CN101338301A

CN101338301A - 一种人胚胎干细胞的培养方法

Info

Publication number: CN101338301A
Application number: CNA2007101230000A
Authority: CN
Inventors: 李凌松
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2009-01-07

Abstract

本发明公开了一种人胚胎干细胞的培养方法及其制备的细胞系。本发明用Gelatin代替了常规方法中的Matrigel，并取得了良好的效果。与常规方法相比，本发明的操作更加简便，成本非常低廉，只相当于常用方法的2.25％，同时应用更加安全。

Description

一种人胚胎干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养方法，特别涉及到一种人胚胎干细胞的培养方法。

背景技术

干细胞是存在于发育阶段或成体阶段多细胞器官中的一群特殊细胞，它们最为显著的特征是具有无限的自我更新以及分化产生各种子代细胞的双重能力，统称为干性(stemness)。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)由受精卵发育成囊胚的内细胞团中而来，是最原始的干细胞，具有分化上的全能性，可以分化成各种构成人体任何一种器官或组织的组成细胞。

1998年美国的Thomson成功分离建立了具有多潜能和永久增殖能力的人胚胎干细胞(hESC)系。最终人胚胎干细胞系的建立，引起了各国政府和研究人员的极大兴趣，这项研究分别被美国《SCIENCE》杂志和《TIMES》周刊评为1999年和20世纪末世界十大科技成就之首。人ES细胞具有分化成内、中、外各个胚层所有类型细胞的能力，有向各种组织分化的潜力，人们不仅可以获得需要的细胞，也有希望获得某个器官，甚至用基因改造的人ES细胞培育出没有排斥反应的细胞、组织、器官；另外，人胚胎干细胞为研究药物对胚胎组织的毒性提供了一个很好的体外实验模型。

起初用于ES细胞培养增殖的小鼠胚胎成纤维细胞来自妊娠12.5-14.5天的小鼠胚胎，在培养4-5代时用作饲养层，但是小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)在体外增殖能力差，且随传代次数的增加，其支持人ES细胞生长的能力降低，需要不断制备原代细胞。而小鼠胚胎成纤维细胞在5-6代后即已老化，况且不同批次的MEF对ES细胞的支持能力不同。更重要的是由于鼠源性的小鼠胚胎成纤维细胞可能引起动物源性病原体或支原体的污染。很多研究组尝试用各种人源细胞直接作为饲养层或制备条件培养基，如胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤成纤维细胞、成人法罗皮奥罗氏管上皮细胞、包皮成纤维细胞、成人骨髓细胞、成人子宫内膜细胞、成人乳房实质细胞、人胚胎成纤维细胞、人胎盘成纤维细胞。然而并不是所有人源细胞都能很好的支持人ES细胞，然而用异体基因来源的细胞仍存在一定交叉污染危险。

同时，基于饲养层的培养需要饲养细胞和干细胞同时生长，由此可能导致出现混合细胞群体，给分离带来困难，于是后来科学家尝试无饲养层的培养方法，在无饲养细胞体系中生长干细胞，能够很容易地从表面分离人胚胎干细胞。

目前最常用的人ES细胞的无饲养层培养方法是2001年美国Geron公司开发的(Xu C.Nat Biotechnol，19(10)：971-974.2001)，在他们的实验中，考虑到了人胚胎干细胞在存活和生长过程中对胞外基质及MEF所分泌因子的依赖性，将人胚胎干细胞接种于胞外基质Matrigel包被的培养皿。Matrigel是BD公司生产的一种从小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物，主要成份是层粘蛋白(laminin)，还有胶原IV、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素糖蛋白，此外还含有一些微量的生长因子，例如表皮生长因子(即epidermal growth factor，EGF)、转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)、纤维母细胞生长因子(FGF)、组织纤溶酶原激活物(tPA)等。在室温下，Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物细胞基底膜类似。实验证明，Matrigel能很好的能支持人胚胎干细胞的生长，经过长期培养的人胚胎干细胞仍然保持正常的核型、各胚层分化能力。美国专利US20030017589中也采用了上述方法。

