CN101300487B - 膜测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有细胞的身体样品的测定方法,所述方法包含在导致细胞裂解的条件下,优选地通过去污剂的方式,处理所述样品;并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。本发明还提供核酸断裂条件在增强膜测定中的用途,完成测定的装置和用于该测定的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及提高对身体样品测定的准确性、可靠性和/或速度的方法。具体地,本发明涉及使用具有小孔径(例如小于1μm)的膜或滤器进行的高速测定,特别是含细胞或细胞碎片的样品。最特别地,本发明涉及提高裂解(例如去污剂裂解)介导的膜浓缩测定的方法和相应的测定试剂盒和装置。
背景技术
快速诊断测定对在即时检验(point-of-care)(PoC-例如在同医学专业人员商讨的时间)或在小型的或快速转变的医学诊断实验室中的用途的重要性日益增加。这样的试验,特别是对PoC用途,典型地使用至少一个含有用于接受样品的容积和允许样品同所述装置的部分相互作用的液体途径的“装置”,例如一次性的管、条、筒、圆筒等,和/或进一步的试剂。具有相对小的孔径,典型地0.2-5μm的膜,例如硝酸纤维素是快速诊断测定(例如免疫测定法)普遍使用的组分。这样的膜可能用做测定的固体相,也用于收集微小颗粒和沉淀的生物物质。
存在两类能用于快速测定含有细胞的样品中的组分含量的普遍方法,例如血中的血浆蛋白的测定;人们能从液体(如血浆)分离细胞或裂解所述细胞使其穿过膜。在分离方法中,在分析前,分离过程中或通过使用试验装置本身中的滤器来去除细胞。在细胞裂解方法中,片段化,并典型地溶解细胞(例如血细胞)的膜,例如通过使用去污剂,从而允许所述物质通过膜的孔。
特别用于即时检验或改进的实验室情形的快速试验一般应限至于少量的(优选简单的)步骤和仅几分钟的持续时间。这使单独分离细胞的步骤变得不实际并意味着,液体(例如血浆)分离必须作为装置内的事件的整合部分,或必须使用裂解试剂或其他条件如去污剂,来裂解/溶解细胞壁和核膜以使样品通过滤膜的孔。特别是对用于定量测定的膜流通(flow-through)形式,裂解方法是有益的,因为难以用这种形式设计有效的血细胞分离。
在用于即时检验的测定中,速度、灵敏度和准确度都是高度渴望的因素,但在测定的环境中,为了在某些因素(如速度)上给出可接受的性能,做一个“权衡”,在另一些因素(如灵敏度)上牺牲可能的提高经常是必需的。提供能共同提高这些性质从而在总体上显示更高性能水平做平衡的方法将具有巨大的价值。
也称之为“免疫浓缩测定法”的膜流通测定法的形式是使用小孔径的,典型地是0.45μm的膜,该膜特定结合了如抗体、受体、抗体片段等部分。这个形式需要高度无颗粒的样品,因为即使是少量的具有同膜的孔径差不多大小或超过膜的孔径的颗粒,例如细胞碎片,都会降低通过膜的液体流通。在最坏的情况下,这能导致通过膜的液体输送的彻底停止,但即使是较小的膜流抑制也能导致流动问题和/或测定可靠性的劣化。因此,开发膜流通测定法时,关键问题是以能使任何含有细胞的样品通过膜,而在整个测定过程中没有改变膜的有效孔径的大小和流动性质的方式处理所述的样品。
除此之外,红细胞压积校正是基于能用裂解(尤其是去污剂裂解)方法处理的全血的定量测定的另一个问题。特别是通过使细胞裂解,裂解物的简单的血红蛋白测量才可能进行红细胞压积校正。
在全血或其它含有细胞的样品的(尤其是去污剂介导的)裂解中,主要目的是裂解细胞的膜和细胞核的膜,以允许其通过装置,尤其是通过滤器或膜。
例如,去污剂侵入膜并产生胶团和蛋白质-去污剂复合物。胶团的大小通常足够小而使他们通过典型的0.45μm孔径的膜。类似地,离液序列高裂解剂(chaotrophiclysingagents)裂解在膜中支持的蛋白质结构并从而裂解它的结构。
虽然膜类型测定中的(例如去污剂)裂解方法具有很多的优点,但极少有商业测定使用这个方法,特别是对自动测定系统。这一点的一个原因可能是,当细胞膜彻底溶解成胶团是所期望的时,在环境中经常发生膜堵塞和流动受限。以往这种人为事情(artefactual)都不予以考虑或不理解,因为先前已经把在裂解测定中的膜运输的限制因素考虑为样品的细胞周围或细胞内的膜的裂解。例如,在血样中,先前已经将细胞膜或白细胞核膜的不充分溶解认为是膜堵塞的主要原因。
发明内容
现在,同先前理解的裂解细胞样品的情况相反,本发明不可思议地证实,甚至非常少的量的细胞核酸,特别是DNA,能导致膜的决定速度的堵塞和高背景测定信号。
因此,在第一方面,本发明提供了一种含有细胞的身体样品的测定方法,所述方法包括在导致细胞裂解的条件下处理所述样品;并将由此产生的裂解样品置于导致核酸分子尤其是DNA分子断裂的条件下。优选地,导致细胞裂解的条件包括加入如去污剂等细胞裂解剂。优选地,所述方法是膜测定方法,更优选地,如下述的“膜捕获”测定方法。所述方法可选择地和优选地包含(随后将样品通过膜)测定样品(例如样品通过膜的那部分或优选地样品保留在膜上或被膜保留的那部分)的至少一种组分,或所述样品中的潜在组分和/或可选择地和优选地将测定值与含有细胞的身体样品中的测定的组分的定性、半定量或定量内容相关联,和/或可选择地和优选地将测定的组分同至少一种医学或生物学状况相关联。
