CN101327336B - 一种骨/软骨组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种骨/软骨组织工程支架材料及其制备方法，涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法。提供一种以明胶与3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷构成纺丝原液，采用电纺丝技术制备具有良好的生物活性、稳定性和生物相容性的骨/软骨组织工程支架材料及其制备方法。其组成为明胶、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和钙盐。在甲酸溶液中加入明胶得溶液A，加入钙盐得溶液B，再与3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷混合得溶液C，将溶液C加入密闭的容器中，反应至其动力学粘度值＞5000cp，得电纺丝原液；对电纺丝原液进行电纺丝得产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法。
背景技术
自19世纪以来，骨移植术一直致力于修复由于创伤、肿瘤、感染所造成的大范围骨缺损，以恢复肢体功能。但该方法存在很多问题，如免疫排斥及供体组织及器官的短缺。随着组织工程概念的提出，一个理想的策略出现了，即利用细胞与生物支架材料的复合培养人工再造骨组织，达到修复体内缺损的目的。其中支架材料一方面可作为细胞的载体，将其运送至缺损部位，另一方面还可提供新骨生长的支架。目前，支架材料的制备方法主要包括：纤维粘结、溶剂浇铸/粒子滤沥、乳化/冻干、气体发泡、相分离、自组装、快速成型和电纺丝法等。其中，电纺丝方法可以连续制备纳米或亚微米级超细纤维，在组织工程支架制备方面具有独特的优势。如Li WJ等人(Li W J，Laurencin C T，Caterson E J，et al.Electrospun nanofibrousstructure：A novel scaffold for tissue engineering.J Biomed Mater Res，2002，60(4)：613-621)用聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)电纺成了软骨组织工程支架材料，Vacanti JP等人(Shin M，Yoshimoto H，Vacanti J P.In vivo bone tissue engineering using mesenchymal stem cells on a novelelectrospun nanofibrous scaffold.Tissue Eng，2004，10(1-2)：33-41)利用电纺丝法技术制备了聚己内酯(PCL)骨组织工程支架材料。但这些报道中所使用的材料多为合成高分子材料，其生物相容性与生物降解性还有待进一步提高。
明胶是一种来源丰富，有良好的生物相容性与生物降解性的天然高分子材料，已广泛应用于药物制剂等领域。Zhang YZ(Y.Z.Zhang，J.Venugopal，Z.-M.Huang，C.T.Lim，et al.Crosslinking of electrospun gelatin nanofibers.Polymer，2006，47：2911-2917)与Chang SK等人(Chang Seok Ki，Doo Hyun Baek，Kyung Don Gang，et al.Characterization of gelatin nanofiberprepared from gelatin-formic acid solution.Polymer，2005，46：5094-5102)分别用电纺丝技术制备得到了明胶纳米纤维支架材料。但使用的有机溶剂腐蚀性强、易造成环境污染。另外为了提高明胶纳米纤维的稳定性，还需用戊二醛蒸汽进行交联，从而导致其生物相容性也降低。此外，单纯的明胶材料缺乏骨诱导性。CN 200410094895.6公开了一种联合采用溶胶-凝胶和冷冻干燥方法制备的明胶/壳聚糖-硅氧烷的多孔复合材料，并且证明了该材料具有非常优良生物相容性、可控的生物降解性、以及优异的生物活性(骨诱导性)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以明胶与3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPSM)构成纺丝原液，采用电纺丝技术制备具有良好的生物活性(骨诱导性)、稳定性和生物相容性的骨/软骨组织工程支架材料及其制备方法。
本发明所述的骨/软骨组织工程支架材料为明胶-硅氧烷纳米纤维，其结构式如下：
其组成为明胶、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPSM)和钙盐，按质量比，各组分的配比为明胶∶3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷∶钙盐为1∶(0.2～2.0)∶(0.01～0.1)，明胶-硅氧烷纳米纤维的直径为100～2500nm。
所述的钙盐最好为硝酸钙、草酸钙或海藻酸钙等。
本发明所述的骨/软骨组织工程支架材料的制备方法包括以下步骤：
1)在甲酸溶液中加入明胶，搅拌至明胶充分溶解，得到溶液A；
2)在溶液A中加入钙盐，得到溶液B；
3)将溶液B与3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷混合，得溶液C；
4)将溶液C加入密闭的容器中，反应至其动力学粘度值＞5000cp，得电纺丝原液；
