。示例性的高度严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在60-65℃在0.1X SSC中冲洗。可选地，冲洗缓冲剂可以包括约0.1％到约1％的SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常约4到约12小时。冲洗时间的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。

特异性通常为杂交后冲洗的功能，关键因素为最终冲洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以为接近来自于Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％形(form))-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形为杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及L为碱基对中杂交体的长度。T_m为(在限定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列杂交到完全匹配的探针的温度。对于每个1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可以调整T_m、杂交、和/或冲洗条件以杂交到希望的同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，T_m可以降低10℃。通常，在限定的离子强度和pH时，对于特异性序列及其互补体，选择的严格的条件比热熔点(T_m)低约5℃。然而，极其严格的条件可以利用比热熔点(T_m)低1、2、3或4℃的杂交和/或冲洗；中等严格的条件可以利用比热熔点(T_m)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或冲洗；低严格性条件可以利用比热熔点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或冲洗。利用所述等式、杂交和冲洗组分、及希望的T_m，本领域的普通技术人员将理解杂交和/或冲洗溶液的严格性中的变化被内在的描述。如果希望的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最好是提高SSC浓度以便可以利用更高的温度。对于核酸的杂交的更广泛的指导存在于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；及Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in MolecularBiology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中。参见，Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)。

下面的术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”，及(d)“序列同一性的百分比”。

(a)如本文所用的，“参考序列”是用作序列比较的基础的限定的序列。参考序列可以为特定的序列的亚组或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段，或者完全的cDNA或基因序列。

(b)如本文所用的，“比较窗”涉及多核苷酸序列的相邻和特异性节段，其中所述比较窗中的多核苷酸序列可以包括相较于参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，间隙)，用于所述两个多核苷酸的最佳对准。通常，比较窗为至少20个相邻核苷酸的长度，可选地可以为30、40、50、100个的长度或更长。本领域的技术人员理解为了避免由于多核苷酸序列中包含间隙导致与参考序列的高度相似性，通常引入间隙罚分并且从匹配的数量被减去。

用于比较的序列的对准方法在本领域是熟知的。因此，任何两个序列之间的百分比序列同一性的确定可以利用数学算法实现。这样的数学算法的非限制性实例是：Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith，et al.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部对准算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局对准算法(global alignment algorithm)；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的检索局部(search-for-local)对准方法；Karlinand Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改良。

这些数学算法的计算机实施可以用于序列的比较以确定序列同一性。这样的实施包括而不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可以从Intelligenetics，Mountain View，California获得)；ALIGN程序(Version 2.0)和GCG Wisconsin Genetics Software Package，Version 10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA(可以从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA获得)。可以利用缺省参数进行利用这些程序的对准。CLUSTAL程序由Higgins，et al.，(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins，et al.，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang，et al.，(1992)CABIOS8：155-65；及Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331充分描述。ALIGN程序是基于上文Myers and Miller(1988)的算法。PAM120权重残基表，12的间隙长度罚分，4的间隙罚分在比较氨基酸序列时可以与ALIGN程序使用。Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是基于上文的Karlin and Altschul(1990)的算法。BLAST核苷酸检索可以借助BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与编码本发明的方法中所用的VSP的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以借助BLASTX程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的方法中所用的VSP同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的间隙对准(gapped alignment)，可以使用间隙BLAST(BLAST 2.0中)，如Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述。可选地，PSI-BLAST(BLAST 2.0中)可以用于进行检测分子之间的遥远关系的反复检索。参见，上文Altschul，et al.，(1997)。当利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的缺省参数(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)。BLAST软件在NCBI网站上是公众可获得的。对准还可以通过检查手动进行。

除非另外说明，本文提供的序列同一性/相似性值指的是利用GAPVersion 10利用下列参数获得的值：利用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵，用于核苷酸序列的％同一性和％相似性；利用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62计分矩阵，用于氨基酸序列的％同一性和％相似性；或者其任何等效程序。“等效程序”指的是任何序列比较程序，对于任何两个所讨论的序列，产生在与由GAP Version 10产生的相应的对准比较时，具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的百分比序列同一性的对准。

GAP利用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以发现最大化匹配的数量和最小化间隙的数量的两个完全序列的对准。GAP考虑所有可能的对准和间隙位置并形成具有最大数量的匹配碱基和最少的间隙的对准。它允许规定匹配的碱基的单位中的间隙形成罚分和间隙扩展罚分。GAP必须利用对于它插入的每个间隙的匹配的间隙形成罚分数量。如果所选的间隙扩展罚分大于零，那么GAP必须，另外，利用插入的每个间隙的间隙长度乘以间隙扩展罚分。用于蛋白序列的GCG Wisconsin Genetics Software Package的Version 10中缺省间隙形成罚分值和间隙扩展罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，缺省间隙形成罚分为50，而缺省间隙扩展罚分为3。间隙形成和间隙扩展罚分可以被表达为选自由从0到200组成的整数的组的整数。因此，例如，间隙形成和间隙扩展罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP表示最佳配准的家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是没有其他成员具有更好的质量。GAP显示四个用于配准的品质因数：质量、比率、同一性、及相似性。质量是为了对准序列最大化的量度。比率是质量除以较短节段中的碱基数量。百分比同一性是实际上匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。从间隙穿过的符号被忽略。当对于成对记号的计分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，相似性被计分。GCG Wisconsin Genetics Software Package的Version 10中所用的计分矩阵是BLOSUM62(参见，Henikoff andHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)如本文所用的，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”指的是两个序列中当在特定的比较窗上对准用于最大的相应性时相同的残基。当使用的序列同一性的百分比涉及蛋白时，认识到不相同的残基位置通常由保守的氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被另外的具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基替换，并因此不改变所述分子的功能性质。当序列在保守的替换方面不同时，百分比序列同一性可以被向上调整以校正替换的保守性质。由于这样的保守替换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这样的调整的方式对于本领域的技术人员是熟知的。典型地，这涉及将保守替换作为部分而不是全部错配计分，由此提高百分比序列同一性。因此。例如，当相同的氨基酸被给予1的得分时，非保守的替换被给予0的得分，保守的替换被给予0和1之间的得分。当在例如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实施时，计算保守替换的计分。

(d)如本文所用的，“序列同一性的百分比”指的是通过在比较窗上比较两个最佳对准的序列确定的值，其中比较窗内多核苷酸序列的部分与参考序列相比(其不包括添加或缺失)可以包括添加或缺失(即，间隙)，用于两个序列的最佳对准。百分比通过如下计算：确定两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配的位置的数量、匹配的位置的数量除以比较窗中位置的总数、结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。

术语“多核苷酸”的应用不意图限于包含DNA的多核苷酸。本领域的普通技术人员将认识到多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。因此，多核苷酸还包括所有形式的序列，包括而不限于单链形式、双链形式、发卡式、茎-和-环结构等。

VSP多核苷酸，例如，ZmLox6多核苷酸或其片段或变体，可以在表达盒中提供，用于在感兴趣的植物中的表达。所述盒将包括可操作地连接到VSP多核苷酸的5’和3’调节序列。“可操作地连接的”意图指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，感兴趣的多核苷酸和调节序列(即，启动子)之间的可操作的连接是允许感兴趣的多核苷酸的表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或不相邻的。当用于指两个蛋白编码区之间的接合时，“可操作地连接的”指的是编码区是在相同的阅读框中。所述盒可以另外包含至少一个要被共转化入植物中的另外的基因。可选地，所述另外的基因可以在多个表达盒上提供。这样的表达盒设置有多个限制性位点和/或重组位点，用于VSP多核苷酸的插入，以在调节区的转录调节下。所述表达盒可以另外地包含其它基因，包括其它可选的标记物基因。

所述表达盒在转录的5′-3′方向上将包括植物中功能性的转录和翻译起始区(即，启动子)、VSP多核苷酸(例如，SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：1的核苷酸62-2737、SEQ ID NO：3、或其片段或变体)、及转录和翻译终止区(即，终止区)。所述调节区(即，启动子、转录调节区、及翻译终止区)和/或VSP多核苷酸可以是对于宿主细胞或者对于彼此是天然的/类似的。可选地，调节区和/或VSP多核苷酸可以是对于宿主细胞或对于彼此是异源的。如本文所用的，关于序列的“异源的”是起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同的物种，通过故意的人类介入而在组成和/或基因组基因座中从其天然的形式充分地修饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子是来自不同于所述多核苷酸来源的物种的物种，或者，如果来源于同样的/类似的物种，一个或两个均从它们起源形式和/或基因组基因座被充分地修饰，或者所述启动子对于可操作地连接的多核苷酸不是天然启动子。

虽然利用异源启动子表达VSP多核苷酸是最佳的，但是可以使用天然启动子序列。这样的构建体可以改变植物或植物细胞中编码的多肽的表达水平。因此，所述植物或细胞的表型可以被改变。

所述终止区可以是与转录起始区是天然的，可以与可操作地连接的感兴趣的VSP多核苷酸是天然的，可以与植物宿主是天然的，或者可以源自对于启动子、感兴趣的VSP多核苷酸、植物宿主、或其任何组合的另外的来源(即，外来或异源的)。本发明所用的方便的终止区包括那些可以从A.tumefaciens的Ti-质粒获得的终止区，如肉碱合酶和胭脂碱(nopaline)合酶终止区。还参见，Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Ce ll64：671-674；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，et al.，(1989)Nuc leicAcidsRes.17：7891-7903；及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。

在本发明的一些实施方式中，所述表达盒包括可操作地连接到感兴趣的VSP编码序列的液泡类别信号的编码序列，所述VSP例如SEQ IDNO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体。将蛋白分类到蛋白贮藏液泡的类别信号是特别有趣的。参见，例如，Neuhaus and Rogers(1998)Plant Mol.Biol.38：127-144，及Holwerda，et al.，(1992)The Plant Cell4：307-318，以引用方式并入本文中。这样的用于液泡类别信号的编码序列的实例在本领域是已知的，并且包括而不限于玉蜀黍proaleurain液泡类别信号。例如，来自烟草几丁酶和南瓜2S白蛋白的C-末端前肽(propeptide)均已经被成功地用于将可溶蛋白靶向液泡。参见，Mistubishi，et al.，(2000)Plant Cell Physiol.41(9)：993-1001；及Tamura，etal.，(2003)The Plant J.35：545-555。

在另外的实施方式中，所述表达盒包括可操作地连接到感兴趣的VSP的编码序列的质体转运肽的编码序列，所述VSP例如SEQ ID NO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体，以便将表达的VSP引导入VSP被表达的植物细胞的质体区室内。这样的转运肽在本领域是已知的。参见，例如，Von Heijne，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer，et al.，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah，et al.，(1986)Science 233：478-481。叶绿体转运肽(还称为叶绿体靶向序列)在本领域是已知的并且包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚单位(de Castro Silva Filho，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell，et al.，(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇式丙酮)莽草酰-3-磷酸合酶(5-(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphate synthase)(EPSPS)(Archer，et al.，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao，et al.，(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence，et al.，(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；chorismate synthase(Schmidt，et al.，(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(light harvesting chlorophyll a/b binding protein)(LHBP)(Lamppa，et al.，(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还参见Von Heijne，et al.，(1991)Plant Mo l.Biol.Rep.9：104-126；Clark，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer，et al.，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah，et al.，(1986)Science 233：478-481。

