CN101272681A - 抗高油酸咪唑啉向日葵 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有咪唑啉抗性和油酸含量大于85％的向日葵种子。本发明也提供指定为E83329、OI1601A、OI2653R、和OI1601B和具有油酸和咪唑啉抗性的向日葵栽培品种，E83329、OI1601A、OI2653R、和OI1601B向日葵栽培品种的植物和种子，通过将E83329、OI1601A、OI2653R或OI1601B栽培品种与其自己或与另一向日葵系或植物杂交产生向日葵植物的方法，和通过将E83329、OI1601A、OI2653R、或OI1601B栽培品种与另一向日葵系或植物杂交产生的杂种向日葵种子和植物。

Description

抗高油酸咪唑啉向日葵

技术领域

[0001]本申请要求于2005年9月28日提交的美国临时申请No.60/721,181的权益。本发明涉及一种新的向日葵(Helianthus sp.)植物，涉及由该新植物获得的产品及涉及生产该向日葵产品的方法。

背景技术

[0002]向日葵是一种少有的起源自北美的农作物品种。它可能在大约1000B.C.为土著美国部落归化。第一批欧洲人观察到向日葵种植于北美的很多地方，从南加拿大至墨西哥。向日葵可能首先通过西班牙传至欧洲，最后到达俄罗斯，在此它得到了广泛的种植。高油的选择在1860年开始于俄罗斯并导致油含量从28％达到50％。俄罗斯的这些高油思路在第二次世界大战后引入了美国。后者发现雄性不育和恢复基因系统，使得杂交容易进行，并增加公司的商业利益。后来，向日葵的产量在大平原洲(Great Plains states)急剧增加，因为销售人员发现这些种子用作含油种子农作物、鸟饵农作物和人小吃食物的新生态位。

[0003]种植的向日葵(Helianthus annuus L.)是主要的全世界的植物油源。在美国，主要的向日葵生产州是达科达(Dakotas)、明尼苏达州(Minnesota)、堪萨斯州(Kansas)、科罗拉多州(Colorado)、内布拉斯州(Nebraska)、德克萨斯州(Texas)和加利福尼亚州(California)，多数州有一些商业种植面积。美国2003年向日葵油产量为2.26百万磅(pound)。非油产量为406,000磅。非油向日葵平均产量2003年为每英亩1,256磅，但是油向日葵平均产量2003年为每英亩1,206磅。

[0004]向日葵与棉子、大豆和低芥酸菜子被认为是含油种子，且向日葵作为含油种子农作物已经可以与大豆竞争。与大豆相比(其大部分数值源自膳食)，向日葵农作物油的数值占80％。向日葵油因为它的它的颜色浅、不饱和脂肪酸水平高、缺少亚麻酸、香味温和、冒烟点高，通常被认为是高级油。油中的伯酸是油酸和亚麻酸，其余的由棕榈酸和硬脂酸不饱和脂肪酸。

[0005]针对于反刍动物以及猪和家禽饮料，未去壳或部分去壳的向日葵食物已经成功在被等氮量(相同的蛋白质)膳食大豆食物替代。与大豆食物相比，向日葵食物纤维含量高，能量值低以及赖氨酸低但是蛋氨酸高。向日葵食物的蛋白质百分数的范围为28％(未去壳种子)至42％(完全去壳种子)。

[0006]它除了可以用于人和动物的食物和食物产品外，向日葵油也具有工业用途。因为向日葵具有良好的半干性能，而不修改颜色以及不含有含高亚麻酸的油，它已经用于油漆、清漆和塑料。它也已用于肥皂、洗涤剂和化妆品的制造。已经探索将向日葵油(及其它的植物油)用作杀虫剂载体，和用于农业化学品、表面活性剂、粘合剂、织物柔软剂、润滑剂和涂料。因为向日葵油含有美国2号内燃机燃料能量的93％(辛烷额定值为37)，也已经进行了大量的工作来探索向日葵作为内燃机引擎的替代能源的潜力。最近，向日葵油已经被建议作为氢燃料电池的氢源。(BBC新闻，2004年8月26日)。

[0007]向日葵是每年生长的、直立的、宽叶植物，具有很强的主根和侧向丰富生长的表面根。茎通常在季节早期是圆的，季节晚期变成有角的和木质化，且通常不分枝。向日葵头部不是单花(名为包含(implies))，但是由1,000至2,000个结合于通常的花托的单独花组成。周边的花是舌状射线状没有雄蕊或雌蕊的花，保留的花是含有雄蕊或雌蕊完美的花。开花期(花粉脱落)从周边开始并到达头部的中心。因为许多向日葵品种具有一定程度的自交不亲和性，通过昆虫在植物之间的花粉运动是重要的，且蜜蜂群通常会增加产量。

[0008]向日葵的细胞质雄性不育和恢复系统的发展已经使种子公司能生产高质量的杂交种子。这些大部分比开授粉的品种具有更高的产量，和更高的油％。在几种环境下试验的品种的性能是选择向日葵杂种的最好基础。选择应该考虑产量、油％、成熟度、种子大小(针对非油种子市场)、和抗倒伏性和抗病性能。

[0009]作为农作物，向日葵的产量在减少，但是与向日葵竞争水分和营养，以及偶尔竞争光线的野草很少降低向日葵的产量。向日葵是野草的强大的竞争者，特别是光线，但是不能足够早地覆盖地面以防止野草产生。因此，对于好的产量来说季节早期的野草控制是根本；成功的野草控制应当包括栽培和化学方法的组合。几乎所有的北美向日葵植物是为了控制杂草而栽种和/或耕种，且超过2/3的用除草剂处理。

[0010]咪唑啉是一类能控制广谱杂草以低速率生长除草剂，其在全世界用于豆类、谷类、森林、和种植农作物。这些除草剂广泛使用，不仅是因为它们的效率，而也因为它们的低哺乳动物毒性和低环境冲击。抗咪唑啉农作物的可用性为裁培者提供了许多益处和好处，允许发展非常灵活的杂草管理程序。因为咪唑啉的广谱活性和灵活的应用技术，利用抵抗的农作物的杂草管理程序可以基于需要用较少关心相对选择性的除草剂进行控制的杂草。抗咪唑啉农作物因而是一种有效的杂草管理工具。

[0011]商业上竞争性的植物品种的特征包括除了高产量以外还要具有优异的稳定性(standability)。尽管产量是影响农作物生产者的利润的唯一最关键的因素，但是生产者希望得到一致的年复一年的产量、抗疾病性、其它的附加特性，以及最近，除草剂抗性。除草剂抗性的增加在产品农业中创造了机遇和巨大的挑战。

