CN101374861A - 糖基聚乙二醇化的因子ⅶ和因子ⅶa - Google Patents

Abstract

本发明提供因子VII或因子VIIa肽与PEG部分之间的缀合物。该缀合物通过插入肽与修饰基团之间而且与两者共价结合的完整的糖基连接基团连接。缀合物由糖基化的和未糖基化的肽通过糖基转移酶的作用形成。糖基转移酶将修饰的糖部分结合至肽的氨基酸或糖基残基上。另外提供包含该缀合物的药物制剂。制备缀合物的方法也在本发明范围内。

Description

糖基聚乙二醇化的因子Ⅶ和因子ⅦA

与其他申请的交叉引用

[0001]本申请涉及2006年5月9日提交的美国临时专利申请60/746,868；2006年1月5日提交的60/756,443；2005年11月4日提交的60/733,649；2005年10月26日提交的60/730,607；2005年10月11日提交的60/725,894；2005年8月19日提交的60/709,983，其通过引用完全并入用于所有目的。

发明概述

[0002]现已发现用一个或多个聚(乙二醇)部分受控修饰因子VII或因子VIIa提供新的因子VII或因子VIIa肽缀合物，其药物动力学性质相对于相应的天然(未聚乙二醇化的)因子VII或因子VIIa得到改进。此外，已经发现并发展出用于可靠和可再现地制备本发明的因子VII或因子VIIa肽缀合物的成本有效的方法。

[0003]在一种示例性的实施方案中，通过在糖基化的或未糖基化的因子VII或因子VIIa肽与在其结构中包括修饰基团例如聚合物修饰基团如聚乙二醇的可酶促转移的糖基部分之间酶介导形成缀合物，制成本发明的“糖基聚乙二醇化的”因子VII或因子VIIa分子。该PEG部分直接(即，通过两个反应性基团的反应所形成的单一基团)连接到糖基部分上或者通过接头部分例如取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基等连接到该糖基部分上。

[0004]因而，一方面，本发明提供PEG部分例如PEG与肽之间的缀合物，其具有与本领域公认的因子VII或因子VIIa相似的体内活性或在其它方面相似。在本发明的缀合物中，PEG部分通过完整的糖基连接基团共价连接到肽上。示例性的完整的糖基连接基团包括用PEG衍生化的唾液酸部分。

[0005]所述聚合物修饰基团可以连接在因子VII或因子VIIa的糖基部分的任意位置上。此外，该聚合物修饰基团可以与野生型或突变的因子VII或因子VIIa肽的氨基酸序列中任意位置上的糖基残基结合。

[0006]在一种示例性的实施方案中，本发明提供通过糖基连接基团与聚合物修饰基团缀合的因子VII或因子VIIa肽。示例性的因子VII或因子VIIa肽缀合物包括具有选自以下的式的糖基连接基团：

和

[0007]在式I和II中，R²是H、CH₂OR⁷、COOR⁷、COO^-或OR⁷，其中R⁷表示H、取代的或未取代的烃基或者取代的或未取代的杂烃基。符号R³、R⁴、R⁵、R⁶和R^6’独立地表示H、取代的或未取代的烃基、OR⁸、NHC(O)R⁹。下标d是0或1。R⁸和R⁹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基或唾液酸。R³、R⁴、R⁵、R⁶或R^6’中的至少一个包括聚合物修饰基团例如PEG。在一种示例性的实施方案中，R⁶和R^6’连同它们所连接的碳一起作为唾液酰部分的侧链的组分。在另一示例性的实施方案中，该侧链以聚合物修饰基团官能化。

[0008]在一种示例性的实施方案中，所述聚合物修饰基团通常如下所示通过接头L经由糖基核心上的杂原子(例如N、O)与糖基连接基团结合：

R¹是聚合物修饰基团而L选自键和连接基团。下标w表示选自1-6、优选1-3以及更优选1-2的整数。示例性的连接基团包括取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基部分和唾液酸。示例性的接头组分是酰基部分。另一示例性的连接基团是氨基酸残基(例如半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、和短链寡肽例如Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Cys-Lys、Ser-Lys等)。

[0009]当L为键时，它通过R¹的前体上的反应性官能团与糖基连接基团的前体上的具有互补反应性的反应性官能团的反应形成。当L是非零级连接基团时，在与R¹前体反应之前L可以处于糖基部分的适当位置上。作为选择，可以使R¹和L的前体结合入预先形成的盒中，其随后连接到糖基部分上。如本文所述，具有合适反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围内。此外，前体的偶合通过本领域熟知的化学方式进行。

[0010]在一种示例性的实施方案中，L是由提供其中聚合物修饰部分通过取代的烃基接头连接的修饰糖的氨基酸或小肽(例如1-4个氨基酸残基)所形成的连接基团。示例性的接头包括甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。如本文所定义的氨基酸类似物也可用作接头组分。该氨基酸可以由另外的接头组分例如烃基、杂烃基来修饰，其通过酰基键，例如经由氨基酸残基的胺部分形成的酰胺或氨基甲酸酯而共价连接。

[0011]在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团具有式I的结构而且R⁵包括聚合物修饰基团。在另一示例性的实施方案中，R⁵同时包括聚合物修饰基团和将该聚合物修饰基团连接到糖基核心上的接头L。L可以是线性或支化的结构。类似地，聚合物修饰基团可以是支化或线性的。

[0012]所述聚合物修饰基团包含两个或更多个可以是水溶性的或基本上不溶于水的重复单元。用于本发明化合物中的示例性的水溶性聚合物包括PEG例如m-PEG、PPG例如m-PPG、聚唾液酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、可生物降解的聚合物(例如聚交酯、聚甘油酯)、以及官能化的PEG例如末端官能化的PEG。

[0013]用于所述因子VII或因子VIIa肽缀合物的糖基连接基团的糖基核心选自天然的和非天然的呋喃糖和吡喃糖。非天然的糖任选地在环上包括烃基化的或酰基化的羟基和/或胺部分，例如醚、酯和酰胺取代基。其他非天然的糖包括在环的一定位置上的H、羟基、醚、酯或酰胺取代基，在该位置上天然糖中不存在上述取代基。作为选择，碳水化合物中缺少其命名由来的碳水化合物中会存在的取代基，例如脱氧糖。更进一步的示例性的非天然糖包括氧化的(例如糖酮酸或糖醛酸)和还原的(糖醇)碳水化合物。糖部分可以是单糖、寡糖或多糖。

[0014]在本发明中用作糖基连接基团组分的示例性的天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木糖(xylanose)、核糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。

[0015]在一种实施方案中，本发明提供包含以下部分的因子VII或因子VIIa肽缀合物：

其中D选自-OH和R¹-L-HN-；G选自H和R¹-L-及-C(O)(C₁-C₆)烃基；R¹是包含直链或支化的聚(乙二醇)残基的部分；以及L是接头，例如键(“零级”)、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基。在示例性的实施方案中，当D为OH时，G为R¹-L-，以及当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

[0016]在另一方面，本发明提供因子VII或VIIa肽缀合物，其包含可以是因子VII或因子VIIa的肽。该缀合物还包含糖基连接基团，其中该糖基连接基团连接到所述肽的氨基酸残基上，以及其中所述糖基连接基团包含具有选自以下的式的唾液酰连接基团：

和

其中

为修饰基团。R²选自H、CH₂OR⁷、COOR⁷、COO^-和OR⁷。R⁷选自H、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基。R³和R⁴独立地选自H、取代的或未取代的烃基、OR⁸和NHC(O)R⁹。R⁸和R⁹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基和唾液酸。L^a是选自键、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基的接头。X⁵、R¹⁶和R¹⁷独立地选自非反应性基团和聚合物臂(例如PEG)。X²和X⁴独立地选自将聚合物部分R¹⁶和R¹⁷连接到C上的键片段。下标j是选自1-15的整数。

[0017]在另一示例性的实施方案中，所述聚合物修饰基团具有下式的结构：

其中下标m和n是独立地选自0-5000的整数。A¹、A²、A³、A⁴、A⁵、A⁶、A⁷、A⁸、A⁹、A¹⁰和A¹¹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、-NA¹²A¹³、-OA¹²和-SiA¹²A¹³。A¹²和A¹³独立地选自取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。

[0018]在一种示例性的实施方案中，所述聚合物修饰基团具有下式的结构：

和

[0019]在根据上述式的另一示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0020]根据该实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括：

和

[0021]本发明提供因子VII或VIIa肽缀合物，其包含选自因子VII和因子VIIa的肽。该缀合物还包含糖基连接基团，其中该糖基连接基团连接到所述肽的氨基酸残基上，以及其中该糖基连接基团包含具有下式的唾液酰连接基团：

其中

为修饰基团。下标s为选自1-20的整数。下标f为选自1-2500的整数。Q选自H和取代的或未取代的C₁-C₆烃基。

[0022]在一种示例性的实施方案中，本发明提供具有下式的修饰的糖：

[0023]本发明提供形成因子VII肽例如因子VII和因子VIIa的缀合物的方法。该方法包括使因子VII/因子VIIa肽与带有与糖共价连接的修饰基团的修饰糖供体接触。该修饰糖部分经由酶的作用从供体转移至因子VII/因子VIIa肽的氨基酸或糖基残基上。代表性的酶包括但不限于糖基转移酶例如唾液酸转移酶。所述方法包括使因子VII/因子VIIa肽与：a)修饰糖供体接触；和b)在适合于将修饰糖部分从供体转移至肽的氨基酸或糖基残基上的条件下，能够将修饰的糖部分从该修饰的糖供体转移至肽的氨基酸或糖基残基上的酶接触，由此合成所述因子VII/因子VIIa肽缀合物。

[0024]在一种优选的实施方案中，在步骤a)之前，使所述肽与唾液酸酶接触，由此除去所述肽上的至少一部分唾液酸。

[0025]在另一优选的实施方案中，使因子VII/因子VIIa肽与唾液酸酶、糖基转移酶和修饰的糖供体接触。在该实施方案中，肽与唾液酸酶、糖基转移酶和修饰的糖供体基本上同时接触，不管各组分的添加顺序如何。在适合于唾液酸酶从肽中除去唾液酸残基以及糖基转移酶将修饰糖部分从修饰糖供体转移至肽的氨基酸或糖基残基上的条件下进行反应。

[0026]在另一优选的实施方案中，在同一容器中进行去唾液酸化和缀合，以及经过去唾液酸化的肽优选在缀合步骤之前不经纯化。在另一示例性的实施方案中，所述方法进一步包含涉及唾液酸化所述肽缀合物的‘加帽’步骤。在含有唾液酸酶、唾液酸转移酶和修饰糖供体的同一反应容器中不经在先纯化而进行该步骤。

[0027]在另一优选的实施方案中，进行因子VII/因子VIIa肽的去唾液酸化，并且纯化该去唾液酸肽。然后使纯化过的去唾液酸肽经受缀合反应条件。在另一示例性的实施方案中，所述方法进一步包含涉及唾液酸化肽缀合物的‘加帽’步骤。在含有唾液酸酶、唾液酸转移酶和修饰糖供体的同一反应容器中不经在先纯化而进行该步骤。

[0028]在另一示例性的实施方案中，在含有唾液酸酶、唾液酸转移酶和修饰糖供体的同一反应容器中不经在先纯化而进行加帽步骤，唾液酸化所述肽缀合物。

[0029]在一种示例性的实施方案中，接触时间少于20小时，优选少于16小时，更优选少于12小时，甚至更优选少于8小时，以及再更优选少于4小时。

[0030]在另一方面，本发明提供因子VII/因子VIIa肽缀合物反应混合物。该反应混合物包含：a)唾液酸酶；b)选自糖基转移酶、外切糖苷酶和内切糖苷酶的酶；c)修饰的糖；和d)因子VII/因子VIIa肽。

[0031]在另一示例性的实施方案中，唾液酸酶与因子VII/因子VIIa肽的比率选自0.1U/L:2mg/mL至10U/L:1mg/mL，优选0.5U/L:2mg/mL，更优选1.0U/L:2mg/mL，甚至更优选10U/L:2mg/mL，再更优选0.1U/L:1mg/mL，更优选0.5U/L:1mg/mL，甚至更优选1.0U/L:1mg/mL，以及再更优选10U/L:1mg/mL。

[0032]在一种示例性的实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的所述因子VII/因子VIIa肽缀合物包括至多两个PEG部分。该PEG部分可以在一锅法中加入，或者它们可以在纯化去唾液酸因子VII/因子VIIa后加入。

[0033]在另一示例性的实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的因子VII/因子VIIa肽缀合物包括至多一个PEG部分。该PEG部分可以在一锅法中加入，或者它可以在纯化去唾液酸因子VII/因子VIIa后加入。

[0034]在另一示例性的实施方案中，该方法进一步包含“加帽”，或者向肽缀合物中加入唾液酸。在另一示例性的实施方案中，加入唾液酸酶，接着滞后30分钟、1小时、1.5小时或2小时，然后加入糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶。

[0035]在另一示例性的实施方案中，加入唾液酸酶，接着滞后30分钟、1小时、1.5小时或2小时，然后加入糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶。本发明的其他目的和优点从下面的详细描述中对于本领域技术人员而言会是明显的。

[0036]在另一示例性的实施方案中，所述方法包括：(a)使包含选自以下的糖基的因子VII/因子VIIa肽：

和

与具有下式的修饰的糖：

以及将糖基连接基团转移至选自所述糖基的GalNAc、Gal和Sia的成员上的合适的转移酶，在适合于所述转移的条件下接触。示例性的修饰糖为通过接头部分用聚合物例如直链或支化的聚(乙二醇)部分修饰的CMP-唾液酸。

[0037]所述肽可以从基本上任何来源获得，然而，在一种实施方案中，在如上所述进行修饰之前，使因子VII/因子VIIa肽在合适的宿主中表达。哺乳动物(例如BHK、CHO)、细菌(例如大肠杆菌(E.coli))和昆虫细胞(例如Sf-9)为提供用于本文所述的组合物和方法中的因子VII或因子VIIa的示例性表达体系。

[0038]在示例性的实施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽缀合物以治疗组织损伤例如局部缺血、外伤、炎症或者与有毒物质接触。在另外的示例性实施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽缀合物以治疗患有A型血友病的患者、患有B型血友病的患者、患有A型血友病同时具有因子VIII抗体的患者、患有B型血友病同时具有因子IX抗体的患者、以及患有肝硬化的患者。

[0039]在另一示例性的实施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽缀合物以治疗紧急事件、选择性外科手术、心脏外科手术、脊柱外科手术、肝脏移植、部分肝切除术、骨盆-髋臼骨折重建、以及异基因干细胞移植中的出血。在另一示例性的实施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽缀合物以治疗急性脑内出血、创伤性脑损伤、静脉曲张出血和上胃肠道出血。

[0040]在另一方面中，本发明提供包含因子VII/因子VIIa肽缀合物和可药用载体的药物制剂。

[0041]在所述因子VII/因子VIIa肽缀合物中，糖基连接基团或修饰基团所结合的氨基酸残基中基本上每一个都具有相同的结构。例如，如果一种肽包含Thr连接的糖基残基的话，群体中至少约70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或者更优选99.8％的肽会具有共价结合到相同Thr残基上的相同糖基连接基团。

[0042]本发明的其他目的和优点从下面的详细描述中对于本领域技术人员而言会是明显的。

附图说明

[0043]图1说明可用于本发明实践中的示例性的修饰的唾液酸核苷酸。A.示例性的支化(例如30KDa、40KDa)CMP-唾液酸-PEG糖核苷酸的结构。B.线性因子VIIa-SA-PEG-10KDa的结构。

[0044]图2是制备示例性的用于制备本发明缀合物的PEG-糖基连接基团前体(修饰的糖)的合成方案。

[0045]图3是提供示例性的用于以修饰的唾液酸形成本发明缀合物，例如糖基聚乙二醇化肽的唾液酸转移酶的表。

[0046]包括图4A至4E的图4描述在因子VII和因子VIIa上重构聚糖结构的示例性方案。图4A是描绘因子VII和因子VIIa肽的图，其显示出与预期重构的聚糖结合的残基。图4B是描绘因子VII和因子VIIa肽A(实线)和B(虚线)的图，其显示出与预期重构的聚糖结合的残基以及聚糖的化学式。图4C至4E是基于其中表达肽的细胞种类和所需的重构聚糖结构的图4B肽的聚糖预期重构步骤的图。

[0047]包括图5A和5B的图5是因子VIIa的示例性核苷酸和相应氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：1和2)。

[0048]图6是去唾液酸-因子VIIa的等电聚焦凝胶(pH 3-7)的图象。泳道1是因子VIIa；泳道2-5是去唾液酸-因子VIIa。

[0049]图7是因子VIIa的MALDI谱图。

[0050]图8是因子VIIa-SA-PEG-1KDa的MALDI谱图。

[0051]图9是描绘因子VIIa-SA-PEG-10KDa的MALDI谱的图。

[0052]图10是PEG化的因子VIIa的SDS-PAGE凝胶的图象。泳道1是去唾液酸-因子VIIa。泳道2是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-1KDa与ST3Gal3反应48小时的产物。泳道3是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-1KDa与ST3Gal3反应48小时的产物。泳道4是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-10KDa与ST3Gal3反应96小时的产物。

[0053]图11A-B显示在较少的唾液酸酶下同时去唾液酸化和PEG化。这些图突出显示在唾液酸酶存在下加帽是有效率的。图11A显示当唾液酸酶水平为0.5U/L时的反应过程。泳道1对应于天然的因子VIIa而泳道2是去唾液酸因子VIIa。从泳道3至泳道7，随着时间前进PEG化产物的量增加。在泳道3中，主要产物是单PEG化的(见64处的点)，而在后面检测的等分试样显示出形成二PEG化(见刚好在97下方的点)、三PEG化(见刚好在97上方的点)和更高PEG化的产物及其含量的增加。泳道8和9显示出向反应中“加帽”或加入唾液酸的结果。当反应加帽时，反应程度得到终止，如同从泳道5、8和9中发现的类似PEG化产物分布中可以看出的那样。图11B显示当唾液酸酶水平为0.1U/L时的反应过程。

[0054]图12A和B。图12A显示当同时加入唾液酸酶和糖基转移酶时的情形。图12B显示当首先加入唾液酸酶、接着在30分钟延迟后加入糖基转移酶时的情形。

[0055]图13是一个或多个糖基连接基团可以结合到其上以便提供本发明肽缀合物的肽的列表。

[0056]图14A和B显示表现HPLC试验结果的色谱图。图14A显示由轻链方法分析的因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然因子VIIa对照(下)的经标记的色谱图。显示出LC(轻链)、1x10KDa-PEG-LC、2x10KDa-PEG-LC和3x10KDa-PEG-LC与其他产物的分离。图14B显示由重链方法分析的因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然因子VIIa对照(下)的经标记的色谱图。显示出HC(重链)、1x10KDa-PEG-HC、2x10KDa-PEG-HC和3x10KDa-PEG-HC与其他产物的分离。

[0057]图15A-15D显示表现HPLC试验结果的色谱图。图15A和15B分别显示由轻链方法分析的还原的天然因子VIIa对照和还原的因子VIIa-SA-PEG-40KDa的经标记的色谱图。显示出LC(轻链)、1x40KDa-PEG-LC、2x40KDa-PEG-LC和3x40KDa-PEG-LC与其他产物的分离。图15C和D分别显示由重链方法分析的还原的天然因子VIIa对照和因子VIIa-SA-PEG-40KDa的经标记的色谱图。显示出HC(重链)、1x40KDa-PEG-HC、2x40KDa-PEG-HC和3x40KDa-PEG-HC与其他产物的分离。

本发明的详述和优选实施方案

缩写

[0058]PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖氨基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖氨基；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酰基或N-乙酰神经氨酸基；Sia，唾液酰基或N-乙酰神经氨酸基；及其衍生物和类似物。

定义

[0059]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。通常，细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交方面的本文所用命名以及实验室操作是本领域熟知并通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。该技术和操作通常根据本领域常规方法和本文件中各处提供的各种一般参考文献(通常参见Sambrook等，

：A

，第2版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通过引用并入本文)来进行。分析化学和下述有机合成方面的本文所用命名以及实验室操作是本领域熟知并通常采用的那些。标准技术或其变型用于化学合成和化学分析。

[0060]本文描述的所有寡糖以非还原糖的名称或缩写(即Gal)描述，接着是糖苷键构型(α或β)、环键(1或2)、与参与键的还原糖的环位置(2、3、4、6或8)，然后是还原糖的名称或缩写(即GlcNAc)。每种糖优选吡喃糖。标准糖生物学命名法的综述参见Essentials of Glycobiology，Varki等编辑，CSHL Press(1999)。

[0061]寡糖被认为具有还原性末端和非还原性末端，无论该还原性末端上的糖是否实际为还原性糖。根据公认的命名法，寡糖在本文中以左侧为非还原性末端而右侧为还原性末端来描述。

[0062]术语“唾液酸”或“唾液酰基”是指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族最常见的成员为N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-D-甘油基-D-半乳糖nonulo吡喃糖-1-酮(onic)酸(往往缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的另一成员为N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。又一唾液酸家族成员为2-酮-3-脱氧-nonulosonic酸(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括9-取代唾液酸例如9-O-C₁-C₆酰基-Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。唾液酸家族的综述参见例如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer编辑(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化过程中唾液酸化合物的合成及使用在1992年10月1日公布的国际申请WO 92/16640中得到公开。

[0063]“肽”是指其中单体为氨基酸并通过酰胺键结合在一起的多聚体，也可称为多肽。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸也包括在内。非基因编码的氨基酸也可以用于本发明中。此外，进行修饰以含有活性基团、糖基化位点、聚合物、治疗部分、生物分子等的氨基酸也可以用于本发明中。本发明中使用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。通常优选L-异构体。另外，其他肽模拟物(peptidomimetics)也可以用于本发明中。本文使用的“肽”是指糖基化的和未糖基化的肽。还包括由表达肽的体系不完全糖基化的肽。一般的综述参见Spatola，A.F.，

，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，NewYork，第267页(1983)。一些本发明的肽的列表在图13中给出。

[0064]术语“肽缀合物”是指其中肽与本文所述的修饰的糖缀合的本发明的物种。

[0065]术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些以及随后得到修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在氨基酸类似的方式发挥作用的化合物。

[0066]本文使用的术语“修饰的糖”或“修饰的糖残基”是指在本发明的方法中酶促加成至肽的氨基酸或糖基残基上的天然或非天然存在的碳水化合物。修饰的糖选自酶底物，其包括但不限于糖核苷酸(单-、双-和三磷酸酯)、活化的糖(例如糖基卤化物、糖基甲磺酸酯)、和既未活化又非核苷酸的糖。“修饰的糖”用“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包括但不限于PEG部分、治疗部分、诊断部分、生物分子等。修饰基团优选不是天然存在或未修饰的碳水化合物。选择用修饰基团官能化的位置以使得它不会阻碍“修饰的糖”酶促加成至肽上。

[0067]术语“水溶性的”是指在水中具有一定可检测的溶解性程度的部分。检测和/或定量水溶解性的方法为本领域所熟知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合序列或由单一氨基酸组成，例如聚(赖氨酸)。示例性的多糖为聚(唾液酸)。示例性的聚醚为聚(乙二醇)。聚(乙烯亚胺)为示例性的聚胺，以及聚(丙烯)酸为代表性的聚(羧酸)。

[0068]水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，应当理解其他相关的聚合物也适合用于本发明的实践中，而且术语PEG或聚(乙二醇)的使用意图在这方面是包括性的而不是排他的。术语PEG包括以其任意形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双官能PEG、多臂PEG、叉状PEG、支化PEG、悬挂型PEG(即具有悬挂在聚合物主链上的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)、或其中具有可降解键的PEG。

[0069]聚合物主链可以是线性的或支化的。支化的聚合物主链通常是本领域已知的。通常，支化聚合物具有中枢分支核心部分和连接到该中枢分支核心上的多个线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，其可以通过向多种多元醇例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇加成环氧乙烷来制备。中枢分支部分还可以衍生自若干氨基酸，例如赖氨酸。支化聚(乙二醇)可以表示成通式R(-PEG-OH)_m，其中R代表核心部分例如甘油或季戊四醇，以及m代表臂的数目。多臂PEG分子也可以用作聚合物主链，例如美国专利No.5,932,462中所述的那些，该专利通过引用全部并入本文。

