CN101294152A

CN101294152A - 在活性位点环区具有额外氨基酸残基的i-s1和i-s2亚族枯草杆菌酶

Info

Publication number: CN101294152A
Application number: CNA2008100876602A
Authority: CN
Inventors: K·安德森维尔博; F·米凯尔森; P·汉森坎普; C·安德森; M·诺里加德-马德森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2008-10-29
Also published as: DE69933695T2; CA2355947C; AU1772600A; JP2002533075A; WO2000037622A1; CN1333822A; BRPI9916353B1; JP4768129B2; DE69933695D1; BR9916353A; CA2355947A1; EP1141257B1; AU773674B2; KR100649901B1; ATE342966T1; EP1141257A1; KR20010093165A

Abstract

本发明涉及在第95－103位的活性位点(b)环内的95位含有额外氨基酸残基的I－S1和I－S2亚族枯草杆菌酶。与其亲本酶相比，枯草杆菌酶变体在洗涤剂中显示改良的洗涤性能。

Description

在活性位点环区具有额外氨基酸残基的I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶

技术领域

本发明涉及在第95-103位的活性位点环(b)区的95位具有至少一个额外氨基酸残基的新的I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶(subtilase)。当用于洗涤剂、清洁和洗涤剂组合物中时，这些蛋白酶是有用的，表现出优异的或改进的洗涤性能。本发明还涉及编码用于所述酶表达的基因，当被插入到合适的宿主细胞或微生物中时表达所述酶。本发明还涉及用此基因转化的能够表达所述酶变体的宿主细胞，以及制备这些新酶的方法。

发明背景

在洗涤剂工业中，酶被用于洗涤制剂已有30多年的历史。在这些制剂中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、以及其它的酶，或它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，例如，DURAZYM(Novo Nordisk A/S)，RELASE

(Novo Nordisk A/s)，MAXAPEM

(Gist-Brocades N.V.)，PURAFECT(Genencor International，Inc.)。

而且，许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，例如EP130756(GENENTECH)(相应于美国再颁专利34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然318375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193803-813；Russel和Fersht自然328496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAYS.A.)；EP 251446(GENENCOR)；WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)；WO91/00345(NOVO NORDISK A/S)；EP 525610A1(SOLVAY)；以及WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)。

然而，尽管已有大量有用蛋白酶变体的描述，但对于许多工业应用，仍需求新的改进蛋白酶或蛋白酶变体。

因此，本发明的目的是提供特别是用于洗涤剂工业的改进蛋白酶或蛋白质工程化蛋白酶变体。

发明概述

本发明人发现，其至少一个活性位点环长于目前已知的活性位点环的枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂组合物中表现出改进的洗涤性能。我们在构建与其亲本野生型酶相比在洗涤剂组合物中表现出改进的洗涤性能的枯草杆菌蛋白酶变体，尤其是枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase

)的变体的过程中对此进行了鉴定。这已在我们的早期申请DK1332/97中描述过。

现在已发现，在第95-103位的活性位点环(b)区的95位(或更确切地在第95-96位之间)具有至少一个额外氨基酸残基的I-S1(真正的“枯草杆菌蛋白酶”)和I-S2(高碱性枯草杆菌蛋白酶)亚族某些枯草杆菌酶或其变体，与目前已知的以及在所述申请中描述的那些相比，显示出令人吃惊的改进的洗涤能力。

根据本发明的改进蛋白酶可以通过从自然资源分离获得，或通过在野生型枯草杆菌蛋白酶的活性位点环(b)第95和第96位之间导入至少一个额外的氨基酸残基(一个插入)来获得(对活性位点环的定义和位置的编号见下)。

尽管此发现是在枯草杆菌蛋白酶309中获得的，但我们预测产生或分离同样有利的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体是可能的。

而且可能特异地对自然分离物进行筛选，以鉴定含有比已知野生型枯草杆菌酶例如枯草杆菌蛋白酶309的相应活性位点环长的活性位点环(b)的新野生型枯草杆菌酶，这种枯草杆菌酶可被认为在第95-96位之间有一个插入氨基酸残基，而且与关系最近的已知枯草杆菌蛋白酶例如枯草杆菌蛋白酶309相比，其在洗涤剂中表现出优异的洗涤能力。

关于比对和编号，参考下图1，1a，2和2a，这些图显示了枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)(a)和枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之间的比对，以及枯草杆菌蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(g)之间的比对。图1和2中的比对是通过使用GCG软件包的GAD程序按下文指示的方法确立的，而图1a和2a中的比对与WO91/00345中所显示的相同。在本专利申请中这些比对被用作残基编号的参考。

7个活性位点环(a)-(g)(包括所指出的两个末端氨基酸残基)在此定义为包括下面所给片段中的氨基酸残基：

(a)第33和43位氨基酸残基之间的区域；

(b)第95和103位氨基酸残基之间的区域；

(c)第125和132氨基酸残基之间的区域；

(d)第153和173氨基酸残基之间的区域；

(e)第181和195位氨基酸残基之间的区域；

(f)第202和204位氨基酸残基之间的区域；

(g)第218和219位氨基酸残基之间的区域。

因此，本发明的第一个方面涉及在第95-103位的活性位点环(b)区的95位具有至少一个额外氨基酸残基的分离的(即，纯度大于10％的)I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶，由此所述额外氨基酸残基相应于在第95和96位之间至少一个氨基酸残基的插入。

本发明的第二个方面涉及编码本发明枯草杆菌酶变体的分离的DNA序列。

本发明的第三个方面涉及含有编码本发明枯草杆菌酶变体的分离DNA序列的表达载体。

本发明的第四个方面涉及用第四方面的表达载体转化的微生物宿主细胞。

本发明的再一个方面涉及本发明枯草杆菌蛋白酶的制备。

本发明的酶通常可以通过如下方式产生：培养微生物菌株，从中分离该酶，并以大体上纯的形式回收该酶；或将本发明第四方面的表达载体插入合适的微生物宿主中，培养该宿主以表达目的枯草杆菌酶，并回收该酶产物。

本发明还涉及含有本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的组合物。

更进一步地，本发明涉及本发明的酶在许多工业相关用途中，尤其是在清洁剂组合物中的应用，以及在含有该突变酶的清洁剂组合物，特别是含有该突变枯草杆菌蛋白酶的洗涤剂组合物中的应用。

定义

在更为详细地论述本发明之前，将首先定义下面的术语和约定。

氨基酸命名

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

W＝Trp＝色氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

C＝Cys＝半胱氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

N＝Asn＝天冬酰胺

Q＝Gln＝谷氨酰胺

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

X＝Xaa＝任意氨基酸

核酸命名

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶(仅在DNA中)

U＝尿嘧啶(仅在RNA中)

变体名称的命名原则和约定

在描述根据本发明产生或设想的各种酶变体时，为了便于提及，采用下述命名原则和约定：

首先通过分离的或亲本野生型酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)之间的比对，定义参照框架。

为了给变体编号，可以通过9.1版本GCG软件包的GAP程序利用下述参数获得该比对：断缺区产生罚分(gap creation penalty)＝8和断缺区延伸罚分(gap extension penalty)＝8，而所有其它参数保留其默认值。