[0012]参考：Putnam等，1990.选择性领域农作物中向日葵手册(Sunflower in Alternative Field Crops Manual.University ofWisconsin-Extension)，合作扩展(Cooperative Extension)；University ofMinnesota：选择植物和动物产品中心(Center for Alternative Plant &Animal Products)；Minnesota Extension Service；Boland，M.，和Stroade，J.2004.向日葵工业简况(Sunflower Industry Profile).农业经济部(Department of Agricultural Economics)，Kansas State University；农业市场资源中心(Agricultural Marketing Resource Center)；Duke，Stephen，Ed.1996.抗除草剂作物(Herbicide-Resistant Crops).农业、环境、经济、管理和技术方面(Agricultural，Environmental，Economic，Regulatory，and Technical Aspects).CRC Press；美国专利No.4,627,192；美国专利No.5,276,264；美国专利No.6,388,113。

发明内容

[0013]相关技术和与此相关的限制的前述实例是为了示例说明和并不排外。相关技术的其它限制在本领域技术人员阅读了说明书后会很明显。

[0014]下列实施方案及其各方面与系统、工具和方法的组合不限定范围地进行示例性和图示性的描述和图示说明。在多个实施方案中，已经减少或消除一个或多个上述问题，但是其它的实施方案用来指导其它的改进。

[0015]本发明一个方面是提供最大油酸含量至少为85.2％和具有咪唑啉抗性的杂种向日葵种子。

[0016]本发明另一方面是提供能高效地用来生产具有希望的农艺学特性的亲本(parent line)和杂种的新向日葵植物。

[0017]本发明再另一方面是提供生产具有抗咪唑啉性的杂种向日葵的方法。

[0018]在完成前述各方面中，已提供本发明的油酸含量大于85.2％和具有咪唑啉抗性的向日葵种子。

[0019]根据本发明的再另一方面，已提供总油酸含量为至少85.2％和具有咪唑啉抗性的向日葵。

[0020]本发明的其它方面、特征、和优势经过下列详细描述后会很明显。但是，应当这样理解，详细说明和特定实施例仅用来示例性说明，并不显示为本发明的优选的实施方案，因为在阅读这个详细说明后，在本发明的精神和范围内的各种变化和改进对于本领域技术人员来说是明显的。

[0021]在下列说明和实施例中，使用了许多的术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚的和一致的理解，包括赋予这些术语给出的保护范围，提供了以下定义：

[0022]ALS抑制剂.如此处所使用，ALS抑制剂指任何有除草效能形式的磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类、咪唑啉、或杂芳基醚包括其任何的盐。

[0023]等位基因(Allele).等位基因是任何一个或多个选择形式的基因，其所有的等位基因涉及一个特性或特征。在两倍体细胞或有机体中，所述基因的两个等位基因占有相应的一对同源染色体上的位点。

[0024]回交.回交是培育者反复重复将杂交后代与亲本中的一个进行杂交(例如，第一代杂种F₁与F₁杂种的亲本基因型中的一个进行杂交)的过程。

[0025]商业上可接受的.术语商业上可接受的指向日葵品种或杂种谷粒产量在至少两年和10个环境中大于2000磅/英亩。

[0026]FAME分析.脂肪酸甲酯(FAME)分析是准确定量组成复合体脂类的脂肪酸的一种方法。

[0027]咪唑啉抗性(Imi).抗性和/或耐受性是由一个或多个改变乙酰乳酸合成酶(ALS)，也已知为乙酰羟酸合成酶(AHAS)的基因授予，允许酶抵抗咪唑啉的行为。

[0028]油含量.油含量测量为整个干种子的百分数，且特征为不同的品种。其可以用多种分析技术，如NMR、NIR、和索氏提取测定。

[0029]油酸含量.油酸是化学通式为C18H34O2的单不饱和脂肪酸。它的IUPAC名称为顺式-9-十八碳烯酸，但是它通常是指C18:1。油酸含量指由C18:1组成的向日葵油的总脂肪酸级分的百分数。

[0030]油酸百分数(OLE).种子的油百分数是油酸。

[0031]总脂肪酸百分数.总脂肪酸的百分数是通过从种子提取油样品，产生存在于所述油样品中的脂肪酸的甲基酯，和用气相色谱分析样品中各种脂肪酸的比例来确定。脂肪酸组合物也可以是一个品种的区分特征。

[0032]蛋白质含量.蛋白质含量测量为整个干种子的百分数，且特征为不同的品种。这可以用多种分析技术，如NIR和凯氏法(Kjeldahl)来测定。

[0033]抗倒伏性.抗倒伏性测量一个品种在田间高产量条件和恶劣的环境下站立的能力。一个品种可能具有好(保持向上)、一般、或差(倒下)的抗倒伏性。抗倒伏性的程度不能在所有的情况下表示，但是在田间试验中有一定程度的倒伏时才最有表达意思。

[0034]转化的单基因(转化率).转化的单基因(转化率)植物指通过所谓的回交植物培育技术发展的植物，其中除了单基因通过回交技术或通过基因工程转化成该品种外，基本上恢复了所述品种的所有希望的形态学的和生理学的特征。

[0035]总不饱和(TOTSAT).油中的饱和脂肪的总油百分数包括C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24.0。

[0036]平均产量.所有的向日葵平均产量包括在给定区域的所有颗数。

[0037]产量.在10个或更多区域比平均产量大10％。

[0038]校验平均.给定区域中一个或多个校验品种或杂交的平均值。

[0039]在本发明之前，还从未培育在一个向日葵基因型中含有高油酸油和咪唑啉抗性的向日葵品种。这些特性以前还未组合于任何商业或野生型向日葵中。在一个向日葵品种中含有两种特性通过提供高期望的高油酸油和在杂草控制中的更大灵活性，基本上扩展了农作物的利用。

[0040]所有的农作物品种为了收获一些商业上重要的产品而生长。所述产品生产力或产量的增加是多数植物培育项目的主要目的。多数向日葵品种发展项目的最优先的增加种子产量。种子产量是由许多基因控制并为环境影响强烈的定量特征。产量的遗传性是最低的和最可变的在栽培品种发展中考虑的主要的农艺学特性，遗传性估计范围为3至58％。产量是培育者想要改善超出存在于当前栽培品种中的产量水平的定量特征的一个例子。在大多数情况下要求抗病性保护栽培品种的产量潜力。