本发明人证实测定装置中膜堵塞的原因是核酸而不是脂质组分的不充分溶解,当将这样的膜用于浓缩样品中的组分时,既需要提高通过小孔径膜的流通,也需要降低背景信号。因此提高流动更迅速的进行测定和/或允许在相同周期内处理更大体积的样品,从而允许从大体积样品中浓缩分析物,并继而提高灵敏度和准确度。
因而,在进一步的方面,本发明提供核酸断裂条件在所述测定方法中的用途,该方法包括裂解的含有细胞的身体样品通过孔径不超过10μm的膜的流动。这个用途提高了所述测定的性能,并可采取一种或多种形式,或可能提高性质的总体平衡。优选地,所述用途在膜浓缩测定中增强液体流通膜和/或降低膜上的背景信号和/或增加测定的速度。
仍然是在进一步的方面中,本发明也提供了整合了用于接受含有细胞的体液的室以及至少一种其孔径不超过10μm的膜的测定装置,其中使用的所述装置提供核酸断裂条件。优选地,该装置含有至少一种核酸断裂的化学和/或生物装置(means),例如本文下面描述的那些。然后使用该装置提供核酸断裂的条件。
仍是在进一步的方面中,本发明提供含有细胞的生物液体测定的试剂盒,所述试剂盒包括:包含孔径小于大约10μm的膜的装置;和至少一种核酸断裂的化学和/或生物装置。可选择地和优选地,试剂盒包含至少一种细胞裂解的装置,例如去污剂和/或至少一种所述样品的组分或潜在组分的测定的试剂。进一步可选择地和优选地,试剂盒包含使用方法说明书,该方法包括所述细胞的裂解(例如去污剂介导的裂解),然后断裂释放的核酸分子,使至少一部分得到的样品通过所述的膜。最优选地,该方法是如本文所述的本发明的方法。
具体实施方式
如本文提及的,导致核酸链断裂的条件可以是物理条件(如摇动、搅拌和涡旋等)、放射性条件(例如用电磁辐射进行处理,例如UV、X-射线或γ-射线辐射)、化学条件(例如控制pH和/或氧化还原条件)和/或生物条件(例如用酶处理和/或具有核酸裂解性质的内源酶如核酸酶的激活)。优选的导致核酸断裂的条件是放射性的、化学的和生物学的条件,特别是加入至少一种的和/或内源酶进行处理。
本发明人已经广泛地检查了包含去污剂裂解的含有细胞的样品(尤其是血液)流过小孔径膜测定的膜堵塞原因。对于相关技术领域的其它技术人员,他们开始假设,典型地通过去污剂介导的,将膜转变到胶团来控制膜流动。让发明人极其惊奇的是,样品尤其是血样中的非常小的相对质量的DNA可能具有任何令人关注的尤其是堵塞膜的物理效果。
正常人的血液中,每1000个红细胞大约有一个白细胞。红细胞不含有核或DNA,而白细胞有核并含有DNA。典型的哺乳动物细胞含有70%的水、3%的磷脂、1.1%的RNA和0.25%的DNA以及其它组分。典型的哺乳动物细胞膜含有大约50%的磷脂和50%的膜结合蛋白。这意味着,细胞膜构成了哺乳动物细胞干重的大约20%,与之相比较,DNA为0.8%。仅看白细胞,膜∶DNA质量比为大约25∶1。考虑到红细胞有膜而没有DNA,全部血液细胞的膜∶DNA质量比为大约1000∶1。
最初,手工进行使用高剪切力的测定。这个测定没有显示出膜堵塞或高背景信号的问题。在手工测定中,从手指(fingerstick)采集全血并继而通过在含有去污剂脱氧胆酸盐的液体中的稀释和剧烈摇动许多秒而裂解全血。在下一步中,将裂解的血液通过用抗体包被的膜过滤,从而捕获分析物。在加入金标抗体及随后加入洗涤溶液后,测量金颗粒发出的红色信号。
随后,发明人开发了上面简单描述的手工操作的测定的自动版本。在这个仪器化的测定中,通过包含在仪器中的泵轻轻地将血液和稀释液搅拌在一起。当用这个仪器分析血样时,某些样品显示了通过硝酸纤维素膜的不同寻常的流动性质。在某些情况中,流动缓慢,在少数情况中,液体通过所述膜的流动彻底停止。注意,稀释的液体含有的去污剂比包含非常高数目的红细胞(红细胞压积80%)的血样的彻底裂解所需的去污剂多。使用作为参考的相同样品的血浆结果时,低流速的血样常常给出严重高估的分析物浓度。
来源于人基因组的DNA非常长,长达5cm,并且,这些链对剪切力非常敏感。在手工制备的样品中,猜测摇动裂解了DNA,而在仪器中,以非常轻柔的方式将血样与稀释液混合,且保留下来DNA结构,从而使得DNA堵塞了膜。发明人制备了仅轻柔搅拌的手工制备的样品并发现也发生了膜堵塞。相似地,在仪器中加工前剧烈摇动所述样品导致流速变得正常且没有膜堵塞,并校正了血浆分析物浓度的测定。发现具有高比例白细胞(其含DNA)的样品比正常样品或具有高比例红细胞的样品(其不含DNA)更易产生膜堵塞。
这些观察共同支持了发明人的假设,即包含在白细胞细胞核中的DNA是流动问题的根源。用化学的实验和具体地核酸消化的生物学方法进一步证实了这一点。这些实验也表明,除导致膜堵塞外,长链核酸也能在膜流通测定中提供非常高的背景信号,从而导致假阳性或不准确的结果。
在本发明的测定方法中,含有细胞的样品通过在相应条件下的处理进行裂解以裂解细胞膜和细胞核的膜。在优选的实施方案中,用至少一种去污剂处理样品来提供细胞和细胞膜的裂解,然后裂解核酸分子。