另一种方法是利用枯草杆菌酶之间的已知公认比对，例如描述于WO91/00345中的比对。在大多数情况下，这些差异并不是重要的。

枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)和枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)以及和枯草杆菌蛋白酶carlsberg(BLSCAR)之间的比对，分别显示在图1，1a，2，和2a中。通过此比对，可以参照BASBPN对许多缺失和插入进行定义。在图1中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶309在第36、58、158、162、163以及164位具有6个缺失，而在图1a中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶309在第36、56、159、164、165以及166位具有同样的缺失。在图2中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在第58位具有一个缺失，而在图2a中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在第56位有一个缺失。这些缺失在图1，1a，2，2a中通过星号(*)标明。

在野生型酶中进行的各种修饰通常使用下面三个要素来表示：

原始氨基酸位置替代氨基酸

因此符号G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。

在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以使用仅指示位置和替代氨基酸的简写符号，

位置替代氨基酸

关于同源枯草杆菌酶中的修饰，此种符号尤其恰当(见下文)。

同样，当替代氨基酸残基的身份不重要时，可以使用

原始氨基酸位置

当原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则仅指明位置，例如：170。

当原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸时，则在括号{}中指出选择的氨基酸，

原始氨基酸位置 {替代氨基酸 ₁ ，....，替代的氨基酸 _n}

对于具体变体，使用具体的三字母或一字母代码，包括指示任意氨基酸残基的代码Xaa和X。

替代：

谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名为：

Glyl95Glu或G195E

或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名为：

Glyl95Xaa或G195X

或

Gly195或G195

因此，丝氨酸在第170位替代任意氨基酸残基将命名为：

Xaa170Ser或X170S

或

170Ser或170S。

关于同源枯草杆菌酶中的改变，该符号尤其适合(见下文)。因此170Ser意味着包含例如BASBPN中的Lys170Ser改变和BLSAVI中的Arg170Ser改变(参见图1)。

对于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸的改变，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸在第170位替代精氨酸可以通过

Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}来表示，以指示变体

R170G、R170A、R170S和R170T。

缺失：

第195位甘氨酸的缺失将表示为：

Gly195*或G195*

相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失将表示为：

Gly195*+Leu196*或G195*+L196*

插入：

额外氨基酸残基的插入，例如赖氨酸在G195位之后的插入表示为：

Gly195GlyLys或G195GK；或

当插入不止一个氨基酸残基时，例如在G195之后插入一个赖氨酸，丙氨酸和丝氨酸时，这表示为：

Gly195GlyLysAlaSer或G195GKAS

在这种情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置数后加上小写字母来编号该插入的氨基酸残基。上述例子中的第194-196位序列将因此被表示为：

194 195 196

BLSAVI A- G- L

194 195 195a 195b 195c 196

变体 A- G- K- A- S- L

在插入与已有氨基酸残基相同的氨基酸残基时，很显然在命名中产生了简并性。例如在上述例子的甘氨酸之后插入一个甘氨酸，则表示为G195GG。而对于从

194 195 196

BLSAVI A- G- L

到

194 195 195a 196

变体 A- G- G- L

194 194a 195 196

的改变，实际上相同的变化同样可以表示为A194AG。

这些情况对于技术人员来说是显而易见的，因此表示式G195G3和针对该类型插入的相应表示式旨在包括这种等同简并表示式。

缺口填充：

当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN’序列进行的参照比较中，一个酶中存在缺失时，在该位置的插入例如第36位的天冬氨酸插入表示为：

*36Asp或*36D

多重修饰：

含有多重修饰的变体通过加号分开，例如：

Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E

表示在第170位和195位用酪氨酸和谷氨酸分别替代精氨酸和甘氨酸的修饰。

或例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示变体

Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，

Tyr167Gly+Arg170Ser，Tyr167Gly+Arg170Thr，

Tyr167Ala+Arg170Gly，Tyr167Ala+Arg170Ala，

Tyr167Ala+Arg170ser，Tyr167Ala+Arg170Thr，

Tyr167Ser+Arg170Gly，Tyr167Ser+Arg170Ala，

Tyr167Ser+Arg170Ser，Tyr167Ser+Arg170Thr，

Tyr167Thr+Arg170Gly，Tyr167Thr+Arg170Ala，

Tyr167Thr+Arg170Ser，和Tyr167Thr+Arg170Thr。

当涉及到对具有特定共性的氨基酸残基例如带正电荷的残基(K，R，H)，带负电荷的残基(D，E)进行替代、置换、插入或缺失修饰时，或涉及到保守氨基酸修饰例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}时，这种命名原则尤其恰当。具体参见“发明详述”部分。

蛋白酶

裂解蛋白质底物中酰胺键的酶被归为蛋白酶，或(可互换使用的)肽酶(参见Walsh，1979，酶反应原理(Enzymatic Reaction Mechanisms)，W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。

氨基酸位置/残基的编号

如没有另外提及，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN’(BASBPN)序列的编号。BPN’序列的进一步描述参见图1和2，或Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性位点含有一个必需丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”，第五版，McGraw-Hill Book Company，NY，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶具有20,000到45,000道尔顿的分子量。其被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上相似于同样是丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更为狭窄的术语，碱性蛋白酶，其包括一个亚族，反映了一些丝氨酸蛋白酶的高最适pH值，从pH 9.0到11.0(综述参见Priest(1977)Bacteriological Rev.41711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，蛋白质科学(Protein Science )6(1997)501-523提议将丝氨酸蛋白酶的一个亚族暂称为枯草杆菌酶(sulbtilase)。通过对170多个先前被称作枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源分析，定义了这些酶。枯草杆菌蛋白酶以前常常被解释为由革兰氏阳性菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人的提议其是枯草杆菌酶的一个亚族。各种各样的枯草杆菌酶已获得鉴定，而且许多枯草杆菌酶的氨基酸序列已被测定。对于这些枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更具体描述，参考Siezen等(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚族，I-S1或“真枯草杆菌蛋白酶”，包含“经典的”枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)，枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE

，NOVO NORDISK A/S)，以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

Siezen等(上文)识别了枯草杆菌酶的另一个亚族，I-S2或高碱性枯草杆菌蛋白酶。I-S2蛋白酶亚族被描述为高碱性枯草杆菌蛋白酶，其包括酶例如枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL

，Gist-BrocadesNV)，枯草杆菌蛋白酶309(SAVINASE

，NOVO NORDISK A/S)，枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE，NOVO NORDISK A/S)，以及碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

枯草杆菌酶的首字母缩写列表

I-S1

枯草杆菌蛋白酶168，BSS168(BSSAS(枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus)，BSAPRJ(枯草杆菌蛋白酶J)，BSAPRN(枯草杆菌蛋白酶NAT)，BMSAMP(肠系膜肽酶(Mesentericopeptidase))，

枯草杆菌蛋白酶BPN’，BASBPN，

枯草杆菌蛋白酶DY，BSSDY，

枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，BLSCAR(BLKERA(角蛋白酶)，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3)，