[0041]将除草剂抗性或耐受性特性并入高产量栽培品种是一个困难的挑战。如果培育者想要将除草剂抗性和高油酸油并入一个栽培品种，这种困难增加几级的幅度。为了植物培育者能找到具有充足的优点(例如高产量)以得到增加或商业上分布的栽培品种，进行许多杂交和生长数以千计的实验基因型是必要的。如此多的基因型的评估是一个巨大的任务，且消耗大量的植物培育者的时间和预算。在一些情况下，初始进行杂交的时间至确定商业上可行的基因型可能要花费十年或更久。

[0042]在培育项目中，选择具有目的(例如产量、除草剂、高油酸油)特性的基因型的效率将依赖于：1)种群中的单株植物的目的特性(traits of interest)中的变异性的程度是基因因素，因此能传递至选择的基因型的后代；和2)多少植物中目的(例如产量、除草剂、高油酸油)特性中的变异性归因于不同的基因型生长的环境。特性的遗传范围为从由一个主要基因(其表达不受环境的影响(即定性特征))控制至由许多基因(其效果受环境的影响(即定量特征))控制。定量特性的培育进一步具有下列事实所述的特征：1)每个基因的影响形成的差异较小，使得单独地确定它们是困难的或不可能的；2)基因数量对特征的贡献是大的，以致清楚的分离比即使获得也是难得的；和3)基因的影响可以基于环境变异以不同的方式表达。因而，超亲变异(transgressive segregant)或具有目的特性的超级基因型的精确识别是非常困难的，且它的成功依赖于植物培育者的最小化环境变异影响种群中的定量特征表达的能力。识别超亲变异的可能性极大地缩减为组合于一个基因型中的特性的数量。例如，如果杂交在三种不同的复合体特性(如产量、除草剂抗性和高油酸油)不同的栽培品种之间进行，同时通过将最大数量的有益的三个特征中的每个基因重组成一个基因型来恢复是非常困难的。因此，所有的培育者通常希望能获得有益的第一复合体的基因分类，将其与除了除草剂抗性基因外，具有有益的第二特征的基因分类组合成一个基因型。

[0043]用于栽培品种发展项目中的方法及其成功的可能性依赖于同时被改进的特征(例如种子产量、抗病性、和除草剂抗性/耐受性特性)的数量。种群中具有多种特征的希望的个体的比例通过将希望的期望种群中每个特征得到改善的单体的比例增加在一起而获得。这可以表现为这些特征不会独立地遗传，例如不会遗传链接。

[0044]这些原则不仅可以用于传统已育种的系，也可以用于具有一个或多个转基因的系。如果通过多个基因的转基因系或共转化来杂交将希望的传统和转基因特性组合成一个系，对产量的组合的影响可能是倍增的。如果考虑转基因对植物内代谢调节的潜在影响，识别含有合适的特性组合的系的可能性进一步降低。例如，培育者会考虑基因授予对咪唑啉抗性的影响。所述基因授予这种特性是该基因编码了突变体乙酰乳酸合成(ALS)酶。ALS基因紧密地影响相关的氨基酸合成中的生物化学反应。

[0045]可接受的系具有背景基因型，其补偿或主要不受由引入的基因引起的干扰的影响。如果通过培育将具有可接受的除草剂抗性的系与具有高油酸油的系组合，已经调节至引入的或突变体基因的背景基因型被组合，且必须选择新的基因型。具有合适产量的基因型的频率会因此而缩减。因此，在给定的向日葵品种或杂交中将除草剂抗性与高产量和高油酸油含量组合是非常困难的障碍。一旦这些特性被组合于一个品种中，然后这些特性会转化成其它的基因背景。

具体实施方式

实施例

[0046]以下提供的实施例进一步说明本发明，而不是用来限定本发明超出后续权利要求书中设定的范围。

实施例1

[0047]向日葵杂种E83329具有高油酸含量和咪唑啉抗性。咪唑啉抗性和高油酸含量的一个例子是向日葵栽培品种E83329。通过植物育种培育成E83329，且呈现稳定和一致。它是对咪唑啉具有抗性的高油酸向日葵。用来在各代中选择的一些标准包括：种子产量、抗倒伏性、出苗性(emergence)、抗病性和成熟度。如下列品种说明信息所述，该杂种已经显示出一致性和稳定性。亲本品系(parent lines)已是自花受粉的与植物株型一致性密切相关的许多代。已经连续观察到杂种的一致性得到增加。E83329具有下列形态学上的和其它的特征。

表1

[0048]植物：

高度：80英寸

叶子数量：28

叶子形状：心脏形的

叶子长度：11英寸

叶子宽度：10.7英寸

叶边缺口：中等

叶子姿态：下垂的

开花天数：68

成熟天数：98

射线状花的颜色：黄色

冠毛：绿色

头部直径：7英寸

头部形状：凸起的

头部姿态：下垂的

种子数/头部：1675

种子重(g/200)：10

成果湿度(％)：10.6

产量(磅/英亩)：2910

油％：41

油组成：

油酸：86.9％

C16:0：4.05％

C16:1：0.18％

C18:0：2.93％

C18:2：3.01％

饱和的：8.89％

咪唑啉抗性：优秀

[0049]在下列表2中，E83329与商品化品种7350的选择特征比较。

表2

特性	E83329	7350
			开花的天数	68	64
成熟的天数	98	96
			高度	80英寸	73英寸
叶子的数量	28	24
			头部直径	7英寸	8英寸
种子数/头部	1675	1822
			种子重量(g/200)	10	10
产量(lbs/acre)	2910	3034

[0050]在下列表3中，E83329与商品化品种7350的油组成比较。

表3

油特性	E83329	7350
			总的油％	41％	45.2％
油酸％	86.9	87.4
			C16:0％	4.05	3.77
C16:1％	0.18	0.15
			C18:0％	2.93	3.11
C18:2％	3.01	2.93
			饱和的％	8.89	8.62

[0051]在下列表4中，用1至9级，其中1为优秀抗性9为差的抗性，对E83329与商品化品种7350的咪唑啉抗性进行比较。栏1显示使用的除草剂的剂量，和应用后测量抗性的时间。IMI是咪唑啉除草剂，1×IMI是1倍标准剂量的咪唑啉，其它类似。

表4

咪唑啉抗性	E83329	7350
			喷洒1周后
1×IMI	2.0	9.0
			2×IMI	3.0	9.0
3×IMI	3.5	9.0
			喷洒3周后
1×IMI	1.0	9.0
			2×IMI	1.0	9.0
3×IMI	1.0	9.0

