CN101320006A - 蛋白质结晶条件的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质结晶条件的筛选方法，首先用不同的缓冲液中溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到5～50mg/ml，用0.22μm的滤膜过滤出去杂质；用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；在密闭的可设定变温程序的控温箱中生长蛋白质，控温箱从1～4℃开始线性升温，8～336小时后升温至30～60℃，然后从30～60℃线性降温，8～336小时后降至1～4℃，完成一个循环周期；或者以前述方式线性降温—线性升温—线性降温，完成一个循环周期；一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋白质晶体的条件数目。由于采用了温度扫描方式，蛋白质结晶条件筛选成功率由现有技术的4～10％提高至14～50％。

Description

蛋白质结晶条件的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质结晶条件的筛选方法，特别是通过温度扫描对蛋白质结晶条件进行筛选的方法。

背景技术

结构生物学是分子生物学的前沿和主流，对蛋白质结构与功能的研究已经成为揭示基因组功能的重要途径。获取高质量及合适尺寸的蛋白质晶体是完成结构解析的瓶颈，而结晶条件的筛选是获得高质量蛋白质晶体的第一步，也是最关键的一步。

影响蛋白质结晶条件筛选的因素是多方面的，其中温度可通过改变蛋白质的溶解性，进而影响蛋白质在溶液中的过饱和度，而成为影响蛋白质结晶的一个重要因素。但一直以来，人们很少在实践中运用此特点开发蛋白质结晶条件筛选技术。

通常的蛋白质结晶条件筛选是在某个特定温度下进行的。文献“Sparse matrix sampling：ascreening method for crystallization of proteins.1991，Vol.24：409-411”公开了一种蛋白质结晶条件的筛选方法，选择Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒构建结晶溶液体系。蛋白质晶体在恒温4℃和室温下生长，统计蛋白质在50种结晶缓冲液中出现晶体的成功率。实验结果得出溶菌酶结晶成功率为10％，胰岛素结晶成功率为4％，过氧化氢酶结晶成功率为10％，核糖核酸酶A结晶成功率为8％，胃蛋白酶结晶成功率为6％。由于对不同蛋白质而言，最适合结晶的温度可能有所不同，因此在某个特定的温度下进行筛选时，适宜在其它温度条件下结晶的缓冲液就不能产生晶体。如此将使这部分实际可以出现晶体的溶液条件被标记为不能结晶的溶液，从而降低筛选的成功率。为了提高蛋白质结晶条件筛选的成功率，应尽可能在所有可能结晶的温度条件下进行筛选。但这样的筛选策略在实践中由于工作量及样品消耗量极大，实现困难。

发明内容

为了克服现有蛋白质结晶条件筛选技术中，因筛选温度覆盖不全而导致不能发现全部结晶条件的不足，本发明提供了一种新的蛋白质结晶条件的筛选方法。该方法通过温度扫描，可覆盖筛选过程中可能结晶的每一个温度点，以此提高蛋白质结晶筛选的成功率。

本发明解决其技术问题的技术方案是，一种蛋白质结晶条件的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到5～50mg/ml，用0.22μm的滤膜过滤除去杂质；

(b)用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；

(c)蛋白质晶体的形核和生长，在密闭的可设定变温程序的控温箱中进行，预先设定该密闭环境的温度，控温箱从1～4℃开始线性升温，8～336小时后升温至30～60℃，然后从30～60℃线性降温，8～336小时后降至1～4℃，完成一个循环周期；或者设定控温箱从30～60℃线性降温，8～336小时后降至1～4℃，再从1～4℃开始线性升温，8～336小时后升温至30～60℃，完成一个循环周期；

(d)上述结晶体系在密闭温控箱中完成一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋白质晶体的条件数目。

本发明的有益效果是：由于采用了温度扫描方式，可以通过一次实验覆盖适宜于蛋白质结晶的所有可能温度，而不用在所有可能结晶的温度点下一一建立实验组进行筛选，从而提高实验效率，并节约结晶缓冲液和蛋白质样品。通过本发明，可使蛋白质结晶条件筛选成功率由过去的4～10％提高至14～50％。