用于提高感兴趣的多肽在植物或植物细胞中的表达的方法在本领域中是已知的，例如，通过将紧邻于起始蛋氨酸ATG密码子并且在其下游的一个或两个富含G/C的密码子(如GCG或GCT)插入多肽编码序列。当合适时，VSP多核苷酸可以被最优化用于提高在转化的植物中的表达。参见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11中对于宿主-优选的密码子选择(codon usage)的讨论。用于合成植物-优选的基因的方法在本领域中是可获得的。参见，例如，美国专利Nos.5,380,831和5,436,391，以及Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，以引用方式并入本文中。包括这样的修饰的实施方式也是本发明的特征。

另外的序列修饰已知提高特定植物宿主中的基因表达。这些包括消除编码伪多聚腺嘌呤信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复、及其它对于基因表达可能有害的这样的充分-表征的序列。所述序列的G-C含量可以被调整到对于给定的植物宿主的平均水平，其通过参考宿主细胞中表达的已知基因计算。在可能时，所述序列被修饰以避免预知的发卡二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5′前导序列。这样的前导序列可以用于提高翻译。翻译前导体在本领域中是已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导体，例如，EMCV前导体(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；potyvirus前导体，例如，TEV前导体(烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus))(Gallie，et al.，(1995)Gene165(2)：233-238)，MDMV前导体(玉蜀黍矮花叶病毒(Dwarf MosaicVirus))(Virology 154：9-20)，及人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白mRNA的未翻译的前导体(AMV RNA 4)(Jobling，et al.，(1987)Nature325：622-625)；烟草花叶病毒前导体(TMV)(Gallie，et al.，(1989)inMolecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；及玉蜀黍chlorotic mottle病毒前导体(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Viro logy 81：382-385)。还参见，Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制备表达盒中，可以处理多个多核苷酸片段，以便提供在正确的方向和适当时正确的阅读框中的序列。为此，可以采用适配子或连接子以连接片段或可以包括其它处理以提供方便的限制性位点、去除多余物质，如去除限制性位点、或类似的事情等。为此目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制、退火、重新替换，如转换和颠换。本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的并且更充分地描述在，例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press；Plainview，New York)中。

大量启动子可以用在本发明的实践中，包括感兴趣的VSP多核苷酸序列的天然启动子。所述启动子可以基于希望的结果选择。感兴趣的VSP多核苷酸可以与组成性、可诱导的、组织-优选的、或用于在植物中表达的其它启动子组合。

这样的组成性启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子和WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中披露的其它组成性启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)；稻米肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(ubiquitin)(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等。其它组成性启动子包括，例如，美国专利Nos.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中披露的那些启动子。

另外，创伤-可诱导的启动子可以用在本发明的构建中。这样的创伤-可诱导的启动子包括用于下列的启动子：马铃薯蛋白酶抑制子(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phyt opath.28：425-449；Duan，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanford，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(systemin)(McGurl，et al.，(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp，et al.，(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok，et al.，(1994)PlantJ.6(2)：141-150)；等等，通过引入方式并入本文。

组织优选的启动子可以用于特定植物组织内靶向提高的VSP多肽表达。组织优选的启动子包括Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；及Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505中披露的那些。这样的启动子可以被修饰，如果必要，用于弱表达。

叶子优选的启动子在本领域是已知的。参见，例如，Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon，et al.，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor，et al.，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；及Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

在一些实施方式中，VSP多肽，例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体，优先在特定的叶子细胞中表达，尤其在叶肉细胞、维管束鞘细胞、或两者中表达。提供可操作地连接的异源多核苷酸在转基因植物中的叶肉细胞-优选的表达的启动子包括而不限于：用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)和丙酮酸盐的启动子；正磷酸二激酶(orthophosphate dikinase)基因(参见，例如，Matsuoka and Sanada(1991)Mol.Gen.Genet.225(3)：411-419；Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：9586-9590；Kausch，et al.，(2001)Plant Mol.Biol.45(1)：1-15；Taniguchi，et al.，(2000)Plant Cell Physiol.41(1)：42-48)；用于cab-l基因的启动子(参见，例如，用于玉蜀黍cab-ml基因的启动子，Shiina，et al.，(1997)Plant Physiol.115(2)：477-483和Bansal，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：3654-3658中)；及用于Rubisco小亚单位基因的启动子(参见，例如，用于番茄和稻米rbcS基因的启动子，Kyozuka，etal.，(1993)Plant Physiol.102：991-1000中；以及由用于玉蜀黍Rubisco小亚单位的启动子提供的在转基因C3植物内叶肉细胞-优选的表达(参见，例如，Matsuoka and Sanada(1991)Mol.Gen.Genet.225(3)：411-419))。提供可操作地连接的异源多核苷酸在转基因植物中的维管束鞘细胞-优选的表达的启动子包括而不限于用于C4植物的Rubisco小单位基因的启动子(参见，例如，玉蜀黍rbcS-m3启动子和为维管束鞘细胞特异性表达提供的元件，描述在Viret，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8577-8581，Bansal，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3654-3658中)，及Sch

ffner and Sheen(1991)PlantCell 3：997-1012。

在一些实施方式中，设计表达盒以便编码的VSP(例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体)的表达，由玉蜀黍Rubisco小亚单位(SSU)启动子驱动(参见，例如，图1A；还参见Genbank编号U09743.1)。当被引入C4植物如玉蜀黍中时，这个构建体提供编码的VSP在叶子组织的维管束鞘细胞内的优先表达。在其它实施方式中，这个构建体进一步包括用于液泡类别信号(例如，玉蜀黍proaleurain液泡类别信号)的编码序列，可操作地连接到VSP多核苷酸，以便表达的VSP被引导到维管束鞘细胞的液泡区室(参见，例如，图1B)。ZM-proaleurain信号肽(SP)和液泡靶向序列(VTS)对于ZmLox6的Golgi-介导的处理和液泡靶向是必要的。

在一些实施方式中，设计所述表达盒以便编码的VSP(例如，SEQID NO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体)的表达由玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)启动子驱动(参见，例如，图2A；还参见GenBank编号X15642.1(部分序列))。当被引入植物中时，这个构建体提供编码的VSP在叶子组织的叶肉细胞内的优先表达。在另外的实施方式中，这个构建体进一步包括液泡类别信号，例如，玉蜀黍proaleurain液泡类别信号的编码序列，可操作地连接到VSP多核苷酸，以便表达的VSP被引导入叶肉细胞的液泡区室(参加，例如，图2B)。当植物为C4植物如玉蜀黍时，所述表达盒可以可选地包括质体转运肽(例如，叶绿体转运肽)的编码序列，可操作地连接到VSP多核苷酸，以便表达的VSP被引导入叶肉细胞的质体区室。

在一些实施方式中，设计所述表达盒以便编码的VSP(例如SEQ IDNO：2的ZmLox6或其生物活性片段或变体)的表达由组成性启动子，如泛素(UBI)启动子(例如，玉蜀黍UBI启动子)驱动(参见，例如，图3A；还参见Genbank编号S94464)。在另外的实施方式中，所述表达盒还包括液泡类别信号(例如，玉蜀黍proaleurain液泡类别信号)的编码序列，可操作地连接到VSP多核苷酸，以便表达的VSP被引导入细胞的液泡区室(参见，例如，图3B)。

所述表达盒还包括用于转化的细胞的选择的可选择的标记物基因。可选择的标记物基因用于转化的细胞或组织的选择。标记物基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶III(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及提供对除草(herbicidal)化合物(如草胺磷(glufosinate ammonium)、溴苯腈(bromoxynil)、咪哇琳酮(imidazolinones)、及2，4-二氯苯氧乙酸酯(dichlorophenoxyacetate)(2，4-D))的抗性的基因。另外的可选择的标记物包括表型标记物，如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)(Su，et al.，(2004)Biotechnol.Bioeng.85：610-9和Fetter，et al.，(2004)Plant Cell16：215-28)、氰基荧光(cyanofluorescent)蛋白(CYP)(Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato，et al.，(2002)Plant Physiol129：913-42)、及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见，Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54)。对于另外的可选择的标记物，通常参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao，et al.，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley，et al.，(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu，et al.，(1987)Cell 48：555-566；Brown，et al.，(1987)Ce ll49：603-612；Figge，et al.，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-5404；Fuerst，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle，et al.，(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of ExperimentalPharmaco logy，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill，et al.，(1988)Nature334：721-724。这样的披露内容以引用方式并入本文中。上述列出的可选择的标记物基因不意图是限制性的。任何可选择的标记物基因可以用在本发明中。

本发明还提供了用于提高植物中VSP多肽(例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体)的浓度和/或活性的方法。通常，相对于没有本发明的VSP序列被引入的野生型或对照植物、植物部分、或细胞，浓度和/或活性提高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。提高本发明中VSP多肽的浓度和/或活性可以在植物生长到希望的发育阶段期间和/或随后存在。在特定的实施方式中，VSP多肽，如ZmLox6蛋白或其片段或变体，在单子叶植物(包括而不限于玉蜀黍)中提高。

VSP多肽的表达水平可以例如，通过用于植物中VSP多肽的水平的分析直接测量。

在特定的实施方式中，VSP多肽或多核苷酸被引入植物细胞。如本文其它地方所讨论的，用于提供多肽到植物的许多方法在本领域是已知的，包括而不限于：多肽直接引入植物和将编码具有VSP性质的多肽的多核苷酸构建体引入植物(瞬时地或稳定地)。随后，利用本领域技术人员已知的方法选择具有引入的本发明的序列的植物细胞，所述方法例如，而不限于，DNA印记分析、DNA测序、PCR分析、或表型分析。通过前述实施方式改良的植物或植物部分在植物形成条件下生长达到足以提高植物中VSP多肽(例如，ZmLox6蛋白或其片段或变体)的浓度和/或活性的时间。植物形成条件在本领域是熟知的并且在本文其他地方简单地讨论。

还认识到可以通过采用不能够引导蛋白或RNA在转化的植物中的表达的多核苷酸提高VSP多肽的水平。例如，VSP多核苷酸(如ZmLox6基因)可以用于设计多核苷酸构建体，所述构建体可以用在用于改变或变异有机体中基因组核苷酸序列的方法中。这样的多核苷酸构建体包括，而不限于，RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合的双链体寡核苷酸、自身互补的RNA：DNA寡核苷酸、及引起重组的寡核酸碱基(oligonucleobases)。这样的核苷酸构建体和使用方法在本领域是已知的。参见，美国专利Nos.5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972；及5,871,984；其全部以引用方式并入本文中。还参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821、及Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；以引用方式并入本文中。因此，可以通过改变编码VSP多肽或其启动子的基因来提高VSP多肽(例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6蛋白或其片段或变体)的水平和/或活性。参见，例如，Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling，et al.，PCT/US93/03868。因此，提供了携带VSP基因中的突变的被诱变的植物，其中所述突变提高VSP基因(例如，ZmLox6基因)的表达，或者提高编码的VSP多肽(例如，ZmLox6蛋白)的VSP性质。

