CN101322782B - 禹白附抗艾滋病的新用途及其有效部位的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及禹白附抗艾滋病的新用途及其有效部位的提取分离方法。该方法是取原生药材，用30％乙醇萃取，上清干燥；取干粉进行大孔树脂柱层析，得到AA、AB、AC、AD、AE 5种部位，其中AB和AC为有效部位；取AB 300mg进行葡聚糖凝胶柱层析，共收集10个流份，根据薄层合瓶，取2、3、4瓶150mg再进行反相C-18柱层析，用水、水∶甲醇分别为8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的甲醇溶液及纯甲醇依次洗脱，其中水∶甲醇＝2∶8的洗脱物为有效部位A302；取AC 200mg进行葡聚糖凝胶柱层析，共收集10个流份，根据薄层合瓶，其中第6、7流份为有效部位B6。本发明的实验表明禹白附30％乙醇提取物及有效部位AB、AC、A302和B6具有很好的抗艾滋病病毒的活性，可用于制备抗艾滋病的药物。

Description

禹白附抗艾滋病的新用途及其有效部位的提取分离方法

技术领域

本发明涉及艾滋病防治药物，具体涉及具有艾滋病病毒抑制活性的天然药物提取物，更具体地涉及禹白附抗艾滋病病毒的新用途及其有效部位的提取分离方法。

背景技术

艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune DeficiencySyndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)感染所导致的以全身免疫系统的严重损害为特征的，患者易于发生机会性感染以及肿瘤的各种临床综合征。全球约95％以上的HIV感染是由HIV-1造成的。

自1981年美国报道首例艾滋病患者以来，艾滋病在全球迅速蔓延，给人类带来了严重灾难。根据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织于2007年11月底共同发布的《2007年全球艾滋病流行最新报告》结果显示，2007年全球新增艾滋病病毒感染者约250万，同时全球又约有210万人死于艾滋病，全球艾滋病病毒感染者的人数达到3320万。自1981以来，全球已有超过2500万人死于艾滋病。而在我国形势也不容乐观，2007年，中国卫生部、联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合对中国艾滋病疫情进行了新的估计，根据最新评估结果，截止2007年底，中国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万，其中艾滋病病人8.5万(8万～9万人)；2007年新发艾滋病病毒感染者5万(4万～6万人)，因艾滋病死亡2万(1.5万～2.5万人)。

要从根本上防治艾滋病，疫苗是最好的选择。一个理想的疫苗应该是广谱、高效、低毒、价廉。然而由于艾滋病毒的高度变异及强大的逃逸功能，使得疫苗的研究变得十分艰难，在可预见的将来，这样的疫苗要获得成功还要有很长的路要走。因此研发具有抗艾滋病病毒的药物仍是一个十分艰巨且迫切的任务。

HIV-1为RNA逆转录病毒，属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒亚属(Lentivirus)，是一种直径约为100nm的球状病毒颗粒，病毒最外层为包膜，是由细胞的胞浆膜和嵌于其中的病毒糖蛋白(外膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41)组成的脂质双层膜，膜内侧紧贴p17基质蛋白，病毒的核心部分呈截头圆锥状，是由p24衣壳蛋白(capsid，CA)及两条单链正链RNA和酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)组成。

