CN101327335A

CN101327335A - 3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物作为组织工程材料的应用

Info

Publication number: CN101327335A
Application number: CNA200710112203XA
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 谢文朋; 赵伟; 梁延省; 胡亚军
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2007-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2008-12-24

Abstract

本发明提供了3－羟基丁酸、4－羟基丁酸和3－羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。已经证明，本发明的共聚物P(3HB－co－4HB－co－3HHx)易加工成型，并且对多种细胞具有良好的生物相容性和生物降解性，能显著地促进细胞生长。本发明还提供了聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂肪酸共混物包含3－羟基丁酸、4－羟基丁酸二聚物和3－羟基丁酸、3－羟基己酸二聚物。

Description

3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物作为组织工程材料的应用

技术领域

本发明涉及新型生物材料3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HHx)作为组织工程生物材料的应用。

背景技术

组织工程材料概述

组织工程(Tissue Engineering)是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的生物活性替代物的一门科学。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞-生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的(Vacanti &Langer，1999)。

可降解的支架材料、种子细胞与细胞生长调节因子并称为组织工程的三大基本要素。其中寻找合适的支架材料备受人们关注，组织工程支架材料的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，有利于细胞的粘附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。除了符合一般生物医学材料的要求外，组织工程学所需的理想生物材料还需满足如下要求：1)具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2)具有可降解性及适宜的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解；3)具有符合细胞、组织器官要求的生物力学强度；4)良好的表面活性：有利于细胞贴附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境；5)便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到体内后能保持原有形状(Shin et al，2003；Drury et al，2003；Takezawa，2003)。

目前比较常用的可作为组织工程支架的材料主要有几大类型，其一为天然材料，包括胶原、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、毛发及血管等；其次是合成高分子材料，如聚氨酯、硅橡胶、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐等。此外还有一类为复合材料(Shin et al，2003；Drury et al，2003；Takezawa，2003)。自20世纪80年代末以来的10多年时间，关于组织工程材料的研究发展十分迅速，Advanced TissueScience公司已有商品化人工皮肤Derma graft出售，用于治疗大面积烧伤(Athanasiou et al，2000)。随着研究的深入更多的组织工程材料也将涌现。

但总体上讲，理想的组织工程支架材料尚未发现，相关研究都集中在对现有材料的改性与复合，各种材料表面处理与修饰技术、材料加工技术等(Shin et al，2003；Drury et al，2003；Takezawa，2003)。

PHA在组织工程中的应用

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates或PHA)是细菌细胞内合成的一类高分子化合物。它的产生是在营养不平衡的环境下，细菌将多余的物质转化为碳源和能源的储备物，同时将水溶性的小分子转化为水不溶性的大分子PHA(Wang et al，1998)。PHA的结构通式可表示为式(1-1)，与化学合成的高分子材料相比，依单体的组成不同，PHA具有从坚硬的晶体到柔软的弹性体等一系列不同的聚合物性质。由于PHA的力学性能与某些热塑性材料如聚乙烯、聚丙烯类似，但又可完全降解进入自然界的生态循环，因而被认为是一种可能替代传统的不可降解的、由石油合成的塑料的“生物可降解塑料”(Lee，1996)。

R为取代基，可为饱和或不饱和、直链或支链的C₁-C₁₉的烷基。m为聚合度。n＝1、2或3。优选地，n＝1。例如，当n＝1，R＝甲基时，PHA单体为羟基丁酸(hydroxybutyrate或HB)；R＝乙基时为羟基戊酸(hydroxyvalerate或HV)；R＝丙基时为羟基己酸(hydroxyhexanoate或HHx)；R＝丁基时为羟基庚酸(hydroxyheptanoate或HHp)；R＝戊基时为羟基辛酸(hydroxyoctanoate或HO)等。