由此认识到本发明的方法不依赖于完整的多核苷酸并入基因组，只是所述植物或其细胞由于多核苷酸引入细胞而被改变。在本发明的一个实施方式中，在将VSP多核苷酸，如SEQ ID NO：1的ZmLox6序列、或SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列引入细胞后，基因组被改变。例如，所述多核苷酸、或其任何部分，可以并入植物的基因组中。本发明的基因组的改变包括而不限于核苷酸的添加、缺失、和替换入基因组。虽然本发明的方法不依赖于任何特定数量的核苷酸的添加、缺失、及替换，但是认识到这样的添加、缺失、或替换包括至少一个核苷酸。

因此，在一些实施方式中，本发明的方法涉及将VSP多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”意图意味着将VSP多核苷酸或多肽以所述序列通向植物的细胞的内部的方式给予所述植物。本发明的方法不依赖于用于将序列引入植物的特定方法，只是所述多核苷酸或多肽通向植物的至少一个细胞的内部。用于将VSP多核苷酸或多肽引入植物的方法在本领域是已知的，包括而不限于：稳定转化方法、瞬时转化方法、及病毒-介导的方法。

“稳定转化”意图意味着引入植物中的核苷酸构建体整合入植物的基因组中并且能够由其后代继承。“瞬时转化”意图意味着多核苷酸被引入植物中并且不整合入植物的基因组中或者多肽被引入植物中。

转化方案以及将VSP多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以依赖于转化靶向的植物或植物细胞的类型而变化。在一些实施方式中，本发明的方法涉及适于将VSP多肽或多核苷酸序列引入单子叶植物中的转化方案。

将VSP多肽和多核苷酸引入植物细胞中的合适的方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4320-334)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，Agrobacterium-mediatedtransformation(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722)、以及弹道粒子加速(ballistic particle acceleration)(参见，例如，美国专利Nos.4,945,050；美国专利No.5,879,918；美国专利No.5,886,244；以及，5,932,782；Tomes，et al.，(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926)；及Lecl transformation(WO 00/28058)。还参见，Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(稻米)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；美国专利Nos.5,240,855；5,322,783；及，5,324,646；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet，et al.，(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)PlantCell Reports9：415-418和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须-介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255及Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻米)；Osjoda，etal.，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉蜀黍，经由Agrobacterium tumefaciens)；其全部以引用方式并入本文中。

在特定的实施方式中，可以利用多种瞬时转化方法，将与野生型或对照植物相比，植物或其植物部分的提高的氮贮藏容量、和伴随的氮含量和/或营养价值的提高，提供给植物。这样的瞬时转化方法包括而不限于：将VSP多肽(例如，SEQ ID NO：2的ZmLox6蛋白或其生物活性片段或变体)直接引入植物中或将转录物引入植物中。这样的方法包括，例如，显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura，et al.，(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler，etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180及Hush，et al.，(1994)TheJournal of Cell Science 107：775-784，其全部以引用方式并入本文中。可选地，可以利用本领域已知的技术，将VSP多核苷酸，例如，SEQ ID NO：1的ZmLox6序列、SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737或SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码VSP多肽的其片段或变体瞬时转化入植物中。这样的技术包括病毒载体系统和多核苷酸的沉淀，方式为排除随后的DNA释放。因此，可以发生从粒子-结合的DNA的转录，但是其被释放以变得整合入基因组中的频率大大降低。这样的方法包括应用聚乙基亚胺(polyethylimine)包覆的粒子(PEI；Sigma #P3143)。

在另外的实施方式中，通过将植物与病毒或病毒核酸接触，VSP多核苷酸可以被引入植物中。通常，这样的方法涉及将核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子内。认识到感兴趣的VSP多肽可以作为病毒多聚蛋白的部分最初合成，其随后可以通过体内或体外蛋白酶解被处理而产生希望的重组蛋白。此外，认识到有用的启动子可以包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。用于将多核苷酸引入植物并表达由其编码的多肽的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)在本领域是已知的。参见，例如，美国专利Nos.5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；5,316,931和Porta，et al.，(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；以引用方式并入本文中。

用于将多核苷酸靶向插入植物基因组中的特定位置的方法在本领域中是已知的。在一个实施方式中，所述多核苷酸在希望的基因组位置的插入利用位点-特异性重组系统实现。参见，例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、和WO 99/25853，其全部以引用方式并入本文中。简短地，多核苷酸可以包含在以两个非重组发生的重组位点为侧翼的转移盒中。所述转移盒被引入植物中，所述植物具有稳定的并入其基因组中的靶位点，所述靶位点以两个相应于转移盒的位点的非重组发生的重组位点为侧翼。提供合适的重组酶并且所述转移盒在靶位点被整合。感兴趣的多核苷酸由此在植物基因组中特异性染色体位置被整合。

已经被转化的细胞可以按照常规的方式被培养入植物中。参见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可以被培养，用同样转化的株系或者与不同的株系授粉，所获得的后代具有鉴定的希望的表型特征的表达，例如，提高的氮贮藏容量、提高的氮含量、和/或提高的营养价值。两个或更多个世代可以被培养以确保希望的表型特征的表达被稳定的维持和遗传，随后收集种子以确保实现希望的表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了具有本文所述的多核苷酸的转化的种子(也称为“转基因种子”)，所述多核苷酸例如包含SEQ ID NO：1的ZmLox6序列、SEQ ID NO：1的核苷酸62-2737中或SEQID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码VSP多肽的其片段或变体的表达盒，稳定地并入它们的基因组中。

本发明的植物可以通过任何合适的方法(包括育种(breeding))产生。植物育种可以用于将希望的特征(例如，稳定地并入的转基因)引入感兴趣的特定植物系中，并且可以以多种不同的方式的任何一种进行。系统育种(Pedigree breeding)起始于两个基因型的杂交(crossing)，如感兴趣的优良系(elite line)与具有一个或多个希望的特征(即，具有稳定地并入的感兴趣的多核苷酸、具有感兴趣的多肽的调整的活性和/或水平等)的一个另外的优良自交系(elite inbred line)，其补充感兴趣的优良植物系。如果两个原始亲本(original parent)不提供所有希望的特征，那么另外的来源可以被包括在育种群体中。在系谱方法中，上升植物自交(selfed)并且在连续的子代中被选择。在连续的子代中，由于自花传粉和选择，杂合情形被同源系取代。典型地，在育种的系谱方法中，实施五个或更多个连续的系谱后代的自交和选择：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5等。在足够量的近交后，连续的子代将用于提高开发的近交体(inbred)的种子。在特定的实施方式中，近交系(inbredline)包括约95％或更多的其基因座的纯合子等位基因。

除了用于形成回交转换，回交还可以与系统育种一起使用，以改良感兴趣的优良系和利用改良的优良系制备杂种。如前所述，回交可以用于将一个或多个特别希望的性状从一个系(供体亲本)转移到称为轮回亲本(recurrent parent)的近交体，所述轮回亲本具有全部的优良农艺学特征，但缺乏希望的一个或多个性状。然而，相同的过程可以用于朝向回归亲本的基因型移动后代但是同时通过停止早期的回交和继续进行自交和选择保留非轮回亲本的许多成分。例如，形成F1，如商业杂种。这个商业杂种可以被回交到其亲本系之一以形成BC1或BC2。后代被自交和选择以便新开发的近交体具有轮回亲本的许多属性和许多非轮回亲本的希望的属性。这个方法影响了(leverages)用在新的杂交体和育种中的轮回亲本的价值和力量(strengths)。

因此，本发明的实施方式是制备感兴趣的近交系的回交转换(backcross conversion)的方法，包括下述步骤：将来自感兴趣的近交系的植物与包含提供希望的性状(如，提高的氮贮藏容量)的至少一个突变基因或转基因的供体植物杂交、选择包含提供希望的性状的突变基因或转基因的F1后代植物、以及将选择的F1后代植物回交到感兴趣的近交系的植物。这个方法可以进一步包括下述步骤：获得感兴趣的近交系的分子标记物性质及利用所述分子标记物性质选择具有希望的性状和感兴趣的近交系的分子标记物性质的后代植物。同样地，这个方法可以用于通过加入下述最后步骤产生F1杂种种子：将感兴趣的近交系的希望的性质转换与不同的植物杂交，以制备包含提供希望的性状的突变基因或转基因的F1杂种种子。

在一些实施方式中，本发明的单子叶植物-来源的VSP多核苷酸可以与感兴趣的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以形成具有希望的性状的植物。本文所用的性状指的是源自特定的序列或序列的组的表型。例如，本发明的VSP多核苷酸可以与编码具有VSP性质的多肽的任何其它多核苷酸堆叠，如碱性磷酸酶(Dewald，et al.，(1992)J.Biol.Chem.267：15958-15964)、淀粉酶(Noquet，et al.，(2001)Australian J.PlantPhysiol.28：279-287)、几丁酶(Peumans，et al.，(2002)Plant Physiol.Rockville 130：1063-1072)、凝集素(Van，et al.，(2002)Plant Physiol.Rockville 130：757-769)、另外的脂加氧酶(Tranbarger，et al.，(1991)PlantCell 3：973-988)等。产生的组合还可以包括感兴趣的多核苷酸的任何一个的多个拷贝。

本发明的多核苷酸还可以与任何其它基因或基因的组合堆叠以产生具有多个希望的性状组合的植物，包括而不限于对于动物饲料希望的性状如高油基因(high oil genes)(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利Nos.5,990,389；5,885,801；5,885,802；及5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；及WO 98/20122)和高蛋氨酸蛋白(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359；及Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；提高的可消化性(例如，改良的贮藏蛋白(美国申请系列No.10/053,410，于2001年11月7日提交)；及硫氧还蛋白(美国申请系列No.10/005,429，于2001年12月3日提交))；其披露的内容以引用方式并入本文中。

本发明的多核苷酸还可以堆叠有：疾病或除草剂抗性的希望的性质(例如，伏马菌素(fumonisin)解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase)(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂如草丁膦(phosphinothricin)或basta(例如，bar基因)；及甘草膦抗性(例如，EPSPS基因和GAT基因；参见，例如，美国公开No.20040082770和WO 03/092360))；及用于加工或处理产品的希望的性状，如高油(例如，美国专利No.6,232,529)；改良的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO94/11516))；改良的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、及淀粉脱枝酶(SDBE))；及聚合物或原生质体(例如，美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶(ketothiolase)、聚羟基丁酸合酶(polyhydroxybutyrate synthase)、及乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)，促进聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表达)；其披露的内容以引用方式并入本文。人们还可以结合本发明的多核苷酸与提供农艺学性状或转化技术性状的多核苷酸，所述农艺学性状如雄性不育(例如，参见美国专利No.5,583,210)、茎秆强度(stalk strength)、开花时间，所述转化技术性状如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619，WO 00/17364，和WO 99/25821)；，其披露的内容以引用方式并入本文中。