BSSPRC，丝氨酸蛋白酶C

BSSPRD，丝氨酸蛋白酶D

I-S2

枯草杆菌蛋白酶Sendai，BSAPRS

枯草杆菌蛋白酶ALP 1，BSAPRQ，

枯草杆菌蛋白酶147，Esperase

BLS147(BSAPRM(SubtilisinAprM)，BAH101)，

枯草杆菌蛋白酶309，Savinase

，BLS 309/BLSAV I(BSKSMK(M-蛋白酶)，BAALKP(枯草杆菌蛋白酶PB92，嗜碱芽胞杆菌(Bacillusalkalophilic)碱性蛋白酶)，BLSUBL(枯草杆菌蛋白酶BL))，

碱性弹性蛋白酶YaB，BYSYAB，

“SAVINASE ”

SAVINASE

由NOVO NORDISK A/S销售。其是来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草杆菌蛋白酶309，而且其仅在一个位置上不同于BAALKP(N87S，参见本文图1)。SAVINASE

具有在图1中称为b)的氨基酸序列。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述了一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。更详细的参见刚才上面的“枯草杆菌酶”描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特性的同时，对其进行随后的修饰。或者，术语“亲本枯草杆菌酶”可以被称为“野生型枯草杆菌酶”。

枯草杆菌酶变体的修饰

本文所用术语“修饰”被定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及编码枯草杆菌酶的DNA的遗传操作。修饰可以是在目的氨基酸中或处的氨基酸侧链置换、氨基酸替代、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体和突变的枯草杆菌酶是指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该生物体来源于含有原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本生物体，为了产生当在合适宿主中表达时生产所述突变枯草杆菌酶蛋白酶的突变基因，对该亲本基因进行了突变。

同源枯草杆菌酶序列

为了修饰以获得本发明枯草杆菌酶变体，对SAVINASE

枯草杆菌酶的特异活性位点环区和所述环中的氨基酸插入进行了鉴定。

然而，本发明并不限于这种特殊枯草杆菌酶的修饰，而是扩展到与SAVINASE

具有同源一级结构的其它亲本(野生型)枯草杆菌酶。两个氨基酸序列之间的同源性在本发明中用“一致性”参数来描述。

为了确定两个枯草杆菌酶的一致性程度，可以应用9.1版本GCG软件包的GAP程序(下文)以及同上的设置参数。除了氨基酸比对外，该程序还输出两个序列之间的“一致性百分数”计算结果。

基于此描述，鉴定可以根据本发明进行修饰的合适同源枯草杆菌酶和相应的同源活性位点环区，对于本领域的技术人员来说是常规的。

洗涤性能

在例如洗涤或硬表面清洗过程中，酶催化降解存在于待清洁物品上的各种天然存在底物的能力通常被称为洗涤能力，洗涤力，去垢力或洗涤性能。在本申请中术语洗涤性能用于包括该性质。

分离的DNA序列

术语“分离的”，当用于DNA序列分子时，表示该DNA序列已从其天然的遗传环境中分离出来，因此不含有其它无关或不需要的编码序列，而且其形式适用于遗传工程蛋白质生产系统。该分离的分子是指那些从其自然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与之相关的其它基因，但可以包括自然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域的普通技术人员来说是容易的(参见例如，Dynan和Tijan，自然 316：774-78，1985)。术语“分离的DNA序列”也可以被称作“克隆的DNA序列”。

分离的蛋白质

当应用于蛋白时，术语“分离的”是指该蛋白已从其天然环境中分离出来。

在一种优选的形式中，分离的蛋白质相当大程度上不含有其它蛋白，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见下述))。

通过SDS-PAGE检测，分离的蛋白质具有大于10％的纯度，优选大于20％的纯度，更优选大于30％的纯度。进一步优选提供高纯度形式的蛋白质，即通过SDS-PAGE检测，其纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，甚至更优选大于99％的蛋白质。

术语“分离的蛋白质”也可以被称为“纯化的蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”是指来源于最初从其中获得本发明多肽的同源细胞的任何杂质(例如非本发明多肽的另一种多肽)。

获自

与特定微生物来源相连的术语“获自”，在本文中是指由该特定来源产生的，或由其中插入了该来源基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。底物

与蛋白酶底物相关的术语“底物”，应以其最广泛形式解释为包含含有至少一个易受枯草杆菌酶水解的肽键的化合物。

产物

与蛋白酶酶解反应得到的产物相关的术语“产物”，在本发明的上下文中应解释为包括涉及枯草杆菌酶蛋白酶的水解反应的产物。产物可以是随后水解反应中的底物。

附图简要说明

图1显示了使用上述GAP程序在枯草杆菌蛋白酶BPN’(a)和Savinase

(b)之间进行的比对。

图1a显示了从WO 91/00345获得的枯草杆菌蛋白酶BPN’和Savinase

之间的比对。

图2显示了使用上述GAP程序在枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg之间进行的比对。

图2a显示了从WO 91/00345获得的枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg之间的比对。

图3显示了Savinase的三维结构(蛋白质数据库(PDB)录入号1SVN)。图中标明了活性位点环(b)。

发明详述

在第一个方面，本发明的枯草杆菌酶涉及在第95到103位的活性位点环(b)区中95位具有至少一个额外氨基酸残基的分离(即纯度大于10％的)I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶，由此所述额外氨基酸残基相应于在第95-96位之间至少一个氨基酸残基的插入。

换句话说，本发明枯草杆菌酶的特征在于含有一个多于9个氨基酸残基的活性位点环(b)区，而且其中与亲本或已知野生型枯草杆菌酶比较，该额外氨基酸被认为是，或可以被认为是在第95位和96位之间插入的。

本发明第一个方面的枯草杆菌酶可以是从自然环境鉴定和分离的亲本或野生型枯草杆菌酶。

这种亲本野生型枯草杆菌酶可以通过本领域已知的标准技术来进行特异筛选。

进行此筛选的一个优选方法是从多种不同微生物，优选不同的芽胞杆菌菌株，特异PCR扩增已知编码枯草杆菌酶活性位点环的DNA区。

从其DNA和氨基酸序列同源的意义上而言，枯草杆菌酶是一族保守酶。因此，在活性位点环两侧构建相对特异的引物是可能的。

进行此操作的一个方法是研究不同枯草杆菌酶之间的比对(参见，例如Siezen等.蛋白质科学6(1997)501-523)。从此常规工作，本领域技术人员即可构建位于活性位点环两侧的PCR引物，其中所述活性位点环相应于I-S1和I-S2族的任意一个成员例如BLSAVI的第95到103位氨基酸残基之间的活性位点环(b)。使用此引物从大量不同微生物优选不同芽胞杆菌菌株扩增DNA，之后对所述扩增PCR片段进行DNA测序，这样就可能鉴定出产生与例如BLSAVI相比含有更长活性位点区的这些族枯草杆菌酶的菌株，其中所述活性位点区对应于从第95位至103位的活性位点环区，而且可以认为在第95-96位之间存在插入。在鉴定了目的枯草杆菌酶的菌株和部分DNA序列之后，完成本发明枯草杆菌酶的克隆、表达和纯化对于本领域技术人员来说是常规工作。

然而，可以认为本发明的枯草杆菌酶主要是亲本枯草杆菌酶的变体。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明第一个方面的分离枯草杆菌酶，其中所述枯草杆菌酶是一个与亲本酶相比具有更长活性位点环(b)的构建的变体，其构建方式是在第95和96位氨基酸残基之间插入至少一个氨基酸。