正因为PHA同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，此外还具有光学活性、压电性、气体相隔性等很多高附加值性能，同时随着PHA发酵工艺和合成手段的提高，PHA已能规模生产，使其在价格上更具优势(Cai & Cheng，2001)。所以作为生物医用材料，这已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。

聚3-羟基丁酸酯(PHB)是最早被应用于骨折固定材料的PHA，但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。将3-羟戊酸(3HV)引入PHB主链，形成3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)，可改善PHB的上述缺点。Rivard等用PHB/9％PHV组成的PHBV共聚物制成三维立体泡沫用作软骨细胞、成骨细胞培养支架，细胞均匀地分散在整个聚合物基质中，呈良好的粘附、增殖状态，并在培养21天时细胞生长达最大密度(Rivardet al，1996)。但PHBV共聚物还存在机械性能差、骨结合力弱等问题。3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)是作为PHB及PHBV的替代产品出现的，其体外细胞亲和性研究发现，该材料制成膜或三维支架后有利于成纤维细胞(Yang et al，2002)，软骨细胞(Deng et al，2002)，骨髓基质干细胞(Yang et al，2004)等黏附和增殖，并能够促进软骨细胞外基质的形成(Deng et al，2003)。经过脂肪酶处理(Zhaoet al，2002)或与PHB共混(Deng et al，2002)能够显著提高其细胞亲和性，但是从降解实验来看，PHBHHx虽然能在磷酸缓冲液(PBS)中降解，但仍然存在着降解较慢的问题，这将不利于体内移植后的组织重建(Wang et al，2004)。将PHBHHX做成狗食管支架，一段时间后结果显示，虽然PHBHHx支架利于组织再生，但是PHBHHx降解缓慢，不利于食管组织重建(Chen & Wu，2005)。

PHA家族中由于单聚物、共聚物及共混物种类的众多，所以同时具备了多种多样的性能。随着PHA研究进一步的发展，除了单聚物，二聚物，人们发现了更加新型的更多单体的PHA共聚物(Tajima et al，2003；Abe et al，1994)。这种PHA在单体组成上比PHBHHx等二聚物PHA有更多的变化，机械性能也更加优良，根据单体组成不同其性能可以从硬塑料到弹性体之间有很大调节空间，有着非常广阔的应用前景(Matsusaki et al，2000)，将比已经实现产业化的几种PHA材料具有更加优良的性能，能够满足更多的应用需求。

目前，仍然需要具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时具有一定机械强度和延展性的新型生物材料。

发明内容

本发明一方面提供了3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。

优选地，所述共聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2～15％，3-羟基己酸单体的摩尔比可以为5～30％。更优选地，所述共聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2～5％，3-羟基己酸单体的摩尔比可以为15～25％。根据一个特别优选的实施方式，4-羟基丁酸单体的摩尔比为3.5％，3-羟基己酸单体的摩尔比为22.7％。

本发明的新型生物材料3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HHx)，已被证明对很多细胞都有很好的生物相容性，并且具有较好的生物降解性，是一种新型的的生物医用材料。该类聚酯可以由微生物发酵方法获得。通过在三聚物制成的膜上培养细胞显示，该类三聚物能显著的促进细胞的生长。因为是生物合成材料，所以它拥有化学合成材料所不能比拟的一些特性如：可降解性，好的组织相容性等，因此可以作为一类生物材料应用到组织工程中。

本发明所提供的3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基已酸共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HHx)是一种比PHB、PHBV、PHBHHx等更优秀的组织细胞相容性的材料。P(3HB-co-4HB-co-3HHx)具有好的机械强度和延展性，可以加工成型，符合组织工程对材料的要求。

本发明中的新型生物材料P(3HB-co-4HB-co-3HHx)与已有的应用于组织工程中的生物材料如PHB和PLA相比，具有以下特点：(1)是完全由微生物合成的生物高分子材料，具有很好的生物可降解性；(2)具有有机溶剂的溶解性；(3)易加工成型；(4)具有细胞相容性；(5)具有更好的促进细胞生长增殖的能力。