这些堆叠的组合可以通过任何方法形成，所述方法包括而不限于通过任何常规或TopCross方法或遗传转化杂交育种植物。如果通过遗传转化植物堆叠所述序列，感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间，以任何顺序被组合。例如，包含一个或多个希望的性状的转基因植物可以用作靶标通过随后的转化引入另外的性状。所述性状可以在利用由转化盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸的共转化方案中被同时引入。例如，如果将引入两个序列，所述两个序列可以被包含在分离的转化盒中(反式)或包含在同样的转化盒上(顺式)。所述序列的表达可以由相同的启动子或者由不同的启动子驱动。在一个实施方式中，希望引入将导致感兴趣的多核苷酸过度表达的转化盒。这可以与其它过度表达盒的任何组合结合以在植物中产生希望的性状的组合。进一步认识到利用位点特异性重组系统，多核苷酸序列可以在希望的基因组位置堆叠。参见，例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、及WO99/25853，其全部内容以引用方式并入本文中。

如本文所用的，术语“植物”包括植物细胞、植物protoseanasts、植物细胞组织培养物(植物可以从其再生)、植物愈伤组织(calli)、植物丛(clumps)、及qnd植物细胞，其在植物或植物的部分(如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶子、花、枝、果实、仁、耳穗、穗轴(cobs)、外壳、茎秆(stalks)、根、根尖、花药等)中是完整的。谷粒(grain)意图意味着由商业种植者生产的用于种植或再生物种之外的目的的成熟种子。再生的植物的Pgeny、变体、和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包括引入的多核苷酸。因此，本发明提供了由本发明的植物产生的转基因种子。

“主题(subject)植物或植物细胞”是其中遗传改变，如转化，已经由于感兴趣的VSP基因而被影响的植物或植物细胞，或者起源于这样改变的植物或细胞并且包括改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型改变的参考点。

对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即，与用于导致主题植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料相同基因型的植物或植物细胞，但是其已经用零(null)构建体(即，用对于感兴趣的性状没有已知影响的构建体，如包含标记物基因的构建体)转化；(c)作为主题植物或植物细胞的后代中的未转化的分离体(segregant)的植物或植物细胞；(d)与主题植物或植物细胞遗传相同的植物或植物细胞，但是其不暴露于将诱导感兴趣的基因的表达的条件或刺激；或(e)主题植物或植物细胞本身，在其中感兴趣的VSP基因不被表达的条件下。

本发明可以用于任何植物物种的转化，包括而不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物物种的实例包括而不限于：玉米(Zea mays)、Brassica sp.(例如，B.napus、B.rapa、B.juncea)、尤其是那些用作种子油来源的芸苔物种，苜蓿(Medicago sativa)、稻米(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbico lor、Sorghum vulgare)、黍(例如、珍珠稷(Pennisetum glaucum)、proso millet(Panicum miliaceum)、谷子(foxtail millet)(Setaria italica)、finger millet(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunusamygdalus)、糖甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、及球果植物。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如、Lactucasativa)、青豆(Phaseo lusvulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、及Cucumis属的成员，如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)、及甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、荷兰石竹(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)、及菊花。

可以用于实施本发明的球果植物包括，例如，松树如如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美车西部黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)、及辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesii)；美国西部铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；true firs如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；及雪松，如大侧柏(Thuja plicata)和阿拉斯加黄桧(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施方式中，本发明的植物为农作物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、黍、烟草等)。

在其它实施方式中，感兴趣的植物为单子叶植物，例如，玉米(Zeamays)、稻米(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare)、黍(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、prosomillet(Panicum miliaceum)、foxtail millet(Setaria italica)、finger millet(Eleusine coracana))、小麦(Triticum aestivum)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、及大麦。

感兴趣的其他植物包括提供感兴趣的种子的谷类植物(grainplants)、含油种子植物、及豆科植物。感兴趣的种子包括谷类种子，如玉米、小麦、大麦、稻米、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆(guar)、槐豆(locust bean)、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

通过示意的方式而非限制的方式提供了下面的实施例。

实验

已知植物积聚VSP，作为在它们的营养细胞中截留过量氮的机制，尤其是在再生库(reproductive sink)为限制性时(Staswick(1994)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45：303-322)。落叶树的叶子在它们在秋天脱落前再循环它们的氮。再循环的氮以VSP的形式储存在树皮中。当需要的氮超出细胞中可获得的量时，例如，在再生库发育期间或春天生长期间，VSP被再流通(Staswick(1994)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45：303-322)。

VSP，大小的范围从～15到～100kDa，已经被鉴定为碱性磷酸酶(Dewald，et al.，(1992)J.Biol.Chem.267：15958-15964)、淀粉酶(Noquet，et al.，(2001)Australian J.Plant Physiol.28：279-287)、几丁酶(Peumans，etal.，(2002)Plant Physiol.130：1063-1072)、凝集素(Van，et al.，(2002)Plant Physiol.130：757-769)，或脂加氧酶(Tranbarger，et al.，(1991)PlantCell 3：973-988)。它们的存在已经在范围广泛的一年生和多年生植物物种中报道：大豆(Staswick(1988)Plant Physiol.87：250-254；Tranbarger，et al.，(1991)Plant Cell 3：973-988)；三叶草(Trifolium)(Corre，et al.，(1996)J.Exp.Botany 47：1111-1118)；Medicago(苜蓿)(Avice，et al.，(1997)CropSci.37：1187-1193；Noquet，et al.，(2001)Australian J.Plant Physiol.28：279-287)；Arabidopsis(Utsugi，et al.，(1998)Plant Mol.Biol.38：565-576)；卡诺拉(canola)(Rossato，et al.，(2002)J.Exp.Botany53：265-275)；杨树(Lawrence，et al.，(1997)Planta Heidelberg203：237-244)；黑桑(black mulberry)(Van，et al.，(2002)Plant Physiol.130：757-769)；和桃树(Gomez & Faurobert(2002)J.Exp.Botany53：2431-2439)。然而，VSP在单子叶植物中的存在至今还没有被建立(Mackown，et al.，(1992)Plant Physiol.99：1469-1474)。

已知在一个物种中为VSP的蛋白还可以在另外的物种中(其中它们通常不被表达)以高水平表达。例如，转基因表达的大豆VSP在烟草中积聚到可溶蛋白的～5％的水平(Guenoune，et al.，(1999)Plant Science145：93-98；Guenoune，et al.，(2002)J.Exp.Botany 53：1867-1870)。不同的VSP蛋白可以采用不同的用于细胞内靶向的机制。例如，VSP-α遵循用于靶向到液泡的ER-Golgi途径，而脂加氧酶(Lox)，也称为VLX(营养脂加氧酶)，遵循不同的、未知的途径到达液泡区室(Klauer andFranceschi(1997)Protoplasma 200：174-185)。不同的VLX蛋白积聚在大豆中分离的细胞内区室中：VLX A、B、和C积聚在细胞溶胶中；VLX D被截留在维管束鞘和侧脉(paraveinal)细胞的液泡中(Fischer，et al.，(1999)Plant Journal 19：543-554)。VLX蛋白甚至在低N下积聚。然而，表明它们扮演除了只是作为VSP之外更广泛的角色(Grimes，et al.，(1993)Plant Physiol.103：457-466)。

植物明显感知应激作为用于组织和由此的氮流失的信号。为了解释这个，已知在植物暴露于水应激和茉莉酮酸甲酯(应激激素)时，VSP积聚(Mason and Mullet(1990)Plant Cell 2：569-580；Rossato，et al.，(2002)J.Exp.Botany 53：1131-1141)。其它应激，如创伤、食草动物损伤、衰老、及臭氧也已知导致它们的积聚(Utsugi，et al.，(1998)Plant Mol.Biol.38：565-576；Berger，et al.，(2002)Physiologia Plantarum 114：85-91；Mira，et al.，(2002)Planta Berlin 214：939-946)。

当前的实施例集中在表现出VSP的特征的玉蜀黍中十一个脂加氧酶基因之一。结果表明在生长培养基中供应高水平的N后，玉蜀黍脂加氧酶ZmLox6被诱导，并在叶子中最高表达，正如大豆VSP VLX D(Tranbarger，et al.，(1991)Plant Cell 3：973-988)。

实施例1：由生长培养基中的氮诱导蛋白

玉米幼苗被测试由生长培养基中硝酸盐或硝酸盐与铵的组合诱导蛋白质。在缺乏施加的氮的温室中的蛭石中生长的两周大的植物表明从叶子的泛黄判断的氮缺乏迹象。甚至在生长培养基中1mM硝酸盐时观察到叶子的一些泛黄。为了鉴定氮-可诱导的蛋白，在生长培养基中供应过量的氮以诱导与任何内源性氮贮藏机器相关的蛋白的表达。在应用100mM硝酸盐(氮的仅有来源)后，应激(叶子卷曲)症状明显。当供应50mM硝酸铵(100mM的总氮)时，植物看起来比1mM或100mM硝酸盐时更健康。硝酸铵处理被包括以确定是否相对于仅硝酸盐处理有任何不同的蛋白被诱导。

来自在不同的氮水平生长的植物的不同组织在缓冲溶液中被均匀化并在超速离心机中以100,000xg离心。对沉淀(pellet)和上清液均进行SDS-PAGE。在较高水平的氮时～100kDa的多肽带在可溶部分中被强烈的诱导(参见图4)。所述诱导在叶子组织中最强。这个多肽在根组织中是不可检测的。当硝酸铵作为营养源供应时，～60kDa的另一多肽似乎在茎组织中被诱导。

实施例2：用于蛋白质组(Proteomic)分析的蛋白加工

来自实施例1中可溶叶子蛋白部分的98kDa蛋白带(其表达水平随着渐增的硝酸盐补充而提高)从Tris-甘氨酸-SDS凝胶切离并粗糙地切碎。凝胶块(约200μL体积)在500μL的100mM碳酸氢铵中冲洗，随后逐渐在渐增的乙腈％(15％、50％、100％)中脱水。干燥的凝胶块在包含15％乙腈/100mM碳酸氢铵中约4μg胰蛋白酶的250μL胰蛋白酶(Roche 1418025)溶液中在冰上再水合1小时。吸出未被吸收的流体并在4℃保存。加入200μL缓冲剂，在37℃进行凝胶中消化16小时。在37℃在200μL的15％乙腈/100mM碳酸氢铵中冲洗凝胶块30分钟，收集流体并汇集。通过在渐增的乙腈％(15％，50％和100％)中冲洗凝胶块收集蛋白水解肽，并汇集抽吸的流体。汇集的抽吸物(aspirant)在真空下完全干燥，将残余物重新溶解在20μL包含0.1％甲酸的H₂O中。将完整样品注入1μL环中，所述肽随后在聚合捕获柱(polymeric trap column)中被捕获。利用C18硅石柱，75μmx100mm，进行反相色谱，流速为200nL/min，乙腈梯度为3-85％。在LCQ Classic四极(quadrapole)粒子捕获质谱仪上建立重复数据依赖的MS实验，以获得在运行(run)的整个持续时间的最丰富的先驱离子的一个全扫描MS，随后三个MS/MS扫描。随后利用MS/MS软件检索获得的数据以鉴定用于单独的肽片段的序列信息。

