CN101321862B - 增强酶的产生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提高谷粒中酶量的方法，其通过在谷粒受损伤的条件下使谷粒萌发来实现。本发明还涉及用于食品加工和制造业的可得自谷粒的水解酶，还涉及谷粒如大麦的萌发以及从谷粒中分离酶。

Description

增强酶的产生

技术领域

本发明涉及用于食品加工和制造业的可得自谷粒的水解酶，还涉及谷粒(如大麦)的萌发以及从谷粒中分离酶。

背景技术

人们已经发现了谷粒的许多水解酶在多种工业特别是食品加工和制造业中的应用，所述水解酶的实例为极限糊精酶(EC 3.2.1.142)、α和β淀粉酶(分别为EC 3.2.1.1和EC 3.2.1.2)、1-6-β葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β1，4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯木聚糖酶(EC 3.2.1.136)和β葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

这些酶(或称为水解酶)通常可从组织如植物组织(包括谷粒、豆类(pulse)、豆荚(legume)等)和细菌发酵物等获得而用于商业用途。在一些情况下，这些酶可在重组表达系统中产生。

获得用于商业用途的许多水解酶的一些方法中的一个问题是，它们通常提供次优的水解酶产率。因此，获得商业量的水解酶所需的费用相当可观。

需要改进获得水解酶的方法，尤其是与提高水解酶产率有关的改进。

发明内容

总体而言，在一些实施方案中提供了用于提高谷粒中酶的量或表达的方法。

在另一些实施方案中，提供了产生酶相对丰度高的谷粒的方法。

在另一些实施方案中，提供了生产酶的方法。

在又一实施方案中，提供了提取、纯化或分离酶相对丰度高的谷粒中的酶的方法。

一般地，所述方法包括：损伤正在萌发的谷粒以形成受损谷粒，该受损谷粒具有至少一个可被该受损谷粒至少部分修复的组织损伤部位；以及允许受损谷粒至少部分修复该受损谷粒的至少一个组织损伤部位，以形成修复的谷粒。除非另有说明，向谷粒提供的条件支持谷粒萌发并支持对谷粒应用一处或多处损伤。这些条件支持谷粒所受损伤被该谷粒修复。

在一些实施方案中，所述方法包括使谷粒长出小根、从谷粒上去除小根以及使谷粒生长另外的小根。

在某些实施方案中，用于提取、纯化或分离酶相对丰度高的谷粒中的酶的方法包括从酶相对丰度高的谷粒中释放或者提取和/或纯化或分离酶的其他步骤。

在另一些实施方案中，提供了酶相对丰度高的谷粒。所述谷粒通常由以下方法形成，所述方法包括向谷粒提供支持谷粒萌发和对谷粒应用一处或多处损伤的条件。这些条件还支持谷粒的损伤被该谷粒修复。

发明详述

已经发现，在组织受损伤并允许修复的情况下，水解酶的表达可显著提高，引起组织中水解酶的相对丰度或相对量显著提高。具体地，如本文所述，已经发现在使谷粒受损和修复条件下培养的大麦谷粒所含有的水解酶α-淀粉酶EC 3.2.1.1和β-淀粉酶EC 3.2.1.2的量比在不涉及损伤和修复的条件下培养的大麦谷粒高1.7倍和0.05倍。发现在这些谷粒中另一些水解酶(极限糊精酶EC 3.2.1.142和β1，4-木聚糖酶EC 3.2.1.8)的量提高多达16.8和6.5倍。

这些发现特别重要，因为当根据商业化提取方法或其它方法加工经受损伤及修复的谷粒以释放酶时，可以获得提高的水解酶产率。

因此，在某些实施方案中，提供了用于提高谷粒中酶的量或表达的方法。该方法包括向谷粒提供一定条件的步骤，所述条件支持谷粒萌发以及对谷粒应用一处或多处损伤，或者换言之，支持在通过应用一处或多处损伤来损伤谷粒的条件下使谷粒萌发。