[0070]许多其他的聚合物也适合于本发明。非肽以及水溶性的在约2-约300个连接位置(loci)内的聚合物主链在本发明中尤其有用。合适聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇)例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙烯多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)(例如在美国专利No.5,629,384中所描述的，该专利通过引用全部并入本文)、以及其共聚物，三元共聚物和混合物。尽管聚合物主链每条链的分子量可以变化，但是它典型地为约100Da-约100,000Da，通常是约6,000Da-约80,000Da。

[0071]本文在向患者施用肽药物的上下文中使用的“曲线下面积”或“AUC”定义为描述作为从零到无穷大时间函数的患者体循环中药物浓度的曲线下的总面积。

[0072]本文在向患者施用肽药物的上下文中使用的术语“半衰期”或“t1/2”定义为药物在患者中的血浆浓度降低一半所需的时间。根据多重清除机制、重分布和本领域熟知的其他机制，可以存在多于一个与肽药物有关的半衰期。通常，定义α和β半衰期以使得α期与重分布有关，而β期与清除有关。然而，对于大部分被限制在血流中的蛋白质药物而言，可以存在至少两个清除半衰期。对一些糖基化的肽来说，快速β期清除可以由巨噬细胞或内皮细胞上识别末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或岩藻糖的受体介导。较慢的β期清除可以通过肾小球对有效半径<2nm(约68kD)分子的过滤和/或在组织中特异或非特异吸收和代谢而发生。糖基聚乙二醇化可以给末端糖(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)加帽并由此阻断通过识别这些糖的受体的快速α期清除。还可以给予较大的有效半径并由此减少分布容积和组织吸收，从而延长晚β期。因此，如同本领域熟知的那样，糖基聚乙二醇化对α期和β期半衰期的精确影响可以根据尺寸、糖基化状态和其他参数而变化。“半衰期”的进一步解释可见Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar编辑，Harwood Publishers，Amsterdam，第101-120页)。

[0073]本文使用的术语“糖缀合”是指修饰的糖物种与多肽，例如本发明的G-CSF肽的氨基酸或糖基残基的酶介导缀合。“糖缀合”的下位类别是“糖基聚乙二醇化”，其中修饰的糖的修饰基团为聚(乙二醇)和其烃基衍生物(例如m-PEG)或活性衍生物(例如H₂N-PEG、HOOC-PEG)。

[0074]术语“大规模的”和“工业规模的”可互换使用，而且是指在单个反应周期完成时产生至少约250mg、优选至少约500mg、以及更优选至少约1g糖缀合物的反应周期。

[0075]本文使用的术语“糖基连接基团”是指与修饰基团(例如PEG部分、治疗部分、生物分子)共价结合的糖基残基；该糖基连接基团将修饰基团连接到缀合物的其余部分上。在本发明的方法中，“糖基连接基团”共价结合在糖基化的或未糖基化的肽上，从而将试剂连接在肽上的氨基酸和/或糖基残基上。“糖基连接基团”通常经由“修饰的糖”酶促结合在肽的氨基酸和/或糖基残基上而衍生自“修饰的糖”。糖基连接基团可以是糖衍生的结构，其在修饰基团-修饰的糖盒形成过程中降解(例如氧化→Schiff碱形成→还原)，或者糖基连接基团可以是完整的。“完整的糖基连接基团”是指衍生自其中将修饰基团连接并至缀合物其余部分上的糖单体未降解，例如氧化(例如由偏高碘酸钠氧化)的糖基部分的连接基团。本发明的“完整的糖基连接基团”可以衍生自天然存在的寡糖，通过向母体(parent)糖结构加成糖基单元或从中除去一个或多个糖基单元来进行。

[0076]本文使用的术语“非糖苷修饰基团”是指不包含直接与糖基连接基团相连的天然存在的糖的修饰基团。

[0077]本文使用的术语“靶向部分”是指将选择性定位于身体特定组织或区域的物种。定位由分子决定子的特异识别、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等介导。其他将试剂靶向至特定组织或区域的机制为本领域技术人员已知。示例性的靶向部分包括抗体、抗体片段、运铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。

[0078]本文使用的“治疗部分”是指任何可用于治疗的试剂，其包括但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性试剂。“治疗部分”包括生物活性剂的前药，即其中多于一个的治疗部分结合在载体例如多价试剂上的构建体。治疗部分还包括蛋白质和包含蛋白质的构建体。示例性的蛋白质包括但不限于粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(例如干扰素-α、-β、-γ)、白介素(例如白介素II)、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)以及抗体融合蛋白质(例如肿瘤坏死因子受体((TNFR)/Fc结构域融合蛋白质))。

[0079]本文使用的“可药用载体”包括与缀合物组合时保留缀合物的活性并且与受试者免疫系统无反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载体例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液例如油/水乳液以及不同类型的湿润剂。其他载体也可以包括无菌溶液、片剂(包括包衣片剂)和胶囊。通常这些载体包含赋形剂例如淀粉、乳、糖、某些种类的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、二元醇或其他已知赋形剂。这些载体还可以包括香料和颜色添加剂或其他成分。包含这些载体的组合物由熟知的常规方法配制。

[0080]本文使用的“施用”是指口服、作为栓剂施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内或皮下施用，或向受试者植入缓释装置例如微型渗透泵。施用通过任何途径进行，包括肠胃外和透粘膜(例如口腔的、鼻的、阴道的、直肠的或经皮肤的)。肠胃外给药包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下的、腹膜内的、心室内和颅内的。此外，当注射用于治疗肿瘤例如诱导细胞调亡时，可以直接施用至肿瘤和/或肿瘤周围组织。其他模式的递送包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。

[0081]术语“改善”是指在治疗病理状况或病症(condition)中任何成功的征候，包括任何客观的或主观的参数例如症状的减轻、缓和或消除或患者身体或精神状态的改善。症状的改善可以基于客观的或主观的参数，包括身体检查和/或精神评估的结果。

[0082]术语“治疗”是指对疾病或病症的“治疗”或“处理”，其包括预防疾病或病症在倾向于患该疾病但是仍未经历或显示该疾病症状的动物上发生(预防性治疗)、抑制疾病(减缓或阻止其发展)、提供疾病症状或副作用的减轻(包括姑息疗法)和解除疾病(使疾病消退)。

[0083]术语“有效量”或“对......有效的量”或“治疗有效量”或任何语法上等价的术语是指当施用于动物以治疗疾病时足够实现对该疾病的治疗的量。

[0084]术语“分离的”是指材料实质上或基本上不含用于制备该材料的成分。对于本发明的肽缀合物，术语“分离的”是指材料实质上或基本上不含在用于制备肽缀合物的混合物中通常伴随该材料的成分。“分离的”和“纯的”可互换使用。通常，本发明的分离的肽缀合物具有的纯度水平优选以范围表达。所述肽缀合物纯度范围的下限为约60％、约70％或约80％，而纯度范围的上限为约70％、约80％、约90％或大于约90％。

[0085]当肽缀合物纯度大于约90％时，其纯度也优选以范围表示。纯度范围的下限为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。

[0086]纯度由任何本领域公认的分析方法来测定(例如银染凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳上的谱带强度、HPLC或相似方法)。

[0087]本文使用的“群体的基本上每个成员”描述本发明肽缀合物群体的特征，其中与肽加成的选定百分比的修饰的糖加成至该肽上多个同等的接纳体位点。“群体的基本上每个成员”是说与修饰的糖缀合的肽上位点的“同质性”以及是指至少约80％、优选至少约90％和更优选至少约95％同质的本发明缀合物。

[0088]“同质性”是指与修饰的糖缀合的接纳体部分群体中的结构一致性。因此，在本发明的肽缀合物中，其中每个修饰的糖部分与接纳体位点缀合，该接纳体位点与每个其他修饰的糖缀合的接纳体位点具有相同结构，该肽缀合物被称为约100％同质的。同质性通常以范围表达。所述肽缀合物同质性范围的下限为约60％、约70％或约80％，以及纯度范围上限为约70％、约80％、约90％或大于约90％。

[0089]当肽缀合物大于或等于约90％同质时，其同质性也优选以范围表达。该同质性范围的下限为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％同质性。肽缀合物的纯度通常由一种或多种本领域技术人员已知的方法来测定，例如液相色谱法-质谱法(LC-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDITOF)、毛细管电泳等。

[0090]当涉及糖肽物种时，“基本均一的糖形”或“基本均一的糖基化模式”是指由目标糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)糖基化的接纳体部分的百分比。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况下，如果在本发明的肽缀合物中基本上所有的(如下定义)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化的类似物均被岩藻糖基化，则存在基本均一的岩藻糖基化模式。在本文所述的岩藻糖基化结构中，Fuc-GlcNAc键通常是α1，6或α1，3，一般优选α1，6。本领域技术人员将会理解原料可以含有糖基化的接纳体部分(例如岩藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算出的糖基化百分比将会包括通过本发明方法糖基化的接纳体部分以及在原料中已经糖基化的那些接纳体部分。

[0091]上述“基本均一的”定义中的术语“基本上”通常是指至少约40％、至少约70％、至少约80％、或更优选至少约90％以及再更优选至少约95％的特定糖基转移酶的接纳体部分得到糖基化。

[0092]当取代基由其从左至右书写的常规化学式定义时，它们同等地包含由从右至左书写结构所得的在化学上等同的取代基，例如-CH₂O-意味着同样描述-OCH₂-。

[0093]除非另有说明，术语“烃基”自身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数(即C₁-C₁₀是指1-10个碳)的直链或支链的或环状的烃基、或它们的组合，其可以是完全饱和的、单-或多不饱和的而且可以包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烃基为具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烃基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物及异构体。除非另有说明，术语“烃基”还意味着包括下面更详细定义的那些烃基衍生物，例如“杂烃基”。限于碳氢化合物基团的烃基称为“高烃基(homoalkyl)”。

[0094]术语“亚烷基”自身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-，以及进一步包括下面描述成“杂亚烷基”的那些基团。通常，烃基(或亚烷基)会具有1-24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。“低级烃基”或“低级亚烷基”是较短链的烃基或亚烷基，其通常具有8个或更少碳原子。

[0095]术语“烃氧基”、“烃基氨基”和“烃基硫基”(或硫代烃氧基)以其常规意义使用，而且是指各自通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分结合的那些烃基。

[0096]除非另有说明，术语“杂烃基”自身或与另一术语组合是指稳定的直链或支链的或环状的烃基或其组合，它由规定数量的碳原子和选自O、N、Si和S的至少一个杂原子组成，而且其中氮和硫原子可以任选地被氧化以及氮杂原子可以任选地被季铵化。可以将杂原子O、N和S及Si置于所述杂烃基的任何内部位置上或者该烃基与分子其余部分结合的位置上。实例包括但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多可以有两个连续杂原子，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“亚杂烷基”自身或作为另一取代基的一部分是指衍生自杂烃基的二价基团，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于亚杂烷基，杂原子也可以占据链末端之一或两端(例如亚烷氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。另外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团式的书写方向并不意味着连接基团的取向。例如，式-C(O)₂R′-表示-C(O)₂R′-和-R′C(O)₂-两者。

[0097]除非另有说明，术语“环烃基”和“杂环烃基”自身或与其他术语组合分别表示“烃基”和“杂烃基”的环状形式。另外，对于杂环烃基，杂原子可以占据该杂环与分子其余部分结合的位置。环烃基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烃基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

[0098]除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”自身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烃基”意味着包括单卤代烃基和多卤代烃基。例如，术语“卤代(C₁-C₄)烃基”意味着包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

[0099]除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的、芳香族取代基，其可以是单环或者稠合在一起或共价连接的多环(优选1-3个环)。术语“杂芳基”是指包含选自N、O和S的1-4个杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子可以任选地被氧化以及氮原子可以任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子其余部分结合。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氢苯并[1，4]二噁英-6基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上述各芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述可接受的取代基。

[0100]简言之，术语“芳基”在与其他术语组合使用时(例如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳基烃基)包括如上定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳基烃基”意味着包括其中芳基与烃基结合的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亚甲基)被例如氧原子代替的那些烃基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

[0101]上述术语(例如“烃基”、“杂烃基”、“芳基”和“杂芳基”)各自意味着包括所述基团的取代的和未取代的形式两者。下面提供每种基团的优选取代基。

[0102]烃基和杂烃基(包括通常被称为亚烷基、链烯基、亚杂烷基、杂链烯基、炔基、环烃基、杂环烷烃、环烯基和杂环烯基)的取代基通称为“烃基取代基”，而且它们可以是选自但不限于以下的多种基团中的一个或多个：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R″′、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R″′、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R″′)＝NR″′、-NR-C(NR’R”)＝NR″′、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，数量从0到(2m’+1)，其中m’为所述基团中碳原子的总数。R’、R”、R″′和R″′各自优选独立地表示氢、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的芳基例如1-3个卤素取代的芳基、取代的或未取代的烃基、烃氧基或硫代烃氧基或芳基烃基。例如当本发明的化合物包含多于一个R基团时，独立地选择各个R基团，当存在多于一个R’、R”、R″′和R″″基团时，这些基团也一样选择。当R’和R”与同一个氮原子结合时，它们可以与该氮原子组合以形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意味着包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的上述论述中，本领域技术人员将会理解术语“烃基”意味着包括含有与除氢基团以外的基团例如卤代烃基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)及酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)结合的碳原子的基团。

[0103]类似于对烃基描述的取代基，将芳基和杂芳基的取代基通称为“芳基取代基”。该取代基选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R″′、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R″′、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R″′)＝NR″″、-NR-C(NR’R”)＝NR″′、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂、-R′、-N₃、-CH(Ph)₂、氟代(C₁-C₄)烃氧基和氟代(C₁-C₄)烃基，其数量从0到该芳环体系上开放价的总数；以及其中R’、R”、R″′和R″″优选独立地选自氢、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。例如当本发明的化合物包含多于一个R基团时，独立地选择各个R基团，当存在多于一个R’、R”、R″′和R″″基团时，这些基团也一样选择。在下面的方案中，符号X代表上述的“R”。

[0104]芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CRR’)_u-U-的取代基代替，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，以及u是0-3的整数。作为选择，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH₂)_r-B-的取代基代替，其中A和B独立地是-CRR’、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或单键，以及r是1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。作为选择，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR’)_z-X-(CR”R″′)_d-的取代基代替，其中z和d独立地是0-3的整数，以及X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。取代基R、R’、R”和R″′优选独立地选自氢或取代的或未取代的(C₁-C₆)烃基。

[0105]本文使用的术语“杂原子”意味着包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

[0106]本文使用的因子VII肽是指因子VII和因子VIIa肽两者。该术语通常涉及这些肽的变体和突变体，包括加成、缺失、取代和融合蛋白突变体。当使用因子VII和因子VIIa两者时，该使用意图说明类别“因子VII肽”的两种物种。

[0107]本发明意欲包括本发明化合物的盐，其根据本文所述化合物上存在的特定取代基用相对无毒的酸或碱制成。当本发明的化合物含有相对酸性的官能度时，可以通过使所述化合物的中性形式与充足量的纯净的或在合适惰性溶剂中的所需碱接触来获得碱加成盐。碱加成盐的实例包括钠、钾、锂、钙、铵、有机氨基或镁盐或者类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能度时，可以通过使所述化合物的中性形式与充足量的纯净的或在合适惰性溶剂中的所需酸接触来获得酸加成盐。酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢根、磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸或亚磷酸等的那些盐，以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲烷磺酸等的盐。另外包括氨基酸盐如精氨酸等的盐，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本发明的某些特定化合物同时含有使得该化合物转化成碱或酸加成盐的碱性和酸性官能度。

[0108]所述化合物的中性形式优选通过使该盐与碱或酸接触并且用常规方法分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度上与各种盐形式不同。

[0109]本文使用的“盐反荷离子”是指当本发明化合物的部分之一带负电荷(例如COO-)时与该化合物结合的带正电荷的离子。盐反荷离子的实例包括H⁺、H₃O⁺、铵、钾、钙、锂、镁和钠。

[0110]本文使用的术语“CMP-SA-PEG”是与含有聚乙二醇部分的唾液酸缀合的胞苷单磷酸分子。如果没有指定聚乙二醇链的长度，则任意PEG链长都是可以的(例如1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、20KDa、30KDa、40KDa)。示例性的CMP-SA-PEG是方案1中的化合物5。

I.引言

[0111]本发明包含重建和修饰因子VII的方法。血液凝结途径是包含许多事件的复杂反应。该途径中的一个中间事件是凝血因子VII，通过在组织因子和钙离子存在下(活化为因子VIIa后)将因子X转变为Xa而参与血液凝结的外在途径的酶原。因子Xa然后依次在因子Va、钙离子和磷脂的存在下又将凝血酶原转变为凝血酶。因子X向因子Xa的活化是内在和外在血液凝结途径所共有的事件，因此，因子VIIa可以用于治疗具有因子VIII缺陷或抑制物的患者。也有证据表明因子VIIa也可以参与内在途径，因此增加了因子VII/因子VIIa在血液凝结中作用的突出性和重要性。

[0112]因子VII是作为无活性酶原在血液中循环的单链糖蛋白。因子VIIa的示例性核苷酸和氨基酸序列在图5中提供。因子VII向VIIa的活化可以由几种不同的血浆蛋白酶催化，例如因子XIIa。当因子VII肽主链在天冬酰胺152切割时，发生因子VII的活化。该活化产物因子VIIa是包含由至少一个二硫键结合在一起的重链和轻链的糖蛋白。此外，不能转变为因子VIIa的修饰的因子VII分子已有描述，其可用作例如在血凝块、血栓等情况下的抗凝结药物。鉴于因子VII在血液凝结途径中的重要性及其作为对增加和降低的凝结水平的治疗的用途，由此得出具有较长的生物学半衰期、提高的效价以及通常与在健康人体中合成和分泌出的野生型因子VII更相似的治疗特性的分子会是有利的以及可用作对凝血障碍的治疗。

[0113]虽然因子VII是治疗应用的重要和有用的化合物，但是当前由重组细胞制备因子VII的方法产生具有相当短的生物学半衰期和非最佳糖基化模式的产物，其可能会导致免疫原性、功能缺失、为达到相同效应而增加需要更大和更频繁剂量等。

[0114]为了提高用于治疗目的的重组因子VII/因子VIIa的有效性，本发明提供糖基化的和未糖基化的因子VII/因子VIIa肽与修饰基团的缀合物。该修饰基团可以选自聚合物修饰基团例如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等、治疗部分、诊断部分、靶向部分等等。例如用水溶性聚合物修饰基团修饰因子VII/因子VIIa肽可以提高重组因子VII/因子VIIa在患者循环中的稳定性和保留时间，和/或减少重组因子VII/因子VIIa的抗原性。

[0115]本发明的肽缀合物可以通过修饰糖与糖基化的或未糖基化的肽的酶促结合来形成。糖基化位点和/或修饰的糖基提供用于例如通过糖缀合使带有修饰基团的修饰的糖与肽缀合的位置。

[0116]本发明的方法还使得装配具有基本上同质衍生模式的肽缀合物和糖肽缀合物成为可能。本发明中使用的酶通常对肽的特定的氨基酸残基、氨基酸残基组合、特定的糖基残基或糖基残基组合具有选择性。该方法对于大规模制备肽缀合物也是实用的。因此，本发明的方法提供用于大规模制备具有预选的均一衍生模式的肽缀合物的实用方法。该方法特别适合于修饰治疗肽，其包括但不限于在细胞培养细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物中制备期间不完全糖基化的糖肽。

[0117]所述因子VII/因子VIIa肽缀合物可以作为包含肽缀合物以及可药用载体的药物制剂来制备。可以向选自以下的患者施用因子VII/因子VIIa肽缀合物：具有出血情况的血友病患者、患有A型血友病的患者、患有B型血友病的患者、患有A型血友病同时具有因子VIII抗体的患者、患有B型血友病同时具有因子IX抗体的患者、患有肝硬化的患者、原位肝移植的肝硬化患者、具有上胃肠道出血的肝硬化患者、骨髓移植患者、肝脏切除患者、肝脏部分切除患者、经历骨盆-髋臼骨折重建的患者、急性脑间出血患者、经历异基因干细胞移植的患者、由于创伤性脑损伤而出血的患者、紧急事故中出血的患者、具有外伤出血的患者、经历静脉曲张出血的患者、由于选择性外科手术而出血的患者、由于心脏外科手术而出血的患者、由于脊柱外科手而出血的患者、由于肝切除术而出血的患者。在一种示例性的实施方案中，所述患者是人患者。

[0118]本发明还提供糖基化的和未糖基化肽的缀合物，其由于例如降低的清除率或者降低的免疫系统或网状内皮系统(RES)吸收的速率而具有提高的治疗半衰期。此外，本发明的方法提供掩蔽肽上的抗原决定簇，从而降低或消除对该肽的宿主免疫应答的方法。也可以将靶向剂的选择性附着用于将肽靶向至对特定靶向剂特异的特定组织或细胞表面受体。

[0119]确定制备具有水溶性聚合物的因子VII/因子VIIa缀合物的最佳条件例如包括取决于肽和水溶性聚合物同一性的众多参数的优化。例如，当聚合物是聚(乙二醇)、如支化聚(乙二醇)时，优选在反应中利用的聚合物的量与可归因于该聚合物存在的反应混合物粘度之间确立平衡：如果聚合物高度浓缩，则反应混合物变粘，使传质和反应的速率放慢。

[0120]此外，虽然添加过量的酶在直觉上是明显的，但是本发明人认识到当酶过高地过量存在时，过量的酶变成污染物，其除去需要额外的纯化步骤和材料并且不必要地提高最终产物的成本。

[0121]此外，通常期望制备具有受控的修饰水平的肽。在一些情形下，理想的是优先加成一种修饰的糖。在另外的情形下，理想的是优先加成两种修饰的糖。因此，优选控制反应条件以影响修饰基团与肽缀合的程度。

[0122]本发明提供使得具有期望缀合水平的因子VII/因子VIIa肽的收率最大化的反应条件。本发明示例性实施方案中的条件也考虑各种试剂的花费以及纯化产物所必需的材料和时间：使本文所述的反应条件最优化以提供期望产物的优异收率同时使昂贵试剂的浪费减到最少。

II.物质/肽缀合物的组成

[0123]在第一方面中，本发明提供修饰的糖与因子VII/因子VIIa肽之间的缀合物。本发明也提供修饰基团与因子VII/因子VIIa肽之间的缀合物。肽缀合物可以具有几种形式中的一种。在一种示例性的实施方案中，肽缀合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和通过糖基连接基团与肽的氨基酸相连的修饰基团。在另一示例性的实施方案中，肽缀合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和通过糖基连接基团与肽的糖基残基相连的修饰基团。在另一示例性的实施方案中，肽缀合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和既与糖肽碳水化合物结合又与肽主链的氨基酸残基直接结合的糖基连接基团。在又一示例性的实施方案中，肽缀合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和直接与肽的氨基酸残基相连的修饰基团。在该实施方案中，肽缀合物可以不含糖基。在这些实施方案的任一种中，因子VII/因子VIIa肽可以经过或未经糖基化。

[0124]本发明的缀合物通常会符合以下通式结构：

其中符号a、b、c、d和s表示非零正整数；以及t是0或正整数。“试剂”或修饰基团可以是治疗剂、生物活性剂、可检测标记、聚合物修饰基团例如水溶性聚合物(如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG)等。“试剂”或修饰基团可以是肽例如酶、抗体、抗原等。接头可以是以下宽范围的连接基团中的任一种。作为选择，接头可以是单键或“零级接头“。

II.A.肽

[0125]因子VII是长度约406个氨基酸以及分子量约50kDa的单链多肽。当因子VII肽主链在天冬酰胺152切割时，发生因子VII向因子VIIa的转变。因子VII和/或因子VIIa肽含有两个N-聚糖位点：一个位于天冬酰胺145而另一个位于天冬酰胺322。天冬酰胺145的N-聚糖位点处于FVIIa的轻链上，而天冬酰胺322的N-聚糖位点处于FVIIa的重链上。因子VII和/或因子VIIa肽含有两个O-聚糖位点。