鉴定属于同样的脂加氧酶多肽(ZmLox6)的十二个不同的肽(参见图5)。所述覆盖全部是所述蛋白，强烈地表明鉴定的蛋白确实是ZmLox6。

除了ZmLox6，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶，～110kDa)、丙酮酸正磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase)(PPDK，Mr～120kDa)、乌头酸水合酶(aconitate hydratase)C(ACH，Mr～116kDa)、以及已经被实验性地注释为细胞分裂蛋白的假定蛋白(Mr～90kDa)被生长培养基中的高N诱导。显然，预定的90kDa蛋白被糖基化，因为其作为>100kDa蛋白移动。最初的三个酶，PEP羧化酶、PPDK和ACH，均为C4酶。

实施例3：ZmLox6与其它蛋白的系统发生分析

在针对公众数据库的BLAST分析后，ZmLox6蛋白表现出与稻米Lox1蛋白最高的同源性(43％同一性，57％相似性)。不限于理论，这个相当低的同源性表明ZmLox6独立地进化为可能携带一些物种-特异性的功能。在利用来自多种其它植物物种及来自玉蜀黍的Lox蛋白进行系统发生分析后，发现ZmLox6蛋白最接近大豆Lox蛋白(参见图6)。大豆Lox蛋白已经被先前展示为在围绕叶子的叶脉的叶肉细胞的液泡中积聚的营养贮藏蛋白(Tranbarger，et al.，(1991)Plant Cell3：973-988)。这些结果表明ZmLox6还可以为营养贮藏蛋白，其可以具有与大豆Lox蛋白直系同源的功能。

实施例4：氮-诱导的蛋白在充分扩展的叶子中积聚最高

来自从在0.1mM或50mM NH₄NO₃中生长的16天大的玉蜀黍植物收集的单独的叶子的蛋白遭受SDS-PAGE，以便鉴定具有在～100-110kDa的多肽带的最高表达的叶子。在～100kDa的多肽带在叶子4中最丰富，其是充分扩展的，从缺乏亮绿基础部分和缺乏任何衰老部分可以判断，如在较老叶子1、2和3中可以看到的。虽然不清楚这个带的什么比例可以通过ZmLox6解释，但是非常清楚这个带中的蛋白在较嫩的叶子7和8中没有存在到任何可感知的程度。这个变化与这个假定一致，即，细胞仅在可以获得过多的氮时将氮截留入VSP，可能在充分扩展的叶子中而不是在幼嫩的、迅速扩展的叶子中发生的情况。

实施例5：通过Lynx MPSS研究的ZmLox6的表达模式

玉蜀黍Lox基因在近交系A63的不同组织中的表达模式从MPSS数据库搜集。抽样用于每个组织的文库的数量如下：分生组织，14；根，33；茎秆，11；叶，35；耳穗，15；外壳，1；整个仁，2；胚胎，8；胚乳，19；果皮，6；须(silk)，7；雄穗(tassel)，14；花药，2；花粉，1。如表1所示，虽然在大量的组织中较低水平的表达，但是ZmLox6在叶子组织中表达最高。

         表1：玉米Lox基因的表达模式。

 

组织	Lox1	Lox2	Lox3	Lox4	Lox5	Lox6	Lox7	Lox8	Lox9	Lox10	Lox11
												分生组织	46	119	17	35	243	59	0	0	21	157	1
根	2065	848	675	303	162	114	0	0	21	423	35
												茎秆	395	1557	9	55	567	190	0	0	18	880	21
叶	195	98	42	35	166	1312	0	0	22	5851	13
												耳穗	3	311	2	68	260	0	0	0	1	50	5
外壳	193	2523	28	161	433	0	0	0	0	1480	4
												仁	146	2701	140	63	613	0	0	0	0	1215	9
胚胎	1	15	125	36	23	0	0	0	0	10	0
												胚乳	1	8	857	19	9	2	0	2	2	2	8
果皮	7	476	783	24	195	108	0	0	3	18	8
												须	0	226	42	22	800	0	0	0	0	1447	3
雄穗	32	577	17	46	800	1	0	0	0	684	18
												花药	282	0	534	38	14	83	0	0	9	110	0
花粉	0	3	0	24	0	0	0	0	0	0	0

在叶子组织中高度表达的另外的基因为ZmLox10。然而，在来自叶子组织的氮-可诱导的多肽带的蛋白质组分析期间，没有检测到由ZmLox10编码的蛋白的单独的肽(参见实施例1和2)。ZmLox6(SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列)和ZmLox10(SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列)的预测的分子质量分别为约97和102kDa，并且所述两个多肽仅分享34％的同一性(参见图7)。这两个蛋白十分地不同，如果ZmLox10在～100kDa多肽带中以可检测的水平存在，那么它可以通过蛋白质组分析被看到。这表明ZmLox10在所用的实验条件下不被诱导，留下ZmLox6为仅有的VSP样蛋白。

随后研究在V5玉米叶子和在V5发育阶段的玉米节根(nodal root)中创伤后ZmLox6基因表达的诱导。在创伤后随时间在0、3、12和24小时以ppm测量表达的诱导。结果表明ZmLox6在叶子和根组织中均由创伤诱导(参见图8和9)，一个由来自其它植物物种的VSP展现的特征(Utsugi，et al.，(1998)Plant Mol.Biol.38：565-576；Berger，et al.，(2002)Physiologia Plantarum 114：85-91；Mira，et al.，(2002)Planta Berlin214：939-946)。

Illinois高蛋白(IHP)和Illinois低蛋白(ILP)系已经通过一百个循环被选择分别用于高或低谷粒蛋白(Uribelarrea，et al.，(2004)CropScience 44：1593-1600)。虽然IHP谷粒包含>25％的蛋白，但是ILP的那些具有<5％。IHP的谷粒中对氮的高需求通过其营养组织中较大量的氮满足，因为熟知营养组织中大部分氮到成熟时重新流通到谷粒。这些系的MPSS分析表明与在IHP中相比，ZmLox6在ILP中以非常低的水平表达，暗示了这个蛋白在营养组织中的氮贮藏中的角色(图10)。

总体地，这些发现支持上述来自氮-诱导和蛋白质组研究的结果，表明ZmLox6是玉米中的VSP并在叶子组织中高度表达。

实施例6：ZmLox6在E.coli中的表达

通过PCR从表达的-序列-标记的克隆扩增全长ZmLox6，以产生ATG的上游的框架内EcoRI限制性位点，以及紧随编码序列的框架内XhoI限制性位点，以产生2,676bp的产物。扩增引物序列：上游，5′-GTTACCGAATTCGCCCTTCCCGGTACCATGATG-3′(SEQ ID NO：5)和下游，5′-CGCCTCCCTCGAGAACGGTGAGGCTGTTG-3′(SEQ ID NO：6)。PCR产物带从溴乙非啶-染色的0.5xTBE琼脂糖凝胶切离，利用Bio-Rad′s＂Freeze & Squeeze＂离心柱(spin columns)洗提，用EcoRI+XhoI过夜消化。利用QiaQuick离心柱(Qiagen)从反应混合物纯化受限制的PCR产物，并通过蒸发在真空下浓缩。表达载体pET-28a(Novagen)用EcoRI+XhoI过夜消化、凝胶-纯化、洗提、及浓缩，如上所述。利用从制造商(来自Roche的Rapid DNA Ligation Kit；来自Invitrogen的OneShot Chemically Competent TOP10 Cells)供应的标准方案进行连接(ligation)和转化。通过EcoRI-XhoI限制分析来自卡那霉素-抗性的集落的质粒DNA，以证明克隆的ZmLox6的存在。

利用供应者的标准方案将pET-28a/ZmLox6载体转化入表达宿主Rosetta(DE3)pLacI(Novagen)。通过在2-mL测试培养基中IPTG-诱导的蛋白表达筛选氯霉素-抗性的和卡那霉素-抗性的转化体。一个高表达转化体被选择用于可溶性研究。利用下面的洗涤剂裂解缓冲剂实现细胞裂解和溶解：50mM磷酸钠pH 7.7、2％(w/v)Triton X-100、+/-200μg/mL溶菌酶。发现重组ZmLox6蛋白积聚在不溶的包涵体中，借助8M尿素仅部分从这个部分(fraction)释放。

表达培养物被放大到2L(4 x 500mL)。细胞被沉淀(pelleted)并在-80℃冷冻。通过用滴管吸取(pipetting)，随后有力地涡旋(vortexing)，将融解的细胞沉淀重新悬浮在裂解缓冲剂中。裂解物被沉淀并再次重新悬浮在具有溶菌酶的裂解缓冲剂中。加入过量1:10稀释裂解缓冲剂，不溶裂解物被沉淀。不溶的裂解物被重新悬浮在如上的1:10稀释裂解缓冲剂中，通过离心收集包涵体。包涵体在1:10稀释裂解缓冲剂中被冲洗一次并重新沉淀。纯化的包涵体沉淀通过用滴管吸取直接溶解在LiDS样品缓冲剂中、加热到100℃、并在Tris-甘氨酸10％丙烯酰胺预备凝胶上运行。凝胶在纯水中大面积地冲洗并在含水Coomassie(SimplyBlueSafe Stain，Invitrogen)中非常简单地染色。重组ZmLox6蛋白作为95-98kDa之间的宽带被溶解(参见图10；SeeBlue Plus 2 MW标记物，Invitrogen)。带从24预备的凝胶切离；蛋白被电洗提(Elutrap，Schleicher& Schuell)并浓缩/脱盐(Centriprep spin columns，3,000 MWCO，Millipore)。总回收量，如从与染色的BSA标准物凝胶内比较估计的，为约2mg。

实施例7：抗-ZmLox6抗体的产生及其用于研究这个蛋白的表达和定位

电洗提的蛋白被注入兔中以通过Strategic Biosolutions(www.strategicbiosolutions.com)产生抗血清(antisera)，主要如前所述(Dhugga and Ray(1994)Eur.J.Biochem.220：943-953)。如此产生的抗体公认在抗体稀释500,000-倍时在玉米叶子提取物的蛋白印记(blots)上的～100kDa单一多肽带。

当来自B73，IHP，和ILP的叶子提取物用这个抗体探测时，观察到显著类似于在基因表达分析中发现的那样的结果，在IHP叶子中具有非常低的蛋白表达水平(图10和12A)。