但是上述方法存在以下问题：a、成本较高；b、操作复杂；c、由于matrigel仍然是一种鼠源组分，应用时易引发人体免疫反应导致移植失败。

本发明申请经过大量实验，用gelatin来代替matrigel，克服了以上种种缺点。与matrigel相比，gelatin有以下优点：

a价格非常便宜；

b操作更加简便；

c来源于猪皮水解产物，应用更安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胚胎干细胞的培养方法。

本发明的另一目的在于提供一种用上述方法制备的人胚胎干细胞系。

本发明提供的人胚胎干细胞的培养方法是通过以下步骤实现的：

a、人胚胎干细胞的消化，和；

b、将消化后的人胚胎干细胞接种于培养基包被的培养皿上，所述培养基包被的培养皿为：将Gelatin水溶液均匀铺满培养皿，室温静置后，吸出Gelatin水溶液；

c、将接种后的人胚胎干细胞培养传代。

其中，所述人胚胎干细胞的消化为：用胰酶消化人胚胎干细胞3min，吸出胰酶，加入培养液吹打，得到大小较为均一的人胚胎干细胞克隆，所述细胞克隆由50-100个细胞构成。

所述培养液包括为：Knockout DMEM 80ml，Knockout serum replacement(血清替代物)20ml，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)400ng，L-谷胺酰胺2mM，非必需氨基酸0.1mM，β-巯基乙醇0.1mM。

所述Gelatin水溶液浓度为0.1％～0.2％，优选0.1％，所述Gelatin为猪皮来源的，室温静置时间为30分钟。

所述胰酶浓度为0.05％～0.25％，优选0.25％。

所述将接种后的人胚胎干细胞培养传代的方法为，将接种后的人胚胎干细胞在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养液，5-7天传代一次。

具体的说，本发明提供的人胚胎干细胞的培养方法是这样实现的：

a、人胚胎干细胞的消化

用0.05％～0.25％的胰酶消化人胚胎干细胞3min，吸出胰酶，加入培养液吹打，得到由50-100个细胞构成的大小较为均一的人胚胎干细胞克隆，胰酶浓度优选0.25％。其中培养液包括为：Knockout DMEM 80ml，Knockout serum replacement(血清替代物)20ml，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)400ng，L-谷胺酰胺2mM，非必需氨基酸0.1mM，β-巯基乙醇0.1mM。

b、将人胚胎干细胞接种于培养基包被的培养皿上

培养基包被培养皿的过程为：将Gelatin水溶液均匀铺满培养皿，室温下静置30min，吸出Gelatin水溶液；常温存放半年内都可使用；其中Gelatin水溶液浓度为0.1％～0.2％，优选0.1％，并且Gelatin优选猪皮来源的。

c、将接种后的人胚胎干细胞培养传代。

接种后的人胚胎干细胞在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养液，5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)胚胎干细胞克隆过于致密或面积过大；(2)胚胎干细胞出现明显的自发分化。

同时，本发明还提供了利用上述方法制备的人胚胎干细胞系。

本发明与使用Matrigel的常用方法相比，具有以下有益效果：

1、操作更加简便

配制Matrigel工作液的所有操作全部要低温操作，Matrigel工作液在使用时，要现用现配，而本发明Gelatin工作液可以在常温下配制，配制后在常温下存放半年内都可使用。

2、成本非常低廉，只有使用Matrigel的常用方法的2.25％

Matrige一个包装10ml，购于BD公司，价格为1600元人民币，1∶25稀释为250ml工作液，培养用60mm的培养皿，铺一个培养皿用2ml Matrigel工作液，一个包装Matrigel可以包被125个培养皿，因此包被一个皿花费12.8元，而Gelatin一个包装500g，购于Sigma公司，价格720元人民币，水溶液浓度为0.1％。500g Gelatin可以配5000ml水溶液，铺一个培养皿用2ml Gelatin水溶液，可以包被2500个培养皿，包被一个皿花费0.288元，所以本发明方法成本只有常规方法的2.25％。

3、应用更安全

Gelatin为猪皮来源产物，比起鼠源的Matrigel来在应用上更加安全。

附图说明

图1Matrigel培养的人胚胎干细胞SSEA-4阳性分析结果。

图2Gelatin培养的人胚胎干细胞SSEA-4阳性分析结果。

图3Matrigel和Gelatin培养的人胚胎干细胞SSEA-4阳性分析结果比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更详细描述，但本发明不受这些实施例限制。

实施例1

人胚胎干细胞的常规培养

1、培养液的配制

按照以下配方配制培养液：Knockout DMEM 80ml，Knockout serum replacement20ml，bFGF400ng，L-谷胺酰胺2mM，非必需氨基酸共0.1mM，β-巯基乙醇0.1mM；其中，Knock out DMEM，knock out serum replacement，β-巯基乙醇购于Gibco公司，L-谷胺酰胺和非必须氨基酸购于Hyclone公司，bFGF购于Peprotech公司。