[0052]在下列表5中，E83329与商品化品种7350的FAME分析比较。每个数据是总的脂肪酸油的百分数。

表5

油组成	E83329	7350
			C14:0	0.06	0.05
C16:0	4.05	3.77
			C16:1	0.18	0.15
C18:0	2.93	3.11
			C18:1	86.90	87.42
C18:2	3.01	2.93
			C18:3	0.09	0.08

C20:0	0.35	0.34
			C20:1	.32	0.33
C20:2	0.01	0.01
			C22:0	1.10	0.98
C24:0	0.40	0.36
			C24:1	0.01	0.01
TOTSAT	8.89	8.62

实施例2

[0053]向日葵栽培品种OI1601A具有咪唑啉抗性和高油酸含量。咪唑啉抗性和高油酸含量的第二个例子是向日葵栽培品种OI1601A。通过植物培育发展OI1601A，且其是稳定和一致的。它是对咪唑啉具有抗性的高油酸向日葵。用来在各代中选择的一些标准包括：种子产量、抗倒伏性、出苗性、抗病性和成熟度。如下列品种说明信息所述，该栽培品种已经显示出一致性和稳定性。它是自花受粉的与植株型的一致性密切相关的许多代。已经连续观察到该栽培品种的一致性得到增加。OI1601A具有下列形态学上的和其它的特征。

表6

[0054]植物：

高度：57英寸

叶子数量：29

叶子形状：心脏形的

叶子长度：10.6英寸

叶子宽度：10.2英寸

叶边缺口：中等

叶子姿态：下垂的

开花天数：68

成熟天数：95

射线状花的颜色：黄色

冠毛：绿色

头部直径：7英寸

头部形状：凸起的

头部姿态：下垂的

油％：40.9

油组成：

油酸：88.95％

C16:0：3.53％

C16:1：0.13％

C18:0：2.49％

C18:2：2.98％

饱和的：7.55％

咪唑啉抗性：优秀

[0055]在下列表7中，OI1601A与商品化品种7350的选择特征比较。

表7

特性	OI1601A	7350
			开花的天数	68	64
成熟的天数	95	96
			高度	57英寸	73英寸
叶子的数量	29	24
			头部直径	7英寸	8英寸
种子数/头部	463	1822
			种子重量(g/200)	12	10
产量(lbs/acre)	1125	3034

[0056]在下列表8中，OI1601A与商品化品种7350的油组成比较。

表8

油特性	OI1601A	7350
			总的油％	40.9	45.2
油酸％	88.95	87.4
			C16:0％	3.53	3.77
C16:1％	0.13	0.15
			C18:0％	2.49	3.11
C18:2％	2.98	2.93
			饱和的％	7.55	8.62

[0057]在下列表9中，用1至9级，其中1为优秀抗性9为差的抗性，对OI1601A与商业品化品种7350的咪唑啉抗性进行比较。栏1显示使用的除草剂的剂量和应用后测量抗性的时间。IMI是咪唑啉除草剂，1×IMI是1倍标准剂量的咪唑啉，其它类似。

表9

咪唑啉抗性	OI1601A	7350
			喷洒1周后
1×IMI	2.0	9.0
			2×IMI	3.0	9.0
3×IMI	3.5	9.0
			喷洒3周后
1×IMI	1.0	9.0
			2×IMI	1.0	9.0
3×IMI	1.0	9.0

实施例3

[0058]向日葵栽培品种(cultivar)OI2653R具有咪唑啉抗性和高油酸含量。咪唑啉抗性和高油酸含量的第三个例子是向日葵栽培品种OI2653R。通过植物育种培育OI2653R，且其呈现稳定和一致的。它是对咪唑啉具有抗性的高油酸向日葵。用来在各代中选择的一些标准包括：种子产量、抗倒伏性、出苗性、抗病性和成熟度。如下列品种说明信息所述，该栽培品种已经显示出一致性和稳定性。它是自花受粉的与植物株型的一致性密切相关的许多代。已经连续观察到栽培品种的一致性得到增加。OI2653R具有下列形态学上的和其它的特征。

表10

[0059]植物：

高度：62英寸

叶子数量：24

叶子形状：心脏形的

叶子长度：11.7英寸

叶子宽度：9.8英寸

叶边缺口：中等

叶子姿态：下垂的

开花天数：74

成熟天数：102

射线状花的颜色：黄色

冠毛：绿色

头部直径：4.5英寸

头部形状：平的

头部姿态：下垂的

油％：42.8

油组成：

油酸：89％

C16:0：3.4％

C16:1：0.11％

C18:0：2.26％

C18:2：3.26％

饱和的：7.15％

咪唑啉抗性：优秀

[0060]在下列表11中，OI2653R与商品化品种7350的选择特征比较。

表11

特性	OI2653R	7350
			开花的天数	74	64
成熟的天数	102	96
			高度	62英寸	73英寸
叶子的数量	24	24
			头部直径	4.5英寸	8英寸
种子数/头部	510	1822
			种子重量(g/200)	7	10
产量(lbs/acre)	400	3034

[0061]在下列表12中，OI2653R与商品化品种7350的油组成比较。

表12

油特性	OI2653R	7350
			总的油％	42.8％	45.2％
油酸％	89	87.4
			C16:0％	3.4	3.77
C16:1％	0.11	0.15
			C18:0％	2.26	3.11
C18:2％	3.26	2.93
			饱和的％	7.15	8.62

[0062]在下列表13中，用1至9级，其中1为优秀抗性9为差的抗性，对OI2653R与商品化品种7350的咪唑啉抗性进行比较。栏1显示使用的除草剂的剂量和应用后测量抗性的时间。IMI是咪唑啉除草剂，1×IMI是1倍标准剂量的咪唑啉，其它类似。

表13

咪唑啉抗性	OI2653R	7350
			喷洒1周后
1×IMI	2.0	9.0
			2×IMI	3.5	9.0
3×IMI	3.5	9.0
			喷洒3周后
1×IMI	1.0	9.0
			2×IMI	1.0	9.0
3×IMI	1.0	9.0

[0063]在下列表14中，OI2653R与商品化品种7350的FAME分析比较。每个数据是总的脂肪酸油的百分数。

表14

油组成	OI2653R	7350
			C14:0	0.04	0.05
C16:0	3.40	3.77
			C16:1	0.11	0.15
C18:0	2.26	3.11
			C18:1	89	87.42
C18:2	3.26	2.93
			C18:3	0.11	0.08
C20:0	0.26	0.34
			TOTSAT	7.15	8.62