为了确定ZmLox6的细胞-类型定位，用于进行上面的Western分析的来自同样的叶子的叶鞘被切开为维管束和叶肉层。利用源自这些组织的蛋白blots的抗ZmLox6抗体的蛋白质印记分析表明这个蛋白在叶肉细胞中表达并且不在维管束中表达(图12B)。

实施例8：转基因植物的转化和再生

用包含可操作地连接到玉蜀黍Rubisco小亚单位(SSU)启动子(图1A)、玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)启动子(图2A)、或玉蜀黍泛素-1(UBI1)启动子(图3A)、以及可选择的标记物基因PAT(Wohlleben，et al.，(1988)Gene 70：25-37)(其提供对于除草剂双丙氨膦的抗性)的SEQ ID NO：1的ZmLox6序列或SEQ ID NO：3的ZmLox6编码序列的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟ZmLox6胚胎。可选地，可选择的标记物基因在分离的质粒上提供。

图1A中所示的构建体提供了编码的VSP在ZmLox6叶子组织的维管束鞘细胞内的优先表达。可选地，这个构建体进一步包括可操作地连接到VSP多核苷酸(参见图1B)的玉蜀黍proaleurain液泡类别信号的编码序列，以便表达的VSP被引导到维管束鞘细胞的液泡区室。

图2A中所示的构建体提供了编码的VSP在玉蜀黍叶子组织的叶肉细胞内的优先表达。可选地，这个构建体进一步包括可操作地连接到VSP多核苷酸(参见图2B)的玉蜀黍proaleurain液泡类别信号的编码序列，以便表达的VSP被引导入叶肉细胞的液泡区室，或者可操作地连接到VSP多核苷酸的质体转运肽的编码序列，例如叶绿体转运肽，以便表达的VSP被引导入叶肉细胞的质体区室。

图3A所示的构建体提供了编码的VSP的组成性表达。可选地，这个构建体进一步包括可操作地连接到VSP多核苷酸(图3B)的玉蜀黍proaleurain液泡类别信号，以便表达的VSP被引导入其中它被组成性表达的细胞的液泡区室。

转化如下进行。介质配方遵循下文。

靶组织的制备

耳穗被脱壳并在30％ Clorox漂白剂加0.5％微洗涤剂中表面除菌20分钟，用无菌水漂洗两次。未成熟的胚胎被切离并胚轴侧向下放置(盾片侧向上)，每个板25个胚胎，在560Y培养基上4小时，随后在制备用于轰击的2.5cm靶区域内对准。

制备图1A、1B、2A、2B、3A或3B中所示的选择的质粒载体。利用如下的CaCl₂沉淀过程将这个质粒DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨球(tungsten pellet)上：100μl制备的水中钨粒、Tris EDTA缓冲剂中10μl(1μg)DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCl₂；及10μl 0.1M亚精胺。

顺序地将每个试剂加入钨粒悬浮液，同时维持在多管涡旋器(vortexer)上。最终混合物被简单地声波处理并允许在恒定的涡流中孵育10分钟。在沉淀期后，所述管被简短地离心、液体去除、用500μl 100％乙醇冲洗、以及离心30秒。再次去除液体，将105μl 100％乙醇加到最终钨粒球。对于基因枪轰击，钨/DNA粒子被简单地声波处理并且10μl点到(spotted onto)每个微载体的中心并允许在轰击前干燥约2分钟。

在基因枪中水平#4轰击样品板。所有的样品接受650PSI处的单射击(shot)，从制备的粒子/DNA的每个管采集总计十个等分试样。

轰击后，将胚胎保持在560Y培养基中2天，随后转移到包含3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基中，并每2周传代培养。在选择约10周后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以开始植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，充分发育的体细胞胚被转移到用于萌发的培养基中并转移到光亮的(lighted)培养室。约7-10天后，将发育中的小植物转移到272V试管中无激素的培养基中达7-10天，直到小植物被充分确立。随后将植物转移到包含盆栽土壤(potting soil)的平面的插入物(相当于2.5＂盆(pot))并在生长室中培养1周，随后在温室中培养另外的1-2周，随后转移到经典600盆(1.6加仑)中并被培养至成熟。植物被监测并对总氮含量计分(全植物和叶子、茎、及种子)。

轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(basal salts)(SIGMAC-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D、及2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调整到pH5.8后，用D-I H₂O加到体积(brought to volume))；2.0g/l Gelrite(在用D-I H₂O加到体积后加入)；及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌后加入并冷却到室温)。选择培养基(560R)包括4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、30.0g/l蔗糖、及2.0mg/l 2，4-D(在用KOH调整到pH5.8后，用D-I H₂O加到体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-IH₂O加到体积后加入)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(bialaphos)(在将培养基灭菌后加入并冷却到室温)。

植物再生培养基(288J)包括4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素类储备溶液(0.100g烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、及0.40g/l甘氨酸，用精制的(polished)D-I H₂O加到体积)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、及1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调整到pH5.6后用精制的D-I H₂O加到体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I H₂O加到体积后加入)；及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌后加入并冷却到60℃)。无激素培养基(272V)包括4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素类储备溶液(0.100g/l烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、及0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I H₂O加到体积)、0.1g/l肌醇、及40.0g/l蔗糖(在调整到pH5.6后用精制的D-I H₂O加到体积)；及6g/l细菌琼脂(在用精制的D-I H₂O加到体积后加入)，灭菌并冷却到60℃。

实施例9：土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转化

对于借助包含SEQ ID NO：1中陈列的ZmLox6序列、SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码SEQ ID NO：2中陈列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列的玉蜀黍的土壤杆菌-介导的转化，采用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840，以及PCT专利申请WO98/32326；其内容以引用方式并入本文中)。简单地，未成熟胚胎从玉蜀黍分离并且胚胎与土壤杆菌的悬浮液接触，其中细菌能够将包含SEQ ID NO：1中陈列的序列、SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码SEQID NO：2中陈列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列转化到未成熟胚胎的至少一个的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，将未成熟的胚胎浸入土壤杆菌悬浮液中用于接种的起始。将胚胎与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。感染步骤后在固体培养基上培养未成熟胚胎。在这个共培养期后，最佳“静止(resting)”步骤被预期。在这个静止步骤中，胚胎在至少一个已知抑制土壤杆菌的生长的抗生素的存在下被孵育而不添加用于植物转化体的选择剂(步骤3：静止步骤)。未成熟的胚胎在具有抗生素而没有选择剂的固体培养基上培养，用于消除土壤杆菌，并用于静止期用于感染的细胞。其次，将接种的胚胎在包含选择剂的培养基上培养并且回收生长的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在具有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚胎，导致转化的细胞的选择性生长。随后愈伤组织被再生入植物中(步骤5：再生步骤)，在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上培养以再生植物。

实施例10：大豆胚胎转化

培养条件

将大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)维持在旋转振荡器上35ml液体培养基SB196中(参见下面的配方)、150rpm，26℃，伴随冷白色荧光，16：8小时白天/夜晚光周期，光强度为60-85μE/m2/s。通过将约35mg的组织接种入35ml新鲜液体SB196中，每7天到2周传代培养培养物(优选的传代培养间隔为每7天)。

通过基因枪轰击的方法(Klein，et al.，(1987)Nature，327：70)用下面的实施例描述的质粒和DNA片段转化大豆胚发生悬浮培养物。

大豆胚发生悬浮培养起始

大豆培养物每个月被起始(initiated)两次，在每个起始之间5-7天。

摘取来自种植后45-55天的可获得的大豆植物的具有未成熟种子的豆荚、去除它们的壳、并置入无菌品红盒中(sterilized magenta box)。大豆种子通过在具有1滴象牙皂(95ml的热压处理的蒸馏水加5ml次氯酸钠和1滴的皂)的5％次氯酸钠溶液中摇动它们达15分钟以无菌化。充分混合。利用21-升瓶的无菌蒸馏水漂洗种子，那些小于4mm的种子被置于单独的显微镜载物片上。切除种子的小端。子叶被压出种皮。子叶被转移到包含SB1培养基的板(每个板25-30个子叶)。用纤维带(tape)包裹板，并储存8周。这个时间后，第二胚胎被切除并置入SB196液体介质中7天。

用于轰击的DNA的制备

将包含可操作地连接到感兴趣的启动子和可选择的标记物基因的SEQ ID NO：1中陈列的ZmLox6序列、SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或者编码SEQ ID NO：2中陈列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的完整质粒或DNA质粒片段用于轰击。利用Promega^TM Protocols andApplications Guide，Second Edition(106页)中描述的方法常规制备用于轰击的质粒DNA并纯化。通过双消化的质粒的凝胶分离获得携带连接到感兴趣的启动子和可选择的标记物基因的SEQ ID NO：1中陈列的ZmLox6序列、SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码SEQ IDNO：2中陈列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的质粒的片段。在每个情况中，100μg的质粒DNA在适于感兴趣的质粒的0.5ml的特异性酶混合物中消化。通过在1％ SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhitaker MolecularApplications)上凝胶电泳分离所获得的DNA片段，从琼脂糖凝胶切下包含可操作地连接到感兴趣的启动子和可选择的标记物基因的SEQ IDNO：1中陈列的ZmLox6序列、SEQ ID NO：3中陈列的ZmLox6编码序列、或编码SEQ ID NO：2中陈列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的DNA片段。利用GELase消化酶，遵循制造商的方案，从琼脂糖纯化DNA。

将包含3mg的金粒的50μl等分试样的无菌蒸馏水加入到5μl的1μg/μl DNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5MCaCl₂和20μl的0.1M亚精胺。混合物在涡旋振荡器的水平3上摇动3分钟，在台式微量离心机(bench microfuge)中离心(spun)10秒。在用400μl 100％乙醇冲洗后，沉淀物通过声波处理被悬浮在40μl的100％乙醇中。5μl DNA悬浮液被分配到Biolistic PDS1000/HE仪器盘的每个飞盘(flying disk)。每次轰击(即，每个盘)每个5μl等分试样包含约0.375mg金。

组织制备和用DNA的轰击

将约150-200mg的7天大的胚胎悬浮培养物置于空的、无菌60 x 15mm培养皿中，所述皿覆盖有塑料筛孔(plastic mesh)。每个板组织被轰击1或2枪(shot)，膜破裂压设置在1100PSI，所述室被抽吸为水银的27-28寸的真空。组织从保留/停止筛被放置约3.5寸。

转化的胚胎的选择

利用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶，HPT，基因用作可选择的标记物时)或氯磺隆(chlorsulfuron)(当乙酰乳酸合酶，ALS，基因被用作可选择的标记物时)选择转化的胚胎。

潮霉素(HPT)选择

轰击后，组织被放置入新鲜SB196介质并如上所述培养。轰击后6天，SB196与包含30mg/L潮霉素的选择剂的新鲜SB196交换。选择介质每周更换。选择后4到6周，可以观察到绿色、转化的组织从未转化的、坏死胚胎发生集簇生长。分离的、绿色组织被去除并接种到多孔板中，以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚胎发生悬浮培养物。