本发明另一方面提供了聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂肪酸共混物包含3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物。

优选地，在所述共混物中，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比在1∶4～4∶1的范围内。根据一个特别优选的实施方式，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比大约为1∶2。

优选地，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为5～20％。

优选地，3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比可以为5～20％。

根据一个特别优选的实施方式，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比为12％；并且3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为12％。

本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物特别适合用作组织工程支架材料。

本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物可用于制备各种组织工程用品，例如但不限于支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨修补物、组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、牙齿移植材料或者心包膜等。

由于本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物具有良好的促进细胞粘附和生长的性能，因此可用作细胞或组织生长附着材料，尤其适合于软骨细胞、间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞和胚肺细胞。

附图说明

图1显示了人间充质干细胞在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜材上的增殖。对照样品：细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜。Nofilms：不加膜。

图2显示了小鼠成骨细胞MC3T3在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜材上的增殖。对照样品：细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜。

图3显示了小鼠成纤维细胞L929在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜材上的增殖。对照样品：细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜。

图4显示了人胚肺细胞HLF在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜材上的增殖。对照样品：细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜。

图5显示了MTT法检测不同比例混合的P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)及对照对兔软骨细胞增殖的影响。柱状图(自左至右)所对应的材料依次示于图右侧的框中(自上至下)。其中P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝2∶4组和P3HB4HBHHx组和TCL组相比有显著差异，p＜0.05。n＝6。

图6显示了P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)共混物的热学性质，从图中可以看出不同比例的混合物都只有一个Tg(玻璃化转化温度)，即P(3HB-co-12％4HB)和P(3HB-co-12％HHx)是相容的。

具体实施方式

本发明所指的3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物可以是3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸任何单体比例的三聚物，也可以是该三聚物的共混物，三聚物的表面改性复合物，三聚物的表面处理修饰物等。

在本发明的聚合物中，对三种单体的比例没有特别的限制。但是，优选的4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2～15％，3-羟基己酸单体的摩尔比可以为5～30％。

本领域中已知多种对聚合物进行表面改性和表面处理的方法，可由本领域技术人员根据具体需要确定采用何种方法。

术语“3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物”是指由3-羟基丁酸单体和4-羟基丁酸单体聚合而成的二聚物。

本发明的共聚物和共混物所适用的细胞包括兔软骨细胞、人间充质干细胞，MC3T3成骨细胞，小鼠成纤维细胞L929，人胚肺细胞HLF等，但不限于这些细胞。

本发明的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)新材料以及其它的对照样品成膜之后，用来培养人间充质干细胞72小时，经过MTT分析来检测对比细胞的生长情况。试验结果显示，四组中PLA膜上生长的细胞最少，而P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜上生长的细胞数量高于各对照组，且具有显著差异性(p＜0.05)(图1)。该试验结果说明，对比不加膜的培养板、PLA膜、PHBHHx膜而言，至少在培养人间充质干细胞上，新材料P(3HB-co-4HB-co-3HHx)具有更优的生物相容性。

相对于对照组，小鼠成骨细胞MC3T3、小鼠成纤维细胞L929和人胚肺HLF在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)上生长的更好(图2，图3，图4)，因此P(3HB-co-4HB-co-3HHx)比其他三种材料有更好的生物相容性。

与对照相比，本发明的包含P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-HHx)的共混物可显著促进兔软骨细胞的增殖。

实施例1：P(3HB-co-4HB-co-3HHx)的获得

P(3HB-co-4HB-co-3HHx)的生产菌株可以通过对中国专利申请03146663.X(公开号CN 1570085A)中公开的嗜水气单胞菌CGMCC NO0911(该菌株已于2003年3月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)进行基因工程改造而获得，其中将phaPCJ基因插入到质粒中然后转入到嗜水气单胞菌中构成重组菌。所涉及的操作均为常规技术，可参考《分子克隆实验指南》等工具书。