本发明的枯草杆菌酶在洗涤剂中显示出优异的洗涤性能，而且如果该酶是构建的变体，则与其关系最近的枯草杆菌酶例如枯草杆菌蛋白酶309相比，该酶在洗涤剂中具有改进的洗涤性能。

不同的枯草杆菌酶在不同类型的洗涤剂组合物中将显示出不同的洗涤能力。在大多数不同类型的洗涤剂组合物中，本发明的枯草杆菌酶与其最近的相关物相比具有改进的洗涤性能。

优选地，本发明的枯草杆菌酶与本文实施例3的洗涤剂组合物(见下文)中的最近相关物相比具有改进的洗涤能力。

为了确定所给枯草杆菌酶氨基酸序列(无论所述枯草杆菌酶序列是亲本野生型枯草杆菌酶序列还是通过定点诱变之外的任何其它方法产生的枯草杆菌酶变体序列)是否属于本发明的范围，可以使用以下程序：

i)将所述枯草杆菌酶序列与枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列进行比对(参见本文的“定义”部分(见上))；

ii)基于步骤i)进行的比对，在所述枯草杆菌酶序列中鉴定对应于枯草杆菌酶BPN’活性位点环(b)区的活性位点环(b)，其中枯草杆菌酶BPN’的活性位点环(b)区包含第95至103位氨基酸残基(包括两个末端氨基酸残基)之间区域；

iii)确定步骤ii)中鉴定的所述枯草杆菌酶序列中的活性位点环(b)是否长于BLSAVI中的相应活性位点环，以及所述延长部分是否相应于在第95和96位之间插入了至少一个氨基酸残基。

如果是，则所研究的枯草杆菌酶是本发明范围中的枯草杆菌酶。

以上步骤i)中进行的比对是按上述方法通过使用GAP程序完成的。

基于此描述，对于本领域技术人员来说，鉴定枯草杆菌酶中的活性位点环(b)和确定所讨论的枯草杆菌酶是否属于本发明范围均是常规的。如果变体是通过定点诱变构建的，则当然预先知道该枯草杆菌酶变体是否属于本发明范围。

本发明的枯草杆菌酶变体可通过本领域已知的标准技术来构建，例如通过定点诱变/随机诱变或通过不同枯草杆菌酶序列的DNA改组来构建。具体参见本文的″制备枯草杆菌酶变体″部分以及材料和方法(参见下文)。

在其它实施方案中，本发明涉及：

1.根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中所述至少一个插入氨基酸残基选自：T、G、A和S；

2.根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中所述至少一个插入氨基酸残基选自下列带电荷氨基酸残基：D、E、H、K和R，更优选D、E、K和R；

3.根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中所述至少一个插入氨基酸残基选自下列亲水性氨基酸残基：C、N、Q、S和T，更优选N、Q、S和T；

4.根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中所述至少一个插入氨基酸残基选自下列小的疏水性氨基酸残基：A、G和V；或

5.根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中所述至少一个插入氨基酸残基选自下列大的亲水性氨基酸残基：F、I、L、M、P、W和Y，更优选F、I、L、M和Y；

在再一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的分离枯草杆菌酶，其中与BLSAVI中的相应活性位点环相比，第95和96位之间的所述插入包括至少两个氨基酸。

在其它实施方案中，本发明涉及含有至少一个选自下组的插入的分离枯草杆菌酶(使用BASBPN的编号方式)：

X95X{T，G，A，S)

X95X{D，E，K，R}

X95X{H，V，C，N，Q}

X95X{F，I，L，M，P，W，Y}

或更为具体地对于枯草杆菌蛋白酶309和紧密相关的枯草杆菌酶例如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK而言该插入是

V95VA

V95VT

V95VG

V95VS

V95VD

V95VE

V95VK

V95VR

V95VH

V95VV

V95VC

V95VN

V95VQ

V95VF

V95VI

V95VL

V95VM

V95VP

V95VW

V95VY

此外，本发明还涉及在第95位含有多个插入，或含有以下任意组合的枯草杆菌酶

V95VT+Y167A

正如本领域所熟知的，所谓一个氨基酸残基对一个相似氨基酸残基的保守替代应该对酶的特性仅产生微小的改变。

下面表III列出了多组保守氨基酸替代：

表III

保守氨基酸替代

共有性质氨基酸

碱性(带正电荷) K＝赖氨酸

H＝组氨酸

酸性(带负电荷) E＝谷氨酸

D＝天冬氨酸

极性 Q＝谷氨酰胺

N＝天冬酰胺

疏水性 L＝亮氨酸

I＝异亮氨酸

V＝缬氨酸

M＝甲硫氨酸

芳香族 F＝苯丙氨酸

W＝色氨酸

Y＝酪氨酸

小分子 G＝甘氨酸

A＝丙氨酸

S＝丝氨酸

T＝苏氨酸

基于此原则，含有保守替代例如G97A+A98AS+S99G，G97S+A98AT+S99A的枯草杆菌酶变体应该表现出彼此不会明显不同的特性。

基于此处公开的和/或示例的枯草杆菌酶变体，为了获得显示出相似改进洗涤能力的其它枯草杆菌酶变体，鉴定这些变体的合适保守修饰对于本领域的技术人员来说是常规的工作。

根据本发明，不论为了从自然或人工产生的多样性中分离本发明新酶，还是为了从亲本枯草杆菌酶设计和产生变体，本发明的枯草杆菌酶均属于I-S1和I-S2亚族，尤其是I-S2族。

关于来自I-S1族的变体，优选从下组选择亲本枯草杆菌酶：BSS168(BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP)，BASBPN，BSSDY，BLSCAR(BLKERA，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC和BSSPRD，或者它们的保留了I-S1亚族特性的功能性变体。

关于来自I-S2亚族的变体，优选从下组选择亲本枯草杆菌酶：BSAPRQ，BLS147(BSAPRM，BAH101)，BLSAVI(BSKSMK，BAALKP，BLSUBL)，BYSYAB和BSAPRS，或它们的保留了I-S2亚族特性的功能性变体。

所述亲本枯草杆菌酶尤其是指BLSAVI(SAVINASE

NOVO NORDISKA/S)，因此本发明的优选枯草杆菌酶变体是SAVINASE

的变体。

本发明还包括所有组合了任意其它氨基酸序列修饰的上述本发明枯草杆菌酶。特别是包括与本领域已知其它修饰的组合以提供改进的酶性质。本领域描述了许多具有不同改良特性的变体，而且在本文的“发明背景”部分(参见上文)也提及了许多这样的枯草杆菌酶。在此公开这些参考文献作为鉴定可以有利地与本发明枯草杆菌酶变体组合的枯草杆菌酶变体的参考。

这些组合包括第222位(提高氧化稳定性)，第218位(提高热稳定性)，在稳定该酶的Ca-结合位点中例如第76位的替代，以及许多现有技术已知的其它位置。

在其它实施方案中，可以有利地将本发明枯草杆菌酶变体与任意下述位置的一个或更多修饰组合起来：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。

特别是下列BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP的变体被认为适用于进行组合：K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。

而且，包含与上述任意一个或多个修饰组合的如下任意变异：

S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或者这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合的变体表现出改进的特性。