HIV-1的复制周期包括：与受体结合(吸附)，融合，脱衣壳，逆转录，整合，转录，翻译，组装、成熟和出芽等9个步骤，HIV-1的复制周期见图1-2所示。当HIV-1侵入人体后，HIV-1首先通过其表面糖蛋白gp120特异性地识别CD4细胞(主要是T细胞和巨噬细胞)，并与细胞膜受体CD4紧密结合，导致gp120的构象发生改变，继而与细胞膜上的协同受体CXCR4或CCR5结合，诱导HIV-1 gp41融合蛋白在细胞膜上打孔。然后，病毒除包膜以外的所有成分全部通过穿孔进入淋巴细胞内部；病毒核心部分进入宿主细胞后，在逆转录酶的作用下，病毒的单链RNA逆转录为双链DNA，双链DNA在整合酶的作用下与宿主细胞染色体DNA整合形成前病毒(provirus)；HIV前病毒在细胞里可以长期潜伏，也可随着细胞染色体的复制而复制，首先前病毒基因利用宿主细胞的酶系统转录生成基因组RNA和信使RNA，信使RNA翻译生成病毒的各种蛋白及酶类；病毒基因组RNA与新产生的HIV蛋白质和酶类一起组装形成新的病毒颗粒，形成的颗粒通过芽生的方式从宿主细胞膜获得包膜而释放出来。新生成的病毒再去感染其它的CD4细胞，从而使人体的免疫系统受到损害，造成人体免疫功能的低下，导致各种疾病的发生。

从理论上讲，HIV-1复制周期各个阶段中所涉及的蛋白都可作为研发抗HIV-1药物的作用靶点，但实际上，20多年来抗HIV/AIDS药物的研发主要针对HIV-1的逆转录酶、蛋白酶、整合酶以及吸附融合蛋白过程进行的。到目前为止，经美国FDA批准的用于治疗艾滋病的29种药物(包括复方制剂fixed-dose combinations)可归划为5大类，分别为：核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside/Nucleotide ReverseTranscriptase Inhibitors，NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(nonNucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors，nNRTIs)、整合酶抑制剂(Integrase Inhibitors)、蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors，PIs)、融合抑制剂(Entry/Fusion Inhibitors)。

临床上治疗艾滋病主要采用联合用药的模式，即将以上几类药物以不同的组合方式使用，如著名的高效抗逆转录病毒疗法(HighActive Anti-Retroviral Therapy，HAART)，该疗法可减少患者体内的病毒载量，达到延长患者生命的效果。但由于这些药物均是由化学合成的方法获得，具有价格昂贵，毒副作用强，耐药性不断发生，且停药后易反弹，不能彻底清除人体内的HIV等缺点，因而在一定程度上限制了其的应用。而天然产物具有结构多样性、生物活性多样性、较低的毒副作用以及广泛的来源等特点，在研发新药及药物先导化合物中发挥越来越重要的作用。因此，如何从天然产物中研发出作用于HIV-1生活周期各个靶点的高效、无毒、价廉的药物已成为新的研究热点。

禹白附为天南星科植物独角莲Typhonium giganteum Engl.的块茎，《四川中药志》记载其性大温，味辛、甘，有毒。归胃、肝二经。能镇痉止痛，祛风痰。治中风失音，心痛血痹，偏正头痛，喉痹肿痛，破伤风。江西《中草药学》记载其解毒，通络。药化研究表明其含有多种氨基酸，内消旋肌醇(meso-inositol)，β-谷甾醇(β-sitosterol)及其葡萄糖苷，胆碱(choline)，尿嘧啶(uracil)，琥珀酸，油酸，亚油酸，三亚油酸甘油脂，棕榈酸，二棕榈酸甘油酯，禹白附凝集素等。现代药理学研究证明禹白附具有抗结核杆菌、抗凝血以及镇痛的作用。临床上可用于治疗颜面神经麻痹，风痰中络，口蜗失语，半身不遂，破伤风，肿痛疔疮，毒蛇咬伤以及颈淋巴结结核等。

目前尚无禹白附及其有效部位抗艾滋病病毒方面的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供禹白附有效部位的提取分离方法。

本发明的另一目的是提供禹白附及其有效部位抗艾滋病的新用途。

禹白附30％乙醇提取物及其有效部位AB、AC、A302和B6的提取分离方法如下：

(1)称取原生药材切成丝状或片状，加入30％乙醇冷浸，在25～30℃下，冷浸24小时，滤去残渣，取冷浸液，离心分离，弃沉淀取上清液，于50～60℃旋转蒸发干燥上清液，得到禹白附30％乙醇提取物干粉；