本实施例还提供了P(3HB-co-4HB-co-3HHx)的采用不同菌株的另一种备选的制备方法。

菌种：带有PHBHHx合成基因phaPCJ的嗜水气生单胞菌Aeromonas hydrophila 4AK4(phaPCJ)(清华大学生物系微生物实验室提供)。

上述两种菌株的培养方法是相似的，如下文所述。

LB培养基(Luria-Bertani Broth media)：5g/L酵母浸出物；10g/L胰蛋白胨；10g/L NaCl

基本矿物盐培养基(Mineral media)：9g/L Na₂HPO₄·12H₂O；1.5g/L KH₂PO₄；1g/L(NH4)₂SO₄；0.41g/L MgSO₄；0.05g/LFe(III)-NH₄-citrate；0.02g/L CaCl₂·2H₂O和1ml的微量元素。

微量元素(每升1mol/L HCl含有)：100mg ZnSO₄·7H₂O；30mgMnCl₂·4H₂O；300mg H₃BO₃；200mg CoCl₂·6H₂O；10mgCuSO₄·5H₂O；20mg NiCl₂·6H₂O和30mg NaMnO₄·2H₂O

本实施例操作如下：

A.hydrophila 4AK4(phaPCJ)在LB培养基(含有50μg/mlkanamycin)中30℃、200rpm培养过夜作为种子液，按照5％的接种量将种子液接种到100ml发酵培养基(MM培养基，含有50μg/mlkanamycin)中，并加入十二酸(8g/L)，30℃、200rpm培养(48h)小时。培养期间，添加1，4-丁二醇(4g/L)作为底物生成4-羟基丁酸单体的摩尔比为3.5％，3-羟基己酸单体的摩尔比为22.7％的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)材料。

摇瓶培养48小时后，离心(5000rpm，15分钟)收集菌体，收集的细胞用蒸馏水和乙醇洗涤两次。冰冻干燥，用研钵将菌体磨碎，称重，加入10倍体积的氯仿，加盖密闭。100℃烘箱中4小时。冷却至室温后，抽滤，用10倍体积的无水乙醇沉淀，再次抽滤，去除氯仿和乙醇；真空干燥，得到新材料P(3HB-co-4HB-co-3HHx)。

具有不同4-羟基丁酸和3-羟基己酸单体摩尔比的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)材料，可以通过对所用的底物浓度进行适当调整而制得。

实施例2：人间充质干细胞在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜表面的增殖

聚合物溶解展膜的试剂：三氯甲烷；

聚合物提纯和溶解加热回流的温度：60℃；

聚合物提纯和溶解加热回流的时间：0.5小时；

膜表面细胞增殖测定的对照：聚乳酸(PLA)(分子量约为30-40万)；

PHBHHx(分子量约为44万)

24孔培养板(不加PHA膜)

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持0.5小时，使已纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)聚合物(4-羟基丁酸单体的摩尔比为3.5％，3-羟基己酸单体的摩尔比为22.7％，参见实施例1)完全溶解于三氯甲烷，室温下展膜，经冰冻干燥去除残余在膜中的有机溶剂。将膜剪至24孔板孔的大小，将其完全浸入75％乙醇中过夜灭菌，用磷酸缓冲液(PBS pH7.4)反复荡洗，去除残余的乙醇。取生长旺盛的人间充质干细胞接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清和5ng/ml的DMEM培养基，使初始的细胞浓度在2×10⁴个/ml，置于37℃ CO₂培养箱中培养72小时。去除培养基，用PBS(pH 7.4)荡洗，加入0.1ml噻唑兰(MTT)和0.9ml基本培养基DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液后加入1ml DMSO(二甲基亚砜)室温放置30分钟，取0.15ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪双波长模式(540nm和690nm)下测定吸光度值。结果示于图1中。