更进一步地，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选与一个或多个在任何第129、131、133和194位的修饰组合，这些修饰优选129K、131H、133P、133D和194P修饰，且最优选P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修饰。任何这样的修饰预期可以在本发明枯草杆菌酶变体的生产中提供更高的该变体表达水平。

因此，本发明的一个更进一步的实施方案涉及根据本发明的变体，其中所述修饰选自下组：

制备枯草杆菌酶变体

用以克隆本发明枯草杆菌酶以及将插入导入基因(例如：枯草杆菌酶基因)的方法是本领域所熟知的，参考在“发明背景”部分引用的文献。

通常，为了获得本发明的枯草杆菌酶变体，可以使用用以克隆基因和将(随机和/或定点)插入导入所述基因的标准程序。对于适合技术的进一步描述，参见本文实施例(见下文)和(Sambrook等人.(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A laboratory manual)，冷泉港实验室.冷泉港，NY；Ausubel，F.M.等(编)″现代分子生物学实验指南(Current protocols in Molecular Biology)″.John Wiley andSons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)″芽胞杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)″.JohnWiley and Sons，1990)；以及WO 96/34946。

此外，本发明的枯草杆菌酶变体可以通过人工产生多样性的标准技术来构建，例如不同枯草杆菌酶基因的DNA改组(WO 95/22625；Stemmer WPC，自然(Nature)370：389-91(1994))。例如将实际上已被鉴定与Savinase

相比含有更长活性位点环(b)区的一个或多个枯草杆菌酶部分序列和编码Savinase

的基因进行DNA改组，在随后对具有改进洗涤性能的变体进行筛选之后，即可提供根据本发明的枯草杆菌酶变体。

表达载体

含有编码本发明酶的DNA结构的重组表达载体可以是任意可方便地进行重组DNA操作的载体。

载体的选择通常取决于其将要导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在并且其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒。或者，该载体可以是当被导入宿主细胞后部分或全部整合到宿主细胞基因组中并且随其整合的染色体一起复制的载体。

该载体优选是表达载体，而且在该表达载体中编码本发明酶的DNA序列可操作地与DNA转录所需的其它片段连接。通常，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或可以含有二者的元件。术语“可操作地连接”是指对片段进行排列以使其按预期目的发挥功能，例如，转录在启动子中起始并沿着编码酶的DNA序列前进。

启动子可以是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任意DNA序列，可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

用于细菌宿主细胞的适合启动子的例子包括嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)基因，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因，或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的启动子，或λ噬菌体P_R或P_L启动子，或大肠杆菌(E.coli)lac， trp或tac启动子。

如有必要，编码本发明酶的DNA序列也可以可操作地连接一个合适的终止子。

本发明的重组载体可以进一步含有使得载体能够在所述宿主细胞中复制的DNA序列。

该载体还可以含有一个选择标记，例如：其产物弥补了宿主细胞缺陷的基因，或编码例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素抗性，或重金属或除草剂抗性的基因。

为了引导本发明酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列，前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。分泌信号序列在正确阅读框中与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是正常与酶联系的分泌信号序列，也可以来自编码另一种分泌蛋白的基因。

用于分别地将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列连接起来，或通过合适的PCR扩增方案装配这些序列，然后将它们插入含有复制或整合所需信息的适合载体中的方法，是本领域技术人员所熟知的(参见，例如Sambrook等，同上)。

宿主细胞

被导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以与所述宿主同源或异源。如果该DNA序列与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生，则其典型地是与另一个启动子序列或，如果适用，与另一个分泌信号序列和/或终止子序列可操作地连接，而不是存在于其天然环境中。术语“同源的”旨在包括编码所述宿主生物天然产生的酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括宿主细胞天然并不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以来自另一种生物，或其可以是合成序列。

本发明DNA结构或重组载体所导入的宿主细胞可以是能够产生本发明酶的任意细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核生物包括植物的细胞。

在培养过程中能够产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子包括革兰氏阳性细菌例如芽胞杆菌属(Bacillus)菌株如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，或链霉菌属(Streptomyces)菌株，如浅青紫链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Echerichia coli)。

细菌的转化可通过原生质体转化、电穿孔、接合、或通过使用感受态细胞，按本来已知的方式进行(参见Sambrook等，见上文)。

当在细菌例如大肠杆菌中表达该酶时，该酶可以典型地以不可溶颗粒(称作包涵体)形式留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导至周质间隙。在前一种情况中，裂解细胞并回收颗粒，变性，之后通过稀释变性剂使该酶重新折叠。在后一种情况中，可以通过破碎细胞从周质间隙回收该酶。例如，通过超声处理或渗压震扰来释放周质间隙的内容物并回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，酶可以保留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导至细胞外培养基中。在后一种情况中，可以按下文所述方法从培养基中回收该酶。

生产枯草杆菌酶的方法

本发明提供生产本发明的分离酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下培养用编码此酶的DNA序列转化的合适宿主细胞，并且从培养物中回收产生的酶。

当含有编码此酶的DNA序列的表达载体被转化到异源宿主细胞中时，即可以进行本发明酶的重组异源产生。

因此生产高纯度的其特征在于不含有同源杂质的枯草杆菌酶组合物是可能的。

在本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如，除本发明酶之外的其它多肽)。

用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适用于所述宿主细胞生长的任何常规培养基。可以将表达的枯草杆菌酶方便地分泌至培养基中，并由此通过熟知程序进行回收，这些程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，采用盐例如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后进行层析如离子交换层析、亲和层析等等。

本发明枯草杆菌酶变体的应用

本发明的枯草杆菌酶蛋白酶变体可以有许多工业用途，尤其是在洗涤剂工业中。

此外，本发明涉及含有本发明枯草杆菌酶变体的酶组合物。

对优选的工业应用以及相应的优选酶组合物的总结描述如下。

该总结不旨在以任何方式完全列出本发明枯草杆菌酶变体适合应用。本发明枯草杆菌酶变体还可以在包括使用蛋白酶，特别是枯草杆菌酶的本领域已知其它工业应用中使用。

含有突变酶的洗涤剂组合物

本发明包括本发明突变酶在清洁和洗涤剂组合物中的应用以及这些含有该突变枯草杆菌蛋白酶的组合物。这些清洁和洗涤剂组合物在本领域中已有很好的描述，对于适合的清洁和去污组合物的进一步描述，参见WO96/34946，WO 97/07202，WO 95/30011。

此外，下面的实施例阐明了许多本发明枯草杆菌酶变体在洗涤性能上的改进。

洗涤剂组合物

本发明酶可以被加入洗涤剂组合物中并因此成为洗涤剂组合物的一个成分。

本发明的洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，其中包括适用于污染的纺织物预处理的洗衣添加组合物以及加入了织物软化剂的漂洗组合物，或配制成用于一般家用硬物体表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制成用于手工或机械洗碟操作的洗涤剂组合物。

在一个具体方面，本发明提供含有本发明酶的洗涤添加剂。该洗涤添加剂与所述洗涤剂组合物均可以含有一或多种其它酶例如蛋白酶、脂酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabanase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

通常，所选酶的性质应与所选洗涤剂相适应(即最适pH、与其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且该酶应当以有效的量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物，植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。

该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选微生物的碱性蛋白酶，或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，尤其是来自芽胞杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO94/25583中的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。