实施例4

[0064]向日葵栽培品种OI1601B具有咪唑啉抗性和高油酸含量。咪唑啉抗性和高油酸含量的第四个例子是向日葵栽培品种OI1601B。通过植物育种培育出OI1601B，其呈现稳定和一致的。它是对咪唑啉具有抗性的高油酸向日葵。用来在各代中选择的一些标准包括：种子产量、抗倒伏性、出苗性、抗病性和成熟度。如下列品种说明信息所述，栽培品种已经显示出一致性和稳定性。它是自花受粉的与植物株型(plant type)的一致性密切相关的许多代。已经连续观察到栽培品种的一致性得到增加。OI1601B具有下列形态学上的和其它的特征。

表15

[0065]植物：

高度：57英寸

叶子数量：29

叶子形状：心脏形的

叶子长度：10.6英寸

叶子宽度：10.2英寸

叶边缺口：中等

叶子姿态：下垂的

开花天数：68

成熟天数：95

射线状花的颜色：黄色

冠毛：绿色

头部直径：7英寸

头部形状：凸起的

头部姿态：下垂的

种子数/头部：463

种子重(g/200)：12

成果湿度(％)：10

产量(磅/英亩)：1125

油％：40.9

油组成：

油酸：88.95％

C16:0：3.53％

C16:1：0.13％

C18:0：2.49％

C18:2：2.98％

饱和的：7.55％

咪唑啉抗性：优秀

[0066]在下列表16中，OI1601B与商品化品种7350的FAME分析比较。每个数据是总的脂肪酸油的百分数。

表16

油组成	OI1601B	7350
			C14:0	0.04	0.05
C16:0	3.40	3.77
			C16:1	0.11	0.15
C18:0	2.26	3.11
			C18:1	89	87.42
C18:2	3.26	2.93
			C18:3	0.11	0.08
C20:0	0.26	0.34
			TOTSAT	7.15	8.62

[0067]本发明也涉及通过将第一亲代向日葵植物与第二亲代向日葵植物杂交生产向日葵植物的方法，其中第一或第二亲代向日葵植物是来自栽培品种E833229、OI1601A、OI2653R、或OI1601B的向日葵植物。第一和第二亲代向日葵植物进一步可以是来自栽培品种E833229、OI1601A、OI2653R、或OI1601B。因此，使用栽培品种E83329、OI1601A、OI2653R、或OI1601B的任何方法是本发明的部分：自交受粉、回交、杂交培育、和对种群进行杂交。使用E83329、OI1601A，OI2653R、或OI1601B作为亲本生产的任何植物处于本发明的范围之内。

[0068]有用的方法包括，但不限于，使用基因转化方法将表达载体导入植物组织，如基因枪导入法、DNA注射、和电穿孔法等等。更优选的是，使用具有基因枪装置或农杆菌介导转化的基因枪介导输送将表达载体导入植物组织。采用本发明原生质获得的转化体植物落入本发明的范围之内。

[0069]随着可以分离和表征编码特定蛋白质产品的基因的分子生物技术的出现，植物生物领域的科学家对为了改变特定样式的植物的特性，而设计植物的基因组以包含和表达外源基因，或另外的，或天然的改进变种，或内源性的，基因(也许由不同的启动子引起的)发生了强烈的兴趣。所述外源的，另外的和/或改进的基因在此都是指“转基因”。在过去的15至20年里，已经发展了数种生产转基因植物的方法，且本发明在特别的实施方案中，也涉及要求保护的品种或系的转化变种。

[0070]植物转化包括在植物体内显示功能的表达载体的组建。这种载体包括DNA，所述的DNA包括调节成分(例如启动子)的控制或者可操作地连接的基因，。该表达载体可以包含一个或多个这种可操作连接的基因/调节成分组合体。所述载体可以是质粒的形式，可以单独使用或与其它的质粒组合，使用如下所述的转化方法将转基因并入向日葵植物的基因材料，以提供转化的向日葵植物。

向日葵转化的表达载体：标记基因

[0071]表达载体包括至少一个基因标记，可操作连接于调节成分(例如，启动子)，所述的调节成分可以使转化的含有标记的细胞或通过阴性选择(即抑制不含有可选择的标记基因的细胞生长)或通过阳性选择(即通过基因标记编码的产品的筛查)，得到恢复。许多常用的可选择的植物转化标记基因在转化领域是公知的，且包括，例如，可以编码通过新陈代谢使选择的化学试剂解毒的酶的基因，或编码对抑制剂敏感的可改变目的的基因，所述的化学试剂可以是抗生素或除草剂。一些阳性选择方法也是本领域公知的。

[0072]一个常用的可选择的植物转化标记基因，是在带有卡那霉素(kanamycin)抗性的植物调节信号的控制下的新霉素磷酸转移酶II(neomycin phosphotransferase II)(npt II)基因。Fraley等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983)。另一常用的可选择的标记基因是带有抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase)基因。Vanden Elzen等，Plant Mol.Biol.，5：299(1985)。

[0073]另外的带有抗生素抗性的细菌源的可选择标记基因包括庆大霉素乙酰基转移酶(gentamycin acetyl transferase)，链霉素磷酸转移酶(streptomycin phosphotransferase)，和氨基糖苷-3′-腺嘌呤基(aminoglycoside-3′-adenyl)转移酶，博来霉素抗性决定子(thebleomycin resistance determinant)。Hayford等，Plant Physiol.86：1216(1988)，Jones等，Mol.Gen.Genet，210：86(1987)，Svab等，Plant Mol.Biol.14：197(1990)，Hille等，Plant Mol.Biol.7：171(1986)。其它的可选择基因也具有除草剂抗性，如草甘宁(glyphosate)、草铵膦(glufosinate)或镇草宁(broxynil)。Comal等Nature 317：741-744(1985)，Gordon-Kamm等Plant Cell 2：603-618(1990)和Stalker等，Science 242：419-423(1988)。

[0074]其它植物转化可选择标记基因不是细菌源。这些基因包括，例如，小鼠二氢叶酸还原酶(mouse dihydrofolate reductase)，植物5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶和植物乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)。Eichholtz等，SomaticCell Mol.Genet.13：67(1987)，Shah等，Science 233：478(1986)，Charest等，Plant Cell Rep.8：643(1990)。