[0126]因子VII或因子VIIa已经进行克隆和测序。在一种示例性的实施方案中，因子VIIa肽具有以SEQ ID NO：1提供的序列。

[0127]决不应当将本发明解释成限于本文所述的因子VII核酸和氨基酸序列。使用经过突变以提高或降低肽的性质或修饰肽的结构特征的其他序列的因子VII/因子VIIa肽处于本发明范围内。例如，用于本发明的突变型因子VII/因子VIIa肽包括具有附加的O-糖基化位点或在其他位置上具有所述位点的那些肽。此外，包含一个或多个N-糖基化位点的突变型肽可用于本发明中。因子VII的变体例如在美国专利Nos.4,784,950和5,580,560中得到描述，其中赖氨酸-38、赖氨酸-32、精氨酸-290、精氨酸-341、异亮氨酸-42、酪氨酸-278和酪氨酸-332被多种多样的氨基酸替代。此外，美国专利Nos.5,861,374、6,039,944、5,833,982、5,788,965、6,183,743、5,997,864和5,817,788描述了不被切割以形成因子VIIa的因子VII变体。技术人员会认识到血液凝结途径及其中因子VII的作用是众所周知的，因此在本发明中包括许多如上所述的天然存在的和设计出的变体。在一种示例性的实施方案中，具有因子VII/因子VIIa活性的肽具有与本文所述的氨基酸序列至少约95％同源的氨基酸序列。优选地，该氨基酸序列与本文所述的氨基酸序列至少约96％、97％、98％或99％同源。

[0128]在一种示例性的实施方案中，所述糖基连接基团所结合的氨基酸残基选自丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺。在另一示例性的实施方案中，所述肽具有SEQ.ID.NO 1的序列。在另一示例性的实施方案中，所述氨基酸残基选自Asn 145、Asn 322及其组合。在另一示例性的实施方案中，所述肽是生物活性因子VII/因子VIIa肽。

[0129]在又一示例性的实施方案中，所述因子VIIa肽缀合物上的修饰的糖和/或PEG部分位于轻链上。在又一示例性的实施方案中，因子VIIa肽缀合物上的修饰的糖和/或PEG部分主要在重链上。在又一示例性的实施方案中，在因子VIIa肽缀合物的群体中，轻链主要含有修饰的糖和/或PEG部分。在又一示例性的实施方案中，在因子VIIa肽缀合物的群体中，重链主要含有修饰的糖和/或PEG部分。

[0130]在另一示例性的实施方案中，群体中轻链：重链官能化的比率为约33:66。在另一示例性的实施方案中，群体中轻链：重链官能化的比率为约35:65。在另一示例性的实施方案中，群体中轻链：重链官能化的比率为约40:60。在另一示例性的实施方案中，群体中轻链：重链官能化的比率为约45:55。在另一示例性的实施方案中，该比率为约50:50。在另一示例性的实施方案中，该比率为约55:45。在另一示例性的实施方案中，该比率为约60:40。在另一示例性的实施方案中，该比率为约65:35。在另一示例性的实施方案中，该比率为约66:33。在另一示例性的实施方案中，该比率为约70:30。在另一示例性的实施方案中，该比率为约75:25。在另一示例性的实施方案中，该比率为约80:20。在另一示例性的实施方案中，该比率为约85:15。在另一示例性的实施方案中，该比率为约90:10。在另一示例性的实施方案中，群体中轻链：重链官能化的比率大于约90:10。

[0131]用于表达因子VII/因子VIIa和确定其活性的方法是本领域熟知的，以及例如在美国专利No.4,784,950中得到描述。简言之，因子VII或其变体的表达可以在包括用杆状病毒表达体系的昆虫细胞、大肠杆菌(E.coli，)、CHO细胞、BHK细胞的多种原核及真核体系中完成，这全都是本领域熟知的。

[0132]根据本发明方法制成的因子VII/因子VIIa肽缀合物活性的测定可以用本领域熟知的方法来完成。作为非限制性的实例，Quick等(Hemorragic Disease and Thrombosis，第2版，Leat Febiger，Philadelphia，1966)描述了可用于测定根据本发明方法制成的因子VII分子的生物活性的一步凝固测定法。

[0133]当所述修饰基团是如下结构时，本发明中使用的肽不限于因子VII/因子VIIa：

在这些情况下，所述肽缀合物中的肽选自图13中的肽。在这些情况下，肽缀合物中的肽选自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、选自以下的肽：促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、α₁-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制剂、葡糖脑苷脂酶、组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脱氧核糖核酸酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生长激素、TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(Enbrel^TM)、抗-HER2单克隆抗体(Herceptin^TM)、呼吸道合胞病毒F蛋白质的单克隆抗体(Synagis^TM)、TNF-α的单克隆抗体(Remicade^TM)、糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(Reopro^TM)、CD20的单克隆抗体(Rituxan^TM)、抗凝血酶III(ATIII)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(Fabrazyme^TM)、α-艾杜糖苷酶(alpha-iduronidase)(Aldurazyme^TM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α单克隆抗体(MLB 5075)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纤维细胞生长因子。

[0134]在一种示例性的实施方案中，所述聚合物修饰基团具有下式的结构：

和

[0135]当所述修饰基团是如下结构时，本发明中使用的肽也不限于因子VII或因子VIIa：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0136]根据该实施方案的示例性聚合物修饰基团包括：

和

[0137]在一种示例性的实施方案中，其中修饰基团为支化的水溶性聚合物，例如上面显示的那些，通常优选唾液酸酶的浓度为反应混合物的约1.5-约2.5U/L。更优选唾液酸酶的量为约2U/L。

[0138]在另一示例性的实施方案中，使约5-约9g的肽底物与上述量的唾液酸酶接触。

[0139]所述修饰的糖在反应混合物中的存在量为约1g-约6g，优选约3g-约4g。通常优选将具有支化水溶性聚合物修饰部分例如上面所示部分的修饰的糖的浓度保持少于约0.5mM。在优选的实施方案中，修饰基团是分子量为约20KDa-约60KDa的支化聚(乙二醇)，更优选约30KDa-约50KDa，以及甚至更优选约40KDa。分子量约40KDa的示例性的修饰基团是约35KDa-约45KDa的基团。

[0140]关于糖基转移酶浓度，在使用上述修饰基团的当前优选的实施方案中，糖基转移酶与肽的比率是约40μg/mL转移酶比约200μM肽。

II.B.修饰的糖

[0141]在一种示例性的实施方案中，本发明的肽与修饰的糖反应，从而形成肽缀合物。修饰的糖包含“糖供体部分”以及“糖转移部分”。糖供体部分是将会通过糖基部分或氨基酸部分与肽结合作为本发明缀合物的修饰的糖的任意部分。糖供体部分包括在其从修饰的糖转变成肽缀合物糖基连接基团的过程中在化学上发生改变的那些原子。糖转移部分是不会与肽结合作为本发明缀合物的修饰的糖的任意部分。例如，本发明的修饰的糖是PEG化的糖核苷酸，PEG-唾液酸CMP。对于PEG-唾液酸CMP，糖供体部分或者PEG-唾液酰基供体部分包含PEG-唾液酸而糖转移部分或者唾液酰基转移部分包含CMP。

[0142]在本发明中使用的修饰的糖中，糖部分优选为糖、脱氧糖、氨基糖或N-酰基糖。术语“糖”及其等价物“糖基”是指单体、二聚物、寡聚物和聚合物。糖部分还用修饰基团官能化。修饰基团通常经由与糖上的胺、巯基或羟基例如伯羟基部分缀合而与糖基部分缀合。在一种示例性的实施方案中，修饰基团通过糖上的胺部分结合，例如通过胺与修饰基团的活性衍生物反应所形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲。

[0143]任何糖基部分可以用作所述修饰的糖的糖供体部分。该糖基部分可以是已知的糖例如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或者是具有已知糖的立体化学的物种。这些修饰的糖的通式为：

和

可用于形成本发明组合物的其他糖基部分包括但不限于岩藻糖和唾液酸，以及氨基糖例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等。糖基部分可以是自然界中存在的结构或者它可以进行修饰以提供缀合修饰基团的位点。例如，在一种实施方案中，修饰的糖提供其中9-羟基部分用胺代替的唾液酸衍生物。胺易于用选定修饰基团的活化类似物衍生化。

[0144]用于本发明的修饰的糖的实例在PCT专利申请No.PCT/US05/002522中得到描述，其通过引用并入本文。

[0145]在另一示例性的实施方案中，本发明采用其中6-羟基的位置转化为相应胺部分的修饰的糖，该部分带有例如上述那些的接头-修饰基团盒。可以用作这些修饰的糖的核心的示例性糖基基团包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根据该实施方案的代表性的修饰的糖具有下式：

其中R¹¹-R¹⁴独立地选自H、OH、C(O)CH₃、NH和NH C(O)CH₃。R¹⁰是与另一糖基残基的连接(-O-糖基)或与因子VII/因子VIIa肽的氨基酸的连接(-NH-(因子VII/因子VIIa))。R¹⁴是OR¹、NHR¹或NH-L-R¹。R¹和NH-L-R¹如上所述。

II.C.糖基连接基团

[0146]在一种示例性的实施方案中，本发明提供在本发明的修饰的糖与因子VII/因子VIIa肽之间形成的肽缀合物。在另一示例性的实施方案中，当所述修饰的糖上的修饰基团为以下结构时

所述肽缀合物中的肽选自图13中的肽。在又一示例性的实施方案中，肽缀合物中的肽选自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、α₁-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制剂、葡糖脑苷脂酶、组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脱氧核糖核酸酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生长激素、TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(Enbrel^TM)、抗-HER2单克隆抗体(Herceptin^TM)、呼吸道合胞病毒F蛋白质单克隆抗体(Synagis^TM)、TNF-α的单克隆抗体(Remicade^TM)、糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(Reopro^TM)、CD20的单克隆抗体(Rituxan^TM)、抗凝血酶III(AT III)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(Fabrazyme^TM)、α-艾杜糖苷酶(Aldurazyme^TM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α单克隆抗体(MLB5075)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纤维细胞生长因子。在该实施方案中，修饰糖的糖供体部分(例如糖基部分和修饰基团)变成“糖基连接基团”。该“糖基连接基团”可替代地可以指位于肽和修饰基团之间的糖基部分。

[0147]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有下式的结构：

和

[0148]在一种示例性的实施方案中，所述修饰的糖上的修饰基团为：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0149]根据该实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括：

和

[0150]由于可用于在肽上加成和/或修饰糖基残基的方法的通用性，所述糖基连接基团可以具有基本上任何的结构。在下面的论述中，参照使用选定的呋喃糖和吡喃糖衍生物来举例说明本发明。本领域技术人员会认识到该论述集中在说明的清楚性而且所述的结构和组成通常可适用于各类糖基连接基团和修饰的糖。糖基连接基团可以包含实际上任何的单糖或寡糖。糖基连接基团可以通过侧链或通过肽主链与氨基酸结合。作为选择糖基连接基团可以通过糖基部分与肽结合。该糖基部分可以是肽上O-连接的或N-连接的聚糖结构的一部分。

[0151]在一种示例性的实施方案中，本发明提供包含具有选自以下的式的完整糖基连接基团的肽缀合物：

和

在式I中，R²是H、CH₂OR⁷、COOR⁷或OR⁷，其中R⁷表示H、取代的或未取代的烃基或者取代的或未取代的杂烃基。当COOR⁷是羧酸或羧酸根时，两种形式都由单一结构的标记COO^-或COOH表示。在式I和II中，符号R³、R⁴、R⁵、R⁶和R^6’独立地表示H、取代的或未取代的烃基、OR⁸、NHC(O)R⁹。下标d是0或1。R⁸和R⁹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、唾液酸或多聚唾液酸。R³、R⁴、R⁵、R⁶或R^6’中的至少一个包括修饰基团。该修饰基团可以是通过键或连接基团相连的聚合物修饰基团例如PEG。在一种示例性的实施方案中，R⁶和R^6’连同它们所结合的碳一起作为唾液酸的丙酮酰(pyruvyl)侧链的组分。在另一示例性的实施方案中，该丙酮酰(pyruvyl)侧链以聚合物修饰基团官能化。在另一示例性的实施方案中，R⁶和R^6’连同它们所结合的碳一起作为唾液酸的侧链的组分以及聚合物修饰基团是R⁵的组分。

[0152]在一种示例性的实施方案中，本发明采用具有下式的糖基连接基团：

其中J为糖基部分，L为键或接头以及R¹为修饰基团，例如聚合物修饰基团。示例性的键为糖基部分上NH₂部分与修饰基团上互补反应性的基团之间所形成的键。例如，当R¹包含羧酸部分时，可以使该部分活化并与糖基残基上的NH₂部分偶合，提供结构为NHC(O)R¹的键。J优选为“完整的”糖基部分，其暴露于切割吡喃糖或呋喃糖结构的条件，例如氧化条件，例如高碘酸钠下未经降解。

[0153]示例性的接头包括烃基和杂烃基部分。接头包括连接基团，例如基于酰基的连接基团如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团为本发明物种组分之间形成的键，例如在糖基部分和接头(L)之间，或者在接头和修饰基团(R¹)之间。其他示例性的连接基团为醚、硫醚和胺。例如，在一种实施方案中，接头为氨基酸残基，例如甘氨酸残基。甘氨酸的羧酸部分通过与糖基残基上的胺反应转化为相应的酰胺，而甘氨酸的胺通过与修饰基团上活化的羧酸或碳酸根反应转化为相应的酰胺或氨基甲酸酯。

[0154]示例性的NH-L-R¹物种具有下式：-NH{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH}_tR¹，其中下标s和t独立地为0或1。下标a、b和d独立地为0-20的整数，以及c为1-2500的整数。其他类似的接头基于其中-NH部分由另一基团，例如-S、-O或-CH₂代替的物种。如同技术人员会意识到的那样，一个或多个对应于下标s和t的括号部分可以由取代的或未取代的烃基或杂烃基部分代替。

[0155]更具体地，本发明采用其中NH-L-R¹为以下结构的化合物：NHC(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)O(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NH(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)(CH₂)_aNHR¹、NH(CH₂)_aNHR¹和NHR¹。在这些式中，下标a、b和d独立地选自0-20的整数，优选1-5。下标c为1-约2500的整数。

[0156]在一种示例性的实施方案中，选择c以使得PEG部分为约1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD或45kD。

[0157]为了方便，本节其余部分中的糖基连接基团将基于唾液酰基部分。然而，本领域技术人员会认识到其他糖基部分例如甘露糖基、半乳糖基、葡萄糖基或岩藻糖基可以代替唾液酰基部分使用。

[0158]在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为完整的糖基连接基团，其中形成该连接基团的糖基部分或多个部分不会由于化学(例如偏高碘酸钠)或酶(例如氧化酶)过程而降解。本发明选定的缀合物包含与氨基糖例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等的胺部分结合的修饰基团。根据该模体的示例性的修饰基团-完整的糖基连接基团盒基于唾液酸结构，例如具有下式的那些：

和

[0159]在上式中，R¹和L如上所述。关于示例性的R¹基团结构的更多细节在下面提供。

[0160]在又一示例性的实施方案中，在肽与其中修饰基团通过接头在修饰的糖6-碳位上结合的修饰的糖之间形成缀合物。因此，根据该实施方案的说明性的糖基连接基团具有下式：

其中各基团如上所述。糖基连接基团不限制地包括葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰-葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰-半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰-甘露糖胺等。

[0161]在一种实施方案中，本发明提供包含以下糖基连接基团的肽缀合物：

其中D选自-OH和R¹-L-HN-；G选自H和R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基；R¹是包含直链或支化的聚(乙二醇)残基的部分；以及L是接头，例如键(“零级”)、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基。在示例性的实施方案中，当D为OH时，G为R¹-L-，以及当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

[0162]在一种实施方案中，本发明提供包含以下糖基连接基团的肽缀合物：

D选自-OH和R¹-L-HN-；G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基-R¹；R¹是包含选自直链聚(乙二醇)残基和支化聚(乙二醇)残基中的成员的部分；以及M选自H、盐反荷离子和单个负电荷；L是选自键、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基的接头。在一种示例性的实施方案中，当D为OH时，G为R¹-L-。在另一示例性的实施方案中，当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

[0163]在任何本发明的化合物中，COOH基团也可以是COOM，其中M选自H、负电荷、及盐反荷离子。

[0164]本发明提供包含具有下式的糖基连接基团的肽缀合物：

[0165]在另外的实施方案中，糖基连接基团具有下式：

其中下标t为0或1。

[0166]在又一示例性的实施方案中，糖基连接基团具有下式：

其中下标t为0或1。

[0167]在另一实施方案中，糖基连接基团具有下式：

其中下标p表示1-10的整数；以及a为0或1。

[0168]在另一示例性的实施方案中，所述肽缀合物包含选自下列式的糖基部分：

其中下标a和接头L^a如上所述。下标p为1-10的整数。下标t和a独立地选自0或1。可以包含这些基团中的每一个作为上述单-、二-、三-和四天线(antennary)糖结构的组分。AA是肽的氨基酸残基。

[0169]在一种示例性的实施方案中，PEG部分具有约20KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约5KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约10KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约40KDa的分子量。

[0170]在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-5KDa部分，而且一个、两个或三个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-5KDa部分，而且一个、两个或三个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-40KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-40KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。

[0171]在一种示例性的实施方案中，本发明的糖基聚乙二醇化的肽缀合物选自以下所述的式：

和

[0172]在上式中，下标t为0-1的整数以及下标p为1-10的整数。符号R^15’表示H、OH(例如Gal-OH)、唾液酰基部分、唾液酰基连接基团(例如唾液酰基连接基团-聚合物修饰基团(Sia-L-R¹)，或者与聚合物修饰的唾液酰基部分结合的唾液酰基部分(例如Sia-Sia-L-R¹)(“Sia-Sia^p”))。示例性的聚合物修饰的糖基部分具有式I和II的结构。示例性的本发明肽缀合物将包含至少一个具有包含式I或II结构的R^15’的聚糖。式I和II的具有开放价的氧优选通过糖苷键与Gal或GalNAc部分的碳结合。在另一示例性的实施方案中，氧与半乳糖残基3位上的碳结合。在一种示例性的实施方案中，修饰的唾液酸α 2，3-连接至半乳糖残基上。在另一示例性的实施方案中，唾液酸α 2，6-连接至半乳糖残基上。

[0173]在一种示例性的实施方案中，唾液酰基连接基团是与聚合物修饰的唾液酰基部分结合的唾液酰基部分(例如Sia-Sia-L-R¹)(“Sia-Sia^p”)。这里，糖基连接基团通过唾液酰基部分与半乳糖基部分结合：

根据该模体的示例性物种通过用形成Sia-Sia键的酶例如CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV，使Sia-L-R¹与聚糖的末端唾液酸缀合来制成。

[0174]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物上的聚糖具有选自以下的式：

和

及其组合。

[0175]在每一个上述式中，R^15’如上所述。此外，示例性的本发明肽缀合物将包含至少一个带有具备式I或II结构的R^15’部分的聚糖。

[0176]在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团包含至少一种具有下式的糖基连接基团：

和

其中R¹⁵是所述唾液酰基连接基团；以及下标p是选自1-10的整数。

[0177]在一种示例性的实施方案中，糖基连接部分具有下式：

其中b是0-1的整数。下标s表示1-10的整数；以及下标f表示1-2500的整数。

[0178]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团为PEG。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约20KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约5KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约10KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，PEG部分具有约40KDa的分子量。在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团与Asn145、Asn322、Ser52、Ser60或其组合结合。

[0179]在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为线性SA-PEG-10KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团为线性SA-PEG-20KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为线性SA-PEG-5KDa部分，而且一个、两个或三个这些糖基连接基团与肽共价结合。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团为线性SA-PEG-40KDa部分，而且一个或两个这些糖基连接基团与肽共价结合。

[0180]在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团为具有下式的唾液酰基连接基团：

在另一示例性的实施方案中，Q选自H和CH₃。在另一示例性的实施方案中，其中所述糖基连接基团具有下式：

和

其中R¹⁵是所述唾液酰基连接基团；以及下标p为选自1-10的整数。在一种示例性的实施方案中，糖基连接基团包含下式：

其中下标b为选自0和1的整数。在一种示例性的实施方案中，下标s为1；以及下标f为选自约200-约300的整数。在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团选自SA-PEG-10KDa和SA-PEG-20KDa，以及其中与因子VII/因子VIIa肽共价结合的所述糖基连接基团的数目为选自1-2的整数。在另一示例性的实施方案中，糖基连接基团选自SA-PEG-5KDa和SA-PEG-40KDa，以及其中与因子VII/因子VIIa肽共价结合的所述糖基连接基团的数目为选自1-3的整数。

II.D.修饰基团

[0181]本发明的肽缀合物包含修饰基团。该基团可以通过氨基酸或糖基连接基团与因子VII/因子VIIa肽共价结合。在另一示例性的实施方案中，当修饰基团为以下结构时，

所述肽缀合物中的肽选自图13中的肽。在另一示例性的实施方案中，肽缀合物中的肽选自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、α₁-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制剂、葡糖脑苷脂酶、组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脱氧核糖核酸酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生长激素、TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(Enbrel^TM)、抗-HER2单克隆抗体(Herceptin^TM)、呼吸道合胞病毒F蛋白质单克隆抗体(Synagis^TM)、TNF-α的单克隆抗体(Remicade^TM)、糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(Reopro^TM)、CD20的单克隆抗体(Rituxan^TM)、抗凝血酶III(AT III)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(Fabrazyme^TM)、α-艾杜糖苷酶(Aldurazyme^TM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α单克隆抗体(MLB 5075)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纤维细胞生长因子。“修饰基团”可以包含多种结构，包括靶向部分、治疗部分、生物分子。另外，“修饰基团”包括聚合物修饰基团，其为能够改变肽的性质例如其生物利用度或其在体内的半衰期的聚合物。

[0182]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有下列式的结构：

和

[0183]在根据上式的另一示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有根据以下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0184]示例性的根据该实施方案的聚合物修饰基团包括：

和

[0185]为了方便，本节其余部分中的修饰基团将主要基于聚合物修饰基团例如水溶性的和水不溶性聚合物。然而，本领域技术人员会认识到可以使用其他修饰基团例如靶向部分、治疗部分和生物分子代替聚合物修饰基团。

II.D.i.修饰基团的接头

[0186]修饰基团的接头用于将修饰基团(即聚合物修饰基团、靶向部分、治疗部分和生物分子)结合至肽上。在一种示例性的实施方案中，如下所示，聚合物修饰基团通过接头L一般经由核心上的杂原子例如氮结合至糖基连接基团上：

R¹是聚合物部分而L选自键和连接基团。下标w表示选自1-6，优选1-3和更优选1-2的整数。示例性的连接基团包括取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基部分和唾液酸。示例性的接头组分是酰基部分。

[0187]示例性的本发明化合物具有上述式I或II的结构，其中R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R^6’中的至少一个具有下式：

[0188]在根据本实施方案的另一实例中，R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R^6’中的至少一个具有下式：

其中s为0-20的整数以及R¹是线性聚合物修饰基团。

[0189]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团-接头构造物(construct)为支化结构，其包含与中心部分结合的两个或更多个聚合物链。在该实施方案中，构造物具有下式：

其中R¹和L如上所述以及w’为2-6，优选2-4以及更优选2-3的整数。

[0190]当L为键时，它在R¹的前体上的反应性官能团与糖基核心上具有互补反应性的反应性官能团之间形成。当L为非零级接头时，在与R¹前体反应之前L的前体可以处于糖基部分的适当位置上。作为选择，可以使R¹和L的前体结合入预先形成的盒中，其随后连接到糖基部分上。如本文所述，具有合适反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围内。此外，前体的偶合通过本领域熟知的化学方式进行。

[0191]在一种示例性的实施方案中，L是由氨基酸或小肽所形成的连接基团(例如1-4个氨基酸残基)，它提供其中聚合物修饰基团通过取代的烃基接头结合的修饰的糖。示例性的接头包括甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。PEG部分可以通过酰胺或氨基甲酸酯键与接头的胺部分结合。PEG分别通过硫醚或醚键连接至半胱氨酸和丝氨酸的硫或氧原子上。

[0192]在一种示例性的实施方案中，R⁵包含聚合物修饰基团。在另一示例性的实施方案中，R⁵同时包含聚合物修饰基团和将修饰基团连接到分子其余部分上的接头L。如上所述，L可以是线性或支化的结构。类似地，聚合物修饰基团可以是支化或线性的。