氯磺隆(ALS)选择

在轰击后，组织被分在2个具有新鲜SB196介质的烧瓶中，并如上所述培养。轰击后6到7天，用包含100ng/ml的氯磺隆的选择剂的新鲜SB196交换SB196。选择培养基每周更新。选择后4到6周，可以观察到绿色、转化的组织从未转化的、坏死胚胎发生集簇生长。去除分离的、绿色组织并接种到包含SB196的多孔板中，以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚胎发生悬浮培养物。

大豆体细胞胚再生入植物中

为了从胚发生悬浮培养物获得全植物，组织必须被再生。

胚胎成熟

在冷白色荧光(Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)灯泡(40瓦)下在SB196中在26℃培养胚胎4-6周，16:8小时光周期，光强度90-120μE/m²s。这个时间后，将胚胎簇去除到固体琼脂培养基SB166，达1-2周。随后集簇被传代培养到培养基SB103达3周。在此期间，从集簇去除单独的胚胎并筛选与野生型或对照相比提高的氮含量。应当注意任何可检测的表型，从感兴趣的基因的表达产生，可以在这个阶段被筛选。

胚胎干燥和萌发

成熟的个体胚胎通过将它们置入空的、小培养皿(35 x 10mm)中约4-7天而被干燥(desiccated)。用纤维带密封板(形成小的潮湿室)。将干燥的胚胎植入SB71-4培养基，其中它们被放置以在上述相同的培养条件下萌发。从萌发培养基去除萌发的小植物并用水彻底漂洗，随后植入24-细胞pack tray中的Redi-Earth中，用透明的塑料圆顶覆盖。2周后，去除圆顶，将植物露天培养(hardened off)另外的一周。如果小植物看起来强壮，它们被移植入10”盆的Redi-Earth，每个盆最多3个小植物。10到16周后，收获成熟的种子，切片并分析蛋白。

介质配方

SB 196-FN低盐液体繁殖培养基(每升)-

MS FeEDTA-100x储备液(stock)1               10ml

MS 硫酸盐-100x储备液2                      10ml

FN 低盐卤化物-100x储备液3                  10ml

FN 低盐P、B、Mo-100x储备液4                10ml

B5 维生素(1ml/L)                           1.0ml

2，4-D(10mg/L终浓度)                       1.0ml

KNO₃                                       2.83gm

(NH4)₂SO₄                                  0.463gm

天冬酰胺                                   1.0gm

蔗糖(1％)                                  10gm

pH 5.8

FN 低盐储备溶液

储备#                           1000ml        500ml

1        MS Fe EDTA 100x储备液

         Na₂ EDTA^*              3.724g       1.862g

         FeSO₄-7H₂O             2.784g       1.392g

            ^*首先加入，溶解在黑瓶中同时搅拌

2           MS硫酸盐100x储备液

            MgSO₄ -7H₂O       37.0g       18.5g

            MnSO₄ -H₂O        1.69g       0.845g

            ZnSO₄ -7H₂O       0.86g       0.43g

            CuSO₄ -5H₂O       0.0025g     0.00125g

3           FN低盐卤化物100x储备液

            CaCl₂-2H₂O        30.0g       15.0g

            KI               0.083g      0.0715g

            CoCl₂-6H₂O        0.0025g     0.00125g

4           FN低盐P、B、Mo 100x储备液

            KH₂PO₄           18.5g       9.25g

            H₃BO₃            0.62g       0.31g

            Na₂MoO₄-2H₂O      0.025g      0.0125g

SB1 固体培养基(每升)包括：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素类1000X储备液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7；及，8g TC琼脂。

SB166 固体培养基(每升)包括：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素类1000X储备液；60g麦芽糖；750mg MgCl₂六水合物；5g活化的木炭；pH 5.7；及，2g凝胶剂(gelrite)。

SB 103 固体培养基(每升)包括：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素类1000X储备液；60g麦芽糖；750mgMgCl₂六水合物；pH 5.7；及，2g凝胶剂。

SB 71-4 固体培养基(每升)包括：1瓶Gamborg’s B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat# 21153-036)；pH 5.7；及，5g TC琼脂。

2，4-D 储备液从Phytotech cat# D 295预先制备获得-浓度为1mg/ml。

B5 维生素储备液(每100ml)(其被储存在-20℃等分试样中)包括：10g肌醇；100mg烟酸；100mg吡哆醇HCl；及，1g硫胺素。如果所述溶液不能足够快速的溶解，经由热搅拌板施加低水平的热。

氯磺隆储备液包括0.01N氢氧化铵中1mg/ml。

实施例11：检测ZmLox6、硝酸还原酶、PEP-羧化酶、以及Rubisco最 优化的高通量ZmLOX蛋白提取技术的分析方法的发展(来自植物叶子 组织)

1.将六片叶子punches收集在大滴定(megatiter)管中，在液氮中冷冻，放置在大滴定架(mega titer rack)中。

2.每管加入1颗不锈钢珠并随后加入400ul蛋白提取缓冲液。

3.在Genogrinder仪器中(来自BT&C/OPS Diagnostics，672 Rt.，202-206 North Bridgewater，NJ，USA的Geno/Grinder 2000)，在1x700设置研磨样品30秒，两次。如果所述样品没有被完全研磨，研磨另外的30秒。

4.在4℃，以4000rpm将megatiter rack离心15分钟。

5.将澄清的上清液仔细地去除入96孔格式架(format rack)中并在液氮中冷冻。

6.为确定蛋白浓度，稀释10倍并利用来自Pierce(Pierce ChemicalCompany，P.O.Box 117，Rockford，IL，USA)的BCA^TM蛋白分析试剂盒。

提取缓冲剂

试剂                   终浓度             amt.per L

Hepes，pH 7.5 w/KOH    50mM               11.9g

甘油                   20％(v/v)          200ml

EDTA                   1mM                0.292g

EGTA                   1mM                0.38g

Triton X-100           0.1％(v/v)         10ml(10％储备液)

苄脒                   1mM                0.12g

6-氨基己酸             1mM                0.13g

加入800ml RO/di水(到900mL)

用～5.9ml4M KOH溶液调节pH到7.5。

用RO/di水使体积到1L。

在4℃储存制备的缓冲剂。

试剂        终浓度         储备溶液               储存位置

PMSF        1mM    250ul中0.0435g(＝1M)RT         干燥器

Leupeptin   10uM   250ul中0.00115g(＝1M)10-20℃   干燥器

DTT         1mM            0.154g

制备小等分试样(～10ul)并在-20℃储存

^*在提取前立即将蛋白酶抑制剂冷冻储备液加入样品等分试样；参见注释

用于检测ZmLox6、硝酸还原酶、PEP-羧化酶、及Rubisco的ELISA方 法

1.来自提取步骤的稀释蛋白是在25mM Tris-Cl、pH 9.0、缓冲剂中。

2.将上述溶液的等分试样50ul加入96-孔微滴定板的孔中。

3.在37℃孵育所述板2小时或者在室温下过夜。没有抗原加入对照孔中。

4.用分散的去离子或蒸馏水漂洗包覆的板。轻轻拂去粘在板上的水并用水漂洗两个更多次，在每次漂洗后从板上轻轻拂去水。

5.用阻断缓冲剂(参见下文)填充每个孔并在室温下孵育30分钟。

6.重复步骤4.

7.将在阻断缓冲剂中稀释的50ul初级抗体溶液加入到每个包覆的孔中，在塑料包裹中包覆板，并在室温下孵育2小时(Lox6的1:15,000稀释)。没有初级抗体加入到对照孔中。

8.如步骤4在水中将板漂洗三次。

9.用阻断缓冲剂填充每个孔，并孵育30分钟。

10.如步骤4用水将板漂洗三次。

11.将阻断缓冲剂中的50ul二级抗体溶液(碱性磷酸酶结合抗体的山羊抗-兔IgG的1:25,000稀释；Sigma A3687)加入到每个包覆的孔，在塑料包裹中包覆板，并在室温下孵育2小时。

12.如步骤4用水将板漂洗三次。

13.用阻断缓冲剂填充每个孔，并孵育10分钟。

14.如步骤4用水将板漂洗三次。

15.将75ul底物溶液加到每个孔并在室温下黑暗中孵育1小时。

16.将25ul的0.5M NaOH溶液加到每个孔以终止反应。混合并在405nm测量吸光度。

10X TBS

0.5M Tris-Cl，pH 8.0

1.5M NaCl

用于一升溶液的阻断缓冲剂

100ml 10X TBS

30ml 0.3％ Triton X100(10％V/W)

2.5g BSA

870ml蒸馏H₂O

底物

磷酸酶底物5mg片(Sigma S0942)：1片用于5ml缓冲剂。

底物缓冲剂

二乙醇胺 100g/L

4.9M溶液的氯化镁102ul

Thimerosal(sigma T5125)100mg

将所有的成分加入900ml去离子水中。用HCl将pH调节到9.8并使体积成为一升。转移到无菌1L瓶并用铝箔覆盖并储存在4℃。

分析的最优化：用于包覆孔的最优的蛋白量和最佳pH：50ul的10ug/ml蛋白，pH 9.0。抗体稀释的滴定的实例被给出用于Lox6蛋白，其中在图13中吸光度为从1:15,000到1:40,000线性稀释。

实施例12：在不同启动子的控制下ZmLox6在玉蜀黍细胞中的过度表 达

用六个不同的构建体获得玉蜀黍的稳定的转基因事件并在温室中培养。如先前的实施例中所述在开花时开始和随后10天或一周的间隔收集叶子盘(discs)。利用抗-ZmLox6抗体获得的ELISA结果如图14中所示。可以从这些结果中获得两个主要结论：首先，在启动子和Lox ORF之间加入液泡靶向信号对于其蛋白的表达是有害的，其次，用PEPC启动子获得最大的表达，其特异性地在叶肉细胞中表达。Ubi-Intron启动子给出下一最高的表达，Rubisco小亚单位给出三个启动子中最低水平的表达。平均来说，利用PEPC启动子获得野生型的Lox6蛋白的5-8倍的更高表达。

实施例13：开花后积聚的Lox6蛋白的重新流通

在开花时约80％的总植物N积聚，在成熟时65％的总N积聚在谷粒中。换句话说，在营养细胞中积聚的大部分N被重新流通到发育中的谷粒。从开花向前(flowering onwards)收集的叶子组织的ELISA结果清楚地表明Lox6蛋白从To转基因植物的叶子重新流通，正如已知被流通的其它蛋白，即，PEP-羧化酶和Rubisco(图15)。