2、Matrigel工作液的配制和培养皿的包被

事先将所有配Matrigel的耗材及试剂放置于-20℃进行降温处理。Matigel原液储存于-20℃取出，按照1∶25稀释成工作液。将Matrigel工作液均匀铺满培养皿，室温静置3-4h或4℃过夜。使用前吸出Matrigel工作液，现用现配。配制Matrigel所有操作全部要低温操作。其中Matrigel购于美国BD公司。

3、人胚胎干细胞的培养

用1mg/ml胶原酶IV消化人胚胎干细胞(来源于北医三院赠送)10-20min，吸出胶原酶IV，加入培养液吹打，得到大小较为均一的人胚胎干细胞。

将人胚胎干细胞接种于Matrigel包被的培养皿上，接种后的人胚胎干细胞在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养液，5-7天传代一次。

实施例2

本发明人胚胎干细胞的培养

1、培养液的配制

同实施例1。

2、Gelatin水溶液的配制和培养皿的包被

将Gelatin粉末与水混合配成0.1％Gelatin水溶液，均匀铺满培养皿，室温静置30min，吸出Gelatin水溶液，常温存放半年内使用即可；其中Gelatin购于Sigma公司，货号是G1890，为猪皮来源的。

3、人胚胎干细胞的培养

用0.25％的胰酶消化人胚胎干细胞3min，吸出胰酶，加入培养液吹打，得到由50-100个细胞构成的大小较为均一的人胚胎干细胞克隆，其中胰酶购于美国Invitrogen公司。

将人胚胎干细胞接种于Gelatin包被的培养皿上，接种后的人胚胎干细胞在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养液，5-7天传代一次。

实施例3

Gelatin水溶液浓度为0.2％，胰酶浓度为0.05％，其余同实施例2。

实施例4

Gelatin水溶液浓度为0.15％，胰酶浓度为0.10％，其余同实施例2。

实施例5

Gelatin水溶液浓度为0.2％，胰酶浓度为0.15％，其余同实施例2。

实施例6

Gelatin水溶液浓度为0.1％，胰酶浓度为0.20％，其余同实施例2。

实验例1

在本实验例中，采用流式分选的方法，对实施例1和2中人胚胎干细胞上进行分选，然后分别对分选出的SSEA4阳性细胞进行分析。结果见图1和图2，比较结果见图3。

SSEA-4是人胚胎干细胞的标志，从图3中可以看出，两种基质培养的人ES细胞SSEA-4阳性率在统计学上差异不显著。

因此本发明用经济，操作简单，应用安全的Gelatin培养人胚胎干细胞可以取得与传统的Matrigel相同的效果

Claims

1、一种人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)人胚胎干细胞的消化；

b)将消化后的人胚胎干细胞接种于培养基包被的培养皿上，所述培养基包被的培养皿为：将Gelatin水溶液均匀铺满培养皿，室温静置后，吸出Gelatin水溶液；

c)将接种后的人胚胎干细胞培养传代。

2、根据权利要求1所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞的消化为：用胰酶水溶液消化人胚胎干细胞3min，吸出胰酶水溶液，加入培养液吹打，得到大小较为均一的人胚胎干细胞克隆。

3、根据权利要求2所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养液包括：Knockout DMEM 80ml，血清替代物20ml，碱性成纤维细胞生长因子400ng，L-谷胺酰胺2mM，非必需氨基酸0.1mM，β-巯基乙醇0.1mM，所述人胚胎干细胞克隆由50-100个细胞构成。

4、根据权利要求1所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述Gelatin水溶液浓度为0.1％～0.2％，所述室温静置时间为30分钟。

5、根据权利要求4所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述Gelatin水溶液浓度为0.1％。

6、根据权利要求1或4或5任何一项所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述Gelatin为猪皮来源的。

7、根据权利要求2所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述胰酶浓度为0.05％～0.25％。

8、根据权利要求7所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，所述胰酶浓度为0.25％。

9、根据权利要求1所述的人胚胎干细胞的培养方法，其特征在于所述将接种后的人胚胎干细胞培养传代的方法为，将接种后的人胚胎干细胞在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养液，5-7天传代一次。

10、权利要求1-8任何一项所述的人胚胎干细胞的培养方法制备的人胚胎干细胞系。