有用蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替换的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上可获得蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM以及Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的脂肪酶的例子包括来自腐殖霉属(Humicola)(同义词Thermomyces)的脂肪酶例如EP 258068和EP 305216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO 96/13580中描述的来自H.insolens的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽胞杆菌属脂肪酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它例子包括例如描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂肪酶变体。

优选的商业上可获得脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S)。

淀粉酶：合适的(α和/或β)淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如，从芽胞杆菌属例如地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶，更详细的描述在GB 1,296,839中。

有用淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novo Nordisk A/s)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐殖霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如Humicola insolens，Myceliophthora thermophila和尖镰孢(Fusariumoxysporum)产生的真菌纤维素酶，这些酶公开于US 4,435,307、US5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。

特别合适的纤维素酶是具有护色功能的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是例如描述于EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其它例子是描述于WO94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶变体。

商业上可获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovoNordisk A/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)^TM(Kao公司)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物，细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的例子包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中所描述的，来自鬼伞菌属(Coprinus)的过氧化物酶例如来自(C.Cinereus)的过氧化物酶，及其变体。

商业上可获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novo Nordisk A/S)。

可以通过加入含有一或多种酶的分开的添加剂，或通过加入含有所有这些酶的组合添加剂，将这些洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂即分开的添加剂或组合添加剂，可以配制成例如颗粒、液体或浆液等等。优选的洗涤剂添加剂制品是颗粒，尤其是非起尘(non-dusting)颗粒，液体，尤其是稳定的液体，或浆液。

非起尘颗粒可以按例如US 4,106,991和4,661,452中所公开的方法生产，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包被。蜡样包被材料的例子是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol)；其中具有15到80个环氧乙烷单位并且醇含有12到20个碳原子的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单、二和三甘油酯。适于通过流化床技术应用的薄膜形成包被材料见GB 1483591。液体酶制品可以根据已有技术通过例如加入多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。可以根据EP 238,216中公开的方法制备受保护的酶。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便形式例如条形、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或是非水性的。

该洗涤剂组合物含有一或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子包括半极性，和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。这些表面活性剂典型地按重量计以0.1％到60％的水平存在。

当包括在内时，洗涤剂通常含有大约1％到大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。

当包括在内时，洗涤剂通常含有大约0.2％到大约40％的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。

该洗涤剂可以含有0-65％的洗涤助剂或络合剂例如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸酯，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

该洗涤剂可以包含一或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。

该洗涤剂可以含有漂白体系，该漂白体系可以包括H₂O₂来源物质例如过硼酸盐或过碳酸盐，这些物质又可以与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐结合。或者，该漂白体系可以含有例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明洗涤剂组合物中的酶可以通过使用常规稳定剂来稳定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且该组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。

该洗涤剂还可以含有其它常规去污成分，例如织物调理剂，其包括粘土、发泡增效剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、光漂白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。

目前我们正在考虑，在该洗涤剂组合物中加入任何酶，尤其是本发明的酶，加入量为每升洗涤液中加入相当于0.01-100mg的酶蛋白，优选每升洗涤液中加入0.05-5mg的酶蛋白，尤其是每升洗涤液中加入0.1-1mg的酶蛋白。

另外可以将本发明的酶加入WO 97/07202中所公开的洗涤剂制品中，其中WO 97/07202在此以参考文献方式并入。

在皮革工业中的应用

本发明的枯草杆菌酶可以被应用于皮革工业，尤其是用于皮革脱毛。

在所述应用中，优选在另外含有其它蛋白酶的酶组合物中使用本发明枯草杆菌酶变体。

对于其它适合的蛋白酶的更具体描述，参见有关用于洗涤剂组合物的合适酶的部分(见上文)。

羊毛工业中的应用

本发明的酶可以被应用于羊毛工业，尤其是用于含羊毛衣物的清洗中。

在所述应用中，优选在进一步含有其它蛋白酶的酶组合物中使用本发明枯草杆菌酶变体。

在下述实施例中对本发明进行了更为详细的描述，这些实施例并不旨在以任何方式对本发明要求的范围进行限制。

材料和方法

菌株：

枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等，1990)。

迟缓芽孢杆菌309和147是保藏在NCIB且编号为NCIB 10309和10147的迟缓芽胞杆菌的特定菌株，其描述于美国专利3,723,250，该文献以参考文献方式并入本文。

大肠杆菌MC 1000(M.J.Casadaban和SN.Cohen(1980)；分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)138179-207)通过常规方法被制备成r-、m+，其也描述于美国专利申请039,298.中。

质粒：

pJS3：大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，含有编码枯草杆菌酶309的合成基因(由Jacob Schiφdt等人描述于“蛋白质和肽通讯”(Proteinand peptide letters)3：39-44(1996)中)。

pSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(描述于WO 96/34946中)。

普通分子生物学方法：

除非另有说明，DNA操作和转化采用分子生物学的标准方法来进行(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等(编)″现代分子生物学实验指南″.John Wiley andSons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)″芽胞杆菌的分子生物学方法″.John Wiley and Sons，1990).

DNA操作用的酶依据供应商的说明书进行使用。

DNA操作用的酶

除非另有说明，所有DNA处理用的酶例如限制性核酸内切酶，连接酶等均从New England Biolabs公司获得。

蛋白水解活性

在本发明的上下文中，蛋白水解活性以Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示。该活性的测定是相对于酶标准(SAVINASE

)进行的，并且以标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白的消化为基础，所述标准条件是50℃、pH8.3、反应时间9分钟、测量时间3min。文件AF 220/1可从Novo NordiskA/S，丹麦索取获得，此文件以参考文献方式并入本文。

GU是甘氨酸单位，定义为在标准条件下，40℃孵育15分钟时，以N-乙酰酪蛋白作为底物产生相当于1mmole甘氨酸的NH₂基团量的蛋白水解酶活性。

酶活性也可以采用PNA实验，根据与可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基酚的反应来测定，该方法描述于美国石油化工产品学会杂志(Journal of American Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，LA.，(1988)。

发酵

用于生产枯草杆菌酶的发酵在含有100ml BPX培养基的500ml带挡板的锥形瓶中于30℃在旋转摇床(300r，p.m)上进行5天。

因此为了制备例如2升细菌培养液，20个锥形瓶同时进行发酵。

培养基：

BPX培养基成分(每升)

马铃薯淀粉 100g

碾碎的大麦 50g

大豆粉 20g

Na₂HPO₄×12H₂O 9g

Pluronic 0.1g

酪蛋白酸钠 10g

该培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并且该培养基通过120℃加热45分钟进行灭菌。灭菌后通过加入NaHCO₃至0.1M将培养基的pH调整到9。

实施例1

酶变体的构建和表达：

定点诱变：

在活性位点环(b)中第95到96位之间含有特定插入的本发明枯草杆菌酶309定向位点变体可以通过DNA片段的传统克隆方法制备(Sambrook等.，分子克隆，实验室手册，第二版.，冷泉港，1989)，其中所述DNA片段是通过含有目的插入片段之寡核苷酸的PCR扩增所产生的(见下文)。