在另一些实施方案中，提供了用于产生酶相对丰度高的谷粒的方法。所述方法包括向谷粒提供支持谷粒萌发以及对谷粒应用一处或多处损伤的条件的步骤。

在一个实施方案中，所述谷粒是大麦谷粒。然而，应该理解，也可以加工其它谷粒，包括如稻、小麦、玉米、玉蜀黍等。另外，还可加工豆科植物和豆类如小扁豆、大豆等。

重要的是，大部分的被加工谷粒不会形成致死性损伤。致死性损伤通常是导致谷粒胚死亡的损伤，或者是阻止谷粒至少部分修复对该谷粒所应用损伤或阻止其萌发的损伤。

另外，如以下更详细讨论的，已发现活的谷粒胚与萌发期间谷粒中一种或多种酶的分泌提高有关。

可通过对谷粒应用物理处理来损伤谷粒。物理处理包括导致磨损(abrasion)、裂伤(laceration)、翻滚(tumbling)、搅动或压迫谷粒的处理。预期可使用其它形式的物理处理。

特别有用的物理处理是引起小根或其部分(如小根尖)损伤的处理，或者从谷粒上去除小根或其部分的处理，或者使茎(shoot)、谷粒外壳或果皮受损的处理。也可使用影响谷粒外层、糊粉层或半纤维素层等的处理。

磨损谷粒的方法实例显示于美国专利号3754929中。压迫谷粒的方法显示于美国专利号4052795中。

也可以通过化学处理、暴露于温度、压力或辐射中的一种或多种方法损伤谷粒。

化学处理包括碱处理。除其他以外，该处理对于溶解或部分溶解谷粒外壳也特别有用。碱处理的一个实例是，在第二浸泡期间使谷粒条件化一段24小时的时间。

其它形式的化学处理包括用氨处理。用氨进行化学处理的实例显示于美国专利号3134724中。

如上所述，可通过加热谷粒来损伤谷粒。一般来说，不应将谷粒加热至超过40℃，因为超过这些温度，谷粒胚可受到致死性损伤。通常在第二浸泡期间进行加热。加热可用于软化谷粒的葡聚糖外壳。

特别有用的损伤方案是：对谷粒应用处理，该处理导致小根从谷粒上去除并且其中修复机制使受损谷粒再次长出另外的小根。在某些实施方案中，从萌发开始培养小根约5至7天，但是其它的时间长度也可能合适。通常，优选在萌发开始后第12天前去除小根，在一些情况下更早，例如在萌发开始后第10天前。

虽然去除根、小根、根尖、茎及茎尖特别有用，但在某些实施方案中，也可去除其它的谷粒器官，其实例包括谷粒外壳和相关的层。

一般而言，仅需要从谷粒上将根、茎等去除一次即可产生导致酶生成有超越未受损谷粒中所观察程度的增强。在某些实施方案中，重复应用损伤谷粒的处理。这对于确保所有谷粒至少受损一次(例如从每个谷粒上去除根、茎等一次)是有利的。这可以是有用的，尤其是因为在应用任何一次处理时，并非所有谷粒都已达到同样的器官发育阶段。此外，在某些实施方案中，去除谷粒上一个以上的根、茎等是有利的。

应该理解，没有必要再次损伤已修复的谷粒。此外，受损的谷粒没有必要完全修复。

用于施加损伤的装置的实例显示于美国专利号3174909中。通常，装置可包括用于容纳谷粒的鼓状物和用于使该鼓状物滚动的滚筒，所述鼓状物具有内部挡板，其用于在鼓状物滚动时搅拌包含在该鼓状物中的谷粒。