II.D.ii.水溶性聚合物

[0193]许多水溶性聚合物为本领域技术人员已知而且可用于实践本发明。术语水溶性聚合物包括例如糖(例如葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、多聚(唾液酸)、类肝素、肝素等)；聚(氨基酸)例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)、聚醚如聚(乙二醇))；肽、蛋白质等物种。本发明可以用任何水溶性聚合物来实施，唯一的限制在于该聚合物必须包含缀合物的其余部分能够与它结合的位点。

[0194]活化聚合物的方法也可以见WO 94/17039、美国专利No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利No.5,219,564、美国专利No.5,122,614、WO 90/13540、美国专利No.5,281,698以及WO 93/15189，以及对于活化的聚合物和肽之间的缀合参见以下文献，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利No.4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。

[0195]示例性的水溶性聚合物为聚合物试样中相当大部分聚合物分子有大致相同的分子量的那些聚合物；所述聚合物为“均匀分散的”。

[0196]本发明参照聚(乙二醇)缀合物来进一步举例说明。可获得关于PEG官能化和缀合的若干综述和专题文章。参见例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，MethodsinEnzymology，135：30-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Biocon jugateChem.6：150-165(1995)；以及Bhadra等，Pharmazie，57：5-29(2002)。制备反应性PEG分子并用该反应性分子形成缀合物的途径为本领域已知。例如，美国专利No.5,672,662公开了选自线性或支化聚氧化烯烃、聚(氧乙烯化多元醇)、聚(烯醇)和聚丙烯酰吗啉的聚合物酸的活性酯的水溶性且可分离的缀合物。

[0197]美国专利No.6,376,604描述通过使聚合物的末端羟基与碳酸二(1-苯并三唑基)酯在有机溶剂中反应来制备水溶性的和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。该活性酯用于与生物活性剂例如蛋白质或肽形成缀合物。

[0198]WO 99/45964描述含生物活性剂和活化的水溶性聚合物的缀合物，该聚合物包含具有通过稳定键与聚合物主链相连的至少一个末端的聚合物主链，其中至少一个末端含有具有与支化部分相连的近端反应性基团的支化部分，其中生物活性剂与至少一个近端反应性基团连接。另外的支化聚乙二醇在WO 96/21469中得到描述，美国专利No.5,932,462描述由包括含有反应性官能团的支化末端的支化PEG分子所形成的缀合物。游离反应性基团可用来与生物活性物种例如蛋白质或肽反应，形成聚乙二醇与生物活性物种之间的缀合物。美国专利No.5,446,090描述双官能PEG接头及其在形成PEG接头每端均有肽的缀合物中的用途。

[0199]包含可降解PEG键的缀合物在WO 99/34833和WO 99/14259以及美国专利No.6,348,558中得到描述。这些可降解键可适用于本发明。

[0200]上述本领域公认的聚合物活化方法在本文所述支化聚合物的形成方面以及对于这些支化聚合物与其他物种例如糖、糖核苷酸等的缀合可用于本发明的上下文中。

[0201]示例性的水溶性聚合物是聚乙二醇，例如甲氧基-聚乙二醇。本发明中使用的聚乙二醇不限于任何特定的形式或分子量范围。对于非支化的聚乙二醇分子，分子量优选为500-100,000。优选使用2000-60,000的分子量以及优选约5,000-约40,000。

II.D.iii.支化的水溶性聚合物

[0202]在另一实施方案中聚乙二醇为结合了多于一个的PEG部分的支化PEG。支化PEG的示例在美国专利No.5,932,462、美国专利No.5,342,940、美国专利No.5,643,575、美国专利No.5,919,455、美国专利No.6,113,906、美国专利No.5,183,660、WO 02/09766、Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)以及Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，52：2125-2127，1998中得到描述。在优选的实施方案中，支化PEG的各个聚乙二醇的分子量小于或等于40,000道尔顿。

[0203]代表性的聚合物修饰部分包括基于含侧链的氨基酸例如丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和小肽例如lys-lys的结构。示例性的结构包括：

技术人员会意识到二-赖氨酸结构中的游离胺也可以通过酰胺或氨基甲酸酯键用PEG部分聚乙二醇化。

[0204]在又一实施方案中，聚合物修饰部分是基于三-赖氨酸肽的支化PEG部分。该三-赖氨酸可以是单-、二-、三-或四PEG化的。示例性的根据该实施方案的物种具有下式：

和

其中下标e、f和f’独立地为选自1-2500的整数；以及下标q、q’和q”独立地为选自1-20的整数。

[0205]如同对技术人员而言明显的那样，用于本发明中的支化聚合物包括上面所述主题的变体。例如上面所示的二赖氨酸-PEG缀合物可以包含三个聚合物亚单元，第三个结合在上文结构中显示未修饰的α-胺上。类似地，用三个或四个以聚合物修饰部分标记的聚合物亚单元官能化的三赖氨酸的应用在本发明的范围内。

[0206]如本文所述，用于本发明缀合物中的PEG可以是线性或支化的。用于形成根据本发明该实施方案的含支化PEG的肽缀合物的示例性前体具有下式：

用于形成根据本发明该实施方案的含支化PEG的肽缀合物的另一示例性前体具有下式：

[0207]根据该式的支化聚合物物种基本上是纯水溶性聚合物。X^3’是包含可离子化的(例如OH、COOH、H₂PO₄、HSO₃、HPO₃及其盐等)或其他反应性官能团例如以下那些的部分。C是碳。X⁵、R¹⁶和R¹⁷独立地选自非反应性基团(例如H、未取代的烃基、未取代的杂烃基)和聚合物臂(例如PEG)。X²和X⁴为可以相同或不同的优选在生理条件下基本上非反应性的键片段。示例性的接头既不包含芳族部分也不包含酯部分。作为选择，这些键可以包含一个或多个设计成在生理上相关的条件下降解的部分例如酯、二硫化物等。X²和X⁴将聚合物臂R¹⁶和R¹⁷连接到C上。当X^3’与接头、糖或接头-糖盒上具有互补反应性的反应性官能团反应时，X^3’转化成键片段X³的组分。

[0208]X²、X³和X⁴的示例性键片段独立地选择以及包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH₂S、CH₂O、CH₂CH₂O、CH₂CH₂S、(CH₂)_oO、(CH₂)_oS或(CH₂)_oY’-PEG，其中Y’为S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O以及o为1-50的整数。在一种示例性的实施方案中，键片段X²和X⁴为不同的键片段。

[0209]在一种示例性的实施方案中，前体(式III)或其活化衍生物通过X^3’和糖部分上互补反应性的基团例如胺之间的反应与糖、活化的糖或糖核苷酸反应并由此与其结合。作为选择，X^3’与前体上的反应性官能团反应成接头L。式I和II的R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶或R^6’中的一个或多个可以包含支化的聚合物修饰部分，或者该部分通过L结合。

[0210]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有根据下式的结构：

和

[0211]在根据上式的另一示例性实施方案中，支化聚合物具有根据下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0212]根据该实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括：

和

[0213]在一种示例性的实施方案中，以下部分：

是接头臂L。在该实施方案中，示例性的接头衍生自天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物、或者由一个或多个上述物种形成的小肽。例如，本发明化合物中存在的某些支化聚合物具有下式：

[0214]X^a是由支化聚合物修饰部分的前体上的反应性官能团例如X^3’与糖部分或接头前体上的反应性官能团的反应形成的键片段。例如，当X^3’是羧酸时，它可以进行活化并且直接结合到氨基糖(例如Sia、GalNH₂、GlcNH₂、ManNH₂等)上悬挂的胺基团上，形成作为酰胺的X^a。另外的示例性反应性官能团和活化前体在下文进行描述。下标c表示1-10的整数。其他符号具有如上述那些相同的含义。

[0215]在另一示例性的实施方案中，X^a是与另一接头形成的连接部分：

其中X^b是另一键片段以及独立地选自对于X^a所述的那些基团，类似于L，L¹是键、取代的或未取代的烃基或取代的或未取代的杂烃基。

[0216]X^a和X^b的示例性物种包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O以及OC(O)NH。

[0217]在另一示例性的实施方案中，X⁴是与R¹⁷的肽键，R¹⁷为其中α-胺部分和/或侧链杂原子用聚合物修饰部分修饰的氨基酸、二肽(例如Lys-Lys)或三肽(例如Lys-Lys-Lys)。

[0218]在另一示例性的实施方案中，本发明的肽缀合物包含具有选自以下的式的部分，例如R¹⁵部分：

和

其中由各种符号表示的基团的含义与上文所述的相同。L^a是键或如上对于L和L¹所述的接头，例如取代的或未取代的烃基或取代的或未取代的杂烃基部分。在一种示例性的实施方案中，L^a是如同所示那样用聚合物修饰部分官能化的唾液酸的侧链的部分。示例性的L^a部分包括含有一个或多个OH或NH₂的取代的或未取代的烃基链。

[0219]在又一实施方案中，本发明提供具有下式的部分，例如R¹⁵部分的肽缀合物：

和

由各种符号表示的基团的含义与上文所述的相同。如同技术人员会意识到的那样，式VI和VII中的接头臂可同等适用于本文所述的其他修饰的糖。在示例性的实施方案中，式VI和VII的物种为结合至本文所述的聚糖结构上的R¹⁵部分。

[0220]在又一示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽缀合物包含具有选自以下的式的R¹⁵部分：

其中基团的含义如上所述。L^a的示例性物种为-(CH₂)_jC(O)NH(CH₂)_hC(O)NH-，其中下标h和j为独立地选自0-10的整数。另一示例性物种为-C(O)NH-。下标m和n为独立地选自0-5000的整数。A¹、A²、A³、A⁴、A⁵、A⁶、A⁷、A⁸、A⁹、A¹⁰和A¹¹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、-NA¹²A¹³、-OA¹²和-SiA¹²A¹³。A¹²和A¹³独立地选自取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。

[0221]上述本发明的实施方案参照其中聚合物为水溶性聚合物，特别是聚乙二醇(“PEG”)如甲氧基-聚乙二醇的物种来进一步举例说明。技术人员会意识到以下段落中的焦点在于说明的清楚性而且用PEG作为示例性聚合物阐述的各种模体可同等适用于其中采用PEG以外的聚合物的物种。

[0222]任意分子量的PEG可用于本发明中，例如1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、15KDa、20KDa、25KDa、30KDa、35KDa、40KDa和45KDa。

[0223]在一种示例性的实施方案中，R¹⁵部分具有选自以下的式：

在上面的每种结构中，接头片段-NH(CH₂)_a-可以存在或不存在。

[0224]在另外的示例性实施方案中，肽缀合物包含选自以下的R¹⁵部分：

和

[0225]在上面的各个式中，下标e和f为独立地选自1-2500的整数。在另外的实施方案中，选择e和f以提供约1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、15KDa、20KDa、25KDa、30KDa、35KDa、40KDa和45KDa的PEG部分。符号Q表示取代的或未取代的烃基(例如C₁-C₆烃基，如甲基)、取代的或未取代的杂烃基或H。

[0226]其他支化的聚合物具有基于二-赖氨酸(Lys-Lys)肽的结构，例如：

和

以及基于三-赖氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的结构，例如：

和

在上述各图中，下标e、f、f’和f”表示独立地选自1-2500的整数。下标q、q’和q”表示独立地选自1-20的整数。

[0227]在另一示例性的实施方案中，修饰基团：

具有选自以下的式：

和

其中Q选自H和取代的或未取代的C₁-C₆烃基。下标e和f为独立地选自1-2500的整数，以及下标q为选自0-20的整数。

[0228]在另一示例性的实施方案中，修饰基团：

具有选自以下的式：

和

其中Q选自H和取代的或未取代的C₁-C₆烃基。下标e、f和f’为独立地选自1-2500的整数，以及下标q和q’为独立地选自1-20的整数。

[0229]在另一示例性的实施方案中，支化聚合物具有根据下式的结构：

其中下标m和n为独立地选自0-5000的整数。A¹、A²、A³、A⁴、A⁵、A⁶、A⁷、A⁸、A⁹、A¹⁰和A¹¹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、-NA¹²A¹³、-OA¹²和-SiA¹²A¹³。A¹²和A¹³独立地选自取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的杂环烃基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。

[0230]式IIIa为式III的子集。式IIIa所述结构也包括在式III中。

[0231]在一种示例性的实施方案中，聚合物修饰基团具有根据下列式的结构：

和

[0232]在根据上式的另一示例性实施方案中，支化聚合物具有根据下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²独立地选自-OH和-OCH₃。

[0233]根据该实施方案的示例性聚合物修饰基团包括：

和

[0234]在一种说明性的实施方案中，修饰的糖是唾液酸而且用于本发明的选定的修饰的糖具有下式：

和

下标a、b和d为0-20的整数。下标c为1-2500的整数。上述结构可以是R¹⁵的组分。

[0235]在另一说明性的实施方案中，糖的伯羟基部分用修饰基团官能化。例如，唾液酸的9-羟基可以转化成相应的胺并且官能化以提供本发明的化合物。根据该实施方案的式包括：

上述结构可以是R¹⁵的组分。

[0236]虽然本发明在前述段落中参照PEG来举例说明，但是如同技术人员会意识到的那样，一系列聚合物修饰部分可用于本文所述的化合物和方法中。

[0237]在选定的实施方案中，R¹或L-R¹为支化PEG，例如上述的物种之一。在一种示例性的实施方案中，支化PEG结构基于半胱氨酸肽。根据该实施方案的说明性修饰的糖包括：

其中X⁴为键或O。在上面各个结构中，烃基胺接头-(CH₂)_aNH-可以存在或不存在。上述结构可以是R¹⁵/R^15’的组分。

[0238]如本文所述，用于本发明的聚合物修饰的唾液酸也可以是线性结构。因此，本发明提供包含衍生自诸如以下结构的唾液酸部分的缀合物：

其中下标q和e如上所述。

[0239]示例性的修饰的糖用水溶性或水不溶性聚合物修饰。有用聚合物的实例在下面进一步说明。

[0240]在另一示例性的实施方案中，肽来源于昆虫细胞，通过向甘露糖核心加成GlcNAc和Gal来重建并用带有线性PEG部分的唾液酸来糖基聚乙二醇化，提供包含至少一个具有下式的部分的因子VII/因子VIIa肽：

其中下标t为0-1的整数；下标s表示1-10的整数；以及下标f表示1-2500的整数。

[0241]在一种实施方案中，本发明提供包含以下糖基连接基团的肽缀合物：

D选自-OH和R¹-L-HN-；G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基-R¹；R¹是包含选自直链聚乙二醇残基和支化聚乙二醇残基中的成员的部分；以及M选自H、盐反荷离子和单个负电荷；L是选自键、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基的接头。在一种示例性的实施方案中，当D为OH时，G为R¹-L-。在另一示例性的实施方案中，当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

[0242]在一种示例性的实施方案中，L-R¹具有下式：

其中a为选自0-20的整数。

[0243]在一种示例性的实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

和

其中e、f、m和n为独立地选自1-2500的整数；以及q为选自0-20的整数。

[0244]在一种示例性的实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

和

其中e、f和f’为独立地选自1-2500的整数；以及q和q’为独立地选自1-20的整数。

[0245]在另一示例性的实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

和

其中e、f和f’为独立地选自1-2500的整数；以及q和q’为独立地选自1-20的整数。

[0246]在另一示例性的实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

和

其中e和f为独立地选自1-2500的整数。

[0247]在另一示例性的实施方案中，糖基接头具有下式：

[0248]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物包含根据选自以下的式的至少一个所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。

[0249]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物包含至少一个所述糖基接头，其中每一个所述糖基接头具有独立地选自下列式的结构：

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。

[0250]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物包含根据选自以下的式的至少一个所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。在一种示例性的实施方案中，选自0和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。在一种示例性的实施方案中，选自1和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。

[0251]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物包含根据选自以下的式的至少一个所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。在一种示例性的实施方案中，选自0和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。在一种示例性的实施方案中，选自1和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。

[0252]在另一示例性的实施方案中，肽缀合物包含根据选自以下的式的至少一个所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。在一种示例性的实施方案中，选自0和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。在一种示例性的实施方案中，选自1和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。

[0253]在另一示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。在另一示例性的实施方案中，糖基接头通过选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

[0254]在另一示例性的实施方案中，天冬酰胺残基选自N152、N322及其组合。

[0255]在另一示例性的实施方案中，因子VIIa肽为生物活性因子VIIa肽。

[0256]在另一示例性的实施方案中，糖基接头通过为天冬酰胺残基的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

[0257]在另一示例性的实施方案中，本发明提供在合适宿主中产生的因子VII/因子VIIa肽。本发明也提供表达该肽的方法。在另一示例性的实施方案中，宿主为哺乳动物表达体系。

[0258]在另一示例性的实施方案中，本发明提供一种治疗需要该治疗的受试者中病症的方法，所述病症的特征为所述受试者中凝血效价受损(compromised clotting potency)，所述方法包括向受试者施用有效改善所述受试者中所述病症的量的本发明因子VII/因子VIIa肽缀合物的步骤。在另一示例性的实施方案中，该方法包括向所述哺乳动物施用适量的根据本文所述方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物。

[0259]在另一方面中，本发明提供一种制备含有糖基接头的因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法，该糖基接头包含具有下式的修饰的唾液酰基残基：

其中R²为H、CH₂OR⁷、COOR⁷或OR⁷。R⁷表示H、取代的或未取代的烃基或取代的或未取代的杂烃基。R³和R⁴独立地选自H、取代的或未取代的烃基、OR⁸、NHC(O)R⁹。R⁸和R⁹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基或唾液酸。R¹⁶和R¹⁷为独立选择的聚合物臂。X²和X⁴为独立选择的将聚合物部分R¹⁶和R¹⁷连接到C上的键片段。X⁵是非反应性基团以及L^a是接头基团。该方法包括使含有糖基部分的因子VII/因子VIIa肽：

与具有下式的PEG-唾液酸供体部分：

以及将PEG-唾液酸转移至所述糖基部分的Gal上的酶，在适合于所述转移的条件下进行接触。

[0260]在另一示例性的实施方案中，部分：

具有选自以下的式：

其中e、f、m和n为独立地选自1-2500的整数；以及

q为选自0-20的整数。

[0261]在另一示例性的实施方案中，部分：

具有选自以下的式：

和

其中e、f和f’为独立地选自1-2500的整数；以及

q和q’为独立地选自1-20的整数。

[0262]在另一示例性的实施方案中，糖基接头包含下式：

[0263]在另一示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽缀合物包含至少一个具有下式的糖基接头：

和

其中AA为所述肽的氨基酸残基；t为选自0和1的整数；以及R15为修饰的唾液酰基部分。

[0264]在另一示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

[0265]在另一示例性的实施方案中，糖基接头通过为天冬酰胺残基的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

[0266]在另一示例性的实施方案中，天冬酰胺残基选自N152、N322及其组合。

[0267]在另一示例性的实施方案中，因子VIIa肽为生物活性因子VIIa肽。

[0268]在另一示例性的实施方案中，所述方法在步骤(a)之前包括：(b)在合适宿主中表达因子VII/因子VIIa肽。

[0269]在另一方面中，本发明提供一种治疗需要该治疗的受试者中病症的方法，所述病症的特征为所述受试者中凝血能力受损，所述方法包括向受试者施用有效改善所述受试者中所述病症的量的根据本文所述方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物的步骤。在另一示例性的实施方案中，该方法包括向所述哺乳动物施用适量的根据本文所述方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物。

[0270]在另一方面中，本发明提供合成因子VII或因子VIIa肽缀合物的方法，所述方法包括将a)唾液酸酶；b)选自糖基转移酶、外切糖苷酶和内切糖苷酶的酶；c)修饰的糖/修饰的唾液酰基残基；d)因子VII/因子VIIa肽合并从而合成所述因子VII或因子VIIa肽缀合物。在一种示例性的实施方案中，合并的时间少于10小时。在另一示例性的实施方案中，本发明进一步包括加帽步骤。

II.D.iv.水不溶性聚合物

[0271]在另一实施方案中，与上面所讨论的那些类似，修饰的糖包括水不溶性聚合物而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物也可以包含一种或多种水不溶性聚合物。本发明的该实施方案通过使用缀合物作为以受控方式递送治疗肽的载体进行说明。聚合物药物递送系统为本领域已知。参见例如Dunn等编辑，

，ACS Symposium Series第469卷，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991。本领域技术人员会意识到，基本上任何已知的药物递送系统都可适用于本发明的缀合物。

[0272]对于R¹、L-R¹、R¹⁵、R^15’和其他基团的上述模体可同等适用于水不溶性聚合物，可以利用本领域技术人员易于采取的化学方式将它们不受限制地引入线性和支化结构中。

[0273]代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基(polyalkylene)、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚氧化烯烃、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚卤乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(pluronics)和聚乙烯基苯酚及它们的共聚物。

[0274]用于本发明缀合物的合成修饰的天然聚合物包括但不限于烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝酸纤维素。广泛种类的合成修饰的天然聚合物中特别优选的成员包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的聚合物。

[0275]本文所讨论的这些和其他聚合物可以容易地从商业来源例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)获得，或者使用标准技术从这些供应商处所获得的单体来合成。

[0276]用于本发明缀合物的代表性的可生物降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己内酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其共混物和共聚物。特别有用的是形成凝胶的组合物，例如含有胶原、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等的那些。

[0277]用于本发明的聚合物包括“杂化”聚合物，它包含在其结构的至少一部分中具有可生物吸收分子的水不溶性物质。这种聚合物的实例为含有水不溶性共聚物的聚合物，所述共聚物的每条聚合物链具有可生物吸收区域、亲水性区域和多个可交联官能团。

[0278]就本发明而言，“水不溶性物质”包括基本上不溶于水或含水环境的物质。因此，尽管共聚物的某些区域或链段可能是亲水的乃至是水溶性的，但是聚合物分子整体上在水中没有任何显著程度的溶解。

[0279]就本发明而言，术语“可生物吸收的分子”包含能够由身体进行代谢或分解并且吸收和/或通过正常排泄途径消除的区域。所述代谢产物或分解产物优选基本上对身体无毒。

[0280]可生物吸收的区域可以是疏水性的或亲水性的，只要该共聚物组合物整体没有变得水溶性即可。由此，基于使聚合物整体保持水不溶性的优选情况来选择可生物吸收的区域。因此，选择相对特性，即可生物吸收的区域所含的官能团种类和该区域的相对比例以及亲水性区域，从而确保有用的可生物吸收的组合物保持水不溶性。

[0281]示例性的可吸收聚合物包括例如合成制备的聚α-羟基羧酸/聚氧化烯烃的可吸收嵌段共聚物(参见Cohn等，美国专利No.4,826,945)。这些共聚物没有交联而且是水溶性的，以至于身体可以排泄降解后的嵌段共聚物组合物。参见Younes等，J Biomed.Mater.Res.21：1301-1316(1987)以及Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。

[0282]目前优选的可生物吸收聚合物包括选自以下的一种或多种组分：聚酯、聚羟基酸、聚内酯、聚酰胺、聚酯-酰胺、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酸酯、聚硫代酯、多糖及其混合物。更优选地，可生物吸收的聚合物包括聚羟基酸组分。在聚羟基酸中，优选聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。

[0283]除了形成在体内被吸收(“生物吸收”)的片段以外，用于本发明方法的优选聚合物包衣还可以形成可排泄和/或可代谢的片段。

[0284]本发明中还可以使用高级共聚物。例如1984年3月20日颁发的Casey等的美国专利No.4,438,253公开了由聚乙醇酸和羟基末端的聚亚烷基二醇的酯交换产生的三嵌段共聚物。公开该组合物用作可吸收的单丝缝合线。通过向共聚物结构中引入芳族原碳酸酯例如原碳酸四对甲苯酯来控制这些组合物的挠性。

[0285]还可以使用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如1993年4月13日颁发的Spinu的美国专利No.5,202,413公开了具有聚丙交酯和/或聚乙交酯依次有序嵌段的可生物降解多嵌段共聚物，其通过将丙交酯和/或乙交酯开环聚合至低聚二醇或二胺残基上、接着用二官能化合物例如二异氰酸酯、二酰氯或二氯硅烷进行扩链来制成。