(2)称取禹白附30％乙醇提取物干粉，加水溶解，经大孔吸附树脂HPD450柱层析，用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇依次洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，旋转蒸发回收各洗脱液，分别得到水洗脱物干粉AA、30％乙醇洗脱物干粉AB、50％乙醇洗脱物干粉AC、70％乙醇洗脱物干粉AD、95％乙醇洗脱物干粉AE 5种部位，其中AB和AC为有效部位；

(3)称取有效部位AB 300mg，用少量50％甲醇溶解，经葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，取第2、3、4流份合瓶后的样品150mg再进行反相C-18填料柱层析，用水、水与甲醇体积比分别为8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的甲醇溶液及纯甲醇依次进行洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，收集各洗脱液，旋转蒸发，干燥备用，其中水∶甲醇＝2∶8的洗脱物为有效部位A302；

(4)称取有效部位AC 200mg，用少量50％甲醇溶解，进行葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，其中第6、7流份合瓶后的样品为有效部位B6。

本发明所述的禹白附为天南星科植物独角莲Typhoniumgiganteum Engl.的块茎，新鲜采挖，未经炮制处理。本发明以吉林和河南省产的禹白附为原料，但并不以此限制本发明，还应包括四川、河北、北京、山西、陕西、山东、安徽、广东、云南、贵州、辽宁等国内各个省份的禹白附原料。本发明还应包括独角莲的种子和地面上的茎叶。

本发明步骤(1)和(2)中的洗脱液不只限于乙醇，还可采用其它有机溶剂，如：甲醇、正丁醇、乙醚、石油醚、二氯甲烷或氯仿等。

本发明经体外抗艾滋病病毒试验，从大量天然植物药中筛选到具有抑制艾滋病病毒活性的禹白附，并从禹白附提取物中得到具有抗-HIV作用的30％乙醇提取物及有效部位AB、AC、A302和B6。

本发明的实验表明，禹白附30％乙醇提取物及有效部位AB、AC、A302、和B6具有很好的抗艾滋病病毒的作用，可用于制备抗艾滋病的药物。

本发明所述的禹白附30％乙醇提取物及有效部位AB、AC、A302、和B6作为药物活性成分，可以制备成常规的药物剂型，例如，口服剂型(胶囊剂、口服液、颗粒剂、片剂)和注射剂。

与现有的抗逆转录病毒药物明显不同的是：有效部位AC与gp41融合蛋白有较好的结合，说明gp41融合蛋白可能是有效部位AC的作用靶点之一。有效部位A302、B6与vif均有较好的结合，说明vif可能为A302、B6的作用靶点之一。

由于禹白附是天然植物，来源广，毒副作用较低，比人工合成的逆转录酶抑制剂更有优势，所以具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：细胞对照组的显微照相图；

图2：病毒对照组的显微照相图；

图3：禹白附30％乙醇提取物组的显微照相图；

图4：禹白附有效部位AB组的显微照相图；

图5：禹白附有效部位AC组的显微照相图；

图6：阳性对照药AZT组的显微照相图；

图7：禹白附有效部位A302组的显微照相图；

图8：禹白附有效部位B6组的显微照相图；

图9：禹白附有效部位AC组的作用靶点图；

图10：禹白附有效部位B6组的作用靶点图；

图11：禹白附有效部位A302组的作用靶点图。

具体实施方式

以下通过试验例与附图进一步阐述本发明抗HIV效果。

试验例1：禹白附30％乙醇提取物及其有效部位抗HIV-1IIIB病毒的作用

1、细胞病变检测法(CPE)检测有效部位对HIV-1的抑制作用

(1)材料

细胞、试剂与仪器：MT4细胞和HIV IIIB病毒由本实验室自行培养。RPMI 1640培养基，特优级胎牛血清(美国GIBCO公司)，普通倒置显微镜(重庆光学仪器厂)，台式高速冷冻离心机(德国HERAEUS公司)，相差倒置显微摄像系统(日本OLYMPUS公司)，生物安全柜(美国BAKER公司)。