5)控制电纺丝参数为电压5～40kV，喷口内径1～4mm，溶液流速100～1000μL/h，温度20～30℃，固化距离5～50cm，对电纺丝原液进行电纺丝，产物即为明胶-硅氧烷纳米纤维构成的骨/软骨组织工程支架材料。
按质量百分比，甲酸溶液的浓度最好为90％～98％；按质量百分比，明胶的加入量最好为甲酸溶液总质量的10％～30％，搅拌的温度最好为25～60℃。按质量比，明胶∶钙盐最好为1∶(0.01～0.1)。按质量比，最好明胶∶3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷＝1∶(0.2～2)，混合的温度最好为25～60℃。反应的温度最好为25～60℃。
本发明通过电纺丝方法制备骨/软骨组织工程支架材料，具有均一性好、孔隙率高、仿生性好、生物相容性好等特点。所有原料都为通用化学试剂，来源丰富，价格低廉，且电纺丝过程操作简便，设备简单，容易掌握，可以高效地制备支架材料。通过调节电纺丝过程的各个参数可控制纤维的直径以及取向，制备微观形态上不同的支架材料。所制备的材料为天然高分子材料与生物陶瓷复合材料，具有良好的生物活性(骨诱导性)、稳定性和生物相容性等优点，可应用于骨/软骨组织工程领域。
附图说明
图1为电纺丝过程示意图。
图2为实施例1制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料的红外谱图。在图2中，横坐标为波数Wavenumber(cm-1)，纵坐标为百分透射率(％)。
图3为实施例1制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料的扫描电镜照片。
图4为实施例3中明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料在模拟体液中浸泡7天后的X射线衍射图谱。在图4中，横坐标为衍射峰位置Position(°2theta)，纵坐标为衍射峰强度Instensity(a.u.)。
图5为实施例3中明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料在模拟体液中浸泡7天后的扫描电镜照片。
图6为实施例3中成骨细胞在明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料表面上生长的扫描电镜照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：向20mL 98％的甲酸溶液中加入2g明胶，在25℃下搅拌溶解。再依次加入硝酸钙和3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPSM)，其中硝酸钙/明胶为(质量比)0.01/1；GPSM/明胶为(质量比)2/1。上述反应液充分混合2h，至完全均匀(没有分相)。然后将上述反应液倒入75mm×55mm×30mm的聚苯乙烯容器中并密封，于40℃恒温箱中反应5天，使其粘度为6000cp，且未成凝胶状。上述反应液在室温下放置1h，即可作为电纺丝原液。将上述7mL电纺丝原液倒入10mL注射器中，并将该注射器固定在微量注射泵上。注射器喷口内径为2mm。在距离微量泵的喷口下方5cm处，放置一个尺寸为3cm×5cm×0.3cm的镀锌铁板作为电纺丝的接收装置。其电纺丝过程如图1所示，微量注射泵1的喷口2接高压正电极4，接收装置3接地线，调节高压正电极上的电压为5kV，用微量注射泵控制电纺丝原液的挤出流速为120μL/h，即可在镀锌铁板上收集到由明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料。
红外光谱(图2)表征显示该纳米纤维材料1650cm-1是羰基-C＝O的伸缩振动吸收峰，1541cm-1是氨基-NH2弯曲振动，均来源于明胶分子，1030和1140cm-1是Si-O-Si的伸缩振动，这表明材料中的明胶分子与GPSM良好结合。扫描电镜(图3)分析结果表明，明胶-硅氧烷纳米纤维平均直径为200～300nm；支架材料中孔的大小为4μm左右，而且孔分布均匀。
实施例2：向20mL 90％的甲酸酸溶液溶解6g明胶，在60℃下搅拌溶解。再依次加入草酸钙和GPSM，其中草酸钙/明胶为(质量比)0.03/1；GPSM/明胶为(质量比)0.2/1。上述溶液充分混合4h，至完全均匀(没有分相)，然后倒入75mm×55mm×30mm的聚苯乙烯容器中并密封，于60℃恒温箱中进行反应。3天后取出上述反应液，并在室温下放置3h，即可作为电纺丝原液。将上述7mL电纺丝原液倒入10mL注射器中，并将该注射器固定在微量注射泵上。注射器喷口内径为4mm。在距离微量泵的喷口下方20cm处，放置一个尺寸为3cm×5cm×0.3cm的镀锌铁板作为电纺丝的接收装置。微量泵的喷口接高压正电极，接收装置接地线。调节电压为20kV，溶液挤出流速240μL/h，即可在镀锌铁板上收集到由明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料。扫描电镜分析结果表明明胶-硅氧烷纳米纤维平均直径为400～500nm，支架材料中孔的大小为2μm左右，且孔的分布均匀。
实施例3：向20mL 98％的甲酸酸溶液溶解5g明胶，在40℃下搅拌溶解。再依次加入硝酸钙和GPSM，其中硝酸钙/明胶为(质量比)0.01/1；GPSM/明胶为(质量比)0.5/1。上述溶液充分混合4h，至完全均匀(没有分相)，然后倒入75mm×55mm×30mm的聚苯乙烯容器中并密封，于40℃恒温箱中进行反应。4天后取出上述反应液，并在室温下放置3h，即可作为电纺丝原液。将上述6mL电纺丝原液倒入10mL注射器中，并将该注射器固定在微量注射泵上。注射器喷口内径为4mm。在距离微量泵的喷口下方45cm处，放置一个尺寸为3cm×5cm×0.3cm的镀锌铁板作为电纺丝的接收装置。微量泵的喷口接高压正电极，接收装置接地线。调节电压为40kV，溶液挤出流速1000μL/h，即可在镀锌铁板上收集到由明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料。扫描电镜分析结果表明明胶-硅氧烷纳米纤维平均直径为2500nm，支架材料中孔的大小为40μm左右，且孔的分布均匀。