[0286]可以将可用于本发明的包衣的可生物吸收区域设计成可水解和/或可酶促切割的。就本发明而言，“可水解切割”是指共聚物，特别是可生物吸收区域在水或含水环境中对水解的敏感性。类似地，本文使用的“可酶促切割”是指共聚物，特别是可生物吸收区域对内源或外源酶切割的敏感性。

[0287]当置于身体中时，可以将亲水性区域加工成可排泄和/或可代谢片段。因此，亲水性区域可以包括如聚醚、聚氧化烯烃、多元醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。此外，亲水性区域还可以是例如聚氧化烯烃。所述聚氧化烯烃可以包括如聚氧乙烯、聚氧丙烯及其混合物和共聚物。

[0288]作为水凝胶组分的聚合物也可用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合物材料。形成水凝胶的化合物的实例包括但不限于聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷、明胶、角叉菜胶和其他多糖、羟基亚乙基甲基丙烯酸(HEMA)及其衍生物等等。可以制成稳定、可生物降解和可生物吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可以包含表现出一种或多种这些性质的亚单元(subunits)。

[0289]其完整性可以通过交联进行控制的生物相容的水凝胶组合物是已知的，而且目前优选用于本发明方法中。例如Hubbell等的1995年4月25日颁发的美国专利No.5,410,016和1996年6月25日颁发的5,529,914公开了水溶性体系，它是具有夹在两个对水解不稳定的延长部分之间的水溶性中心嵌段链段的交联嵌段共聚物。这些共聚物进一步由可光聚合的丙烯酸酯官能度封端。在交联时，这些体系变成水凝胶。上述共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚乙二醇，而对水解不稳定的延长部分可以是聚α-羟基酸，例如聚乙醇酸或聚乳酸。参见Sawhney等，Macromolecules 26：581-587(1993)。

[0290]在另一优选的实施方案中，凝胶为热可逆的凝胶。目前优选包含诸如以下组分的热可逆凝胶：聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨酯水凝胶、聚氨酯-脲水凝胶及其组合。

[0291]在又一示例性的实施方案中，本发明的缀合物包含脂质体的组分。可以根据本领域技术人员已知的方法制备脂质体，例如Eppstein等的美国专利No.4,522,811中所述那样。例如，脂质体制剂的制备可以通过将合适的脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂中，随后蒸发溶剂，在容器表面留下干燥脂质的薄膜。然后向容器中引入活性化合物或其可药用盐的水溶液。接着用手旋动容器以从容器侧面释放脂质物质并分散脂质聚集体，由此形成脂质体悬浮液。

[0292]为了举例提供上述微粒和制备微粒的方法，它们并非意图限定可用于本发明的微粒的范围。对于本领域技术人员而言明显的是，用不同方法制备的一系列微粒可用于本发明中。

[0293]就水不溶性聚合物而言，上面在水溶性聚合物的上下文中论述的直链和支化的结构形式一般也可适用。因此，例如可以使半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸支化核心用两个水不溶性聚合物部分官能化。用于制备这些物种的方法一般与用于制备水溶性聚合物的那些方法非常相似。

II.D.v.制备聚合物修饰基团的方法

[0294]可以活化聚合物修饰基团以便与糖基部分或氨基酸部分反应。示例性的活化物种结构(例如碳酸酯和活性酯)包括：

和

[0295]在上面的图中，q选自1-40。适合活化可用于制备本文所述化合物的线性和支化PEG的其他活化基团或离去基团包括但不限于：

和

用这些和其他物种活化的PEG分子以及制备活化PEG的方法在WO04/083259中得到描述。

[0296]本领域技术人员会意识到上面所示的支化聚合物的一个或多个m-PEG臂可以由具有不同末端例如OH、COOH、NH₂、C₂-C₁₀-烃基等的PEG部分代替。此外，上述结构容易地通过在氨基酸侧链的α-碳原子和官能团之间插入烃基接头(或除去碳原子)来进行修饰。因此，“同质(homo)”衍生物和高级同系物以及低级同系物在可用于本发明的支化PEG核心的范围内。

[0297]本文所述的支化PEG物种容易地通过诸如以下方案中所述的方法来制备：

其中X^d为O或S而r为1-5的整数。下标e和f为独立地选自1-2500的整数。在一种示例性的实施方案中，选择这些下标之一或其两者以使得聚合物分子量为约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa或40kDa。

[0298]因此，根据该方案，使天然或非天然的氨基酸与活性m-PEG衍生物(在该情况下为甲苯磺酸酯)接触，通过将侧链杂原子Xd烷基化而形成1。使单官能化的m-PEG氨基酸与活性m-PEG衍生物处于N-酰化条件下，从而组合成支化m-PEG 2。如同技术人员会意识到的那样，甲苯磺酸酯离去基团可以用任何合适的离去基团代替，例如卤素、甲磺酸酯、三氟甲基磺酸酯等。类似地，用于酰化胺的反应性碳酸酯可以用活性酯例如N-羟基琥珀酰亚胺等代替，或者酸可以用脱水剂例如二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑等原位活化。

[0299]在另外的示例性实施方案中，脲部分由诸如酰胺等基团代替。

II.E.物质的均匀分散的肽缀合物组合物

[0300]除了提供通过化学或酶促加成糖基连接基团而形成的肽缀合物以外，本发明提供包含在其取代模式上高度同质的肽缀合物的物质组合物。采用本发明的方法，可以形成其中因子VII/因子VIIa缀合物的群体中相当大部分的糖基连接基团和糖基部分与结构上一致的氨基酸或糖基残基结合的肽缀合物。因此，在另一方面中，本发明提供具有通过糖基连接基团，例如完整的糖基连接基团共价结合至肽上的水溶性聚合物部分的群体的肽缀合物。在示例性的本发明肽缀合物中，水溶性聚合物群体的基本上每个成员通过糖基连接基团结合至肽的糖基残基上，而且该糖基连接基团所结合的肽的每个糖基残基具有相同结构。

[0301]本发明还提供类似于上述那些的缀合物，其中肽与修饰基团例如治疗部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分等通过糖基连接基团缀合。每一个上述修饰基团可以是小分子、天然聚合物(例如肽)或合成聚合物。当修饰基团与唾液酸结合时，通常优选该修饰基团是基本上非荧光的。

[0302]在一种示例性的实施方案中，本发明的肽包含至少一个O-连接的或N-连接的糖基化位点，其用包含聚合物修饰基团例如PEG部分的修饰的糖来糖基化。在一种示例性的实施方案中，PEG通过完整的糖基连接基团、或者通过非糖基的接头例如取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基共价结合至肽上。糖基连接基团共价结合至肽的氨基酸残基或糖基残基上。作为选择，糖基连接基团结合至糖肽的一个或多个糖基单元上。本发明也提供其中糖基连接基团既与氨基酸残基又与糖基残基结合的缀合物。

[0303]本发明肽上的聚糖通常对应于在根据本文所述方法重构之后由哺乳动物(BHK、CHO)细胞或昆虫(例如Sf-9)细胞所产生的因子VII/因子VIIa肽上存在的那些。例如用三甘露糖基核心表达的昆虫来源的因子VII/因子VIIa肽随后与GlcNAc供体和GlcNAc转移酶以及Gal供体和Gal转移酶接触。将GlcNAc和Gal附加至三甘露糖基核心上在两步或一步中完成。如本文所述使修饰的唾液酸加成到糖基部分的至少一个分支上。没有用修饰的唾液酸官能化的那些Gal部分任选地通过在唾液酸转移酶的存在下与唾液酸供体反应而“加帽”。

[0304]在一种示例性的实施方案中，肽群体中至少60％的末端Gal部分用唾液酸加帽，优选至少70％、更优选至少80％、再更优选至少90％以及甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％的末端Gal部分用唾液酸加帽。

II.F.核苷酸糖

[0305]在本发明的另一方面中，本发明还提供糖核苷酸。根据该实施方案的示例性物种包括：

其中下标y为选自0、1和2的整数。碱基为核酸碱基例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。R²、R³和R⁴如上所述。在一种示例性的实施方案中，L-(R¹)_w选自

和

其中各变量如上所述。

[0306]在一种示例性的实施方案中，L-(R¹)_w具有根据下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

[0307]根据该实施方案的示例性聚合物修饰基团包括：

和

[0308]在另一示例性的实施方案中，核苷酸糖具有选自以下的式：

和

[0309]根据该实施方案的示例性核苷酸糖具有以下结构：

[0310]根据该实施方案的示例性核苷酸具有以下结构：

[0311]在另一示例性的实施方案中，核苷酸糖基于下式：

其中R基团和L表示如上所述的部分。下标“y”为0、1或2。在一种示例性的实施方案中，L为NH与R¹之间的键。该碱基为核酸碱基。

[0312]在一种示例性的实施方案中，L-R¹选自

和

其中各变量如上所述。

[0313]在一种示例性的实施方案中，L-R¹具有根据下式的结构：

在一种示例性的实施方案中，A¹和A²各自选自-OH和-OCH₃。

III.方法

[0314]除了上述缀合物以外，本发明提供制备这些及其他缀合物的方法。此外，本发明提供通过向具有发生所述疾病风险的受试者或患有所述病的受试者施用本发明的缀合物来预防、治疗或改善疾病状态的方法。

[0315]在示例性的实施方案中，在聚合物修饰部分与糖基化的或未糖基化的肽之间形成缀合物。聚合物与肽通过插入其间而且同时与肽(或糖基残基)和修饰基团(例如水溶性聚合物)共价连接的糖基连接基团缀合。该方法包括使肽与含有修饰的糖以及使该修饰的糖与底物缀合的酶例如糖基转移酶的混合物接触。反应在适合于在修饰的糖与肽之间形成共价键的条件下进行。修饰的糖的糖部分优选选自核苷酸糖。合成因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法，包括将a)唾液酸酶；b)能够催化糖基连接基团的转移的酶，例如糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶；c)修饰的糖；d)因子VII/因子VIIa肽合并，从而合成该因子VII/因子VIIa肽缀合物。反应在适合于在修饰的糖与肽之间形成共价键的条件下进行。修饰的糖的糖部分优选选自核苷酸糖。

[0316]在一种示例性的实施方案中，将修饰的糖，例如上述的那些，活化成相应的核苷酸糖。以其修饰过的形式用于本发明的示例性的糖核苷酸包括核苷酸单-、二-或三磷酸或其类似物。在优选的实施方案中，修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷、或GDP-糖苷。甚至更优选地，修饰的糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在一种示例性的实施方案中，核苷酸磷酸结合至C-1。

[0317]本发明还提供在6-碳位上用L-R¹修饰的糖核苷酸的应用。根据该实施方案的示例性物种包括：

其中R基团和L表示如上所述的部分。下标“y”为0、1或2。在一种示例性的实施方案中，L为NH与R¹之间的键。该碱基为核酸碱基。

[0318]其中6-位的碳被修饰的用于本发明的示例性的核苷酸糖包括具有GDP甘露糖的立体化学的物种，例如：

和

其中X⁵为键或0。下标i表示0或1。下标a表示1-20的整数。下标e和f独立地表示1-2500的整数。Q如上所述为H或取代的或未取代的C₁-C₆烃基。如同技术人员会意识到的那样，其中S用0代替的丝氨酸衍生物也落在该通式模体中。

[0319]在又一示例性的实施方案中，本发明提供其中修饰的糖基于UDP半乳糖的立体化学的缀合物。用于本发明的示例性核苷酸糖具有以下结构：

和

[0320]在另一示例性的实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立体化学。根据该实施方案的示例性物种具有下式：

和

[0321]因此，在其中糖基部分为唾液酸的说明性实施方案中，本发明方法采用具有下式的化合物：

其中L-R¹如上所述，以及L¹-R¹表示与修饰基团结合的接头。如同L，根据L¹的示例性接头物种包括键、烃基或杂烃基部分。

[0322]此外，如上所述，本发明提供用直链或支化的水溶性聚合物修饰的核苷酸糖的应用。例如，具有下面所示式的化合物可用于制备本发明范围内的缀合物：

和

其中X⁴为O或键。

[0323]一般而言，通过使用反应性基团将糖部分或糖部分-接头盒与PEG或PEG-接头盒基团连接在一起，该反应性基团通常由连接过程转化成新的有机官能团或非反应性物种。糖反应性官能团位于糖部分的任何位置上。可用于实践本发明的反应性基团和反应种类一般为生物缀合化学领域中熟知的那些。目前有利的可用于反应性糖部分的反应类型是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括但不限于亲核取代(例如醇和胺与酰基卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如Michael反应、Diels-Alder加成)。这些及其他有用的反应例如在以下文献中有论述：March，

，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，

，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等，

；Advancesin Chemistry Series，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。

[0324]悬挂于糖核或修饰基团的有用的反应性官能团包括但不限于：

(a)羧基及其各种衍生物，其包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯，烷基、烯基、炔基和芳香酯；

(b)羟基，其可以例如转化成酯、醚、醛等；

(c)卤代烃基，其中卤化物可以随后用亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子置换，从而引起卤素原子官能团处新基团的共价结合；

(d)能够参与Diels-Alder反应的亲二烯体基团，例如马来酰亚氨基；

(e)醛或酮基团，以至于可以通过形成羰基衍生物如亚胺、腙、缩氨基脲或肟、或者通过诸如Grignard加成或烷基锂加成等机理而随后衍生化；

(f)磺酰基卤基团，以便随后与胺反应例如形成磺酰胺；

(g)硫醇基，其可以例如转换成二硫化物或与酰基卤反应；

(h)胺基团或巯基，其可以是例如酰化的、烃基化的或氧化的；

(i)能够经历例如环加成、酰化、Michael加成等的烯烃；和

(j)能够例如与胺和羟基化合物反应的环氧化物。

[0325]可以选择反应性官能团以使得它们不参与或不干扰组装反应性糖核或修饰基团所必需的反应。作为选择，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团免于参与反应。本领域技术人员了解如何保护特定的官能团以使其不会干扰选定的一组反应条件。对于有用保护基团的实例，例如参见Greene等，

，John Wiley & Sons，New York，1991。

[0326]在下面的论述中，阐述了可用于实践本发明的修饰的糖的若干具体实例。在示例性的实施方案中，将唾液酸衍生物用作结合有修饰基团的糖核。对唾液酸衍生物集中论述只是为了说明的清楚性而不应当解释成限制本发明的范围。本领域技术人员会意识到可以用以唾液酸作为实例阐述的类似方法活化和衍生化各种其他糖部分。例如，许多方法可用于修饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖以列举几种糖底物，该糖底物容易通过本领域已知的方法修饰。例如参见Elhalabi等，Curr.Med.Chem.6：93(1999)和Schafe等，J.Org.Chem.65：24(2000)。

[0327]在一种示例性的实施方案中，修饰的糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。

[0328]在上述方案中，下标n表示1-2500的整数。在一种示例性的实施方案中，选择该下标以使得聚合物分子量为约10KDa、15KDa或20KDa。符号“A”表示活化基团，例如卤素、活化酯的组分(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、碳酸酯的组分(例如对硝基苯基碳酸酯)等。本领域技术人员会意识到其他PEG-酰胺核苷酸糖容易由该方法和类似方法制成。

[0329]肽通常从新合成，或者在原核细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌)或在真核细胞如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中重组表达。肽可以是全长蛋白质或片段。此外，肽可以是野生型或突变的肽。在一种示例性的实施方案中，肽包括向肽序列中加入一个或多个N-或O-连接的糖基化位点的突变。

[0330]本发明的方法还提供重组产生的不完全糖基化肽的修饰。许多重组产生的糖蛋白不完全糖基化，露出可能具有不期望的性质例如免疫原性、被RES识别的碳水化合物残基。在本发明方法中采用修饰的糖，可以使肽同时进一步糖基化和用例如水溶性聚合物、治疗剂等衍生化。修饰的糖的糖部分可以是会适当地与完全糖基化肽中的接纳体缀合的残基或具有期望性质的另一糖部分。

[0331]技术人员会意识到可以用来自任意来源的基本上任何的肽或糖肽来实践本发明。可以用来实践本发明的示例性的肽在WO03/031464以及其中所述的参考文献中得到叙述。

[0332]通过本发明方法修饰的肽可以是合成的或野生型肽，或者它们可以是通过本领域已知的方法例如定点诱变产生的突变肽。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。示例性的N-连接为修饰的糖与天冬酰胺残基的侧链结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸为碳水化合物部分酶促结合至天冬酰胺侧链上的识别序列，其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，这些三肽序列中的任一种在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指一个糖(例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)结合至羟基氨基酸的羟基侧链上，该羟基氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用不常见或非天然的氨基酸例如5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

[0333]此外，除了肽以外，可以用其他生物结构(例如含有糖基化位点的糖脂、脂质、鞘氨基醇(sphingoid)、神经酰胺、全细胞等)实践本发明的方法。

[0334]通过改变氨基酸序列以使得它含有一个或多个糖基化位点来便利地实现向肽或其他结构中加入糖基化位点。也可以通过在肽的序列中并入一个或多个提供-OH基团的物种，优选丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)来完成该添加。可以通过肽的突变或完全化学合成来完成添加。优选通过DNA水平的变化，特别是通过在预选的碱基处使编码肽的DNA突变以至于产生将翻译成期望的氨基酸的密码子，来改变肽的氨基酸序列。优选用本领域已知的方法进行DNA突变。

[0335]在一种示例性的实施方案中，通过改组(shuffling)多核苷酸加入糖基化位点。可以用DNA改组实验流程调控编码候选肽的多核苷酸。DNA改组是递归重组和突变的方法，其通过随机片段化相关基因库接着由类似于聚合酶链式反应的方法重新组装片段来进行。例如参见Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；以及美国专利Nos.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。

[0336]可以用其实践本发明的示例性的肽、加入或去除糖基化位点以及加入或去除糖基结构或亚结构的方法在WO 03/031464及相关的美国和PCT申请中得到详细描述。

[0337]本发明还利用向肽中加入(或从中去除)一个或多个选定的糖基残基，其后使修饰的糖与肽中至少一个选定的糖基残基缀合。例如，当期望使修饰的糖与不存在于肽中或未以期望的量存在的选定糖基残基缀合时，本实施方案是有用的。因此，在使修饰的糖与肽偶合之前，通过酶或化学偶合使选定的糖基残基与肽缀合。在另一实施方案中，在修饰的糖缀合之前，通过从糖肽中去除碳水化合物残基来改变糖肽的糖基化模式。例如参见WO 98/31826。

[0338]用化学或酶促方法实现糖肽上存在的任何碳水化合物部分的加入或去除。示例性的化学脱糖基化通过将多肽变体暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物下来进行。该处理导致除连接性糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外大部分或所有糖的切割，同时保留肽完整。化学脱糖基化在以下文献中有描述：Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118：131(1981)。多肽变体上的碳水化合物部分的酶促切割可以通过利用多种内切糖苷酶或外切糖苷酶来实现，如同Thotakura等，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述的那样。

[0339]在一种示例性的实施方案中，在肽上进行糖缀合或重构步骤之前用神经氨酸酶使肽基本上完全去唾液酸化。在糖缀合或重构之后，任选地用唾液酸转移酶使肽重新唾液酸化。在一种示例性的实施方案中，唾液酰基接纳体群体中的基本上每个(例如>80％，优选大于85％、大于90％，优选大于95％以及更优选大于96％、97％、98％或99％)末端糖基接纳体上发生重新唾液酸化。在优选的实施方案中，糖具有基本上均一的唾液酸化模式(即基本上均一的糖基化模式)。

[0340]糖基部分的化学加入通过任何本领域公认的方法来进行。糖部分的酶促加入优选采用本文所述方法的变型、用原始的糖基单元代替本发明中所用的修饰的糖来实现。加入糖部分的其他方法在美国专利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中得到公开。

[0341]示例性的用于选定糖基残基的结合点包括但不限于：(a)N-连接糖基化的共有位点和O-连接糖基化的位点；(b)作为糖基转移酶接纳体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基，如半胱氨酸中的那些；(f)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸中的那些；(g)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。可用于本发明的示例性方法在以下文献中有描述：1987年9月11日公布的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC 

.，第259-306页(1981)。

[0342]在一种实施方案中，本发明提供通过连接基团连接两个或更多个肽的方法。该连接基团具有任何有用的结构而且可以选自直链和支链结构。优选地，结合至肽上的接头的每个末端包含修饰的糖(即初生的完整的糖基连接基团)。

[0343]在示例性的本发明方法中，通过包含聚合物的接头部分(例如PEG接头)将两个肽连接在一起。该构造物符合上面图中所述的通式结构。如本文所述，本发明的构造物包含两个完整的糖基连接基团(即s+t＝1)。集中在包含两个糖基基团的PEG接头是为了清楚起见而且不应当解释成限制可用于本发明该实施方案中的接头臂的同一性。

[0344]因此，使PEG部分在第一末端用第一糖基单元以及在第二末端用第二糖基单元官能化。该第一和第二糖基单元优选为不同转移酶的底物，其分别容许第一和第二肽正交(orthogonal)结合至第一和第二糖基单元上。实际上，使(糖基)¹-PEG-(糖基)²接头与第一肽和第一糖基单元为其底物的第一转移酶接触，由此形成(肽)¹-(糖基)¹-PEG-(糖基)²。然后任选地从反应混合物中除去转移酶和/或未反应的肽。向(肽)¹-(糖基)¹-PEG-(糖基)²缀合物中加入第二肽和第二糖基单元为其底物的第二转移酶，形成(肽)1-(糖基)¹-PEG-(糖基)²-(肽)²；至少一个糖基残基是直接或间接地O-连接的。本领域技术人员会意识到以上概述的方法也可适用于例如通过利用支化PEG、枝状物、聚氨基酸、多糖等而形成多于两个肽之间的缀合物。

[0345]在一种示例性的实施方案中，由本发明方法修饰的肽为在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)或在转基因动物中产生并因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-连接寡糖链的糖肽。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以被PEG化、PPG化或以其它方式用修饰的唾液酸进行修饰。

[0346]在方案1中，用受保护氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯处理氨基糖苷1，将糖胺残基转化成相应的受保护氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理该加合物以形成α-羟基羧酸盐2。通过CMP-SA合成酶的作用将化合物2转化成相应的CMP衍生物，接着催化氢化该CMP衍生物以产生化合物3。将经由甘氨酸加合物的形成所引入的胺用作通过使化合物3与活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-对-硝基苯基)反应而结合PEG的位点，分别产生诸如4或5的物种。

方案1

在一种示例性的实施方案中，可以使修饰的糖结合至因子VII/因子VIIa肽上的O-聚糖结合位点上。可以用于制备该因子VII/因子VIIa肽缀合物的糖基转移酶包括：对于Ser56(-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG-，半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶；对于Ser56-Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG-，木糖基转移酶；以及对于Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-PEG-，GlcNAc转移酶。

III.A.修饰的糖与肽的缀合

[0347]使PEG修饰的糖与糖基化的或未糖基化的肽缀合，其使用适当的酶来介导该缀合。优选地，选择修饰的供体糖、酶和接纳体肽的浓度以使得进行糖基化直至将接纳体耗尽为止。下面论述的考虑因素，虽然在唾液酸转移酶的上下文中阐述，但是通常可适用于其他糖基转移酶反应。可用于本发明的优选唾液酸转移酶的列表在图3中提供。

[0348]使用糖基转移酶合成期望的寡糖结构的许多方法是已知的而且通常可适用于本发明。示例性的方法例如在以下文献中有描述：WO 96/32491、Ito等，PureAppl.Chem.65：753(1993)、美国专利Nos.5,352,670、5,374,541、5,545,553以及共同拥有的美国专利Nos.6,399,336和6,440,703，以及共同拥有已公布PCT申请WO03/031464、WO 04/033651、WO 04/099231，其通过引用并入本文。

[0349]使用单一的糖基转移酶或糖基转移酶的组合来实践本发明。例如，可以使用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在使用多于一种酶的实施方案中，优选在初始反应混合物中合并酶和底物，或者一旦第一酶促反应完成或接近完成时向反应介质中加入第二酶促反应的酶和试剂。通过在单一容器中依次进行两个酶促反应，总收率相对其中分离中间产物物种的方法得到提高。此外，减少了额外溶剂和副产物的清除及处理。