因此，在某些实施方案中，提供了用于提高谷粒中水解酶的量的方法，其包括：

-使小根从谷粒上长出；

-从谷粒上去除所述小根；和

-使另外的小根从谷粒上长出，以提高谷粒中水解酶的量。

萌发公认是特征为组织的一次或多次水化的过程，所述组织的水化引起谷粒体积的调节、酶活性的调节、胚乳结构和组成的变化以及胚活性的调控。

通常，应用损伤和修复条件的谷粒是正在萌发的谷粒，即在应用损伤时即将萌发的谷粒，或者在应用损伤时处于萌发活跃状态的谷粒，或者在应用损伤时已完成萌发的谷粒。

在某些实施方案中，谷粒在应用损伤时处于萌发的活跃状态，并且在修复以及后续的其他的损伤和修复步骤期间保持该状态。

通常，在损伤和修复过程发生时，所述谷粒的含湿量约为40％或更低。含湿量是干重与水化重量的比例。在某些实施方案中，约为干重30-35％比例的含湿量特别有用。

通常，含湿量高于约10％，高于约15％、约20％、约25％、约30％至35％，并且通常不应超过40％。

在某些实施方案中，含湿量在浸泡后高于约25％，在延长的萌发期之后约为30％至35％，并且在任何时候均不应超过40％。

可通过将谷粒浸泡在适当的水溶液中来获得理想的含湿量。该溶液可以只是水，或者可以包含其它化合物如生长促进剂(如赤霉酸)、抗微生物剂(如SO₂)尤其是抗真菌剂，或者其它化合物，如用于软化谷粒并提高pH的NH₄OH碱。

浸泡可由单个浸泡步骤组成，或者可由多个浸泡步骤组成，每个步骤根据每次浸泡期间所使用的条件来进行表征。例如，第一浸泡可包括使谷粒水化至低于约40％的条件。例如，在第一浸泡中，可以在～50ppm SO₂存在下，使谷粒在约12-24小时中从最初的谷粒水分～10％水化至约20％含湿量。接着可除去该溶液以排除任何细菌并避免SO₂与表面蛋白质或葡聚糖的任何继续反应。第二浸泡步骤可包括：在更高pH(可高至8.0)下将谷粒的水化调整至约20％-30％的含湿量，其中存在5-20ppm赤霉酸，并且在总浸泡时间12-24小时的最后一小时可能稍加热至40℃。

在某些实施方案中，将谷粒浸泡约5天，但是也可以浸泡较少的天数，例如1、2、3或4天。另外，将谷粒浸泡多于5天可能有好处。然而，在这些情况下，控制浸泡过程期间的真菌污染变得更加困难。

另外，可以在浸泡前、浸泡期间或浸泡后(即在“浸出”时)对谷粒进行损伤和/或修复。

应该理解，在某些实施方案中可能不需要常规的浸泡步骤。

当进行一个或多个浸泡步骤时，可以在完成浸泡步骤后损伤谷粒并允许其修复长达12天，但是损伤和修复的时间也可更长。该时间长度部分取决于谷粒中所提高的酶。适于特定谷粒的时间将在本文有进一步的讨论。在某些实施方案中，在浸泡完成后约3天、浸泡完成后约5天或浸泡完成后约10天损伤谷粒并允许其修复。在这些时间内，可以用生长促进剂(如赤霉酸)处理谷粒，并在光照下维持其水分低于35％。

在某些实施方案中，控制条件以使浸泡或萌发期间谷粒的呼吸作用最小化。呼吸作用是广为人知的过程，通过该过程从分子(如碳水化合物)中释放能量。限制呼吸作用的一个益处是可使得与损伤修复无关的生化过程的程度最小化，由此保存可用的能量并引导至损伤修复，从而引起谷粒中水解酶合成的提高。另一个益处是可限制产生与呼吸作用有关的分子，如糖和CO₂等，它们会支持污染微生物如真菌等的生长。

使呼吸作用最小化的一种方法是控制萌发和/或浸泡的谷粒的含湿量。这可以通过控制萌发和/或浸泡期间环境的相对湿度来实现，即通过控制环境的温度和含湿量来实现。通常，优选提供使呼吸作用最小化的条件，所述条件防止谷粒中的淀粉颗粒破裂。在一个实施方案中，相对湿度约为80％，温度低于约20℃，优选约10～15℃。