[0075]另一类植物转化标记基因要求推断地筛查转化的植物细胞，而不是指引基因选择具有有毒物质(如抗生素)抗性的转化的细胞。这些基因在量化或显现特定组织中的基因表达的空间模型是特别有用的，且经常被指定为报告基因(reporter gene)，因为它们能被融入到基因表达研究的基因或基因调节序列。通常使用于推断地筛查转化的细胞的基因包括β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶(luciferase)和氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicolacetyltransferase)。Jefferson，R.A.，Plant Mol.Biol.Rep.5：387(1987)，Teeri等，EMBO J.8：343(1989)，Koncz等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84：131(1987)，DeBlock等，EMBO J.3：1681(1984)。

[0076]生物体内显现GUS活性的方法不要求破坏植物组织是有效的。分子探针出版社(Molecular Probes publication)2908，lmagene GreenJ，1-4页(1993)和Naleway等，J.Cell Biol.115：151a(1991)。但是，因为低敏感度、高荧光性背景、和使用荧光素酶基因作为可选择标记的限制，这些生物体内显现GUS活性的方法还未证明对转化的细胞的恢复是有用的。

[0077]已经利用编码绿色荧光蛋白质(GFP)的基因作为原核和真核细胞中的基因表达标记。Chalfie等，Science 263：802(1994)。GFP和GFP的突变体可以用作可筛查的标记。

向日葵转化的表达载体：启动子

[0078]包括于表达载体的基因必须由包括调节成分(例如启动子)的核苷序列驱使。多种启动子是转化技术中公知的，其是其它的可单独使用或与启动子组合使用的调节成分。

[0079]如本文中所使用，Apromoter@包括从转录开始参考DNA上游区域，且包括于识别和将RNA聚合酶和其它蛋白质的结合以启动转录。Aplant promoter@是一种能引发植物细胞中的转录的启动子。在试验性控制下，启动子的例子包括优选地启动某种组织(如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)内的转录的启动子。所述启动子称为Atissue-preferred@。仅在某种组织内引发转录的启动子是称为Atissue-specific@。Acell type@特定启动子基本上驱使一个或多个器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的脉管细胞，中的表达。Ainducible@启动子是一种处于环境控制下的启动子。经可诱导启动子影响转录的环境条件的例子包括厌氧条件或光线的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性的、和可诱导启动子构成Anon-constitutive@启动子。Aconstitutive@启动子是一种在大多数环境条件具有活性的的启动子。

[0080]A.可诱导启动子-可诱导启动子是可操作连接至向日葵中的表达基因。任选地，可诱导启动子是可操作连接至一核苷序列，该序列编码可操作连接于向日葵中的表达基因信号序列。通过可诱导启动子，转录速率应答诱导试剂而增加。

[0081]任何可诱导启动子可用于本发明。见Ward等，Plant Mol.Biol.22：361-366(1993)。示例性可诱导启动子包括，但不限于，来自下列的那些：ACEI系统，其响应铜(Mett等，PNAS 90：4567-4571(1993))；In2基因，其来自玉米响应除草剂安全剂(Hershey等，Mol.Gen Genetics227：229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genetics 243：32-38(1994))或Tet阻抑物，其来自Tn10(Gatz等，Mol.Gen.Genetics 227：229-237(1991))。一种特别优选的可诱导启动子是应答植物通常不应答的诱导剂的启动子。示例性可诱导启动子是来自类固醇激素基因的可诱导启动子，其转录活性是由糖皮质激素诱导的。Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：0421(1991)。

[0082]B.组成型启动子(constitutive promoter)一组成型启动子是可操作连接至向日葵中的表达基因，或者组成型启动子是可操作连接至一核苷序列，该序列编码可操作连接至向日葵中的表达基因的信号序列。

[0083]许多不同的组成型启动子可以在本发明中利用。示例性的组成型启动子包括，但不限于，来自植物病毒的启动子，如来自CaMV的35S启动子(Odell等，Nature 313：810-812(1985))和来自如大米肌动蛋白的基因的启动子(McElroy等，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素(ubiquitin)(Christensen等，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等，EMBO J.3：2723-2730(1984))，玉米H3组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genetics 231：276-285(1992)和Atanassova等，Plant Journal 2(3)：291-300(1992))，拟南芥肌动蛋白(Last和Gray，Plant Mol.Biol.12：655-666(1989))和豌豆质体蓝素启动子(McCabe等，Theor.Appl.Genet.99：587-592(1999))。

[0084]ALS启动子，连接至甘蓝型油菜ALS3结构基因Xbal/Ncol断片5′(或与所述Xbal/Ncol断片相似的核苷序列)，是特别有用的组成型启动子。见PCT应用WO 96/30530。

[0085]C.组织特异的或组织优选的启动子-组织特异的或组织优选的启动子是可操作连接至向日葵中的表达基因。任选地，组织特异的启动子是可操作连接至一核苷序列，该序列编码可操作连接至向日葵中的表达基因的信号序列。采用可操作连接至组织特异的启动子的目的基因(gene of interest)转化的植物，产生特定组织中排它的或优选的转基因蛋白质产物。

[0086]本发明可以使用任何组织特异的或组织优选的启动子。示例性的组织特异的或组织优选的启动子包括，但不限于，根部优选的启动子，如来自菜豆蛋白基因的那种(Murai等，Science 23：476-482(1983)和Sengupta-Gopalan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324(1985))启动子；叶子特异的和光线诱导的启动子，如来自cab或rubisco的那种的(Simpson等，EMBO J.4(11)：2723-2729(1985)启动子和Timko等，Nature 318：579-582(1985))；另一种特异性的启动子，如来自LAT52的那种(Twell等，Mol.Gen.Genetics 217：240-245(1989))；花粉特异的启动子，如来自Zm13的那种(Guerrero等，Mol.Gen.Genetics 244：161-168(1993))或小孢子特异的启动子，如来自烷基多苷(apg)的那些(Twell等，Sex.Plant Reprod.6：217-224(1993))。

[0087]通过转基因将生成的蛋白质转输至亚细胞隔室，如叶绿体、液泡、过氧化酶体、乙醛酸循环体、细胞壁、或线粒体或分泌进入非原质体，通过可操作连接至编码目的蛋白的5′和/或3′基因区域核苷序列编码信号序列的核苷序列来完成。在蛋白质合成和加工过程中，结构基因的5′和/或3′末端的目的序列可以确定编码的蛋白质最终在哪里被隔开。