下面结合实施例对本发明作详细说明。

具体实施方式

实施例1：溶菌酶结晶条件的筛选。

第一步：将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH为4.60，0.1mol/L的醋酸钠缓冲液中，使其终浓度为20mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对溶菌酶结晶条件进行筛选。

第三步：将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为：从1℃线性升温168小时至60℃，然后再以同样变温速率从60℃降温至1℃，即一个温控周期为：

或者从60℃线性降温168小时至1℃，然后再以同样变温速率从1℃线性升温至60℃。

第四步：样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出溶菌酶晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。

经过统计得到如下结果：有21种结晶条件出现了溶菌酶晶体，结晶成功率为42％。与现有技术在4℃和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了4.2倍。

实施例2：胰岛素结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为I5500的胰岛素，溶于1mol/L的氨水中，使其终浓度为30mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对胰岛素的结晶条件进行筛选。

第三步：将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为：从2℃线性升温24小时至35℃，然后再以同样变温速率从35℃降温至2℃，即一个温控周期为：

或者从35℃线性降温24小时至2℃，再以同样变温速率从2℃线性升温至35℃。

第四步：样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出胰岛素晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。

经过统计得到如下结果：有25种结晶条件出现了胰岛素酶晶体，结晶成功率为50％。与现有技术在4℃和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了12.5倍。

实施例3：过氧化氢酶结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7.00，0.025mol/LHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为40mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对过氧化氢酶的结晶条件进行筛选。

第三步：将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为：从4℃线性升温8小时至30℃，然后再以同样变温速率从30℃降温至4℃。或者从30℃线性降温8小时至4℃，然后再以同样变温速率从4℃线性升温至30℃。

第四步：样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出过氧化氢酶晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。

经过统计得到如下结果：有13种结晶条件出现了过氧化氢酶晶体，结晶成功率为26％。与现有技术在4℃和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了2.6倍。

实施例4：核糖核酸酶A结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为R5500的核糖核酸酶A，溶于pH为7.00，0.025mol/LHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为5mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对核糖核酸酶A的结晶条件进行筛选。

第三步：将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为：从4℃线性升温72小时至50℃，然后再以同样变温速率从50℃降温至4℃。或者从50℃线性降温72小时至4℃，然后再以同样变温速率从4℃线性升温至50℃。

第四步：样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出核糖核酸酶A晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。

经过统计得到如下结果：有6种结晶条件出现了核糖核酸酶A晶体，结晶成功率为12％。与现有技术在4℃和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.5倍。

实施例5：胃蛋白酶结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为R5500的胃蛋白酶，溶于pH为7.00，0.025mol/L HEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为50mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对胃蛋白酶的结晶条件进行筛选。

第三步：将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为：从4℃线性升温336小时至60℃，然后再以同样变温速率从60℃降温至4℃。或者从60℃线性降温336小时至4℃，然后再以同样变温速率从4℃线性升温至60℃。

第四步：样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出胃蛋白酶晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。

经过统计得到如下结果：有7种结晶条件出现了胃蛋白酶晶体，结晶成功率为14％。与现有技术在4℃和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了2.33倍。

除上述的实施例外，用本方法还通过变温方式分别对胰凝乳蛋白酶、伴刀豆球蛋白、蛋白酶K和枯草杆菌蛋白酶的结晶条件进行了筛选，结果这些蛋白的结晶筛选成功率均得到了明显的提高。

Claims (1)

1、一种蛋白质结晶条件的筛选方法，其特征在于包括下述步骤：

(a)用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到5～50mg/ml，用0.22μm的滤膜过滤除去杂质；

(b)用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；

(c)蛋白质晶体的形核和生长，在密闭的可设定变温程序的控温箱中进行，预先设定该密闭环境的温度，控温箱从1～4℃开始线性升温，8～336小时后升温至30～60℃，然后从30～60℃线性降温，8～336小时后降至1～4℃，完成一个循环周期；或者设定控温箱从30～60℃线性降温，8～336小时后降至1～4℃，再从1～4℃开始线性升温，8～336小时后升温至30～60℃，完成一个循环周期；

(d)上述结晶体系在密闭温控箱中完成一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋白质晶体的条件数目。