[0350]在一种优选的实施方案中，第一和第二种酶各自是糖基转移酶。在另一优选的实施方案中，一种酶为内切糖苷酶。在另外的优选实施方案中，用多于两种酶来装配本发明的修饰的糖蛋白。在向肽中加入修饰的糖之前或之后任意时刻用酶来改变肽上的糖结构。

[0351]在另一实施方案中，本方法使用一种或多种外切糖苷酶或内切糖苷酶。糖苷酶通常是经过设计以形成糖基键而非使它们断裂的突变体。该突变体聚糖酶通常包括用氨基酸残基代替活性位点酸性氨基酸残基。例如，当内切聚糖酶为endo-H时，取代的活性位点残基通常会是130位置的Asp、132位置的Glu或其组合。该氨基酸一般由丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。

[0352]突变体酶通常经由与内切聚糖酶水解步骤的逆反应相似的合成步骤来催化反应。在这些实施方案中，糖基供体分子(例如期望的寡糖或单糖结构)含有离去基团，通过将供体分子加到蛋白质的GlcNAc残基上进行反应。例如，离去基团可以是卤素例如氟化物。在另外的实施方案中，离去基团为Asn或Asn-肽部分。在其他实施方案中，糖基供体分子上的GlcNAc残基被修饰。例如该GlcNAc残基可以包含1，2噁唑啉部分。

[0353]在优选的实施方案中，用于制备本发明缀合物的每一种酶以催化量存在。具体酶的催化量根据该酶底物的浓度以及反应条件例如温度、时间和pH值而改变。在预选的底物浓度和反应条件下测定给定酶的催化量的方法为本领域技术人员所熟知。

[0354]进行上述方法的温度的范围可以从刚好在冰点以上到最敏感的酶变性的温度。优选的温度范围是约0℃-约55℃，以及更优选约20℃-约37℃。在另一示例性的实施方案中，使用嗜热酶在升高的温度下进行本发明方法的一个或多个部分。

[0355]将反应混合物保持足以使接纳体糖基化的一段时间，从而形成期望的缀合物。一些缀合物往往可以在几小时后检测到，通常在24小时或更短时间内得到可回收的量。本领域技术人员理解反应速率取决于许多变量因素(例如酶浓度、供体浓度、接纳体浓度、温度、溶剂体积)，其对选定体系进行优化。

[0356]本发明还提供修饰的肽的工业规模生产。本文使用的工业规模一般产生至少1g纯化的成品缀合物。

[0357]在下面的论述中，通过将修饰的唾液酸部分缀合至糖基化的肽上来举例说明本发明。用PEG标记示例性的修饰的唾液酸。下面的论述集中在使用PEG-修饰的唾液酸和糖基化的肽是为了说明的清楚性，而且并非意图暗示本发明限于这两种配对体的缀合物。技术人员理解该论述一般可适用于加入除唾液酸以外的修饰的糖基部分。此外，该论述同样可适用于以包含其他PEG部分、治疗部分和生物分子的除PEG以外的试剂修饰糖基单元。

[0358]可以将酶促方法用于PEG化或PPG化的碳水化合物选择性引入肽或糖肽上。该方法使用含PEG、PPG或受掩蔽的反应性官能团的修饰的糖，并与适当的糖基转移酶或糖合酶组合。通过选择将会产生期望的碳水化合物键的糖基转移酶以及使用修饰的糖作为供体底物，可以将PEG或PPG直接引入至肽主链上，引入至糖肽中现有的糖残基上或者引入至已加到肽中的糖残基上。

[0359]在一种示例性的实施方案中，唾液酸转移酶的接纳体作为天然存在的结构存在于有待修饰的肽上或者它以重组、酶促或化学方式位于其上。合适的接纳体例如包括半乳糖基接纳体如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)以及本领域技术人员已知的其他接纳体(例如参见Paulson等，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。示例性的唾液酸转移酶为本文所述的。

[0360]在一种实施方案中，唾液酸转移酶的接纳体在糖肽的体内合成后存在于有待修饰的糖肽上。可以不预先修饰糖肽的糖基化模式而使用所要求保护的方法将这些糖肽唾液酸化。作为选择，本发明的方法可以用于唾液酸化不含合适接纳体的肽；首先通过本领域技术人员已知的方法修饰该肽以含有接纳体。在一种示例性的实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用加入GalNAc残基。

[0361]在一种示例性的实施方案中，通过将半乳糖残基结合至与肽相连的适当接纳体例如GlcNAc来装配半乳糖基接纳体。该方法包括将有待修饰的肽与含适当量的半乳糖基转移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和适当的半乳糖基供体(例如UDP-半乳糖)的反应混合物孵育。使反应基本进行至完成或者作为选择在加入预选量的半乳糖残基时中止该反应。装配选定的糖接纳体的其他方法对本领域技术人员会是显而易见的。

[0362]在另一实施方案中，首先整体或部分“修剪”糖肽连接的寡糖，以暴露出唾液酸转移酶接纳体或可以加入一个或多个适当的残基以得到合适接纳体的部分。诸如糖基转移酶和内切糖苷酶等的酶(例如参见美国专利No.5,716,812)可用于结合和修剪反应。在该方法的另一实施方案中，基本上完全除去肽的唾液酸部分(例如至少90、至少95或至少99％)，暴露出修饰的唾液酸的接纳体。

[0363]在下面的论述中，通过利用具有与其结合的PEG部分的修饰的糖来举例说明本发明的方法。论述的集中是为了说明的清楚性。技术人员会意识到该论述同样与其中修饰的糖带有治疗部分、生物分子等的那些实施方案有关。

[0364]在其中加入修饰的糖之前“修剪”碳水化合物残基的本发明示例性实施方案中，将高级甘露糖剪回至第一代双天线式结构。将带有PEG部分的修饰的糖与通过“剪回”暴露出的一个或多个糖残基缀合。在一个实例中，通过与PEG部分缀合的GlcNAc部分加入PEG部分。该修饰的GlcNAc结合至双天线式结构的末端甘露糖残基之一或两者上。作为选择，未修饰的GlcNAc可以加入至该支化物种的末端之一或两者上。

[0365]在另一示例性的实施方案中，通过具有半乳糖残基的修饰的糖将PEG部分加至双天线式结构的末端甘露糖残基之一或两者上，该修饰的糖与加至末端甘露糖残基上的GlcNac残基缀合。作为选择，未修饰的Gal可以加至一个或两个末端GlcNAc残基上。

[0366]在又一实例中，PEG部分用修饰的唾液酸例如上述那些加至Gal残基上。

[0367]在另一示例性的实施方案中，将高级甘露糖结构“剪回”至双天线式结构从中分支的甘露糖。在一个实例中，通过用聚合物修饰的GlcNAc加入PEG部分。作为选择，将未修饰的GlcNAc加至甘露糖，接着加入结合了PEG部分的Gal。在另一实施方案中，将未修饰的GlcNAc和Gal残基顺序加至甘露糖，接着加入用PEG部分修饰的唾液酸部分。

[0368]也可以将高级甘露糖结构剪回至基本的三甘露糖基核心。

[0369]在另一示例性的实施方案中，将高级甘露糖“剪回”至结合有第一个甘露糖的GlcNAc。使GlcNAc与带有PEG部分的Gal残基缀合。作为选择，将未修饰的Gal加至GlcNAc，接着加入用水溶性糖修饰的唾液酸。在另一实例中，末端GlcNAc与Gal缀合，随后用带有PEG部分的修饰的岩藻糖将GlcNAc藻糖化。

[0370]还可以将高级甘露糖剪回至与肽的Asn结合的第一个GlcNAc。在一个实例中，GlcNAc-(Fuc)a残基的GlcNAc与带有水溶性聚合物的GlcNAc缀合。在另一实例中，用带有水溶性聚合物的Gal修饰GlcNAc-(Fuc)a的GlcNAc。在另一实施方案中，用Gal修饰GlcNAc，接着与用PEG部分修饰的唾液酸的Gal缀合。

[0371]另外的示例性实施方案在以下文献中被阐述：共同拥有的美国专利申请公开文本：20040132640、20040063911、20040137557；美国专利申请Nos：10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/410,945和PCT/US02/32263，其各自引用并入本文。

[0372]上述实例提供对本文所述方法的能力的说明。使用本文所述的方法，可以“剪回”和建立基本上任何期望结构的碳水化合物残基。修饰的糖可以如上所述加至碳水化合物部分的末端，或者它可以是肽核心和碳水化合物末端之间的中间物。

[0373]在一种示例性的实施方案中，用唾液酸酶从糖肽中除去存在的唾液酸，从而暴露出全部或大部分的下面的半乳糖残基。作为选择，用半乳糖残基或者末端为半乳糖单元的寡糖残基标记肽或糖肽。暴露或加入半乳糖残基之后，使用适当的唾液酸转移酶加入修饰的唾液酸。

[0374]在另一示例性的实施方案中，采用将唾液酸转移至唾液酸上的酶。可以不用唾液酸酶处理唾液酸化的聚糖以暴露出唾液酸下的聚糖残基而实施该方法。示例性的聚合物修饰的唾液酸为用聚乙二醇修饰的唾液酸。将唾液酸和修饰的唾液酸部分加至包含唾液酸残基的聚糖上或者将聚糖上现有的唾液酸残基换成这些物种的其他示例性的酶包括ST3Gal3、CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV。

[0375]在另一种方法中，受掩蔽的反应性官能度存在于唾液酸上。该受掩蔽的反应性基团优选未受用于将修饰的唾液酸结合至因子VII/因子VIIa肽的条件影响。在将修饰的唾液酸共价结合于肽之后，除去掩蔽并使肽与试剂例如PEG缀合。该试剂通过其与修饰的糖残基的未掩蔽的反应性基团的反应以特异性方式与肽缀合。

[0376]根据糖肽寡糖侧链的末端糖，任何修饰的糖可以与其适当的糖基转移酶一起使用。如上所述，引入PEG化结构所需的糖肽末端糖可以在表达过程中天然引入，或者它可以在表达后用适当的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物来制成。

[0377]在另一示例性的实施方案中，使UDP-半乳糖-PEG与β1，4-半乳糖基转移酶反应，从而将修饰的半乳糖转移至适当的末端N-乙酰葡糖胺结构上。糖肽的末端GlcNAc残基可以在表达过程中产生，如在诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌等的表达体系中可以发生的那样，也可以根据需要通过用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。

[0378]在另一示例性的实施方案中，将GlcNAc转移酶例如GNT1-5用于使PEG化的GlcNAc转移至糖肽的末端甘露糖残基上。在另一示例性的实施方案中，从糖肽中酶促去除N-和/或O-连接的聚糖结构以暴露出随后与修饰的糖缀合的氨基酸或末端糖基残基。例如，使用内切糖苷酶去除糖肽的N-连接结构以暴露出糖肽上作为GlcNAc-连接-Asn的末端GlcNAc。将UDP-Gal-PEG和适当的半乳糖基转移酶用于在暴露出的GlcNAc上引入PEG-半乳糖官能度。

[0379]在一种可供选择的实施方案中，使用已知将糖残基转移至肽主链上的糖基转移酶直接将修饰的糖加至肽主链上。可用于实践本发明的示例性的糖基转移酶包括但不限于GalNAc转移酶(GalNAcT1-14)、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶等。使用该方法容许将修饰的糖直接加到缺少任何碳水化合物的肽上或者作为选择地加到原有的糖肽上。在这两种情况下，修饰的糖的加入在由糖基转移酶的底物特异性所限定的肽主链的特定位置上发生，而且不是如同使用化学方法修饰蛋白质肽主链过程中出现的那样以随机方式发生。可以通过将适当的氨基酸序列设计到多肽链中而将一系列试剂引入缺少糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中。

[0380]在上述各个示例性的实施方案中，在修饰的糖与肽缀合后，可以采用一个或多个额外的化学或酶促修饰步骤。在示例性的实施方案中，使用酶(例如岩藻糖基转移酶)将糖基单元(例如岩藻糖)附加到与肽结合的末端修饰的糖上。在另一实例中，使用酶促反应来使修饰的糖未能缀合的位点“加帽”。作为选择，使用化学反应来改变所缀合的修饰的糖的结构。例如，使所缀合的修饰的糖与试剂反应，该试剂使修饰的糖与它所结合的肽组分之间的键稳定化或去稳定化。在另一实例中，在其与肽缀合后使修饰的糖的组分去保护。技术人员会意识到在修饰的糖与肽缀合之后的阶段中，存在可用于本发明方法的一系列酶促和化学过程。修饰的糖-肽缀合物的进一步加工在本发明的范围内。

[0381]用于制备本发明缀合物的酶和反应条件在本申请的母体(parent)以及共有的已公布PCT专利申请WO 03/031464、WO04/033651、WO 04/099231中得到详细论述。

[0382]在选定的实施方案中，重构在昆虫细胞中表达的因子VII/因子VIIa肽以使得经过重构的糖肽上的聚糖包含GlcNAc-Gal糖基残基。GlcNAc和Gal的加入可以作为分开的反应或者在单一容器中作为单一反应进行。在该实例中，使用GlcNAc-转移酶I和Gal-转移酶I。用ST3Gal-III加入修饰的唾液酰基部分。

[0383]在另一实施方案中，GlcNAc、Gal和修饰的Sia的加入也可以在单一反应容器中用上述酶进行。酶促重构和糖基聚乙二醇化步骤各自单独地进行。

[0384]当在哺乳动物细胞中表达肽时，可用不同的方法。在一种实施方案中，通过使肽与唾液酸转移酶接触，该唾液酸转移酶将修饰的唾液酸直接转移至肽的唾液酸上形成Sia-Sia-L-R¹，或者将肽上的唾液酸换成修饰的唾液酸形成Sia-L-R¹，在缀合之前无需重构而使肽缀合。可用于该方法的示例性的酶为CST-II。将唾液酸加至唾液酸上的其他酶为本领域技术人员已知而且这些酶的实例在附图中得到阐述。

[0385]在制备本发明缀合物的又一方法中，在哺乳动物体系中表达的肽用唾液酸酶去唾液酸化。用对O-连接的聚糖特异性的唾液酸转移酶以修饰的唾液酸使露出的Gal残基唾液酸化，提供具有O-连接修饰聚糖的因子VII/因子VIIa肽。经过去唾液酸化的修饰的因子VII/因子VIIa肽任选地通过使用唾液酸转移酶例如ST3GalIII部分或完全地重新唾液酸化。

[0386]在另一方面中，本发明提供制备本发明的PEG化因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法。该方法包括：(a)使包含选自以下的糖基基团的因子VII/因子VIIa肽：

和

与具有选自以下的式的PEG-唾液酸供体

和

以及将PEG-唾液酸从所述供体转移至选自所述糖基基团的GalNAc、Gal和Sia中的成员上的酶，在适合于所述转移的条件下接触。示例性的修饰的唾液酸供体为通过接头部分用聚合物例如直链或支化的聚乙二醇部分修饰的CMP-唾液酸。如本文所述，肽在结合修饰的糖之前任选地用GalNAc和/或Gal和/或Sia糖基化(“重构”)。重构步骤可以在同一容器中依次进行而在步骤间没有糖基化肽的纯化。作为选择，在一个或多个重构步骤之后，可以在使糖基化的肽进行下一个糖基化或糖基聚乙二醇化步骤之前将它纯化。在一种示例性的实施方案中，该方法进一步包括在宿主中表达肽。在一种示例性的实施方案中，该宿主为哺乳动物细胞或昆虫细胞。在另一示例性的实施方案中，该哺乳动物细胞选自BHK细胞和CHO细胞以及该昆虫细胞为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

[0387]如同在实施例中举例说明以及下面进一步论述的那样，PEG-糖的接纳体部分的布置以任意期望数目的步骤来完成。例如，在一种实施方案中，在GalNAc加至肽上以后，可以在同一反应容器中进行使PEG-糖与GalNAc缀合的第二步。作为选择，这两个步骤可以在单一容器中近似同时地进行。

[0388]在一种示例性的实施方案中，PEG-唾液酸供体具有下式：

[0389]在另一示例性实施方案中，PEG-唾液酸供体具有下式：

[0390]在另一示例性实施方案中，因子VII/因子VIIa肽在进行糖基聚乙二醇化或重构之前在适当的表达体系中表达。示例性的表达体系包括Sf-9/杆状病毒和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

[0391]在一种示例性的实施方案中，本发明提供制备包含糖基接头的因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法，该接头包含具有下式的修饰的唾液酰基残基：

其中D选自-OH和R¹-L-HN-；G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基-R¹；R¹是包含选自直链聚乙二醇残基和支化聚乙二醇残基中的成员的部分；M选自H、金属和单个负电荷；L是选自键、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基的接头，以至于当D为OH时，G为R¹-L-，以及当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-

所述方法包括：(a)使包含糖基部分的因子VII/因子VIIa肽：

与具有下式的PEG-唾液酸供体：

和将所述PEG-唾液酸转移至所述糖基部分的Gal上的酶，在适合于所述转移的条件下接触。

[0392]在一种示例性的实施方案中，L-R¹具有下式：

其中a为选自0-20的整数。

[0393]在另一示例性的实施方案中，R¹具有选自以下的式的结构：

和

其中e、f、m和n为独立地选自1-2500的整数；以及q为选自0-20的整数。

[0394]可以通过本文所述的方法制备大规模或小规模量的因子VII/因子VIIa肽缀合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.5mg-约100kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.1kg-约1kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.5kg-约10kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.5kg-约3kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.1kg-约5kg。在一种示例性的实施方案中因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.08kg-约0.2kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.05kg-约0.4kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.1kg-约0.7kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约0.3kg-约1.75kg。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量选自约25kg-约65kg。

[0395]用于本文所述反应中的因子VII/因子VIIa肽的浓度选自约0.5-约10mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约0.5-约1mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约0.8-约3mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约2-约6mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约4-约9mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约1.2-约7.8mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽浓度选自约6-约9.5mg因子VII/因子VIIa肽/mL反应混合物。

[0396]可以用于本文所述反应中的CMP-SA-PEG的浓度选自约0.1-约1.0mM。可以提高或降低该浓度的因素包括PEG的尺寸、孵育时间、温度、缓冲组分以及所用糖基转移酶的种类和浓度。一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.1-约1.0mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.1-约0.5mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.1-约0.3mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.2-约0.7mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.3-约0.5mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.4-约1.0mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.5-约0.7mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.8-约0.95mM。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG浓度选自约0.55-约1.0mM。

[0397]可以用于本文所述反应中的CMP-SA-PEG的摩尔当量基于可以加至因子VII/因子VIIa蛋白上的SA-PEGs的理论数量。当与CMP-SA-PEG的MW和由此其摩尔数比较时，该SA-PEGs的理论数量基于因子VII/因子VIIa蛋白上的唾液酸化位点的理论数量以及因子VII/因子VIIa蛋白的MW。对于因子VII/因子VIIa，以仅有两个聚糖位点的主要是二-和三-天线式的N-聚糖计，其为约4或5个PEGs。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自1-20的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自1-20的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自2-6的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自3-17的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自4-11的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自5-20的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自1-10的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自12-20的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自14-17的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自7-15的整数。在一种示例性的实施方案中，CMP-SA-PEG的摩尔当量为选自8-16的整数。

III.B.因子VII/因子VIIa的同时去唾液酸化和糖基聚乙二 醇化

[0398]本发明提供将因子VII/因子VIIa糖基聚乙二醇化的“一锅”式方法。该一锅法与制备因子VII/因子VIIa肽缀合物的其他示例性方法不同，它们采取用唾液酸酶顺序去唾液酸化，随后在阴离子交换柱上纯化去唾液酸因子VII/因子VIIa，接着用CMP-唾液酸-PEG和糖基转移酶(例如ST3Gal3)、外切糖苷酶或内切糖苷酶糖基聚乙二醇化。该因子VII/因子VIIa肽缀合物然后通过阴离子交换接着以尺寸排阻色谱法进行纯化以制备纯化过的因子VII/因子VIIa肽缀合物。

[0399]该一锅法是制造因子VII/因子VIIa肽缀合物的改进方法。在该方法中，将去唾液酸化和糖基聚乙二醇化反应合并在一锅反应中，其避免在前面所述的方法中用于纯化去唾液酸因子VII/因子VIIa肽的第一阴离子交换色谱法步骤。这种工艺步骤的减少产生了若干优点。首先，减少了制备因子VII/因子VIIa肽缀合物所需的工艺步骤数目，这也降低了工艺的操作复杂性。其次，减少用于制备肽缀合物的工艺时间，例如从4天减少到2天。这使与工序间控制相关的原料要求和质量控制成本降低。第三，本发明使用较少的唾液酸酶，例如相对于该过程需要直至少20倍的唾液酸酶，例如500mU/L来制备因子VII/因子VIIa肽缀合物。这种唾液酸酶用量上的减少使反应混合物中的污染物如唾液酸酶的量显著减少。

[0400]在一种示例性的实施方案中，由以下方法制备因子VII/因子VIIa肽缀合物。在第一步中，将因子VII/因子VIIa肽与唾液酸酶、本发明的修饰的糖以及能够催化糖基连接基团从修饰的糖转移至肽的酶合并，从而制备因子VII/因子VIIa肽缀合物。任何唾液酸酶可以用于该方法中。可用于本发明的示例性的唾液酸酶可以在CAZY数据库中找到(参见http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html和www.cazy.org/CAZY)。示例性的唾液酸酶可以从许多来源(QA-Bio、Calbiochem、Marukin、Prozyme等)购买到。在一种示例性的实施方案中，唾液酸酶选自细胞质唾液酸酶、溶酶体唾液酸酶、外切-α唾液酸酶和内切唾液酸酶。在另一示例性的实施方案中，所用唾液酸酶由细菌例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)或者由病毒例如腺病毒制成。在一种示例性的实施方案中，能够催化糖基连接基团从修饰的糖转移至肽的酶选自糖基转移酶，例如唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶，以及外切糖苷酶和内切糖苷酶。在一种示例性的实施方案中，该酶为糖基转移酶，它是ST3Gal3。在另一示例性的实施方案中，所用的酶由细菌例如大肠杆菌或真菌例如黑曲霉(Aspergillus niger)制成。在另一示例性的实施方案中，将唾液酸酶在糖基转移酶之前加入到因子VII/因子VIIa肽中持续一段规定时间，使唾液酸酶反应进行，然后在加入PEG-唾液酸试剂和糖基转移酶下开始糖基聚乙二醇化反应。许多的这些实例在本文中得到论述。最后，本文所述的任何修饰的糖可以用于该反应。

[0401]在另一示例性的实施方案中，该方法进一步包括“加帽”步骤。在该步骤中，向反应混合物中加入另外的未PEG化的唾液酸。在一种示例性的实施方案中，将该唾液酸加至因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上，从而阻止PEG-唾液酸的进一步加成。在另一示例性的实施方案中，该唾液酸阻止反应混合物中糖基转移酶的功能，有效中止糖基连接基团加至因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上。最重要地，加入到反应混合物中的唾液酸使未糖基聚乙二醇化的聚糖加帽，由此提供具有改善的药物动力学的因子VII/因子VIIa肽缀合物。另外，当期望PEG化的程度至一定量时可以不经在先纯化将该唾液酸酶直接加入到糖基聚乙二醇化反应混合物中。

[0402]在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约50％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约40％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约30％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约20％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约10％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上约20％-约5％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上少于约25％-约10％的唾液酸化位点不含唾液酰部分。在一种示例性的实施方案中，加帽步骤之后，因子VII/因子VIIa肽或肽缀合物上基本上所有的唾液酸化位点包含唾液酰部分。

III.C.因子VII/因子VIIa肽的去唾液酸化和选择性修饰

[0403]在另一示例性的实施方案中，本发明提供使因子VII/因子VIIa肽去唾液酸化的方法。该方法优选提供至少约40％、优选45％、优选约50％、优选约55％、优选约60％、优选约65％、优选约70％、优选约75％、优选约80％、优选至少85％、更优选至少90％、再更优选至少92％、优选至少94％、甚至更优选至少96％、再更优选至少98％以及再更优选100％去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽。

[0404]该方法包括使因子VII/因子VIIa肽与唾液酸酶接触，优选接触一段时间。该预先选定的时间期间足以使因子VII/因子VIIa肽去唾液酸化至期望的程度。在优选的实施方案中，当达到期望的去唾液酸化程度时，将去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽与唾液酸酶分离。示例性的去唾液酸化反应和纯化循环描述于本文中。