如本文指明的,“去污剂”可以是任何能促进磷脂膜转化成能通过小孔膜(如本文描述的)的例如胶团和/或微粒的小的结构的双嗜性分子。合适的去污剂包括阳离子、阴离子、两性离子和非离子表面活性剂,但优选阴离子表面活性剂。具体的例子包括;包括胆酸钠、脱氧胆酸钠(DOC)的胆酸盐去污剂;例如Triton、吐温、Genapol、Lubrol、Thesit、Brij和Lubrol的聚氧乙烯序列去污剂;和其它去污剂,包括十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基-β-D-麦芽糖苷和辛基-β-D-葡萄糖苷、N-月桂酰肌氨酸钠盐、月桂酰二甲胺氧化物(Lauryldimethylamine-oxide,LDAO)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)和双(2-乙基己基)磺基丁二酸钠盐。尽管提到的是钠盐,但显然地,用其它的例如钾、镁等金属生成的盐将同样有效。最优选的去污剂是脱氧胆酸钠。
尽管去污剂的使用是用于本发明的细胞裂解的优选的方法,但本发明同样适合使用许多其它细胞裂解方法,包括低渗或高渗裂解、离液序列高裂解(chatrophiclysis)等。合适的用于这样的方法的试剂是本领域技术人员公知的并包括;去离子水(用于低渗裂解);张力调节剂,例如包括钠盐、镁盐和钾盐的盐(例如NaCl、KCl),用于高渗裂解;和离液序列高试剂,例如氯仿、苯酚或包括异硫氰酸胍(GuSCN)的离液序列高的盐或尿素。
如本文所用,术语“核酸”是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的高分子链,二者均处于纯的形式,并更普遍地以它们的与其它分子包括例如多肽/蛋白质的大分子的组合的天然形式。特别地,来源于哺乳动物样品的基因组DNA通常以核小体和接头区与其它的因子如染色质或伴随蛋白组合的组合物存在。优选的,本文提到的核酸是DNA和特别地,基因组DNA。
在本发明的所有方面,如本文上面表明地,适于导致核酸断裂的条件是典型地物理的、反射性的、化学的和/或生物的条件。优选的条件是导致核酸链断裂的化学的和/或生物的条件。能用任何的包括各种著名的DNA损伤剂如环氧化物、亚胺类、活化的环丙烷类、杂环N氧化物(hetrocyclicN-oxides)、奎宁等的合适试剂导致DNA化学断裂。优选地,这些“化学核酸酶”将是通过氧化途径断裂DNA的氧化还原活性(redoxactive)配合物。优选的例子包括邻菲咯啉铜,然后是氧化剂、重氮盐、使用金属络合物的光断裂和铁/EDTA系统。
可使用任何合适的核酸酶并通常在温和条件下进行核酸断裂的“生物学”方法。适用于本发明的核酸酶是能断裂核酸的核苷酸亚基间的磷酸二酯键的酶。已知许多类型的具有变化的活性、金属依赖性和特异性的核酸酶,包括遗传操作实验中普遍用于产生DNA片段的“限制酶”。这些酶包括依赖于例如镁和钙等离子的核酸酶。钙依赖核酸酶是优选的用于本发明的一组,镁依赖核酸酶也是。这些核酸酶的任何一种均是合适的,因为核酸链断裂成即使是中等长度的片段也通常足以允许样品非限制的通过膜。
核酸酶普通的例子包括微球菌核酸酶(S7核酸酶)、Si核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I(DNaseI)、核酸酶BAL31BenzonaseTM。一个具体的合适的核酸酶是微球菌核酸酶(也称为细球菌核酸酶,因为它衍生自微球菌(Micrococcuspyrogenes)),该酶是Ca2+依赖的内切核酸酶,其优先在处于11nm直径的核小体间的接头区内断裂DNA。DNA降解后,降低未断裂DNA的非常粘的溶液的粘度。
在下面的实施例中,将0.1-0.5U/ml的微球菌核酸酶以及1mMCaCl2加入用去污剂裂解的血样中,并在用于膜流动分析前孵育30秒。液体流动速度和测定结果被正常化,即使是对具有高(35×109/L)白细胞计数的血样。同不加入核酸酶的对照相比,Ca2+的省略给出了相同的低流速和假的高测定结果。
如核酸酶等大多数生物材料在水溶液中本来就不稳定。因此,假如将核酸酶稳定化以使它们能作为本发明装置和/或试剂盒的一部分而长期存放是一个优点。因此,在本发明的一个实施方案中,以干燥形式提供核酸酶,因而,在将该酶并入诊断测定装置或试剂盒前将其干燥。
干燥核酸酶的优选方法是使用标准的冷冻干燥方法,然而本领域的技术人员也能容易地使用其它干燥试剂的方法,例如喷雾干燥或真空干燥。
在一个实施方案中,将核酸酶作为单独的测定单位进行干燥,例如在反应池上干燥,例如干燥到室或容器内表面的至少一部分之上。在优选的实施方案中,以至少一种干燥的(例如冷冻干燥)试剂颗粒(例如小珠或小球)形式提供核酸酶试剂。从Price等(美国专利U.S.PatNo.3,655,838)可获知球状冷冻干燥颗粒。其公开的球状小珠含有免疫反应的物质,并通常称为液圈(lyospheres)。已知某些物质的液圈,例如来源于美国专利U.S.Pat.No.3,932,943的,且本领域技术人员能容易地将这些已知的方法应用到用于本发明的核酸酶中。关于液圈的生产,参见例如Wiseman,WilliamHoward,Jan1958Thesis(Ph.D)-InstituteofPaperChemistry,1958和美国专利U.S.Pat.No.3,655,838)。这些以及本文引用的所有参考都以其全文引入本文作为参考。