模板质粒DNA是pJS3，或其含有枯草杆菌酶309变体的类似物。

通过寡核苷酸指导的诱变导入插入物以构建V95VX插入变异(X＝第95和96位之间插入的任意氨基酸残基)，产生V95VX枯草杆菌酶309变体。

将该枯草杆菌酶309变体转化到大肠杆菌中。通过限制性核酸内切酶消化、DNA片段的纯化、连接以及枯草芽孢杆菌的转化，将从这些大肠杆菌转化体的过夜培养物中纯化的DNA转化到枯草芽孢杆菌中。枯草芽孢杆菌的转化按Dubnau等，1971，分子生物学杂志.56，第209-221页所述的方法进行。

用于在确定区域插入随机插入物的定域随机诱变：

用于进行定域随机诱变的整个策略是：

合成一个对应于插入位点两侧DNA序列的诱变引物(寡核苷酸)，其由定义该插入片段的DNA碱基对分隔开。

随后，所获的诱变引物与合适的反向引物一起用于PCR反应。纯化产生的PCR片段并在第二次PCR反应中延伸该片段，之后用核酸内切酶进行消化并将所获片段克隆至大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体中(见下文)。

或者，如有必要，将产生的PCR片段作为引物和第二个合适的反向引物一起进行第二次PCR反应，使得该诱变区可以被消化并克隆至穿梭载体中。PCR反应在常规的条件下进行。

通过此策略，在SAVINASE中构建了定域随机文库，其中插入片段被导入到活性位点环区的第95和96位之间。

通过诱变引物引入突变(见下文)，以致可以提供所有20种氨基酸(N＝25％的A，T，C，和G；而S＝50％C和G)。使用如下引物PCR扩增产生一段PCR片段：5’CTA AAT ATT CGT GGTGGC GC 3’(有义)和5’GAC TTTAAC AGC GTA TAG CTC AGC 3’(反义)，然后将一段重叠序列与该PCR片段组合并通过另一轮PCR，使上文诱变引物产生的PCR片段向Savinase的N端延伸。将延伸的DNA片段克隆到修饰质粒pJS3(见上文)的Hind III和Mlu I位点，并对十个随机选择的大肠杆菌菌落测序以证实所设计的突变。

诱变引物(5’GCT GAG CTA TAC GCT GTT AAA GTC NNS CTA GGG GCGAGC GGT TCA GGT TC 3’(正义))与位于pJS3的Mlu I位点下游的合适反向反义引物(例如5’-CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3’(反义)一起用于PCR反应，质粒pJS3作为模板。通过使用限制酶Hind III和MluI将该获得的PCR产物克隆到pJS3穿梭载体中。

通过熟知技术将该随机文库转化到大肠杆菌中。

制备的文库含有大约100,000个独立克隆/文库。

对随机选择的10个菌落进行测序以证实所设计的突变。

为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，用含有本发明变体的枯草芽孢杆菌pJS3表达质粒转化感受态枯草芽孢杆菌菌株，并按上述方法在含有10μg/ml氯霉素(CAM)的培养基中进行发酵。

实施例2

酶变体的纯化：

本方法涉及用于在芽孢杆菌宿主细胞中生产本发明枯草杆菌酶的2升级发酵的纯化。

大约1.6升的发酵培养液在1升的离心杯中5000rpm离心35分钟。上清液用10％醋酸调节pH至6.5并用Seitz Supra S100过滤板过滤。

滤出液使用配有Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF装置浓缩到大约400ml。离心和过滤UF浓缩液，之后室温下在pH7的杆菌肽(Bacitracin)亲和柱上进行吸附。使用含有25％ 2-丙醇、1M氯化钠和0.01二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(调节pH至7)的缓冲液，室温下从该杆菌肽柱中洗脱该蛋白酶。

将来自杆菌肽纯化步骤的具有蛋白酶活性的组分合并，并施加至经如下缓冲液平衡的750ml Sephadex G25柱中(5cm直径)，该缓冲液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，调节pH至6.5。

合并来自Sephadex G25柱的具有蛋白水解活性的组分，并施加至经如下缓冲液平衡的150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱中(5cm直径)，该缓冲液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，调节pH至6.5。

使用具有0-0.1M氯化钠线性梯度的2升相同缓冲液(对于枯草杆菌蛋白酶147为0-0.2M氯化钠)洗脱该蛋白酶。

在最后的纯化步骤中，合并含有蛋白酶的来自CM Sepharose柱的组分，并在配有GR81PP膜的Amicon超滤小室(来自Danish Sugar Factories公司)中浓缩。

通过使用实施例1中的构建和发酵技术，以及上述的分离操作，我们生产和分离了下列枯草杆菌蛋白酶309变体：

V95VT

V95VS

V95VD

V95VE

V95VP

V95VG

V95VH

V95VI

V95VT+Y167A

这些变体在初步测试中显示出比Savinase更好的洗涤性能。

实施例3

含有酶变体的洗涤剂组合物的洗涤性能

下面的实施例提供了在所显示条件下进行的许多洗涤测试的结果。

小型洗涤(MINI WASH)

洗涤条件：

	欧洲	美国
	欧洲	美国	洗涤剂用量	4g/L	1g/L
洗涤温度	30℃	25℃	洗涤剂用量	4g/L	1g/L
洗涤温度	30℃	25℃	洗涤时间	30分钟	10分钟
水硬度	18°dH(Ca²⁺/Mg²⁺＝5∶1)	6°dH(Ca²⁺/Mg²⁺＝2∶1)	洗涤时间	30分钟	10分钟
水硬度	18°dH(Ca²⁺/Mg²⁺＝5∶1)	6°dH(Ca²⁺/Mg²⁺＝2∶1)	pH	未调节	未调节
酶浓度	1，2，5，10，30nM	1，2，5，10，30nM	pH	未调节	未调节
酶浓度	1，2，5，10，30nM	1，2，5，10，30nM	测试体系	150ml玻璃烧杯和搅棒	150ml玻璃烧杯和搅棒
织物/体积	50ml洗涤剂中5件织物(φ2.5cm)	50ml洗涤剂中5件织物(φ2.5cm)	测试体系	150ml玻璃烧杯和搅棒	150ml玻璃烧杯和搅棒
织物/体积	50ml洗涤剂中5件织物(φ2.5cm)	50ml洗涤剂中5件织物(φ2.5cm)	测试材料	EMPA116	EMPA117

洗涤剂：

所用洗涤剂分别从丹麦(OMO，目录ED-9745105)和美国(Wisk，目录ED-9711893)的超市获得。使用前，通过微波处理使洗涤剂中的所有酶失活。

布样：

所用布样是从EMPA Testmaterialen，Movenstrasse 12，CH-9015St.Gall，瑞士获得的EMPA116和EMPA117。

反射率：

测试材料的反射率(R)测量是使用Macbeth ColorEye 7000光度计在460nm下进行的。该测量依据厂商说明书来进行。

评价

对枯草杆菌酶洗涤性能的评价由所研究的枯草杆菌酶的改进因子或性能因子决定。

改进因子，IF_{剂量/反应}，定义为当枯草杆菌酶浓度趋于零时，含有所研究枯草杆菌酶的洗涤剂的洗涤性能曲线和含有参照枯草杆菌酶的相同洗涤剂的洗涤性能曲线的斜率的比值。

IF_{剂量/反应}＝a/a_参照

洗涤性能根据通过式I计算：

R = R_{0} + \frac{a \cdot {ΔR}_{\max} \cdot c}{{ΔR}_{\max} + a \cdot c} - - - (I);