[0088]信号序列的存在使多肽到达细胞内的细胞器或亚细胞隔室(subcellular compartment)或为了分泌至质外体(apoplast)。许多信号序列是本领域公知的。见，例如，Becker等，Plant Mol.Biol.20：49(1992)，Close，P.S.，硕士论文题目(Master′s Thesis)，lowa State University(1993)，Knox，C.等，两个偏离α-淀粉酶基因的结构和组织(AStructureand Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes)，来自Barley@，Plant Mol.Biol.9：3-17(1987)，Lerner等，Plant Physiol.91：124-129(1989)，Fontes等，Plant Cell 3：483-496(1991)，Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci 88：834(1991)，Gould等，J.Cell.Biol.108：1657(1989)，Creissen等，Plant J.2：129(1991)，Kalderon等，能指定核位置的短氨基酸序列(A short amino acid sequence able to specifynuclear locaion)，Cell 39：499-509(1984)，Steifel等，玉米细胞壁富羟基脯氨酸蛋白基因在早期叶和根脉管分化中的表达(Expression of amaize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf androot vascular differentiation)，Plant Cell 2：785-793(1990)。

外源蛋白质基因和农艺学基因

[0089]采用本发明的转基因植物，可以生产商业数量的外源基因。因此，本领域都充分理解的选择或繁殖转基因植物的技术产生多种转基因植物，所述转基因植物用通常的方式收获，然后外源蛋白可以从目的组织和总生物量中提取。从植物生物量中提取蛋白质可以通过已知的方法完成，其在例如，Heney和Orr的Anal.Biochem.114：92-6(1981)中讨论。

[0090]根据优选的实施方案，提供的外源基因的商业产品的转基因植物是向日葵植物。在另一个优选的实施方案中，另一目的生物量是种子。对于相对数量小的显示更高水平的表达的转基因植物，主要通过通常的能识别整合的DNA分子的大约的染色体位置的RFLP、PCR和SSR分析，可以产生基因图。这方面示例性的方法学，见Glick和Thompson，植物分子生物学和生物工艺学方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)CRC Press，Boca Raton 269：284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对主题转基因植物的专有保护是有用的。如果进行未经授权的繁殖和用其它的种质杂交，整合区域的图谱可以与值得质疑的植物的相似图谱进行比较，以确定是否后者与主题植物具有共同的亲缘。图谱比较包括杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，它们都是普通的技术。

[0091]同样地，利用本发明，可以在转基因植物中表达农艺学基因。更特别地，植物可以通过基因工程来表达多种农艺学目的的表现型。相关的示例性基因包括，但不限于，以下分类的那些：

1.对抗害虫或抗病性的基因及其编码为：

[0092]A.植物抗病性基因.。通常由植物中的抗病基因(R)的产物和对应的病原体中的无毒(Avr)基因的产物之间的特定相互作用激活植物防御。可以用将抗性基因克隆至基因工程植物来转化植物品种，所述基因工程植物对特定的病原体菌株具有抗性。见，例如Jones等，Science 266：789(1994)(蕃茄(对叶霉病具有抗性的蕃茄Cf-9基因的克隆(cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporiumfulvum))，Martin等，Science 262：1432(1993)(对桑细菌性疫病菌具有抗性的蕃茄Pto基因与蕃茄编码蛋白质激素(tomato Pto gene forresistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a proteinkinase))；Mindrinos等，Cell 78：1089(1994)(对桑细菌性疫病菌具有抗性的拟南芥RSP2基因(Arabidopsis RSP2gene for resistance toPseudomonas syringae)。

[0093]B.抗害虫的基因，如大豆胞囊线虫类.见例如，PCT申请WO 96/30517、PCT申请WO 93/19181。

[0094]C.苏云金杆菌蛋白质，其衍生的或模仿其合成的多肽。见，例如，Geiser等，Gene 48：109(1986)，其公开了克隆和Btδ-内毒素基因的核序列。而且编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国TypeCulture Collection，Manassas，Virginia购买，例如，在ATCC保藏号Nos.40098，67136，31995和31998。

[0095]D.凝集素。见，例如，Van Damme等人公开的Plant Molec.Biol.24：25(1994)，其公开了数种约束君子兰甘露糖凝集素基因的核苷序列。

[0096]E.维生素结合蛋白质，如抗生素蛋白。见PCT申请US93/06487。该申请指出将抗生素蛋白和抗生素蛋白同系物用作抗害虫的杀虫剂。

[0097]F.酶抑制剂，例如，朊酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。见，例如，Abe等，J.Biol.Chem.262：16793(1987)(大米半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核序列(nucleotide sequence of rice cysteine proteinaseinhibitor))，Huub等，Plant Molec.Biol.21：985(1993)(编码蕃茄蛋白酶抑制剂I的cDNA的核序列(nucleotide sequence of cDNA encodingtobacco proteinase inhibitor I))，Sumitani等，Biosci.Biotech.Biochem.57：1243(1993)(链霉菌属硝基孢子α-淀粉酶抑制剂的核序列(nucleotide sequence of Streptomyces nitrosporeus α-amylase inhibitor))和美国专利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，出版于1996年2月27日)。

[0098]G.昆虫特异的激素或信激素，如蜕皮激素和保幼激素、其变种、基于它们的拟态体、和拮抗物或其激动剂。见，例如，由Hammock等人公开的Nature 344：458(1990)，关于克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达，一种保幼激素的钝化剂。

[0099]H.昆虫特定的肽或神经肽，其在表达上破坏了受影响的害虫的生理学。例如，见Regan公开的J.Biol.Chem.269：9(1994)(表达克隆产生昆虫利尿剂激素受体的DNA编码(expression cloning yieldsDNA coding for insect diuretic hormone receptor)))，和Pratt等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(1989)(异汀类在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中被识别)。也见Tomalski等人的美国专利No.5,266,317，其公开编码昆虫特异的瘫痪神经毒素的基因。

[0100]I.由蛇、黄蜂等天然产生的昆虫特异的毒物.例如，见Pang等，Gene 116：165(1992)，其公开编码蝎子昆虫肽的基因的植物中的异源表达。

[0101]J.负责单萜的超积累特性的酶，倍半单萜，类固醇，羟肟酸，苯丙素衍生物或另一种具有杀虫剂活性的非蛋白分子。

[0102]K.包括于修饰中的酶，其包括具有生物活性的分子的转译后的修饰；例如，糖分解酶、蛋白水解酶、分解脂肪的酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的均可。见Scott等人的PCT申请WO 93/02197，其公开了胼胝质基因的核苷序列。可以得到含有编码壳质酶序列的DNA分子，例如从ATCC得到名为保藏号Nos.39637和67152。也见Kramer等，Insect Biochem.Molec.Biol.23：691(1993)，其指编码烟草钩虫壳质酶cDNA的核苷序列，和Kawalleck等人的Plant Molec.Biol.21：673(1993)，其提供欧芹泛4-2多聚泛素基因核苷序列。