在干燥方法中,例如使用冷冻干燥,可能使用标准的低温保护剂(croyprotective)、裂解保护剂(lyoprotective)和/或再水化增强剂来增强干燥的试剂的性质。典型的试剂包括盐和糖,特别是海藻糖、乳糖、蔗糖、脯氨酸、甘露醇、棉子糖和乳酸钠。海藻糖特别有效。
本发明的方法可能额外地包括测定裂解的和处理的(来断裂核酸链)样品的至少一种组分或潜在组分。合适的用于测定的组分包括任何的品种多样的生物标记物,包括小分子(例如氨基酸)、维生素、寡肽和多肽(包括抗体、蛋白质和蛋白质组合物)、肽和非肽激素和许多其它物质。因为该测定方法通常是去污剂介导的细胞裂解测定方法,也可以是测定膜结合组分如受体的方法。本发明方法尤其提高了血浆中蛋白质、维生素、氨基酸和/或辅因子的测定。具体的例子包括C反应蛋白(CRP)、维生素B12、运钴胺蛋白(尤其是全的运钴胺蛋白)、高半胱氨酸、叶酸、叶酸受体和它们的组合。例如CRP的accute相标记尤其合适。
可以本领域公知的许多形式中的任何形式来实现可选择的,且优选的测定样品组分的步骤。然而,本发明之特别益处在于通过膜测定,尤其是膜浓缩测定方法完成样品组分的测定。在这种类型的测定中,将特异结合配体如抗体、受体或抗体片段、组合物或衍生物(例如单链抗体)固定在膜上并用来捕获和浓缩目标分析物。然后可能直接检测这个捕获的分析物,或更通常的,用将同信号形成部分依次结合或缀合的进一步的(特异的或非特异的)结合剂(例如抗体)结合该分析物。这样的信号形成部分可能是(mybe)放射性的、有色的、荧光的、化学发光的或生物发光的或能反应或加工底物来产生任何可检测的信号的。所述测定然后典型地涉及检测可检测信号和可选择地,比较这个信号和预定值或标准来测定(以定性、半定量或定量方式)原始样品中目标组分的浓度。
本发明特别优选的形式包含在存在任何必需的金属或辅助因子(例如Mg2+或Ca2+)下将含有细胞的身体样品(优选全血样品)同裂解条件如去污剂(例如DOC)和生物的或化学的“核酸酶”(例如微球菌核酸酶)接触。然后将产生的样品与具有不超过10μm孔径,优选地不超过2μm(例如大约0.45μm)并具有固定其上的特异结合样品组分(例如CRP)的配体(例如抗体)的膜接触。一旦样品流过膜,然后用进一步的针对结合到信号生成部分(例如金配合物)的样品组分的结合剂(例如进一步的抗体)处理膜或支持物。然后检测信号生成部分(例如比色法)来给出含有细胞的样品中的组分浓度的值或指示(例如低、正常、轻微提高或高度提高的任何组合)。这样的测定可选择地包括额外的评价细胞总数计数,或特定细胞类型的细胞计数的步骤,以及可选择地通过这个细胞计数校正测量的值或将测量的值与这个细胞计数相关联。例如,假如需要,可能通过使用标准方法的血红蛋白比色测量进行血样的红细胞计数(红细胞压积)值和校正。
在本发明的任何方法中,优选在将样品同分离膜接触前进行核酸断裂,但可能可选择地在已将样品应用到这样的膜之后发生。在后一种情况中,在膜上断裂核酸,典型地在将样品应用到膜上后通过加入合适的化学或生物试剂(如本文所讨论的)进行。可选择地,可将断裂剂加在膜之上、之中、周围和/或靠近所述膜。这可能处于干燥包被或颗粒的形式。
明显地,通过提供一种以上的膜和/或一种以上的固定的特异结合剂可测定样品中一种以上的组分,只要能鉴定来源于不同组分的信号,例如通过空间隔离(存在于不同的膜或膜区域上)或通过使用不同的和可分离的信号(例如具有不同激发和/或发射波长的两种荧光基团)。
测定样品的至少一种组分后,然后可以可选择地将产生的定性或(半)定量值同特异的生物条件或疾病相联系,或在疾病或生物条件的诊断中用作加权因子或影响因素。例如,可将高CRP同急性炎症、炎性风湿病相联系和/或同对这样的情况的治疗的需求或这样的情况的治疗的有效性相联系。
本发明提供了核酸断裂条件在测定方法中降低膜堵塞的用途,所述的测定方法包括在将含去污剂裂解的含有细胞的样品流过孔径为10μm或少于10μm(优选地2μm或更小)的膜。通常,促进了两个相关的提高并且其中一个或两个可能在任何特定测定中是重要的。基本上,核酸断裂降低了膜堵塞,且这种提高具有两个主要的结果;增强了液体通过所述膜的流动和/或降低了来源于所述样品的组分的非特异性捕获。然后,这些每一种提高均具有额外的优点,因为更好的流动提供了更快的和/或更可靠的测定,并且降低的非特异性结合使得测定更低的背景信号、更高的灵敏度和更大的分辨力。明显地,本发明提供的“用途”可用于本文描述的任何方法中,并可使用本文描述的任何化学或生物试剂,或其它技术,而且产生核酸断裂条件。特别是核酸酶介导的断裂。