实施例3：小鼠成骨细胞MC3T3在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜表面的增殖

聚合物溶解展膜的试剂：三氯甲烷；

聚合物提纯和溶解加热回流的温度：60℃；

聚合物提纯和溶解加热回流的时间：1小时；

PHBHHx(分子量约为44万)

24孔培养板(不加膜)

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实施例2中的组成)完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化。将纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液中，室温下展膜。将膜完全在75％的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过夜灭菌，用PBS(pH 7.4)反复洗三次，去除残液。取生长旺盛的MC3T3细胞接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，使初始的细胞浓度在2.0×10⁴个/ml，置于37℃ CO₂培养箱中培养48小时。去除培养基用PBS(pH 7.4)荡洗，加入1ml MTT和9ml DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS(pH7.4)荡洗，加入10ml DMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540nm和690nm测定吸光度值。结果示于图2中。

实施例4：小鼠成纤维细胞L929在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜表面的增殖

聚合物溶解展膜的试剂：三氯甲烷；

聚合物提纯和溶解加热回流的温度：60℃；

聚合物提纯和溶解加热回流的时间：1小时；

PHBHHx(分子量约为44万)

24孔培养板(不加膜)

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实施例2中的组成)完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化。将纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液中，室温下展膜。将膜完全在75％的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过夜灭菌，用PBS(pH 7.4)反复洗三次，去除残液。取生长旺盛的成纤维细胞L929接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，使初始的细胞浓度在1.0×10⁴个/ml，置于37℃CO₂培养箱中培养48小时。去除培养基用PBS(pH 7.4)荡洗，加入1ml MTT和9ml DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS(pH 7.4)荡洗，加入10mlDMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540nm和690nm测定吸光度值。结果示于图3中。

实施例5：人胚肺(HLF)细胞在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜表面的增殖

聚合物溶解展膜的试剂：三氯甲烷；

聚合物提纯和溶解加热回流的温度：60℃；

聚合物提纯和溶解加热回流的时间：1小时；

PHBHHx(分子量约为44万)

24孔培养板(不加膜)

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实施例2中的组成)完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化。将纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液中，室温下展膜。将膜完全在75％的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过夜灭菌，用PBS(pH 7.4)反复洗三次，去除残液。取生长旺盛的人胚肺(HLF)细胞接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清的1640培养基，使初始的细胞浓度在2.0×10⁴个/ml，置于37℃ CO₂培养箱中培养48小时。去除培养基用PBS(pH 7.4)荡洗，加入1ml MTT和9ml无血清1640继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS(pH7.4)荡洗，加入10ml DMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540nm和690nm测定吸光度值。结果示于图4中。

实施例6：P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)共混物的制备

P(3HB-co-12％4HB)与P(3HB-co-12％HHx)以下列比例混合(w/w)：

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝0∶6

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝1∶5

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝2∶4

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝3∶3

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝4∶2

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝5∶1

P(3HB-co-12％4HB)∶P(3HB-co-12％HHx)＝6∶0

按照以上比例准确称量P(3HB-co-12％4HB)和P(3HB-co-12％HHx)共1.8g，加入100ml三氯甲烷中，65℃水浴中回流，待材料溶解后，倒入直径15cm的玻璃培养皿中，于通风橱中干燥。待干燥成膜后，真空冷冻干燥2天，以彻底除去三氯甲烷。

实施例7：用DSC(热差扫描量热仪)检测P(3HB-co- 12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)共混物热学性质