为检测明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料的生物活性(骨诱导性)，将所制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料裁剪为1.5cm×1.5cm大小，然后浸泡于20mL模拟体液(SBF)中，放置于37.5℃的恒温培养箱中。SBF含有与人体血浆相同的离子和离子团浓度，其组成为：
NaCl 8.036g/L
NaHCO3 0.352g/L
KCl 0.225g/L
K2HPO4·3H2O 0.230g/L
MgCl2·6H2O 0.311g/L
1M-HCl 40mLg/L
CaCl2 0.293g/L
Na2SO4 0.072g/L
TRIS 6.063g/L
7天后，从SBF中取出材料，材料完整，表明本发明制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料的稳定性良好。用大量去离子水冲洗材料表面，室温干燥后用X射线衍射仪(XRD)与扫描电子显微镜对材料分别进行分析测试，XRD结果显示在2θ角为26°及32°出现了明显的羟基磷灰石特征衍射峰(图4)；扫描电镜可见材料表面沉积的大量羟基磷灰石晶体(图5)。测试结果表明所制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料具有良好的生物活性，有作为骨组织工程支架材料的潜力。
将收集得到的材料裁剪为1.5cm×1.5cm大小，并在70％乙醇中浸泡2h灭菌，然后在超静工作台内风干。将兔松质骨来源的成骨细胞制成密度为5×105/mL的细胞悬液。将灭菌后的材料放入24孔细胞培养板孔中，然后取30μL细胞悬液滴于材料表面。将24孔细胞培养板置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞恒温培养箱中培养2h。从培养箱中取出24孔细胞培养板，并向其每个孔中添加培养基1.5mL，继续置于37℃、饱和湿度、5％CO2细胞恒温培养箱中培养1周(每2～3天换液1次)。为了考察细胞在材料中生长状况，用戊二醛对细胞-支架材料复合物进行固定，然后用乙醇进行梯度脱水、最后在临界点进行干燥。用扫描电子显微镜观察材料中细胞形态(图6)，结果显示细胞在材料表面粘附、生长良好。从中可见所制备的明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料具有良好的生物相容性，并利于骨细胞粘附、生长。
实施例4：向20mL 95％的甲酸酸溶液溶解5g明胶，在40℃下搅拌溶解。再依次加入海藻酸钙和GPSM，其中海藻酸钙/明胶为(质量比)0.1/1；GPSM/明胶为(质量比)0.5/1。上述溶液在室温下充分混合4h，至完全均匀(没有分相)，然后倒入75mm×55mm×30mm的聚苯乙烯容器中并密封，于40℃恒温箱中进行反应。4天后取出上述反应液，并在室温下放置3h，即可作为电纺丝原液。电纺丝过程同实施例3，即可在镀锌铁板上收集到由明胶-硅氧烷纳米纤维构成的组织工程支架材料。
Claims (5)
1.一种骨/软骨组织工程支架材料，其特征在于为明胶-硅氧烷纳米纤维，其结构式如下：
其组成为明胶、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和钙盐，按质量比，各组分的配比为明胶∶3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷∶钙盐为1∶0.2～2.0∶0.01～0.1；所述的钙盐为硝酸钙、草酸钙或海藻酸钙。
2.一种骨/软骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在甲酸溶液中加入明胶，搅拌至明胶充分溶解，得到溶液A，按质量百分比，明胶的加入量为甲酸溶液总质量的10％～30％；
2)在溶液A中加入钙盐，得到溶液B，按质量比，明胶∶钙盐为1∶0.01～0.1；
3)将溶液B与3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷混合，得溶液C，按质量比，明胶∶3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷＝1∶0.2～2，混合的温度为25～60℃；
4)将溶液C加入密闭的容器中，反应至其动力学粘度值>5000cp，得电纺丝原液；
5)控制电纺丝参数为电压5～40kV，喷口孔径1～4mm，溶液流速100～1000μL/h，温度20～30℃，固化距离5～50cm，对电纺丝原液进行电纺丝，产物即为明胶-硅氧烷纳米纤维构成的骨/软骨组织工程支架材料。
3.如权利要求2所述的一种骨/软骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于按质量百分比，甲酸溶液的浓度为90％～98％。
4.如权利要求2所述的一种骨/软骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于搅拌的温度为25～60℃。
5.如权利要求2所述的一种骨/软骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于反应的温度为25～60℃。
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