如本文所指,基于上下文可以认为,“膜”是具有孔径不大于10μm,优选地不大于5μm(例如1μm或更小)和更优选地0.5μm或更小的多孔的膜。具有大约0.45μm孔径的膜尤其合适。尽管膜的最小孔径仅被充分流动的要求和适当组分穿过膜的需要所限制,典型地最小孔径是至少50nm,优选地至少100nm,更优选地至少200nm。膜材料是对合适样品的通过稳定的任何材料,其通常是含水的(aqueousbased)但可能含有加入的适当溶剂。硝酸纤维素膜尤其合适,那些玻璃、聚乙烯类、聚丙烯类、氟聚合物(例如PTFE或PTFE掺合物或共聚物)、聚酰胺和其掺合物及共聚物。最优选硝酸纤维素。
基于上下文可以认为,在本发明的所有方面提及的样品是含有细胞的样品或衍生自它们的样品。含有细胞的样品可能含有任何类型的组织和可能包含任何类型的细胞。然而,最典型地,这些样品是液体样品,其中血液和精液是优选的含有细胞的样品。具有或不具有改善储存性质和/或降低结合的添加物的全血是优选的含有细胞的样品并在本文用作例证。明显地,假如执行测定需要的话(例如去为测定释放结合的组分或抽提竞争的分析物)可以处理这样的血样,但在可能的时候,应当在装置内进行最大数目的步骤来将需要的时间和处理最小化。
本发明的装置包括接受至少一种含有细胞的身体样品(或可选择地但不太优选地去污剂裂解的含有细胞的样品)的室,并含有本文公开的至少一种膜。该装置可能可选择地用至少一种裂解剂如去污剂预装来提供细胞裂解,或者可包括将这样的试剂加入其中的室。在通过所述膜之前,进行细胞裂解,该装置提供核酸断裂的条件,其可选择地和优选地在细胞裂解过程中或紧随裂解后发生。
如本文所述,该装置优选地包括至少一种导致核酸断裂的生物和/或化学试剂,或包含接受这样的试剂的加入的室。该装置也优选地包含或接受用于浓缩样品的至少一种组分的特异性结合剂、用于吸附浓缩的组分的第二(特异的或非特异的)结合剂和至少一种信号生成部分,借此产生相应于目标组分的存在、不存在或浓度的信号。本文公开了所有这些实体(entities)并且生物测定领域的技术人员公知这些实体。包含在本发明的装置中的膜可优选地用于固定针对预期的样品中至少一种组分,或可能的组分的至少一种特异结合的配体。本文公开了合适的结合剂。可选择地,可在支持物如小珠或不可溶的颗粒上固定特异结合配体,这些小珠或颗粒然后将被膜的作用所固定。
一种优选的装置包含用于接受血样的室;用于接受包含去污剂(例如DOC)、核酸酶(例如微球菌核酸酶)和任何金属或辅因子(例如Ca2+)的稀释剂的室;具有不超过10μm,优选地2μm(例如大约0.45μm)的孔并具有固定其上的针对至少一种分析物(例如CRP、全TC、SAH)的特异结合配体(例如和抗体或片段,其构建物或衍生物)的膜;和用于接受包含至少一种额外的结合剂和可选择地信号生成部分的溶液的室。所述装置可能额外地包含用于评价从所述信号生成部分生成的并相应于(直接地或间接地)目标组分的存在、不存在或浓度的信号的区域、比色皿或窗口。
在相关的和更优选的装置中,所述装置包括用于接受血样的室、要么含有或者适于接受去污剂的室和含有按已知方法和/或本文公开的那些方法干燥的核酸酶的室。这些室是三个分离的室,或优选地是一个或两个室,例如,含有去污剂的一个室和含有干燥的核酸酶的第二个室。该装置将和可以含有如上所述的其它特征。
大量形式适用于本发明的装置,包括管、圆筒、筒、瓶、片、棒等。许多这样的形式是公知的但这些形式的性质不是关键的,只要能提供装置的基本特点。圆筒和筒形式高度合适,因为它们能容易地提供用于增强液体通过装置的压力。任何本发明的装置可包含用于评价在操作装置中产生的信号的区域、比色皿或窗口。
本发明的试剂盒通常包括本发明的至少一种装置且,至少,试剂盒将包括膜和用于核酸断裂的材料(例如化学或生物试剂包括本文公开的那些)。典型地的是,提供用于细胞裂解和膜脂转变成小的胶团/微粒的去污剂,以及本文公开的任何方法中的试剂盒使用的试剂和/或指导。
本发明的试剂盒和装置最优选地适用于自动分析设备或与自动分析设备共同使用。最合适的是“即时检验”自动分析设备。
一个优选的试剂盒包括用于获得血样的可选方式;用于接受所述血样和包含去污剂(例如DOC)、核酸酶(例如微球菌核酸酶)、任何金属或辅因子(例如Ca2+)和可选择地缓冲液的稀释剂的容器;具有不超过2μm(例如大约0.45μm)的孔并具有固定其上的针对至少一种分析物(例如CRP、全TC、SAH)的特异结合配体(例如和抗体或片段、其构建物或衍生物);和用于接受包含至少一种额外的结合剂和可选择地信号生成部分的溶液的容器或室。试剂盒可能可选择地和额外地包含使用、评价测定的结果和/或将结果与生物状况相联系的指导。
特别优选的试剂盒包括用于获得血样的可选的方式;用于接受所述血样和包含去污剂(例如DOC)的稀释剂的容器。试剂盒中的容器或第二容器也含有干燥形式的核酸酶(例如微球菌核酸酶)和任何必需的金属或辅因子(例如Ca2+)。试剂盒也含有;具有不超过2μm(例如大约0.45μm)的孔并具有固定其上的针对至少一种分析物(例如CRP、全TC、SAH)的特异结合配体(例如和抗体或片段、其构建物或衍生物);和用于接受包含至少一种额外的结合剂和可选择地信号生成部分的溶液的容器或室。试剂盒可可选择地和额外地包括使用、评价测定的结果和/或将所述结果与生物状况相联系的指导并也可能可选择地含有干燥或溶液形式的缓冲液。
具体实施方式