(2)方法

CPE方法检测样品对HIV-1的抑制作用：取换液后24小时的MT4细胞，调制浓度为250万/10mL/96孔板，实验时先将96孔板划线分组，每个样品1组，每组6个浓度，每个浓度3复孔(1孔细胞毒对照，3孔样品)；每孔先加入100μL 1640完全培养基，然后把不同浓度的样品加入相应的孔；再向细胞毒对照组和正常细胞对照组的各孔分别加入100μL(2.5万细胞/100μL/孔)调制好的细胞液；随后将200TCID₅₀的HIV-1IIIB病毒与剩余的MT4细胞混匀，放入5％CO₂培养箱中37℃培养30min；向各个样品孔和病毒对照孔分别加入100μL预温好的细胞病毒混悬液，放置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，3天后换药1次，第6天观察结果，并用相差倒置显微摄像系统结合CPE法对结果进行照相，之后再用以下方法对结果进行评判，抑制率根据公式1计算。

$\mathrm{IR}=(1-\frac{\mathrm{CC}-\mathrm{TT}}{\mathrm{CC}-\mathrm{VC}})\×100\%$ 公式1

IR为抑制率，CC为细胞对照组，VC为病毒对照组，TT为实验组，1为总有效率。

当细胞对照生长正常，可以设定CC＝1，TT和VC则是1以下相应小数，根据图像结果对VC的活细胞数进行百分比估算，正常情况下VC的活细胞数低于CC的30％以下，其余实验组依次类推。

(3)结果

CPE检测法实验结果见表1。

2、p24抗原检测法检测有效部位对HIV-1的抑制作用

对样板条的各孔分别进行编号；每个反应孔中加入25μL裂解液(空白孔不加)；将100μL待测样品或对照品加入到有裂解液的反应孔中，振荡30～60秒混匀，置37℃孵育1小时；洗板5次，拍干后每孔加入酶结合物125μL/孔(空白孔不加)，置37℃孵育45分钟；洗板5次，拍干后每孔加入混合后的底物液：显色剂(1∶1)125μL/孔，置37℃孵育15分钟；加入终止液50μL/孔；用酶标仪读数，波长450nm(推荐使用双波长，参考波长630nm)。抑制率根据公式2计算。

公式2

p24抗原检测法实验结果见表2。

由表1和表2的结果可见，禹白附30％乙醇提取物及其有效部位AB、AC、A302和B6均具有较好的抗病毒作用，特别是A302和B6，当剂量各自分别为125μg/ml时，CPE检测法的抗病毒抑制率均为78.57，而p24抗原检测法抑制率分别为74.88和73.71，两种结果非常接近，两组数据具有明显的相关性，相关系数≈0.99。从上表的结果可见，两种检测方法都证明禹白附30％乙醇提取物、AB、AC、A302和B6具有较好的抗病毒作用。采用上述两种方法进行检测可以发挥优势互补相互验证的作用，能够显著提高实验的可信度。结果还显示有效部位A302和B6的抗病毒作用比AB和AC的抗病毒作用还强。

从上表不难发现两种检测法所测的禹白附30％乙醇提取物、AB、AC、A302和B6的治疗指数均大于10，根据《抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则》中“一般认为治疗指数大于10的药物具有体外抗HIV活性”。

再见禹白附30％乙醇提取物、AB、AC、A302、B6的显微照相图1-8。

图1是细胞对照组，从图1可见，细胞对照组的MT4细胞生长状态良好，细胞成团成片生长，各自独立但又相互通过纤毛连接，胞膜圆润光滑，胞浆晶莹饱满有光泽，细胞数量比病毒对照组明显增加，细胞生长正常。