其中

R是以反射率单位表示的洗涤性能；R₀是拟合曲线与y-轴的截距(空白)；a是当c→0时拟合曲线的斜率；c是酶的浓度；ΔRmax是当c→∞时的理论最大洗涤效果。

性能因子P是通过式II计算的

其中

R_变体是用10nM变体洗涤的测试材料的反射率；R_savinase是用10nMSavinase洗涤的测试材料的反射率；R_空白是未用酶洗涤的测试材料的反射率。

US(洗涤剂：US Wisk，布样：EMPA117)

变体	IF_{剂量/反应}	P
变体	IF_{剂量/反应}	P	V95VT	＞3	2.3

因此，观察到本发明的枯草杆菌酶与Savinase

相比显示出改进的洗涤能力。

序列表

<110>Novo Nordisk A/S

<120>在活性位点环区具有额外氨基酸残基的I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶

<130>5792.204

<140>

<141>

<160>2

<170>patentIn Ver.2.1

<210>1

<211>275

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)

<400>1

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Xaa Leu

85 90 95

Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala

130 135 140

Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly

145 150 155 160

Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr

195 200 205

Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr

245 250 255

Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210>2

<211>270

<212>PRT

<213>达缓芽孢杆菌

<400>2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Xaa Leu Gly

85 90 95

Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp

100 105 110

Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro

115 120 125

Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg

130 135 140

Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp

165 170 175

Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp

180 185 190

Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr

195 200 205

Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly

210 215 220

Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln

225 230 235 240

Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn

245 250 255

Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265 270

Claims

1.I-S1和I-S2亚族枯草杆菌酶，其在第95-103位的活性位点环(b)区中的95位具有至少一个额外的氨基酸残基，由此所述额外氨基酸残基相应于在第95和96位之间至少一个氨基酸残基的插入。

2.权利要求1的分离的枯草杆菌酶，其中所述枯草杆菌酶是在前体枯草杆菌酶的第95和96位之间具有至少一个插入的氨基酸的构建的变体。

3.权利要求1或2的分离的枯草杆菌酶，其选自：

X95X{A，T，G，S}，

X95X{D，E，K，R}，

X95X{H，V，C，N，Q}，和

X95X{F，I，L，M，P，W，Y}。

4.权利要求3的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基选自T，G，A和S。

5.权利要求3的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基选自带电荷的氨基酸残基D、E、H、K和R，更优选D、E、K和R。

6.权利要求3的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基选自亲水性氨基酸残基C、N、Q、S和T，更优选N、Q、S和T。

7.权利要求3的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基选自小的疏水性分子氨基酸残基A、G和V。

8.权利要求3的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基选自大的疏水性分子氨基酸残基F、I、L、M、P、W和Y，更优选F、I、L、M和Y。

9.根据前述权利要求之任意一项的分离的枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外或插入的氨基酸残基包含在活性位点环(b)中的一个以上的额外或插入氨基酸残基。

10.前述权利要求之任意一项的枯草杆菌酶变体，其中所述第95和96位之间的插入与在任意其它位置的一个或多个进一步修饰相结合。

11.权利要求15的枯草杆菌酶变体，其中所述进一步修饰位于以下的一个或多个位置：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。

12.前述权利要求之任意一项的枯草杆菌酶变体，其中所述修饰与下列一个或多个位置的修饰相结合：129、131、133和194。

13.前述权利要求之任意一项的枯草杆菌酶，其中该枯草杆菌酶，或如果该枯草杆菌酶是变体，则亲本枯草杆菌酶，属于I-S1亚族。

14.权利要求13的枯草杆菌酶，其中该亲本枯草杆菌酶选自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR，或它们的保留了I-S1亚族特性的功能性变体。

15.根据权利要求1-14之任意一项的枯草杆菌酶，其中该枯草杆菌酶，或如果该枯草杆菌酶是变体，则亲本枯草杆菌酶，属于I-S2亚族。

16.权利要求15的枯草杆菌酶，其中该亲本枯草杆菌酶选自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB，或它们的保留了I-S2亚族特性的功能性变体。

17.权利要求3、15或16的分离的枯草杆菌酶，其选自

V95VA，

V95VT，

V95VG，

V95VS，

V95VD，

V95VE，

V95VK，

V95VR，

V95VH，

V95VV，

V95VC，

V95VN，

V95VQ，

V95VF，

V95VI，

V95VL，

V95VM，

V95VP，

V95VW，和

V95VY。

18.权利要求15-17之任意一项的枯草杆菌酶变体，其中所述进一步修饰选自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。

19.权利要求15-17之任意一项的枯草杆菌酶变体，其中所述进一步修饰选自S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合，其与权利要求1-14之任意一项中提及的任意一个或多个替代、缺失和/或插入相组合。

20.权利要求15-17之任意一项的枯草杆菌酶变体，其中所述进一步修饰还选自P129K、P131H、A133P、A133D和A194P。

21.根据前述权利要求之任意一项的变体，其含有选自以下组的修饰：V95VT+Y167A。

22.属于I-S1亚族的具有下列氨基酸序列的枯草杆菌酶：

1 10 20 30

A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V

40 50 60

L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-^＊-Y-N-T-D

70 80 90

G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L

95a 110 120

Y-A-V-K-V-X-L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D

130 140 150

V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V

160 170 180

A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V

190 200 210

D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P

220 230 240

T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N

250 260 270

L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V

275

E-A-A-A-Q

或具有包含第95a位氨基酸残基并显示与上述序列相比有大于70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性的氨基酸序列的同源枯草杆菌酶。

23.属于I-S2亚族的具有下列氨基酸序列的枯草杆菌酶：

.1 10 20 30

.A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-

. 40 50 60

.L-D-T-G-I-^＊-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-^＊-S-T-Q-D-

. 70 80 90

.G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-

. 95a 110 120

.Y-A-V-K-V-X-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-

. 130 140 150

.V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-

. 160 170 180

.A-A-S-G-N-S-G-A-^＊-G-S-I-S-^＊-^＊-^＊-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-

. 190 200 210

.D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-

. 220 230 240

.G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-

. 250 260 270

.W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-

. 275

.E-A-A-T-R

24.权利要求22或23的枯草杆菌酶变体，其中第95a位的X选自T、A、G、S和P。

25.编码权利要求1-24之任意一项的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的分离的DNA序列。

26.含有权利要求25的分离DNA序列的表达载体。

27.转化了权利要求26的表达载体的微生物宿主细胞。

28.权利要求27的微生物宿主，其是细菌，优选芽孢杆菌属细菌，特别是迟缓芽孢杆菌。

29.权利要求27的微生物宿主，其是真菌或酵母，优选丝状真菌，特别是曲霉属。

30.制备权利要求1-24之任意一项的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的方法，其中在利于所述变体表达和分泌的条件下培养权利要求27-29之任意一项的宿主，并回收该变体。

31.含有权利要求1-24之任意一项的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的组合物。

32.根据权利要求31的组合物，其还含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、别的蛋白酶、或淀粉酶。

33.根据权利要求31或32的组合物，其中该组合物是洗涤剂组合物。

34.根据权利要求1-24之任意一项的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体或者根据权利要求31或32的酶组合物在洗衣和/或洗碟洗涤剂中的应用。