以下将参考非限制性实施例解释本发明。
实施例1
按生产商描述的方法在密度梯度介质PolymorphprepTM(Axis-ShieldPoCAS,Oslo,Norway)上离心来源于健康供体的全血。在两个分离的部分中收集总的白细胞和红细胞。将白细胞计数。将白细胞加入全血中来增加白细胞的数目,使从7×109/L增加到30×109/L。将12.5μl富集的血液加入到1ml含有1mMCaCl2的稀释液体中(缓冲的脱氧胆酸钠)。将这个溶液分成500μl的两等份,随后在其中一份中加入2.5μl(0.25U)微球菌核酸酶。将50μl等份的对照溶液和含核酸酶的溶液加到含有0.45μm孔径的硝酸纤维素膜的膜流通装置(NycoCard试验装置)中。在加入核酸酶后的0秒、60秒和120秒加入等份。当血细胞裂解物已经以流通方式浸湿了膜后,加入50μl金标抗体,然后加入50μl洗涤溶液。应注意,膜结合抗体和标记抗体被定向到抗不同蛋白,这意味着没有形成三明治结构及实验只显示了金标抗体和所述膜的非特异性结合。使用反射计(NycoCard阅读器)测量保留在膜上的抗体的红色。这个仪器以K/S表示颜色的密度,K/S同捕获在膜上的金标记抗体的量成比例。白膜给出大约0.05的K/S,而非常密的、深红色给出大约5的K/S。
x秒后的K/S
秒060120
对照0.710.891.24
核酸酶0.1540.1230.136
该表显示了对照的随着孵育周期而增加的高的非特异背景,当背景下降到正常的低水平(同基于血浆的分析一样低),甚至用第一等份用少于30秒的孵育。
实施例2
在本实验中,没有使用实施例1中使用的密度梯度介质离心来将白细胞富集到全血中。在2500xg将来源于健康供体的全血离心15分钟。吸出血浆,随后吸出棕黄层和红细胞部分的一部分。棕黄层部分含有富集了白细胞的红细胞。最后,从试管的底部获得纯的红细胞。将富集了白细胞的部分和红细胞部分加入到血浆中来给出同全血一样的红细胞压积,计数所有三部分的白细胞。在575nm使用岛津分光光度计用分光光度法测量200倍稀释在蒸馏水中的血红蛋白。
O.D.575nm白细胞/L
全血0.6727.5×109
白细胞富集0.65734×109
红细胞0.6900
此后,将这三部分命名为C(全血)、W(白细胞富集的血)和R(红细胞部分)。
分别将5μl的C、W和R轻柔地同400μl稀释液体混合,将50μl的每一种溶液加到NycoCard试验装置中,然后加入50μl的金标抗体和50μl的洗涤溶液。如实施例1中所公开的,定向标记抗体和膜结合抗体使抗不同的蛋白。换言之,这个实验仅显示非特异背景。然后剧烈摇动裂解的C、W和R稀释物10秒钟,并在上面公开的膜试验装置中处理50μl的每一种稀释物。使用NycoCard阅读器测量两个系列的标记背景。
K/SK/S摇动的样品
C0.1360.097
W0.4220.112
R0.0880.094
该表显示,与用纯红细胞部分(R)获得的背景相比较,在W的情况下,非特异背景高度升高,用C获得的背景轻度升高。摇动将C和W的背景降低到同R的背景相同的水平。
在下一个实验中,将5μl的C、W和R轻柔地同400μl含有1mMCaCl2和0.4U微球菌核酸酶的稀释液体混合并在上面公开的试验装置中处理。
K/S
C0.12
W0.108
R0.094
该表显示,样品的核酸酶消化降低背景到“摇动”水平。用剪切力或DNA的酶消化降解DNA获得了相同的有利的低背景。核酸酶消化的样品的摇动没有进一步降低背景(没有显示)。
实施例1和2证明了去污剂增溶的全血的核酸酶消化如何将在膜流通试验装置中的非特异背景降低到同我们用基于血浆的分析获得的背景相同的低水平。下面的两个实施例显示了在我们的基于同实施例1和2中公开的手动操作的试验装置相同的膜流通系统的自动分析仪中分析稀释的和裂解的血样的CRP(C反应蛋白)时核酸酶处理的效果。应注意,这个分析仪以非常轻柔的方式将同样体积的取自手指的全血(1.5μl)同稀释液体(200μl)混合。换言之,没有剪切力来降解从裂解的白细胞核释放的DNA或该剪切力太小以至于不能有效作用。
实施例3
使用自动分析仪分析实施例2中公开的血样C、W和R。血液要么在正常的稀释液体中裂解要么在含有5mMCaCl2和0.2U微球菌核酸酶的稀释液体中裂解。
W | 8.8 | 45.0 | 2.70 | 45.0 |
R | 1.72 | 43.6 | 1.93 | 46.4 |
该表显示,血样中的CRP-浓度是大约1mg/L(基于血浆的测定)。这是健康人的典型的值。使用血液时,由于血红蛋白的红颜色,必须预期到所述背景的轻度升高。这意味着,样品R(红细胞和没有白细胞)的CRP-值是基线或CRP的目标值。看用对照稀释液体获得的结果,它显示,正常全血的CRP结果升高了45%,用白细胞富集的制备物的CRP结果升高了512%。使用含核酸酶的稀释液体时,没有观察到全血的CRP增加,发现白细胞富集的制备物的CRP增加了40%。结论是,当使用正常稀释液体稀释样品W(高白细胞计数)时,显著高估了CRP。当使用核酸酶时,也似乎轻微高估了这个样品。这表明,在这个实验中本应使用更高浓度的核酸酶。HCT(红细胞压积)测定显示,这些对所有三个样品是相似的。