图2是病毒对照组，从图2可见，病毒对照组的细胞生长状态较差，细胞大量死亡，胞膜萎缩，胞浆干瘪无华，细胞数量明显减少，尚存的细胞出现大量合胞体，细胞色泽逐渐黑化死亡，死细胞融合成团，与细胞对照组比较有明显区别，说明病毒的毒力很强。

图3是禹白附30％乙醇提取物组，从图3可见，禹白附30％乙醇提取物组的细胞生长状态明显好于病毒对照组，与细胞对照组相似，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量和生存质量均较病毒对照组显著上升，说明禹白附30％乙醇提取物组的抗HIV效果很强，抑制率为71.43％。

图4是禹白附AB组，从图4可见，禹白附AB组的细胞生长状态明显好于病毒对照组，与细胞对照组相似，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量和生存质量均较病毒对照组显著上升，说明禹白附AB组的抗HIV效果很强，抑制率为78.57％。

图5是禹白附AC组，从图5可见，禹白附AC组的细胞生长状态明显好于病毒对照组，与细胞对照组相似，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量和生存质量均较病毒对照组显著上升，说明禹白附AC组的抗HIV效果很强，抑制率为71.43％。

图6是阳性对照药AZT组，从图6可见AZT(11.8mg/ml)组的细胞生长状态良好，相似但有别于细胞对照组，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜也圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量比病毒对照组明显增加，说明AZT具有很好的抗病毒效果，对HIV的抑制率为85.7％。本实验证明了AZT确实具有很好的抗病毒效果，与临床用药结果相似，说明我们的实验结果有较高的可信度。

图7是禹白附A302组，从图7可见，禹白附A302组的细胞生长状态明显好于病毒对照组，与细胞对照组相似，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量和生存质量均较病毒对照组显著上升，说明禹白附A302组的抗HIV效果很强，抑制率为78.57。

图8是禹白附B6组，从图8可见，禹白附B6组的细胞生长状态明显好于病毒对照组，与细胞对照组相似，细胞成团成片生长，彼此通过纤毛连接成片，未见任何合胞体生成，细胞色泽鲜亮，胞膜圆润光滑有光泽，胞浆晶莹饱满，细胞数量和生存质量均较病毒对照组显著上升，说明禹白附B6组的抗HIV效果很强，抑制率为78.57。

试验例2：禹白附30％乙醇提取物及其有效部位抗HIV作用靶点的研究

(1)方法

采用BIACORE

3000分子对接仪对禹白附的有效部位分别进行了作用靶点的研究。首先打开电脑，启动BIACORE

3000控制软件，调用偶联程序，利用偶联试剂把抗HIV-1药物的靶点蛋白(如gp41，vif)偶联在芯片表面，待用。

再将偶联好靶点蛋白的芯片插入芯片仓内，同时把不同类型不同浓度的待测样品放入仪器指定位置，控制设备到相应位点采集样品进行测定，通过传感图实时观察药物与靶点蛋白分子之间的相互连接作用。

根据图像峰值判断样品是否与靶点有作用及样品的作用程度，由于样品只有与靶点结合才能发挥作用，所以样品与靶点的结合程度越牢固说明样品对靶点的作用程度越强，作用程度越强则图像的峰值越高，通常用RU(μg蛋白/ml，活性单位)代表峰值的高度。峰值越高说明样品对靶点的抑制作用越强。又因为靶点蛋白都是样品的直接作用部位，即样品发挥作用的具体位点，所以靶点的研究能够反映样品的作用原理。如果样品不与芯片上的靶点蛋白反应，图片上则不出现任何峰值，说明该样品的实验靶点蛋白选错，或样品对该靶点没有作用，可以更换以后再试。利用BIACORE3000分子对接仪除了可以判断样品的作用靶点以外，还可以直接判断样品的药理作用及样品的有效部位所在。

(2)结果

图9是禹白附有效部位AC作用靶点图，靶点蛋白是HIV外膜上的gp41融合蛋白，当提取物的浓度为500μg/ml时，与靶点的结合度为151.1RU，结合程度很强，说明有效部位AC的作用靶点可能包括gp41融合蛋白。