[0405]技术人员能够确定进行去唾液酸化反应的适当的预选时间期间。在一种示例性的实施方案中，该期间少于24小时，优选少于8小时，更优选少于6小时，更优选少于4小时，再更优选少于2小时以及甚至更优选少于1小时。

[0406]在另一示例性的实施方案中，在去唾液酸化反应结束时在因子VII/因子VIIa制备物中，因子VII/因子VIIa肽群体中至少10％的成员仅有一个与其结合的唾液酸，优选至少20％、更优选至少30％、再更优选至少40％、甚至更优选至少50％和更优选至少60％、以及再更优选全部去唾液酸化。

[0407]在又一示例性的实施方案中，在去唾液酸化反应结束时在因子VII/因子VIIa制备物中，因子VII/因子VIIa肽群体中至少10％的成员彻底去唾液酸化，优选至少20％、更优选至少30％、甚至更优选至少40％、再更优选至少50％和甚至再更优选至少60％彻底去唾液酸化。

[0408]在另一示例性的实施方案中，在去唾液酸化反应结束时在因子VII/因子VIIa制备物中，因子VII/因子VIIa肽群体中至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的成员仅有一个唾液酸，以及至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的因子VII/因子VIIa肽彻底去唾液酸化。

[0409]在一种优选的实施方案中，在去唾液酸化反应结束时在因子VII/因子VIIa制备物中，因子VII/因子VIIa肽群体中至少50％彻底去唾液酸化以及因子VII/因子VIIa肽群体中至少40％的成员仅带有一个唾液酸部分。

[0410]在去唾液酸化之后，因子VII/因子VIIa肽任选地与修饰的糖缀合。示例性的修饰的糖包含与支化或线性聚乙二醇部分结合的糖基部分。由将修饰的糖从修饰的糖供体转移至因子VII/因子VIIa肽的氨基酸或糖基残基上的酶来催化该缀合。示例性的修饰的糖供体为带有支化或线性聚乙二醇部分的CMP-唾液酸。示例性的聚乙二醇部分的分子量为至少约2KDa，更优选至少约5KDa，更优选至少约10KDa，优选至少约20KDa，更优选至少约30KDa以及更优选至少约40KDa。

[0411]在一种示例性的实施方案中，用于从修饰的糖供体中转移修饰的糖部分的酶为糖基转移酶，例如唾液酸转移酶。可用于本发明方法的示例性的唾液酸转移酶为ST3Gal3。

[0412]示例性的本发明方法产生带有至少一个、优选至少两个、优选至少三个修饰基团的修饰的因子VII/因子VIIa肽。在一种实施方案中，制成的因子VII/因子VIIa肽在该因子VII/因子VIIa肽的轻链上带有一个修饰基团。在另一实施方案中，该方法提供在重链上带有一个修饰基团的修饰的因子VII/因子VIIa肽。在又一实施方案中，该方法提供在轻链上具有一个修饰基团而且在重链上具有一个修饰基团的修饰的因子VII/因子VIIa肽。

[0413]在另一方面中，本发明提供制备修饰的因子VII/因子VIIa肽的方法。该方法包括使因子VII/因子VIIa肽与带有修饰基团的修饰的糖供体和能够将修饰的糖部分从修饰的糖供体转移至肽的氨基酸或糖基残基上的酶接触。

[0414]在一种示例性的实施方案中，该方法提供修饰的因子VII/因子VIIa肽群体，其中至少40％、优选至少50％、优选至少60％、更优选至少70％和甚至更优选至少80％的群体成员为在该因子VII/因子VIIa肽的轻链上单缀合的。

[0415]在一种示例性的实施方案中，该方法提供修饰的因子VII/因子VIIa肽群体，其中至少40％、优选至少50％、优选至少60％、更优选至少70％和甚至更优选至少80％的群体成员为在该因子VII/因子VIIa肽的轻链上二缀合的。

[0416]在该方面的一种示例性实施方案中，该方法提供修饰的因子VII/因子VIIa肽群体，其中不大于50％、优选不大于30％、优选不大于20％、更优选不大于10％的群体成员为在该因子VII/因子VIIa肽的重链上单缀合的。

[0417]在该方面的一种示例性实施方案中，该方法提供修饰的因子VII/因子VIIa肽群体，其中不大于50％、优选不大于30％、优选不大于20％、更优选不大于10％的群体成员为在该因子VII/因子VIIa肽的重链上二缀合的。

[0418]可以使因子VII/因子VIIa肽在该接触步骤之前受到唾液酸酶的作用，或者该肽可以不经在先去唾液酸化而使用。当肽与唾液酸酶接触时，可以使它基本上全部去唾液酸化或者仅部分去唾液酸化。在优选的实施方案中，在接触步骤之前使因子VII/因子VIIa肽至少部分地去唾液酸化。因子VII/因子VIIa肽可以是基本上彻底去唾液酸化的(基本上脱唾液酸的)或只是部分去唾液酸化。在优选的实施方案中，去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽是上文所述的去唾液酸化的实施方案之一。

III.D.因子VII/因子VIIa肽缀合物合成中加入的额外等分 试样的试剂

[0419]在本文所述肽缀合物合成的一种示例性实施方案中，在选定的时间期间后向反应混合物中加入一种或多种额外等分试样的反应组分/试剂。在一种示例性的实施方案中，该肽缀合物为因子VII/因子VIIa肽缀合物。在另一示例性的实施方案中，加入的反应组分/试剂为修饰的糖核苷酸。向反应中引入修饰的糖核苷酸会提高促使糖基聚乙二醇化反应完全的可能性。在一种示例性的实施方案中，该核苷酸糖为本文所述的CMP-SA-PEG。在一种示例性的实施方案中，加入的反应组分/试剂为唾液酸酶。在一种示例性的实施方案中，加入的反应组分/试剂为糖基转移酶。在一种示例性的实施方案中，加入的反应组分/试剂为镁。在一种示例性的实施方案中，加入的额外等分试样占反应开始时加入的原始量的约10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％或90％。在一种示例性的实施方案中，在反应开始后约3小时、或6小时、或8小时、或10小时、或12小时、或18小时、或24小时、或30小时或36小时向其中加入该反应组分/试剂。

III.E.轻链PEG化的因子VII/因子VIIa肽缀合物的选择性制 备

[0420]在一种示例性的实施方案中，本发明提供增加制备在轻链上修饰的因子VIIa肽缀合物的方法，相对于在重链上修饰的缀合物。该方法包括重链的钝化或螯合，从而使糖基聚乙二醇化优先在轻链上发生。因子VIIa重链的丝氨酸蛋白酶活性可以用作该螯合的基础。向糖基聚乙二醇化反应混合物中加入苄脒基质和/或丝氨酸蛋白酶的假亲和性(pseudoaffinity)树脂引起重链的螯合，而糖基聚乙二醇化在轻链上进行。然后可以由本领域已知的标准技术从重链中纯化出轻链。可以通过加入苄脒从基质中除去重链，或者通过降低溶液的pH从树脂中除去重链。在该步骤中引入的苄脒杂质可以通过渗滤除去。

III.E.因子VII/因子VIIa肽缀合物的纯化

[0421]通过上述方法产生的产物可以不经纯化而使用。然而，通常优选回收产物以及一种或多种中间产物，例如核苷酸糖、支化和线性的PEG物种、修饰的糖和修饰的核苷酸糖。可以使用回收糖基化肽的熟知的标准技术，例如薄层或厚层色谱法、柱色谱法、离子交换色谱法或膜过滤。如下文中以及本文引用文献中论述的那样，优选使用膜过滤，更优选采用反渗透膜，或一种或多种柱色谱法技术进行回收。例如，可以将其中膜的截留分子量为约3000-约10,000的膜过滤用于除去蛋白质例如糖基转移酶。在某些情形下，为了确保产物纯化将会利用杂质和产物之间的截留分子量差异。例如，为了从未反应的CMP-SA-PEG-40KDa中纯化产物因子VIIa-SA-PEG-40KDa，必须选择例如会使因子VIIa-SA-PEG-40KDa留在保留物中而使CMP-SA-PEG-40KDa流入滤液中的过滤器。然后可以用纳滤或反渗透来除去盐和/或纯化产物糖(例如参见WO 98/15581)。纳滤膜是一类反渗透膜，它使一价盐通过但是保留多价盐和大于约100-约2,000道尔顿的未带电荷的溶质，其取决于所用的膜。因此，在通常的应用中，由本发明方法制备的糖会保留在膜上而污染的盐会通过。

[0422]如果在细胞内制备肽，作为第一步，除去微粒碎屑(宿主细胞或裂解片段)。在糖基聚乙二醇化之后，通过本领域已知的方法，例如通过离心或超滤纯化该PEG化的肽；任选地，可以用市售的蛋白浓缩过滤器浓缩蛋白质，接着通过选自以下的一个或多个步骤将其他杂质与多肽变体分离：免疫亲和色谱法，离子交换柱分级分离(例如在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺基丙基的基质上)，在Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、lentillectin-Sepharose、WGA-Sepharose、Con A-Sepharose、EtherToyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl或A蛋白Sepharose上的色谱法，SDS-PAGE色谱法，硅石色谱法，层析聚焦，反相HPLC(例如具有附属脂族基团的硅胶)，例如使用Sephadex分子筛的凝胶过滤或尺寸排阻色谱法，与多肽选择性结合的柱色谱法以及乙醇或硫酸铵沉淀法。可以将纯化用于使因子VII/因子VIIa肽缀合物的一种链与另一种链分离，如同本节后面进一步描述的那样。

[0423]在培养物中产生的修饰糖肽通常经由最初从细胞、酶等中提取，接着进行一次或多次浓缩、盐析、含水离子交换或尺寸排阻色谱法步骤来分离。另外，可以通过亲和色谱法纯化修饰的糖蛋白。最后，可以将HPLC用于最后的纯化步骤。

[0424]可以在任何前述步骤中包括蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，以及可以包括抗生素或防腐剂以阻止外来污染物的生长。用于前述步骤中的蛋白酶抑制剂可以是低分子量抑制剂，其包括抗蛋白酶、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶、亮抑蛋白酶肽、氨肽酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、banzamidin以及其他丝氨酸蛋白酶抑制剂(即丝氨酸蛋白酶抑制剂类)。通常，丝氨酸蛋白酶抑制剂应当以0.5-100μM的浓度使用，尽管细胞培养物中的胰凝乳蛋白酶抑制剂可以在超过200μM的浓度下使用。其他丝氨酸蛋白酶抑制剂将包括对类胰凝乳蛋白酶、类枯草杆菌蛋白酶、α/β水解酶或丝氨酸蛋白酶的信号肽酶异种集团特异的抑制剂。除丝氨酸蛋白酶以外，也可以使用其他种类的蛋白酶抑制剂，包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂(1-10μM)和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(1-5μM)，以及非特异性的蛋白酶抑制剂例如胃酶抑制剂(0.1-5μM)。用于本发明的蛋白酶抑制剂还可以包括天然的蛋白酶抑制剂，例如从水蛭中分离出的hirustasin抑制剂。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂会包含合成的肽或抗体，其能够特异性与蛋白酶催化位点结合以稳定因子VII/因子VIIa而不干扰糖基聚乙二醇化反应。

[0425]在另一实施方案中，首先用市售的蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备浓缩来自制备本发明修饰糖肽的体系的上清液。在该浓缩步骤之后，可以将浓缩物应用于合适的纯化基质。例如，合适的亲和基质可以含有与合适的载体结合的肽的配体、凝集素或抗体分子。作为选择，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬挂DEAE基团的基质或底物。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白质纯化中普遍使用的其他类型。作为选择，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含有磺基丙基或羧甲基的各种不溶性基质。特别优选磺基丙基。

[0426]用于纯化的其他方法包括尺寸排阻色谱法(SEC)、羟基磷灰石色谱法、疏水作用色谱法和Blue Sepharose色谱法。这些和其他有用的方法在共同转让的美国临时专利(律师案卷号No.40853-01-5168-P1，2005年5月6日提交)中得到说明。

[0427]可以采取一个或多个用疏水RP-HPLC介质例如具有悬挂甲基或其他脂族基团的硅胶的RP-HPLC步骤以进一步纯化多肽缀合物组合物。也可以将各种组合的一些或全部的上述纯化步骤用于提供同质的或基本上同质的修饰的糖蛋白。

[0428]由大规模发酵产生的本发明的修饰糖肽可以通过与Urdal等，J.Chromatog.296：171(1984)所公开那些类似的方法来纯化。该参考文献描述了用于在制备型HPLC柱上纯化重组人IL-2的两个连续的RP-HPLC步骤。作为选择，可以将诸如亲和色谱法等技术用于纯化该修饰的糖蛋白。

[0429]在一种示例性的实施方案中，通过在共同拥有的、共同转让的2005年3月24日提交的美国临时专利No.60/665,588中所述的方法来完成纯化。

[0430]根据本发明，通过顺序的去-唾液酸化或同时的唾液酸化所制成的聚乙二醇化的肽，例如因子VII、因子VIIa肽或肽缀合物可以通过使用氯化镁梯度来纯化或解析。

[0431]在一种示例性的实施方案中，可以将因子VII/因子VIIa肽缀合物分离成轻链和重链，而且可以将一种链从另一种链中纯化出来。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少80％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的轻链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少90％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的轻链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少95％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的轻链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中基本上全部的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的轻链部分的产物。对于本发明的任意化合物而言该产物是可能的。

[0432]在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少80％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的重链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少90％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的重链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中至少95％的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的重链部分的产物。在另一示例性的实施方案中，获得其中产物中基本上全部的因子VII/因子VIIa肽缀合物为该因子VII/因子VIIa肽缀合物的重链部分的产物。对于本发明的任意化合物而言该产物是可能的。

III.F.因子VII/因子VIIa缀合物的性质

[0433]在一种示例性的实施方案中，本发明的因子VII/因子VIIa肽缀合物具有与天然因子VII/因子VIIa肽基本上相同的生物化学性质(例如凝血)。在一种示例性的实施方案中，根据PEG化的位点、加入的PEG的尺寸和加入的PEGs的数量，本发明的因子VII/因子VIIa肽缀合物相对于天然因子VII/因子VIIa肽具有降低的或提高的生物化学性质(例如凝血)。

[0434]因子VII/因子VIIa肽缀合物参与血液凝结过程。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽缀合物保留约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％的天然因子VII/因子VIIa的凝血活性。

[0435]因子VII/因子VIIa肽缀合物具有酰胺分解活性(amidolytic activity)。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽缀合物保留约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％的天然因子VII/因子VIIa的酰胺分解活性。

[0436]因子VII/因子VIIa肽缀合物能够使因子X转变为因子Xa。在一种示例性的实施方案中，因子VII/因子VIIa肽缀合物保留约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％的天然因子VII/因子VIIa的因子X转变活性。

IV.药物组合物

[0437]在另一方面中，本发明提供药物组合物。该药物组合物包含可药用稀释剂以及非天然存在的PEG部分、治疗部分或生物分子与糖基化的或未糖基化的肽之间的共价缀合物。聚合物、治疗部分或生物分子通过完整的糖基连接基团与肽缀合，该连接基团介于肽和聚合物、治疗部分或生物分子之间并与二者共价连接。

[0438]本发明的药物组合物适合用于多种药物递送系统。可用于本发明的合适制剂参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第十七版，(1985)。药物递送方法的简短综述参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。

[0439]在一种示例性的实施方案中，药物制剂包含因子VII/因子VIIa肽缀合物和选自氯化钠、氯化钙二水合物、甘氨酰甘氨酸、聚山梨酯80和甘露糖醇的可药用稀释剂。在另一示例性的实施方案中，可药用稀释剂为氯化钠和甘氨酰甘氨酸。在另一示例性的实施方案中，可药用稀释剂为氯化钙二水合物和聚山梨酯80。在另一示例性的实施方案中，可药用稀释剂为甘露糖醇。

[0440]可以配制药物组合物用于任何适当的给药方式，所述方式例如包括局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于肠胃外给药例如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服给药，可以采用任何上述载体或固体载体例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以用可生物降解微球(例如聚乳酸、聚乙醇酸)作为本发明药物组合物的载体。合适的可生物降解微球例如在美国专利Nos.4,897,268和5,075,109中被公开。

[0441]通常，药物组合物经肠胃外例如静脉内给药。因此，本发明提供用于肠胃外给药的组合物，其含有溶解或悬浮于可接受载体、优选水性载体如水、缓冲水、盐水、PBS等的化合物。组合物可以含有接近生理条件所需的可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调整剂、湿润剂、去污剂等。

[0442]这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌或可以进行过滤灭菌。得到的水溶液可以原样包装待用或冻干，使冻干制剂在给药前与无菌水性载体合并。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9和最优选7-8。

[0443]在一些实施方案中，本发明的糖肽可以混入由标准小泡形成性(vesicle-forming)脂质所形成的脂质体中。多种方法可用于制备脂质体，如同在例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)、美国专利Nos.4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述那样。使用多种靶向剂(例如本发明的唾液酰半乳糖苷)靶向脂质体为本领域所熟知(例如参见美国专利Nos.4,957,773和4,603,044)。

[0444]可以使用将靶向剂与脂质体偶合的标准方法。这些方法一般包括将脂质组分混入脂质体中，该组分例如是可以进行活化以便与靶向剂结合的磷脂酰乙醇胺，或者衍生化的亲脂化合物例如本发明的脂质衍生化的糖肽。

[0445]靶向机制一般要求以一定的方式将靶向剂置于脂质体的表面，该方式使得靶向部分可用于与靶标例如细胞表面受体相互作用。可以使用本领域技术人员已知的方法(例如分别用长链烷基卤或脂肪酸烷基化或酰化碳水化合物上存在的羟基)在形成脂质体之前将本发明的碳水化合物与脂质分子结合。作为选择，可以一定的方式构造脂质体，该方式使得在形成膜时首先将连接体部分引入膜中。该连接体部分必须具有牢固嵌入并锚定在膜中的亲脂部分。它还必须具有在脂质体的水性表面上可化学利用的反应性部分。选择该反应性部分以使得它会在化学上适合与随后加入的靶向剂或碳水化合物形成稳定的化学键。在一些情况下，可以将靶向剂直接与连接体分子结合，但在大多数情况下更适合使用第三方分子来充当化学桥，从而连接膜中的连接体分子和三维扩张到小泡表面外的靶向剂或碳水化合物。

[0446]通过本发明方法制备的化合物还可以用作诊断剂。例如，可以将标记过的化合物用于在怀疑具有炎症的患者中定位炎症或肿瘤转移的区域。对于该用途，化合物可以使用¹²⁵I、¹⁴C或氚进行标记。

[0447]本发明药物组合物中所用的活性成分为具有刺激血液凝结产生的生物特性的因子VII/因子VIIa肽缀合物。优选地，该因子VII/因子VIIa肽缀合物经肠胃外施用(例如IV、IM、SC或IP)。有效剂量预期根据被治疗的病症和给药途径而显著变化，但是预期活性物质为约0.1(～7U)-100(～7000U)μg/kg体重。治疗贫血病症的优选剂量为每周三次约50-约300单位/kg。由于本发明提供具有增强的体内停留时间的包含因子VII/因子VIIa肽的物质的组合物，因此在施用本发明的组合物时，任选地降低所述剂量。

[0448]可用于制备本发明组合物的物种的制备方法通常在各种专利出版物中得到阐述，例如US 20040137557、WO 04/083258和WO04/033651。提供下列实施例来举例说明本发明的缀合物和方法，但是不限制要求保护的本发明。

实施例

实施例1

因子VIIa的去唾液酸化

[0449]在不含血清的介质中表达的因子VIIa，在含血清的介质中产生的因子VIIa加上三种因子VIIa突变体N145Q、N322Q和类似物DVQ(V158D/E296V/M298Q)。

[0450]为准备酶促去唾液酸化，用10KDa的MWCO在Snakeskin渗析管中在4℃下过夜渗析至MES中，150mM NaCl，5mM CaCl₂，50mMMES，pH6。用10U/L来自产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的可溶性唾液酸酶(Calbiochem)在32℃下在交换缓冲液中进行因子VIIa(1mg/mL)的去唾液酸化18小时。

实施例2

因子VIIa的唾液酰-PEG化

[0451]在32℃下在去唾液酸化缓冲液中用100 U/L ST3Ga1-III和200μMCMP-唾液酸-PEG(40KDa、20KDa、10KDa、5KDa和2KDa)对去唾液酸-因子VIIa(1mg/mL)进行唾液酰-PEG化(“糖基聚乙二醇化”)2-6小时。在适当的反应时间届满后，立即纯化该PEG化的试样以使进一步糖基聚乙二醇化减到最少。

[0452]为了用加帽有唾液酸的试样使糖基聚乙二醇化的因子VII/因子VIIa加帽，首先通过如下面说明的阴离子交换色谱法从去唾液酸-因子VIIa中除去唾液酸酶。加入过量的CMP-唾液酸(5mM)并在32℃下孵育2小时，用唾液酸使糖基聚乙二醇化的因子VIIa加帽。由非还原SDS-PAGE(三甘氨酸凝胶和/或NuPAGE凝胶)和ColloidalBlue Staining试剂盒分析因子VIIa的唾液酰-PEG化形式，如Invitrogen所述那样。

实施例3

PEG化因子VIIa的纯化

[0453]用改进的阴离子交换方法纯化因子VIIa的糖基聚乙二醇化试样。试样在5℃下进行处理。刚好在装柱之前，向重建的样品中每10mL因子VIIa溶液加入1g Chelex 100(BioRad)。在搅拌10分钟后，用真空体系在乙酸纤维素膜(0.2μm)上过滤该悬浮液。将过滤器上保留下的螯合剂树脂每10mL体积用1-2mL水洗涤一次。将滤液的电导率调节至5℃下10mS/cm，需要的话调节至pH8.6。

[0454]阴离子交换在8-10℃下进行。在装载之前通过用1M NaOH(10柱容积)，水(5柱容积)，2M NaCl、50mM HOAc、pH 3(10柱容积)洗涤，并用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(10柱容积)平衡，制成含Q Sepharose FF的柱。对于各个PEG化反应，将15-20mg因子VIIa以100cm/h的流速装载至具有10mL QSepharose FF(每mL树脂不大于2mg蛋白质)的XK16柱(AmershamBiosciences)上。对于2KDa线性PEG，将20mg因子VIIa以100cm/h的流速装载至具有40mL Q Sepharose FF(每mg树脂0.5mg蛋白质)的XK26柱(Amersham Biosciences)上。

[0455]装载之后，用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(10柱容积)和50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(2柱体积)洗涤该柱。通过使用50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl₂、pH 8.6(5柱体积)以15mM CaCl₂的步梯度进行洗脱。然后用1M NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH8.6(5柱体积)洗涤该柱。由280nm下的吸光度监控流出物。在流动通过和两次洗涤期间收集级分(5mL)；在CaCl₂和1M盐洗脱期间收集2.5mL级分。由非还原SDS-PAGE(三甘氨酸凝胶和/或NUPAGE凝胶)和Colloidal Blue Staining试剂盒分析含因子VIIa的级分。将适合的具有因子VIIa的级分集中，用4MHCl调节pH至7.2。

[0456]除了以下改变外，如上所述纯化因子VIIa-SA-PEG-10KDa。向PEG化的因子VIIa溶液中加入EDTA(10mM)，调节pH至pH 6，以及调节电导率至5℃下5mS/cm。将约20mg因子VIIa-SA-PEG-10KDa以100cm/h的流速装载至具有10mL Poros 50 Micron HQ树脂(每mL树脂不大于2mg蛋白质)的XK16柱(Amersham Biosciences)上。装载之后，用175mM NaCl、10mM组氨酸、pH6(10柱容积)和50mMNaCl、10mM组氨酸、pH6(2柱体积)洗涤该柱。在50mM NaCl、10mM组氨酸、pH6(5柱体积)中以20mM CaCl₂的步梯度进行洗脱。然后用1M NaCl、10mM组氨酸、pH6(5柱体积)洗涤该柱。