实施例14：ZmLox6蛋白在来自T1世代的田地(field)-培养的植物中 的积聚和重新流通

来自利用PEPC启动子与对照近交系获得的、通过定量基因组PCR鉴定的八个单独的拷贝基因插入事件的种子在2006年的夏天在双行区(plots)的田地中培养。在开花前对从每行对八种植物进行标记，每个事件或对照16个植物。从开花前的两周开始以每周间隔收集叶子punches并在开花后两周结束。当与对照植物相比时，Lox6蛋白的积聚水平是对照事件的5倍(图16)。其它蛋白(PEPC、Rubisco、NR)的积聚没有被影响到任何可感知的程度。第二个主要结论是来自转基因的积聚的蛋白如其它已知的蛋白(如，PEPC和Rubisco)那样有效地重新流通(图16)。这些结果表明Lox6蛋白如其它营养蛋白那样作为营养贮藏蛋白被重新流通到发育中的谷粒。

实施例15.LOX序列的变体

A.不改变编码的氨基酸序列的LOX序列的变体核苷酸序列

SEQ ID NO：1或3中陈列的LOX核苷酸序列用于产生变体核苷酸序列，其具有在与合适的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比时约70％、76％、81％、86％、92％和97％的核苷酸序列同一性的开放阅读框的核苷酸序列。利用标准密码子表产生这些功能性变体。虽然所述变体的核苷酸序列被改变，但是由所述开放阅读框编码的氨基酸序列不变。

B.LOX6序列的变体氨基酸序列

产生LOX6序列的变体氨基酸序列。在这个实施例中，一个氨基酸被改变。具体地，检查SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：1(62-2737)中陈列的开放阅读框以确定合适的氨基酸改变。通过参考蛋白对准(与来自多种物种的其它直系同源体和其它基因家族成员)进行要改变的氨基酸的选择。参见图7和表2。选择的氨基酸被认为不在高选择压力下(不是高度保守的)并且被具有类似的化学性质(即，类似的功能侧链)的氨基酸相当容易地替换。利用图7和表2中陈列的蛋白对准，合适的氨基酸可以被改变。一旦鉴定了靶向的氨基酸，接着进行实施例6A中列出的方法。利用这个方法产生具有与SEQ ID NO：1或3约70％、75％、81％、86％、92％和97％的核酸序列同一性的变体。

C.LOX6序列的另外的变体氨基酸序列

在这个实施例中，形成相对于参考蛋白序列具有82％、87％、92％和97％的同一性的人工蛋白序列。这个后面的努力需要从图7中陈列的对准鉴定保守和可变区并随后明智的应用氨基酸替换表。这些部分将在下面更详细地讨论。

主要地，基于LOX6蛋白中或其它LOX蛋白中的保守区进行那些氨基酸序列被改变的确定。参见图7。基于序列对准，可以可能地被改变的LOX序列的变化区以小写字体示出，而保守区以大写字母示出。认识到可以在下面保守区进行保守的替换而不改变功能。此外，本领域的技术人员将理解本发明的LOX序列的功能性变体可以在保守的结构域中具有较小的非保守的氨基酸改变。

随后可以形成人工蛋白序列，其不同于原始序列，间隔为80-85％、85-90％、90-95％和95-100％的同一性。这些间隔的中点被靶向，例如，具有加或减1％的自由活动范围。氨基酸替换将被custom Perl script影响。替换表在下面的表2中提供。

            表2.替换表

 

氨基酸	强烈的类似和最佳替换	改变的顺序等级	注释
				I	L，V	1	50：50替换
L	I，V	2	50：50替换
				V	I，L	3	50：50替换
A	G	4
				G	A	5
D	E	6
				E	D	7
W	Y	8
				Y	W	9
S	T	10
				T	S	11
K	R	12
				R	K	13
N	Q	14
				Q	N	15
F	Y	16
				M	L	17	第一个蛋氨酸不能改变
H		Na	没有好的替换
				C		Na	没有好的替换
P		Na	没有好的替换

首先，蛋白中不应该被改变的任何保守的氨基酸被鉴定并“区分”用于与替换隔离。起始蛋氨酸将当然被自动地加到这个列表中。其次，进行改变。

在任何情况下H、C、和P不应该被改变。改变将首先用异亮氨酸发生，从N-末端扫到C-末端。随后亮氨酸，等等沿列表向下直到它达到希望的靶标。可以进行临时数量的替换以便不造成改变的反转。所述列表被排序1-17，因此在亮氨酸前以如所需的一样多的异亮氨酸改变开始，等等向下到蛋氨酸。清楚地，以这种方式，许多氨基酸将不需要被改变。L、I和V将涉及两个可选的最佳替换的50：50替换。

变体氨基酸序列将作为输出写出。Perl script用于计算百分比同一性。利用这个过程，LOX序列的变体产生具有与相应的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列约82％、87％、92％和97％的氨基酸同一性。

冠词“a”和“an”用在本文中指的是冠词的语法目标的一个或超过一个(即，至少一个)。例如，“an element”意味着一个或多个元件。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表明这个发明所属的领域中的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请以引用方式并入本文中到同样的程度，好像每个单独的出版物或专利申请被具体和逐一地表明以引用方式并入。

虽然为了理解清楚的目的，通过阐述和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但是在所附权利要求的范围内可以实施一些变化和变更。

序列表

Claims (89)

1.一种用于提高植物的氮贮藏容量的方法，所述方法包括将至少一个核苷酸构建体引入所述植物中，所述核苷酸构建体包括可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自由下列组成的组:

(a)包含SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2中陈列的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；

(d)在严格的条件下杂交到(a)或(b)的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列，其中所述严格的条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在0.1X SSC中在60℃-65℃冲洗，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；以及

(e)编码与SEQ ID NO:2中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物为C4植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述启动子为叶肉细胞-优选的启动子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的质体转运肽的编码序列。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述启动子为维管束鞘细胞-优选的启动子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

10.根据权利要求4到9中任何一项所述的方法，其中所述C4植物为玉蜀黍、高粱、或甘蔗。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤可诱导的启动子。

14.根据权利要求1到3和11到13中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

22.根据权利要求16到21中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

24.一种用于提高草料或青贮饲料的营养价值的方法，所述方法包括将至少一个包含可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的核苷酸序列的核苷酸构建体引入用于草料或青贮饲料的植物中，其中所述核苷酸序列选自由下列组成的组:

(a)包含SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2中陈列的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；

(d)在严格的条件下杂交到(a)或(b)的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列，其中所述严格的条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在0.1X SSC中在60℃-65℃冲洗，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；以及

(e)编码与SEQ ID NO:2中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述(e)的核苷酸序列编码富含必需氨基酸的营养贮藏蛋白。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述必需氨基酸包括选自由赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、及异亮氨酸组成的组的一个或多个氨基酸。

27.根据权利要求24到26中任何一项所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物为C4植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述启动子为叶肉细胞-优选的启动子。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的质体转运肽的编码序列。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述启动子为维管束鞘细胞-优选的启动子。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

35.根据权利要求29到34中任何一项所述的方法，其中所述C4植物为玉蜀黍、高粱、或甘蔗。

36.根据权利要求24到26中任何一项所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

37.根据权利要求24到26中任何一项所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

39.根据权利要求24到28和36到38中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

41.根据权利要求24到26中任何一项所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

47.根据权利要求41到46中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

49.一种用于提高植物或其植物部分的氮含量的方法，所述方法包括将至少一个包括可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的核苷酸序列的核苷酸构建体引入所述植物中，其中所述核苷酸序列选自由下列组成的组:

(a)包含SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2中陈列的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；

(d)在严格的条件下杂交到(a)或(b)的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列，其中所述严格的条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在0.1X SSC中在60℃-65℃冲洗，其中所述核苷酸序列编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽；以及

(e)编码与SEQ ID NO:2中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述(e)的核苷酸序列编码富含必需氨基酸的营养贮藏蛋白。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述必需氨基酸包括选自由赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、及异亮氨酸组成的组的一个或多个氨基酸。

52.根据权利要求49到51中任何一项所述的方法，其中所述植物或植物部分用于草料或青贮饲料。

53.根据权利要求52所述的方法，其中用于草料或青贮饲料的所述植物部分选自由叶子、茎、种子、及其任何组合组成的组。

54.根据权利要求49到53中任何一项所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述植物为C4植物。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述启动子为叶肉细胞-优选的启动子。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的质体转运肽的编码序列。

60.根据权利要求56所述的方法，其中所述启动子为维管束鞘细胞-优选的启动子。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

62.根据权利要求56到61中任何一项所述的方法，其中所述C4植物为玉蜀黍、高粱、或甘蔗。

63.根据权利要求49到53中任何一项所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

64.根据权利要求49到53中任何一项所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

66.根据权利要求49到55和63到65中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

68.根据权利要求49到53中任何一项所述的方法，其中所述核苷酸构建体包括可操作地连接到所述核苷酸序列的液泡类别信号的编码序列。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

71.根据权利要求68所述的方法，其中所述启动子为组成性启动子。

72.根据权利要求68所述的方法，其中所述启动子为可诱导的启动子。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

74.根据权利要求68到73中任何一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述单子叶植物选自由玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦组成的组。

76.一种核苷酸构建体，包括液泡类别信号的编码序列和编码具有营养贮藏蛋白性质的多肽的核苷酸序列，其中所述编码序列和所述核苷酸序列可操作地连接到驱动在植物细胞中表达的启动子，并且其中所述核苷酸序列选自由下列组成的组:

(a)包含SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2中陈列的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO:1中陈列的序列、SEQ ID NO:1的核苷酸62-2737中陈列的序列、或者SEQ ID NO:3中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；

(d)在严格的条件下杂交到(a)或(b)的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列，其中所述严格的条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在0.1X SSC中在60℃-65℃冲洗；以及

(e)编码与SEQ ID NO:2中陈列的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。

77.根据权利要求76所述的核苷酸构建体，其中所述(e)的核苷酸序列编码富含必需氨基酸的营养贮藏蛋白。

78.根据权利要求77所述的核苷酸构建体，其中所述必需氨基酸包括选自由赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、及异亮氨酸组成的组的一个或多个氨基酸。

79.根据权利要求76到78中任何一项所述的核苷酸构建体，其中所述启动子为组织-优选的启动子。

80.根据权利要求79所述的核苷酸构建体，其中所述组织-优选的启动子为叶子-优选的启动子。

81.根据权利要求76到78中任何一项所述的核苷酸构建体，其中所述启动子为组成性启动子。

82.根据权利要求76到78中任何一项所述的核苷酸构建体，其中所述启动子为可诱导的启动子。

83.根据权利要求82所述的核苷酸构建体，其中所述可诱导的启动子为创伤-可诱导的启动子。

84.一种植物，包括权利要求76到83中任何一项所述的核苷酸构建体。

85.根据权利要求84所述的植物，其中所述植物为单子叶植物。

86.根据权利要求85所述的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱、或黑麦。

87.根据权利要求84到86中任何一项所述的植物，其中所述核苷酸构建体被稳定的并入所述植物的基因组中。

88.权利要求84到87中任何一项所述的植物的转基因种子。

89.一种确定植物组织中ZmLox表达的方法，包括:

a.从所选植物收获植物组织；

b.利用最优化的高通量ZmLox蛋白提取技术提取植物蛋白；以及

c.通过ELISA分析所述提取的蛋白以确定ZmLox表达的水平。

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