图10是禹白附有效部位B6的作用靶点图，靶点是vif基因表达蛋白，当样品的浓度为20μg/mL的浓度时与vif的结合量为59.7RU，结果提示vif表达蛋白可能为B6的作用靶点之一。

图11是禹白附有效部位A302的作用靶点图，靶点是vif基因表达蛋白，当样品的浓度为20μg/mL的浓度时与vif的结合量为69.6RU，结果提示vif表达蛋白为A302的作用靶点之一。

以下通过实施例进一步阐述本发明的制备方法。

实施例1：有效部位AB和AC的制备

称取原生药材禹白附片或丝5公斤，加入原生药材5倍量的30％乙醇，在26℃下冷浸24小时，之后滤去残渣，取冷浸液，以2500转/分离心分离，弃沉淀取上清液，于50℃旋转回收上清液，得到禹白附30％乙醇提取物干粉174.5g。取禹白附30％乙醇提取物干粉5克，加入200ml水溶解，然后经大孔吸附树脂(HPD-450，柱体积823cm³)柱层析，用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇依次洗脱，洗脱液的体积为柱体积的3倍，旋转蒸发回收各洗脱液，分别得到水洗脱物干粉683.43mg、30％乙醇洗脱物干粉695.85mg、50％乙醇洗脱物干粉151.75mg、70％乙醇洗脱物干粉56.91mg和95％乙醇洗脱物干粉18.23mg，其中AB和AC为有效部位。

实施例2：有效部位A302的制备

称取有效部位AB 300mg，用少量50％甲醇溶解，经葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(柱长：95cm，直径：2cm)，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据各样品流份的性状结合薄层层析技术对其进行合瓶并作药效学检测，合瓶方法为：1#流份，2～4#流份，5～7#流份，8～9#流份，10#流份，经细胞生物学检测，其中2～4#流份有较高的抗HIV活性；

称取2～4#流份合瓶后的干燥样品150mg，用去离子水溶解，过滤，进行反相C-18填料柱层析(柱长：45cm，直径：2cm)，用水、水与甲醇体积比分别为8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的甲醇溶液及纯甲醇依次进行洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，收集各洗脱液，旋转蒸发，干燥备用，其中水∶甲醇＝2∶8的洗脱物为有效部位A302。

实施例3：有效部位B6的制备

称取有效部位AC 200mg，用少量50％甲醇溶解，进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(柱长：95cm，直径：2cm)，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据各样品流份的性状结合薄层层析技术对其进行合瓶并作药效学检测，合瓶方法为1#流份，2～3#流份，4～5#流份，6～7#流份，8～9#流份，10#流份，其中6～7#流份为有效部位B6。

实施例4：口服剂型的制备

取实施例1制备的禹白附30％乙醇提取物干粉、有效部位AB和AC干粉加入淀粉，制粒、整粒，制得颗粒剂。

取实施例2制备的有效部位A302，分别加入淀粉，制粒、整粒，压片或装胶囊，制得片剂或胶囊剂。

取实施例3制备的有效部位B6，分别加入淀粉，制粒、整粒，压片或装胶囊，制得片剂或胶囊剂。

实施例5：注射剂的制备

取实施例2制备的有效部位A302和实施例3制备的有效部位B6，加入pH调节剂、渗透压调节剂，制备成注射剂。

表1禹白附30％乙醇提取物及其有效部位对HIV-1的抑制作用

药物	剂量/μg.mL-1	活细胞数(％)	抑制率(％)	IC50/μg.mL-1	TC50/μg.mL-1	TITC50/IC50	统计(P)
								细胞对照		100
病毒对照		30
								AZT	0.0205	90	85.7	1.6	29.2	18.25	＜0.001
30％醇提取物	15.625	80	71.43	11.37	125.34	11.02	＜0.001
								AB	7.813	85	78.57	3.66	239.76	65.45	＜0.001
AC	7.813	80	71.43	4.46	61.28	13.74	＜0.001
								A302	125	85	78.57	47.97	1017.68	21.22	＜0.001
B6	125	85	78.57	28.44	360.66	12.68	＜0.001