[0457]通过根据制造商的说明使用Amicon Ultra-15 10K离心过滤装置(Millipore)将含有因子VIIa-SA-PEG-10KDa(25mL)的阴离子交换洗脱液浓缩至5-7mL。在浓缩之后，进行尺寸排阻色谱法。将试样(5-7mL)装载至对于大多数PEG化的变体在50mMNaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl₂、pH 7.2中平衡的含Superdex 200(HiLoad16/60，制备级；Amersham Biosciences)的柱上。在1mL/min的流速下使未修饰的去唾液酸-因子VIIa与因子VIIa-SA-PEG-10KDa分离，并且在280nm下监控吸光度。收集含因子VIIa的级分(1mL)并通过非还原SDS-PAGE(三甘氨酸凝胶和/或NuPAGE凝胶)和ColloidalBlue Staining试剂盒分析。将含有目标PEG化的同工型(isoform)而且没有未修饰去唾液酸-因子VIIa的级分混合并且用AmiconUltra-15 10K离心过滤装置浓缩至1mg/mL。由采用1.37(mg/mL)^-1cm^-1的消光系数在280nm下的吸光度读数测定蛋白质浓度。

实施例4

通过反相HPLC分析测定PEG化的同工型

[0458]通过反相柱(Zorbax 300SB-C3，5μm粒度，2.1 x 150mm)上的HPLC分析PEG化的因子VIIa。洗脱剂为A)水中的0.1 TFA和B)乙腈中的0.09％ TFA。在214nm下检测。梯度、流速和柱温取决于PEG长度(40KDa、20KDa和10KDa PEG：30min内35-65％ B，0.5mL/min，45℃；10KDa PEG：30min内35-60％ B，0.5mL/min，45℃；5KDa：40min内40-50％ B，0.5mL/min，45℃；2KDa：67min内38-43％ B，0.6mL/min，55℃)。基于四种不同证据中的两种或更多种指定每个峰的身份：天然因子VIIa的已知保留时间，分离的峰的SDS-PAGE迁移，分离的峰的MALDI-TOF质谱，以及随着增加结合的PEG数目各个峰保留时间的有序进展。

实施例5

通过反相HPLC测定PEG结合的位点

[0459]通过将试样(10μL浓度为1mg/mL)与还原缓冲液(40μL，50mM NaCl，10mM甘氨酰甘氨酸，15mM EDTA，8M尿素，20mM DTT，pH 8.6)在室温下混合15min而还原因子VIIa和PEG化因子VIIa变体。加入水(50μL)并使试样冷却至4℃直至注入HPLC为止(<12hrs)。HPLC柱、洗脱剂和检测如同以上对于未还原的试样描述的那样。流速为0.5mL/min以及梯度为90min内30-55％ B，接着是简短的洗涤周期直至90％ B。如实施例4中所述指定每个峰的身份。

实施例6

因子VIIa凝结试验

[0460]PEG化试样和标准物一式两份进行测试，而且在100mMNaCl、5mM CaCl₂、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris、pH 7.4中稀释。在0.1-10ng/mL的范围内检验该标准物和试样。将相同体积的稀释过的标准物和试样与缺乏因子VIIa的血浆(Diagnostica Stago)混合，并且在检验它们之前在冰上存储不超过4小时。

[0461]用STart4血凝度计(Coagulometer，Diagnostica Stago)测量凝结时间。血凝度计测量直至如同由样品杯中磁性球缓和的来回移动的停止所指示的那样形成体外凝块为止所经过的时间。

[0462]向每个杯中放入一个磁性球加上100μL因子VIIa试样/缺乏该因子的血浆和100μL稀释的大鼠脑脑磷脂溶液(在冰上存储不超过4小时)。每种试剂每孔之间间隔5秒加入，最后的混合物在37℃下孵育300秒。稀释的大鼠脑脑磷脂(RBC)溶液由2mL RBC储备溶液(来自Haemachem的1小瓶RBC储备液，加上10mL150mM NaCl)和4mL100mM NaCl、5mM CaCl₂、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH7.4制成。

[0463]在300秒时，通过加入100μL预热过的(37℃)可溶性组织因子在100mM NaCl、12.5mM CaCl₂、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris、pH 7.4中的溶液(2μg/mL；氨基酸1-209)开始检验。再一次地，该接下来的溶液在试样间以5秒间隔加入。

[0464]来自稀释过的标准物的凝结时间用于产生标准曲线(对数凝结时间相对于对数因子VIIa浓度)。由该曲线得到的线性回归用来测定PEG化变体的相对凝结活性。将PEG化的因子VIIa变体与因子VIIa的等分储备液进行比较。

实施例7

在BHK细胞中产生的重组因子VIIa的糖基聚乙二醇化

[0465]本实施例阐述在BHK细胞中制成的重组因子VIIa的PEG化。

[0466]去唾液酸-因子VIIa的制备。在BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)中制备重组因子VIIa。将因子VIIa(14.2mg)以1mg/mL溶解在缓冲溶液中(pH 7.4，0.05M Tris，0.15M NaCl，0.001M CaCl₂，0.05％NaN₃)并且用300mU/mL唾液酸酶(霍乱弧菌)-琼脂糖缀合物在32℃下孵育3天。为监控反应，将该反应的小等分试样用适当的缓冲液稀释并且根据Invitrogen方法(图157)进行IEF凝胶。将混合物在3,500rpm下离心并收集上清液。用上述缓冲溶液(pH 7.4，0.05MTris，0.15M NaCl，0.05％ NaN₃)洗涤树脂三次(3×2mL)并且将合并的洗涤液在Centricon-Plus-20中浓缩。余下的溶液用0.05MTris(pH7.4)，0.15M NaCl，0.05％ NaN₃缓冲液交换至14.4mL的最终体积。

[0467]因子VIIa-SA-PEG-1KDa和因子VIIa-SA-PEG-10KDa的制备。因子VIIa溶液的去唾液酸化分成两份相同的7.2mL试样。向每一份试样中加入CMP-SA-PEG-1KDa(7.4mg)或CMP-SA-PEG-10KDa(7.4mg)。向两个管中加入ST3Gal3(1.58U)并使反应混合物在32℃孵育96小时。用Invitrogen所述的试剂和条件由SDS-PAGE凝胶监控反应。当反应完成时，以PBS缓冲液(pH 7.1)用Toso HaasTSK-Gel-3000制备型柱纯化反应混合物并且基于UV吸收收集级分。将合并的含有产物的级分在4℃下在Centricon-Plus-20离心过滤器(Millipore，Bedford，MA)中浓缩，并且将浓缩过的溶液重新配制以得到1.97mg(二金鸡宁酸蛋白质检测，BCA检测，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)的因子VIIa-SA-PEG。根据Invitrogen提供的方法和试剂用SDS-PAGE和IEF分析来分析反应产物。将试样对水透析并由MALDI-TOF分析。图7显示天然因子VIIa的MALDI结果。图8包含因子VIIa-SA-PEG-1KDa的MALDI结果。图9包含因子VIIa-SA-PEG-10KDa的MALDI结果。图10描绘所有反应产物的SDS-PAGE分析，其中因子VIIa-SA-PEG-10KDa的带明显。

实施例8

因子VIIa-SA-PEG-10KDa：一锅法

[0468]将因子VIIa(5mg，在产物配制缓冲液中稀释至1mg/mL的最终浓度)、CMP-SA-PEG-10KDa(10mM，60μL)和黑曲霉酶ST3Gal3(33U/L)以及10mM组氨酸、50mM NaCl、20mM CaCl₂连同10U/L、1U/L、0.5U/L或0.1U/L唾液酸酶(CalBiochem)一起在反应容器中合并。各成分在32℃下混合及孵育。通过前4个小时以30分钟间隔分析等分试样来测量反应进展。然后在20小时时间点取出一等分试样并进行SDS-PAGE。通过在1.5、2.5和3.5小时时间点取出试样并在Poros50HQ柱上纯化样品来确定PEG化的程度。

[0469]对于含10U/L唾液酸酶的反应条件，没有形成可察觉量的因子VIIa-SA-PEG产物。对于含1U/L唾液酸酶的反应条件，在1.5小时后反应混合物中约17.6％的因子VIIa为单-或二PEG化的。在2.5小时后这提高至29％，以及在3.5小时后提高至40.3％。对于含0.5U/L唾液酸酶的反应条件，在3小时后反应混合物中约44.5％的因子VIIa为单-或二PEG化的，以及0.8％为三PEG化或更多。20小时后，69.4％为单-或二PEG化的，以及18.3％为三PEG化或更多。

[0470]对于含0.1U/L唾液酸酶的反应条件，在3小时后反应混合物中约29.6％的因子VIIa为单-或二PEG化的。在20小时后，71.3％为单-或二PEG化的，以及15.1％为三PEG化或更多。

[0471]结果示于图11和图12中。

实施例9

半胱氨酸-PEG₂(2)的制备

a.化合物1的合成

[0472]将氢氧化钾(84.2mg，1.5mmol，粉末)在氩气下加入到L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在无水甲醇(20L)中的溶液内。在室温下搅拌混合物30min，然后用2小时分若干份加入分子量为20千道尔顿的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)。在室温下搅拌混合物5天，并通过旋转蒸发浓缩。用水(30mL)稀释残留物并在室温搅拌2小时以破坏任何过量的20千道尔顿mPEG-O-甲苯磺酸酯。然后用乙酸中和该溶液，将pH调节至pH 5.0并且装载至反相色谱(C-18硅石)柱上。用甲醇/水梯度洗脱该柱(产物在约70％甲醇下洗脱)，通过蒸发光散射监控产物洗脱，收集适当的级分并用水(500mL)稀释。对该溶液进行色谱分析(离子交换，XK 50 Q，BIGBeads，300mL，氢氧化物形式；水至水/乙酸的梯度-0.75N)并且用乙酸将适当级分的pH降低至6.0。然后使该溶液在反相柱(C-18硅石)上捕获并用如上所述的甲醇/水梯度洗脱。将产物级分混合，浓缩，重新溶解于水并冻干以提供453mg(44％)的白色固体(1)。

[0473]化合物的结构数据如下：¹H-NMR(500MHz；D₂O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH ₂-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH ₃O)，3.7(t，OCH ₂CH ₂O)，3.95(q，1H，CHN)。产物的纯度由SDS PAGE确定。

b.半胱氨酸-PEG₂(2)的合成

[0474]将三乙氨(～0.5mL)滴加至溶解于无水CH₂Cl₂(30mL)的化合物1溶液(440mg，22μmol)中直至溶液碱性为止。室温下用1小时分若干份加入20千道尔顿mPEG-O-对硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，30.8μmol)在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物24小时。然后通过旋转蒸发除去溶剂。将残留物溶解于水(100mL)，用1.0N NaOH调节pH至9.5。在室温下搅拌该碱性溶液2小时然后用乙酸中和至pH 7.0。接着将溶液装载至反相色谱(C-18硅石)柱上。用甲醇/水梯度洗脱该柱(产物在约70％甲醇下洗脱)，通过蒸发光散射监控产物洗脱，收集适当的级分并用水(500mL)稀释。对该溶液进行色谱分析(离子交换，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氢氧化物形式；水至水/乙酸的梯度-0.75N)并且用乙酸将适当级分的pH降低至6.0。然后使该溶液在反相柱(C-18硅石)上捕获并用如上所述的甲醇/水梯度洗脱。将产物级分混合，浓缩，重新溶解于水并冻干以提供575mg(70％)的白色固体(2)。

[0475]化合物的结构数据如下：¹H-NMR(500MHz；D₂O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH ₂-S)，2.95(t，2H，O-C-CH ₂-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH ₃O)，3.71(t，OCH ₂CH ₂O)。产物的纯度由SDS PAGE确定。

实施例10

因子VIIa-SA-PEG-40KDa

[0476]因子VIIa的糖基聚乙二醇化(一锅法并加帽)。在其中去唾液酸化和PEG化同时进行的一锅式反应中实现因子VIIa的糖基聚乙二醇化，接着用唾液酸加帽。在通过循环水浴控制在32℃的带夹套的玻璃容器中进行反应。首先，将浓缩过的0.2μm-经过滤的因子VIIa引入容器中并且通过用搅拌棒混合20分钟加热至32℃。唾液酸酶溶液由干燥粉末在10mM组氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl₂、pH 6.0中以4,000U/L的浓度制成。一旦因子VIIa达到32℃，向因子VIIa中加入唾液酸酶，混合反应混合物约5分钟以在中止混合之后确保均匀的溶液。使去唾液酸化在32℃进行1.0h。在去唾液酸化反应期间，将CMP-SA-PEG-40KDa溶解入10mM组氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl₂、pH 6.0缓冲剂中，并由271nm下的UV吸光度确定浓度。在CMP-SA-PEG-40KDa溶解后，向反应中加入该CMP-SA-PEG-40KDa以及ST3Gal3，将反应用搅拌棒混合约15分钟以确保均匀的溶液。加入85mL额外体积的缓冲液以使反应混合物为1.0L。使反应在没有搅拌下进行24小时，然后加入CMP-SA至4.3mM的浓度以使反应猝灭并且用唾液酸使剩余的末端半乳糖残基加帽。使猝灭在32℃混合30分钟下进行。猝灭前反应混合物的总体积为1.0L。在0、4.5、7.5和24h取出时间点试样(1mL)，用CMP-SA猝灭，并用RP-HPLC和SDS-PAGE分析。

[0477]因子VIIa-SA-PEG-40KDa的纯化。在加帽后，溶液用2.0L已经在4℃存储过夜的10mM组氨酸、pH 6.0稀释并且通过0.2μmMillipakn 60过滤器过滤试样。所得装载体积为3.1L。在Akta Pilot系统上在20-25℃(环境室温)进行AEX2色谱分析。装载后，用平衡缓冲液进行10柱体积洗涤，并且用10柱体积MgCl₂梯度从柱中洗脱产物，其导致未PEG化因子VIIa与PEG化-因子VIIa物种的拆分。有意地将该柱的装载保持在低水平，目标为<2mg因子VIIa/mL树脂。除了选定级分和级分集合的RP-HPLC分析以外还运行SDS-PAGE凝胶，以便制备原料(bulk)产物的集合物。将混合的级分用1M NaOH调节pH至6.0并在2-8℃的冷藏室中存储过夜。

[0478]最后浓缩/渗滤，无菌过滤和等分(aliquoting)。将混合的级分通过Millipak 20 0.2μm过滤器来过滤并在2-8℃下存储过夜。为进行浓缩/渗滤，在装有蠕动泵和硅树脂管的系统中使用Millipore 0.1m² 30KDa再生纤维素膜。装配该系统并用水冲洗，然后用0.1M NaOH清洁至少1小时，接着存储在0.1M NaOH中直至刚好在使用前用10mM组氨酸/5mM CaCl₂/100mM NaCl pH 6.0渗滤缓冲液平衡为止。将产物浓缩至大约400mL然后在用大约5diavolumes缓冲液在定容下进行渗滤。接着将产物浓缩至约300mL并在低压再循环5分钟后回收，将膜通过再循环5分钟用200mL渗滤缓冲液冲洗。洗涤液与产物一起回收，并将另外50mL缓冲液再循环另外5分钟以便最终洗涤。所得体积为约510mL，通过装有0.2μm PES膜(Millipore)的1L真空过滤器将其过滤。然后将无菌过滤的散装物(bulk)在50mL无菌falcon管中等分成25mL等分试样并在-80℃冷冻。

PEG化反应的HPLC分析(实施例10)

24小时后，批量产物PEG状态分布为：0.7％未聚乙二醇化，85.3％单聚乙二醇化，11.5％二聚乙二醇化和0.3％三聚乙二醇化。在产生该产物分布的方法中柱色谱法是主要步骤，其主要通过从单-和二-聚乙二醇化的物种中除去未聚乙二醇化的物质进行。

实施例11

因子VIIa-SA-PEG-10KDa

[0479]下列实施例描述通过反相HPLC测定与因子VIIa-SA-PEG-10KDa的轻链和重链结合的修饰的糖数量的程序。

[0480]使因子VIIa-SA-PEG-10KDa经受还原条件以便将重链与轻链分离。分离之后，使重链和轻链进行单独的反相HPLC试验。基于它们相对于天然因子VIIa对照物的色谱图中未修饰的因子VIIa峰的峰位置来将指定各峰。

[0481]下表描述用于轻链的HPLC溶剂梯度参数。柱温为39℃。

       HPLC轻链溶剂梯度参数

 

时间，分	溶剂B，％	流速，mL/min	备注
				0	30	0.5	初始条件
60	47	0.5	梯度洗脱
				60.2	90	0.5	开始洗涤
70	90	0.5	洗涤

[0482]轻链因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然的轻链因子VIIa(下)的色谱图提供于图14A中。

[0483]下表描述用于重链的HPLC溶剂梯度参数。柱温为52℃。

        HPLC重链溶剂梯度参数

 

时间，分	溶剂B，％	流速，ml/min	备注
				0	42.5	0.5	初始条件

 

36	52.5	0.5	梯度洗脱
				36.1	90	0.5	开始洗涤
41	90	0.5	洗涤

[0484]重链因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然的重链因子VIIa(下)的色谱图提供于图14B中。

实施例12

因子VIIa-SA-PEG-40KDa

[0485]下列实施例描述通过反相HPLC测定与因子VIIa-SA-PEG-40KDa的轻链和重链结合的修饰的糖数量的程序。

[0486]使因子VIIa-SA-PEG-40KDa经受还原条件以便将重链与轻链分离。分离之后，使重链和轻链进行单独的反相HPLC试验。基于它们相对于天然因子VIIa对照物的色谱图中未修饰的糖峰的峰位置来指定各峰。

[0487]下表描述用于轻链的HPLC溶剂梯度参数。柱温为25℃。

        HPLC轻链溶剂梯度参数

 

时间(分)	洗脱剂B(％)	备注
			0	30	初始条件
60	47	梯度洗脱
			60.5	90	开始洗涤
65.5	90	结束洗涤
			66	42.5	开始重链方法平衡
70	42.5	结束运行

[0488]轻链因子VIIa-SA-PEG-40KDa和天然的轻链因子VIIa的色谱图分别提供于图15B和图15A中。

[0489]下表描述用于重链的HPLC溶剂梯度参数。柱温为40℃。

 HPLC重链溶剂梯度参数

 

时间(min)	洗脱液B(％)	备注
			0	42.5	初始条件
36	52.5	梯度洗脱
			36.5	90	开始洗涤
41.5	90	结束洗涤
			42	30	开始轻链方法平衡
47	30	结束运行

[0490]重链因子VIIa-SA-PEG-40KDa和天然的重链因子VIIa的色谱图分别提供于图15D和图15C中。

[0491]应当理解本文所述的实施例和实施方案只是为了说明性目的，根据它们的多种改进或变化会暗示给本领域技术人员，而且会包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用完全并入本文用于所有目的。

Claims (35)

1.制备包含糖基接头的因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法，所述接头包含具有下式的修饰的唾液酰基残基：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基-R¹；

R¹是包含选自直链聚(乙二醇)残基和支化聚(乙二醇)残基中的成员的部分；以及

M选自H、金属和单个负电荷；

L是选自键、取代的或未取代的烃基和取代的或未取代的杂烃基的接头，

以至于当D为OH时，G为R¹-L-，以及当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-

所述方法包括：

(a)使包含糖基部分的因子VII/因子VIIa肽：

与具有下式的PEG-唾液酸供体部分：

以及将所述PEG-唾液酸转移至所述糖基部分的Gal上的酶，在适合于所述转移的条件下进行接触。

2.权利要求1的方法，其中L-R¹具有下式：

其中

a为选自0-20的整数。

3.权利要求1的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

和

其中

e、f、m和n为独立地选自1-2500的整数；以及

q为选自0-20的整数。

4.权利要求1的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

和

其中

e、f和f’为独立地选自1-2500的整数，以及

q和q’为独立地选自1-20的整数。

5.权利要求1的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

和

其中

e和f为独立地选自1-2500的整数。

6.权利要求1的方法，其中所述糖基接头具有下式：

7.权利要求1的方法，其中所述肽缀合物包含至少一个根据选自以下的式的所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。

8.权利要求1的方法，其中所述肽缀合物包含至少一个所述糖基接头，其中所述糖基接头各自具有独立地选自以下式的结构：

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数。

9.权利要求1的方法，其中所述肽缀合物包含至少一个根据选自以下的式的所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数

以及其中选自0和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。

10.权利要求1的方法，其中所述肽缀合物包含至少一个根据选自以下的式的所述糖基接头：

和

其中AA是所述肽缀合物的氨基酸残基以及t为选自0和1的整数

以及其中选自0和2个不含G的唾液酰基部分中的成员不存在。

11.权利要求1的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

12.权利要求1的方法，其中所述糖基接头通过选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

13.权利要求1的方法，其中所述糖基接头通过为天冬酰胺残基的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

14.权利要求13的方法，其中所述天冬酰胺残基选自N152、N322及其组合。

15.权利要求1的方法，其中所述因子VIIa肽为生物活性的因子VIIa肽。

16.权利要求1的方法，其在步骤(a)之前进一步包括：

(b)在适合的宿主中表达所述因子VII/因子VIIa肽。

17.权利要求16的方法，其中所述宿主为哺乳动物表达体系。

18.在有此需要的受试者中治疗病症的方法，所述病症的特征为所述受试者中凝血效价受损，所述方法包括向受试者施用有效改善所述受试者中所述病症的量的根据权利要求1的方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物的步骤。

19.提高哺乳动物中凝血效价的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用适量的根据权利要求1的方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物。

20.制备包含糖基接头的因子VII/因子VIIa肽缀合物的方法，所述接头包含具有下式的修饰的唾液酰基残基：

其中

R²为H、CH₂OR⁷、COOR⁷或OR⁷

其中

R⁷表示H、取代的或未取代的烃基或取代的或未取代的杂烃基；

R³和R⁴独立地选自H、取代的或未取代的烃基、OR⁸、NHC(O)R⁹

其中

R⁸和R⁹独立地选自H、取代的或未取代的烃基、取代的或未取代的杂烃基或唾液酸；

R¹⁶和R¹⁷为独立选择的聚合物臂；

X²和X⁴为独立选择的将聚合物部分R¹⁶和R¹⁷连接到C上的键片段；

X⁵是非反应性基团；以及

L^a是接头基团

所述方法包括：

(a)使含有糖基部分的因子VII/因子VIIa肽：

与具有下式的PEG-唾液酸供体部分：

以及将所述PEG-唾液酸转移至所述糖基部分的Gal上的酶，在适合于所述转移的条件下进行接触。

21.权利要求20的方法，其中部分：

具有选自以下的式：

其中

e、f、m和n为独立地选自1-2500的整数；以及

q为选自0-20的整数。

22.权利要求20的方法，其中部分：

具有选自以下的式：

和

其中

e、f和f’为独立地选自1-2500的整数，以及

q和q’为独立地选自1-20的整数。

23.权利要求20的方法，其中所述糖基接头包含下式：

24.权利要求20的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽缀合物包含至少一个具有下式的糖基接头：

和

其中

AA是所述肽的氨基酸残基；

t为选自0和1的整数；以及

R¹⁵为修饰的唾液酸部分。

25.权利要求20的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

26.权利要求20的方法，其中所述糖基接头通过为天冬酰胺残基的氨基酸残基结合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

27.权利要求26的方法，其中所述天冬酰胺残基选自N152、N322及其组合。

28.权利要求20的方法，其中所述因子VIIa肽为生物活性的因子VIIa肽。

29.权利要求20的方法，其在步骤(a)之前进一步包括：

(b)在适合的宿主中表达所述因子VII/因子VIIa肽。

30.权利要求29的方法，其中所述宿主为哺乳动物表达体系。

31.在有此需要的受试者中治疗病症的方法，所述病症的特征为所述受试者中凝血效价受损，所述方法包括向受试者施用有效改善所述受试者中所述病症的量的根据权利要求20的方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物的步骤。

32.提高哺乳动物中凝血效价的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用适量的根据权利要求20的方法制备的因子VII/因子VIIa肽缀合物。

33.合成因子VII或因子VIIa肽缀合物的方法，所述方法包括将

a)唾液酸酶；

b)选自糖基转移酶、外切糖苷酶和内切糖苷酶的酶

c)修饰的糖/修饰的唾液酰基残基

d)因子VII/因子VIIa肽

合并，从而合成所述因子VII或因子VIIa肽缀合物。

34.权利要求33的方法，其中所述合并的进行时间少于10小时。

35.权利要求33的方法，其进一步包括加帽步骤。

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