称取2mg共混物，放入DSC，检测程序如下：

1：平衡温度于-60.00℃

2：等温1.00分钟

3：以10.00℃/分钟的速度升高到180.00℃

4：等温2.00分钟

5：第一轮循环结束

6：降低温度到-60.00℃

7：温度平衡在-60.00℃

8：等温1.00分钟

9：第二轮循环结束

10：以10.00℃/分钟的速度升高到180.00℃

11：第三轮循环结束

结果示于图6中。

实施例8：兔软骨细胞的分离及培养

(1)取1月龄新西兰兔一只，兔耳静脉注射5ml空气致死。

(2)游离并用骨剪截取肱骨头、股骨头及膝关节，置入无菌平皿。

(3)带入超净工作台作如下操作：先用生理盐水充分漂洗，离断髌韧带，内外侧副韧带以及前后交叉韧带，切开膝关节，刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，D-Hanks液充分漂洗。用尖刀片充分利用软骨的弹性，削下每个关节表面的软骨，不要误带软骨下骨和骨膜，一般以不渗血为度。充分漂洗软骨小块，更换洗液3次。用眼科小剪刀剪碎至1mm大小，用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。

(4)吸去漂洗液，加入0.25％胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5％CO₂孵箱中消化30分钟，中途不时摇晃。

(5)加入0.2％II型胶原酶5ml，置37℃水浴中消化45min，将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出，120目尼龙网筛过滤，所得滤液放入一无菌离心管内，1200r/min离心8min，弃上清，加入5ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化，1200r/min离心5min，弃去上清液，只留下细胞球，并加入少量含有血清的培养液吸打后先封口置放。原消化瓶中再加入0.2％II型胶原酶5ml，如前法消化45min，消化后的处理同上。然后把2次消化所得的软骨细胞悬液合并在一起。

(6)10％FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X10⁴。

(7)将细胞悬液接种于6孔培养板，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

实施例9：MTT法检测P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx) 共混物对兔软骨细胞增值的影响

(1)将制备好的P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)共混膜剪成24孔培养板的孔一样大小的小块，70％的酒精消毒过夜，PBS洗两次，铺在24孔板上待用。同时设置对照：不加任何膜的培养板TCL、PLA、P3HB4HBHHx(4HB含量为1.2mol％)。每组设6个平行样，一个空白对照。

(2)0.25％胰蛋白酶消化兔软骨细胞6分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液，血球计数板计数。

(3)将消化好的兔软骨细胞以2×10⁴/孔的密度接种到铺有P(3HB-co-12％4HB)/P(3HB-co-12％HHx)共混物及对照的24孔培养板上。每孔加1ml含10％FBS的DMEM培养液。

(4)37℃，5％CO₂培养箱培养72小时之后，吸掉培养液，加入0.9ml无血清培养液和0.1mlMTT[5mg/ml溶于PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.2)]，继续置培养箱中培养4小时，可见细胞被染成蓝紫色。

(5)吸掉无血清培养液和MTT混合液，每孔加1ml DMSO。置摇床上振荡半个小时，以使DMSO充分溶解蓝紫色的结晶。

(6)将24孔培养板中的DMSO吸到96孔培养板，酶标仪读取540nm和690nm处的吸光值。

结果示于图5中。

本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内客包括在本文中。

应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

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Claims

1.3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其中在所述共聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比在2～15％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在5～30％范围内。

3.根据权利要求2的应用，其中在所述共聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比在2～5％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在15～25％范围内。

4.根据权利要求3的应用，其中在所述共聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比在20～25％范围内。

5.聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂肪酸共混物包含3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物。

6.根据权利要求5的应用，其中所述共混物中，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比在1∶4～4∶1的范围内。

7.根据权利要求5的应用，其中所述共混物中，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比大约为1∶2。

8.根据权利要求5的应用，其中所述3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比为5～20％。

9.根据权利要求5的应用，其中所述3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为5～20％。

10.根据权利要求5的应用，其中所述3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比为12％；并且所述3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为12％。

11.根据权利要求1-10之任一项的应用，其中所述共聚物或共混物用作组织工程支架材料。

12.根据权利要求1-10之任一项的应用，其中所述共聚物或共混物用于制备支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨修补物、组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、牙齿移植材料或者心包膜。

13.根据权利要求1-10之任一项的应用，其中所述共聚物或共混物用作细胞或组织生长附着材料。

14.根据权利要求13的应用，其中所述细胞选自软骨细胞、间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞和胚肺细胞。