表2禹白附30％乙醇提取物及其有效部位对HIV-1的抑制作用

Claims (4)

1.禹白附作为唯一活性成分在制备抗艾滋病的药物中的用途，其中所述的禹白附为天南星科植物独角莲Typhonium giganteum Engl.的块茎。

2.抗艾滋病的禹白附的有效部位AB、AC、A302和B6的组合，其特征在于是由以下方法制备的：

(1)称取原生药材切成丝状或片状，加入30％乙醇冷浸，在25～30℃下，冷浸24小时，滤去残渣，取冷浸液，离心分离，弃沉淀取上清液，于50～60℃旋转蒸发干燥上清液，得到禹白附30％乙醇提取物干粉；

(2)称取禹白附30％乙醇提取物干粉5g，加200ml水溶解，经柱体积823cm3的大孔吸附树脂HPD450柱层析，用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇依次洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，旋转蒸发回收各洗脱液，分别得到水洗脱物干粉AA、30％乙醇洗脱物干粉AB、50％乙醇洗脱物干粉AC、70％乙醇洗脱物干粉AD、95％乙醇洗脱物干粉AE 5种部位，其中AB和AC为有效部位；

(3)称取有效部位AB 300mg，用少量50％甲醇溶解，经柱长95cm、直径2cm的葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，取第2、3、4流份合瓶后的样品150mg再进行柱长45cm、直径2cm的反相C-18填料柱层析，用水、水与甲醇体积比分别为8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的甲醇溶液及纯甲醇依次进行洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，收集各洗脱液，旋转蒸发，干燥备用，其中水∶甲醇＝2∶8的洗脱物为有效部位A302；

(4)称取有效部位AC 200mg，用少量50％甲醇溶解，进行柱长95cm、直径2cm的葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，其中第6、7流份合瓶后的样品为有效部位B6。

3.抗艾滋病的禹白附的有效部位AB、AC、A302和B6的组合的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)称取原生药材切成丝状或片状，加入30％乙醇冷浸，在25～30℃下，冷浸24小时，滤去残渣，取冷浸液，离心分离，弃沉淀取上清液，于50～60℃旋转蒸发干燥上清液，得到禹白附30％乙醇提取物干粉；

(2)称取禹白附30％乙醇提取物干粉5g，加200ml水溶解，经柱体积823cm³的大孔吸附树脂HPD450柱层析，用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇依次洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，旋转蒸发回收各洗脱液，分别得到水洗脱物干粉AA、30％乙醇洗脱物干粉AB、50％乙醇洗脱物干粉AC、70％乙醇洗脱物干粉AD、95％乙醇洗脱物干粉AE 5种部位，其中AB和AC为有效部位；

(3)称取有效部位AB 300mg，用少量50％甲醇溶解，经柱长95cm、直径2cm的葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，取第2、3、4流份合瓶后的样品150mg再进行柱长45cm、直径2cm的反相C-18填料柱层析，用水、水与甲醇体积比分别为8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的甲醇溶液及纯甲醇依次进行洗脱，洗脱液的体积为柱床体积的3倍，收集各洗脱液，旋转蒸发，干燥备用，其中水∶甲醇＝2∶8的洗脱物为有效部位A302；

(4)称取有效部位AC 200mg，用少量50％甲醇溶解，进行柱长95cm、直径2cm的葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20层析，洗脱液为50％甲醇，收集层析样品，流速8滴/分，10ml/流份，共收集10个流份，从第10个流份以后的样品均浓缩合并到第10流份，之后，根据薄层层析进行合瓶，其中第6、7流份合瓶后的样品为有效部位B6。

4.根据权利要求2所述的禹白附的有效部位AB、AC、A302和B6的组合在制备抗艾滋病的药物中的用途。

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