实施例4
在该仪器上分析具有低、中和高血浆浓度的CRP的三个血样。所有三个样品均具有高白细胞计数。正常的细胞计数是大约7×109。
样品CRP,mg/L白细胞计数
11.329.6×109
217.223.5×109
3136.826.6×109
使用正常的稀释液体或含有5mMCaCl2和0.5U微球菌核酸酶的稀释液体分析样品。基于实施例3中的结论,在这个实验中将核酸酶的浓度从0.2(实施例3)提高到0.5U。也基于4-6个平行测定变异系数(CV)。由于样品1的CRP值非常低,没有计算其CV。
该表显示,当使用正常稀释液体时,所有三个血样的CRP-浓度均被高估。CRP-浓度越低,使用血液比血浆的测定间的差别越差。认为使用血浆的测定是正确的值。尤其严重的是含有低CRP-浓度的样品的差别。样品1高估了1800%,样品2高估了185%和样品3高估了117%。假如我们假定所有三个样品具有相同的固定的非特异背景贡献,这能被预期。
使用含有核酸酶的稀释液体时,情况极其不同。所有三个样品的全血测定同血浆的值相似。此外,当稀释液体中包括核酸酶时,所述测定的CV显著更低。
结论是,核酸酶介导的裂解的血样的DNA降解给出了自动CRP-测定的惊人的质量提升。
实施例5
按实施例2中公开的方法处理来源于健康供体的全血。全血(C)、白细胞富集的血液(W)和红细胞(R)显示了相同的红细胞压积。白细胞计数分别是5.9×109、16.9×109和0×109/L。将25μl“血液”样品加入到含有2mMMgCl2、具有或不具有1U核酸酶的400μl缓冲的去污剂中。为了将剪切力降低到最低,非常轻柔地将血液同裂解溶液混合。将50μl这种溶液加入到膜流通装置(膜面积9.4mm2)和选取流动时间。用抗-CRP抗体包被所述膜。然后加入50μl金标抗-CRP抗体,然后加入50μl洗涤溶液。最终,使用反射计(NycoCard阅读器)测量膜的颜色。在这个实施例中,在膜上的红颜色代表了真正的CRP-信号加上更多或更少量的非特异性背景信号。
样品 | 流动时间(秒) | 颜色(K/S) |
C | 38 | 0.81 |
C+核酸酶 | 22 | 0.313 |
W | 188 | Nd** |
W+核酸酶 | 23 | 0.310 |
R | 25 | 0.27 |
R+核酸酶 | 23 | 0.306 |
血浆* | 24 | 0.322 |
*用15μl血浆来提供同用血样得到的装载相同的血浆装载。
**由于堵塞,结合物没有通过膜。颜色是暗红。
该表显示,同核酸酶处理的样品相比,全血(C)给出了流动时间的显著增加。对于样品W,流动时间戏剧性地增加(8倍)并且在应用金标物时液体流动完全停止。当加入核酸酶时,所有样品均显示了大约23秒的相同的良好的流动。这是同血浆和同没有核酸酶的红细胞部分相同的流动时间。关于信号,没有核酸酶的全血应该已经导致CRP的非常显著的高估,关于W,由于DNA介导的膜堵塞,流动完全停止。
在核酸酶处理时,所有三个样品给出了大约0.31的非常相似的CRP-信号,该信号接近于应视为目标值的用血浆获得的信号(0.322)。这个低信号充分地高于用不相关抗体包被的膜获得的颜色(0.093),其代表了本应用含有零CRP的样品获得的背景值。因此,这是低的但显著的0.31的信号,并且与健康血液供体的低CRP水平相一致。
实施例6
当分析低浓度血液分析物时,为了部分补偿所述低浓度并获得可读的信号,处理尽可能多的血液是有利的。设计这个实验来测定去污剂介导的血液裂解物能通过0.45μm硝酸纤维素膜(流动面积9.4mm2)处理的最高可能的血液的量。
由于在这个实验的部分使用了巨大量的血液,必须使用高浓度的去污剂来确保去污剂的效率不会成为弱流动的原因。
用具有或不具有1U核酸酶的缓冲的去污剂稀释来源于健康供体的血液(白细胞计数6.5×109/L)并在室温下孵育30秒(孵育体积为200μl)。将100μl含有从1.5到25μl全血的这种溶液加入到流通装置中,然后加入50μl的金标抗-CRP抗体和50μl洗涤溶液。测量总的测定时间(起始于样品应用止于洗涤溶液)。
处理的血液体积(μl) | 总的测定时间(秒) |
25 | Nd* |
25+核酸酶 | 189 |
12.5 | 672 |
12.5+核酸酶 | 142 |
6.25 | 291 |
6.25+核酸酶 | 128 |
3.1 | 264 |
3.1+核酸酶 | 128 |
1.5 | 150 |
1.5+核酸酶 | 120 |
*在样品应用时膜堵塞
该表格显示,DNA的核酸酶消化在血液装载的全部水平上导致升高的流动。看一下测定时间,似乎是具有核酸酶消化的12.5μl的血液给出了同1.5μl没有核酸酶的血液大约相同的测定时间,大约8的因素。从其他角度看一下结果,假如我们需要低于4分钟的快速试验的总测定时间,这个系统容忍1.5μl的没有核酸酶的血液和25μl的有核酸酶消化的血液,16.7的因素。广泛而言,在这个免疫-浓缩试验装置中,核酸酶介导的DNA消化允许至少10倍多的待处理血液。
实施例7-核酸酶冷冻干燥程序:
在含有12%海藻糖、0.1%BSA、1mMMgC12、25mMTrispH7.4的缓冲液中在40U/ml的浓度制备BenzonaseTM。冷冻这个BenzonaseTM溶液的等份,然后以本质上已知的方式在-30摄氏度冷冻干燥。
实施例8-冷冻干燥的核酸酶的用途:
将冷冻和冷冻干燥的BenzonaseTM小珠(如实施例7中制备的)置于AfinionTM分析仪CRP圆筒中,并使用AfinionTM分析仪处理含有升高的白细胞的血样。通过使用正常化的CRP值计算并以百分比表达BenzonaseTM的相对活性。
在AfinionTMCRP测定中的相对核酸酶活性:
A.-在分析含有升高的白细胞的血样前在AfinionTMCRP裂解缓冲液中以40U/ml重悬BenzonaseTM高达18小时的各种时间周期,温度为22摄氏度。
时间 | 5分钟 | 60分钟 | 120分钟 | 18小时 |
相对活性 | 100% | 104% | 94% | 61% |
它证明,BenzonaseTM似乎在水悬液中稳定低于一天的时间。注意,活性在120分钟后降低。
B-在分析含有升高的白细胞的血样前,在4、22或37摄氏度孵育按实施例7中方法制备的并置于上面公开的AfinionTMCRP圆筒中的冷冻和冷冻干燥的BenzonaseTM小珠高达2个月的各种时间周期。
温度 | 0天 | 1个月 | 2个月 |
4C | 100 | 99 | 96 |
22C | 100 | 100 | 105 |
37C | 102 | 98 | 99 |
以冷冻和冷冻干燥的小珠存在时,BenzonaseTM似乎稳定几个月的时间。
Claims (17)
1.全血样品的膜测定方法,该方法包含在导致细胞裂解的条件下处理所述样品,并将由此产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下,其中所述膜的孔径不大于10μm,并且其中在所述膜上固定特异结合所述样品组份的配体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中通过物理条件、化学条件和/或生物条件提供核酸分子的断裂。
3.根据权利要求2所述的方法,其中通过放射性条件提供核酸分子的断裂。
4.根据权利要求2所述的方法,其中通过选自微球菌核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I、核酸酶BAL31或BenzonaseTM的生物试剂提供所述的生物条件。
5.根据权利要求1到4任一项所述的方法,其中细胞裂解是去污剂裂解、低渗裂解、高渗裂解或离液序列高裂解。
6.根据权利要求5所述的方法,其中通过选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂的去污剂提供所述裂解。
7.核酸断裂条件在提高测定方法性能中的用途,该测定方法包括裂解的全血样品流通过孔径不大于10μm的膜,并且其中在所述膜上固定特异结合所述样品组份的配体。
8.根据权利要求1到6任一项所述的方法在提高测定方法性能中的应用。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的用途,以获得至少一种下述改进:
a)降低膜堵塞;
b)减少测定时间;
c)增加可处理的样品体积。
10.测定装置,其包括用于接收全血的室和至少一种孔径不大于10μm的膜,其中所述装置含有用于断裂核酸的化学和/或生物试剂,并且其中在所述膜上固定特异结合所述样品组份的配体。
11.根据权利要求10所述的装置,其中所述生物试剂是核酸酶。
12.根据权利要求10到11任一项所述的装置,其中所述装置含有去污剂。
13.用于测定全血中选自C反应蛋白、钴胺、运钴胺蛋白、高半胱氨酸、叶酸、叶酸受体或其组合的至少一种组分的试剂盒,所述试剂盒包括孔径不大于10μm的膜;和至少一种用于核酸断裂的化学和/或生物装置,并且其中在所述膜上固定特异结合所述样品组份的配体。
14.一种用于测定全血中全的运钴胺蛋白的试剂盒,所述试剂盒包括孔径不大于10μm的膜;和至少一种用于核酸断裂的化学和/或生物装置,并且其中在所述膜上固定特异结合所述样品组份的配体。
15.根据权利要求13所述的试剂盒,含有至少一种试剂,其选自;
i)引起细胞裂解的试剂;
ii)测定所述样品组分的试剂,所述组分选自C反应蛋白、钴胺、运钴胺蛋白、高半胱氨酸、叶酸、叶酸受体或其组合;
iii)方法使用说明书,该方法包括裂解试剂介导的所述细胞的裂解、因而断裂释放的核酸分子、然后使至少部分产生的样品通过所述的膜。
16.根据权利要求14所述的试剂盒,含有至少一种试剂,其选自;
i)引起细胞裂解的试剂;
ii)测定所述样品组分的试剂,所述组分是全的运钴胺蛋白;
iii)方法使用说明书,该方法包括裂解试剂介导的所述细胞的裂解、因而断裂释放的核酸分子、然后使至少部分产生的样品通过所述的膜。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的试剂盒,其中所述生物装置含有核酸酶。
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