在某些实施方案中，可以处理谷粒以消除位于谷粒表面上的微生物。这至少对于谷粒萌发时限制谷粒的污染可能是有用的。特别有用的处理是杀死真菌或真菌孢子的处理，否则在谷粒萌发期间真菌将能够在谷粒上生长。实例包括用抗微生物剂洗涤、用SO₂或氨进行气体处理、用尿素处理、辐射(特别是UV辐射)、暴露于光。

作为补充或替代的一种方法是防止根或小茎的发育穿透谷粒外壳。在某些情况下，这些器官穿透外壳为微生物提供了感染胚乳的机会。

应该理解，可以通过改变浸泡条件而获得谷粒中特定水解酶相对丰度的进一步提高。与特定水解酶有关的改变的实例在本文有进一步的讨论。

本文所讨论方法的一个特别的优势是：可对由此获得的谷粒实施其他下游加工，例如从这些谷粒中纯化或提取酶。例如，可对得自本文所讨论方法的谷粒实施美国专利号4355110中所讨论的方法以纯化支链淀粉酶。

本文所讨论的方法对于增强谷粒水解酶的表达特别有用，尤其是位于糊粉层和淀粉胚乳层以及胚中的水解酶。酶的实例包括极限糊精酶、α和β淀粉酶、1-6-β-葡聚糖酶、β1，4-木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、脂加氧酶和β葡糖苷酶。

可以通过2天浸泡和3天萌发获得提高量的α和β淀粉酶。

可以通过2天浸泡和7-8天萌发获得提高量的极限糊精酶。

可以通过2天浸泡和10-12天萌发获得提高量的木聚糖酶。

实施例

如所述将谷粒浸泡2天，然后在以下条件下再孵育10至15天：

UV光照以阻滞微生物生长；

控制温度在约7～13℃之间，通常约10℃；

用被动式再循环气流控制相对湿度为80％；

定期翻滚30分钟，以防止小根和小茎穿透谷粒外壳，每次翻滚之后为3小时静息期。

Claims (18)

1.用于提高谷粒中一种或多种水解酶的量的方法，其包括在选定的谷粒器官或组织受到非致死性损伤的条件下使所述谷粒萌发，其中所述选定的器官或组织是小根或其部分或者小茎，其中所述水解酶选自α淀粉酶、β淀粉酶、极限糊精酶和β1，4-木聚糖酶。

2.根据权利要求1的方法，其中在对谷粒应用物理处理以损伤谷粒的条件下使所述谷粒萌发。

3.根据权利要求2的方法，其中通过翻滚、搅拌或压迫对所述谷粒进行物理处理。

4.根据权利要求1的方法，其中在对谷粒应用化学或热处理以损伤谷粒的条件下使所述谷粒萌发。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述选定的器官或组织是谷粒的小根。

6.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中在对谷粒应用物理处理以部分或全部地从谷粒上去除小根的条件下使所述谷粒萌发。

7.根据权利要求6的方法，其中所述条件支持小根或其部分从谷粒上长出或再次长出。

8.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述选定的器官或组织是谷粒的小茎。

9.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述谷粒的含湿量为40％或更低。

10.根据权利要求1的方法，其包括在谷粒萌发前将所述谷粒浸泡在水溶液中的步骤。

11.根据权利要求10的方法，其中浸泡所述谷粒以提供含湿量为40％或更低的谷粒。

12.根据权利要求10或11的方法，其中所述水溶液包含选自生长促进剂、抗微生物剂或碱的一种或多种化合物。

13.根据权利要求10或11的方法，其中将所述谷粒浸泡在多于一种水溶液中。

14.根据权利要求13的方法，其中首先将所述谷粒浸泡在包含50ppmSO₂的水溶液中，以将所述谷粒的含湿量提高至20％。

15.根据权利要求14的方法，其中还将所述谷粒浸泡在包含5～20ppm赤霉酸并且pH为8.0的水溶液中，以将所述谷粒的含湿量提高至40％。

16.根据权利要求10或11的方法，其中将所述谷粒浸泡5天或更短时间。

17.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中在损伤谷粒的条件下使所述谷粒萌发10天或更短时间。

18.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述选定的器官或组织是小根或其部分以及小茎。