[0103]L.刺激信号转导的分子。例如，见Botella等人公开的PlantMolec.Biol.24：757(1994)，关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷序列，和Griess等人的Plant Physiol.104：1467(1994)，其提供玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷序列。

[0104]M.疏水的瞬间肽(moment peptide).见PCT申请WO95/16776(公开了抑制霉菌植物病原体的鲎素肽衍生物)和PCT申请WO 95/18855(指出合成的具有抗病性的杀虫剂缩氨酸)。

[0105]N.膜透性酶，通道形成者或通道阻塞者.例如，见Jaynes等人公开的Plant Sci 89：43(1993)，关于天蚕素-β、细胞溶解酶肽相似物的异源表达以给予烟草植物对假单胞菌细菌素的抗性。

[0106]O.病毒入侵的蛋白或其衍生的复合体毒.例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞的积累给予由衍生外壳蛋白基因的病毒，以及相关的病毒引起的病毒感染和/或疾病发展以抗性。见Beachy等人的，Ann.rev.Phytopathol.28：451(1990)。以外壳蛋白介导的抗性已经给予转化的植物来抵抗苜蓿花叶病病毒，黄瓜花叶病毒，烟草条纹病毒，马铃薯病毒X，马铃薯病毒Y，烟草腐蚀病毒，烟草脆裂病毒，和烟草花叶病毒.Id。

[0107]P.昆虫特异的抗体或及其衍生的免疫毒素。因此，在昆虫肠内靶向关键的新陈代射功能的抗体可能钝化受影响的酶，杀死昆虫.参见Taylor等人，摘要#497，第七届分子植物-微生物相互作用国际会议(Seventh Int′l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions)(Edinburgh，Scotland)(1994)(通过单链抗体链段的生成基因改造烟草中的酶钝化)。

[0108]Q.病毒特异的抗体.见，例如，Tavladoraki等，Nature 366：469(1993)，其显示表达重组的抗体基因的转基因植物受保护不受病毒攻击。

[0109]R.由病原体或寄生虫天然产生的发展的引人注意的蛋白.因此，霉菌内桥α-1，4-D-聚半乳糖醛酸酶有助于霉菌的克隆和通过溶解细胞壁同源-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶的植物营养物释放。见Lamb等Bio/Technology 10：1436(1992)。编码大豆内桥聚半乳糖醛酸酶的基因的克隆和表征如Toubart等，Plant J.2：367(1992)所述。

[0110]S.由植物产生的天然发展的引人注意的蛋白质.例如，Logemann等，Bio/Technology 10：305(1992)，其已显示表达大麦钝化核糖体的转基因植物已经增加霉菌的抗性。

2.授予除草剂抗性的基因：

[0111]A.抑制生长点或分裂组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。这类示例性的基因如所述为突变体ALS和AHAS酶编码，例如分别为Lee等，EMBO J.7：1241(1988)，和Miki等，Theor.Appl.Genet.80：449(1990)。

[0112]B.草甘膦(分别为突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因的受损的抗性)和其它膦酰基化合物，如草铵膦(乙酰草胺膦转酶(PAT)、和链霉菌属乙酰草胺膦转酶、棒(bar)、基因)，和丙酸或苯氧基丙酸和环己酮(ACCase编码抑制剂基因)。见，例如，Shah等人的美国专利No.4,940,835，其公开授予草苷膦抗性的EPSP形式的核苷序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以由ATCC保藏号39256得到，且突变体基因在Comai的美国专利No.4,769,061中公开。Kumada等人的欧洲专利申请No.0333033和Goodman等人的美国专利No.4,975,374公开了授予除草剂抗性的谷氨酸合酶基因，如L-草胺膦的核苷序列。Leemans等人的欧洲专利申请No.0242246提供了乙酰草胺膦转酶基因的核苷序列，DeGreef等，Bio/Technology 7：61(1989)，描述表达编码乙酰草胺膦转酶活性的奇怪的棒基因转基因植物的产品。授予苯氧基丙酸和环己酮的示例性基因，如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，如Marshall等，Theor.Appl.Genet.83：435(1992)所述。

[0113]C.抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psbA和gs+基因)或苄腈(腈水解酶)。Przibila等Plant Cell 3：169(1991)，描述了含有编码突变体psbA基因的质粒衣滴虫的转化。腈水解酶的核苷序列在Stalker的美国专利No.4,810,648中进行了公开，且含有这些基因的DNA分子从ATCC注册号Nos.53435、67441、和67442获得。编码谷胱甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达如Hayes等，Biochem.J.285：173(1992)所述。

3.给与或贡献于价值增加特性的基因，如：

[0114]A.改性的脂肪酸代谢，例如，通过转化含有硬脂酰-ACP脱氢酶的反义基因植物以增加植物的硬脂酸含量。见Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：2624(1992)。

[0115]B.减少的肌醇六磷酸含量-1)编码肌醇六磷酸酶基因的引入会加强肌醇六磷酸的破坏，向转化的植物中加入更多的游离磷酸盐。例如，见Van Hartingsveldt等，Gene 127：87(1993)，关于曲霉皂角肌醇六磷酸酶基因的核苷序列的公开。2)可以引入能缩减肌醇六磷酸含量的基因。例如在玉米中，这可以通过克隆然后再引入联合了负责玉米突变体的单等位基因的DNA来完成，其特征是植酸水平低。见Raboy等，Maydica 35：383(1990)。

[0116]C.改性的有效碳水化合物，例如，通过转化具有编码改变淀粉分支模式的酶基因的植物进行改性。见Shiroza等，J.Bacteol.170：810(1988)(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷序列)，Steinmetz等，Mol.Gen.Genet.20：220(1985)(枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷序列)，Pen等，Bio/Technology 10：292(1992)(表达芽孢杆菌α-淀粉酶转基因植物产品)，Elliot等，Plant Molec.Biol.21：515(1993)(番茄转化酶基因的核苷序列)，Sogaard等，J.Biol.Chem.268：22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点突变)，和Fisher等，Plant Physiol.102：1045(1993)(玉米胚乳淀粉分枝酶II)。

向日葵转化方法

[0117]已经开发了大量的植物转化方法，包括生物学的和生理的植物转化规约。例如，见Miki等，“将外源DNA引入植物的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)”，在植物分子生物学和生物技术学(Plant Molecular Biology and Biotechnology)的方法中，Glick B.R.和Thompson，J.E.Eds.(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)第67页至第88页。此外，可以获得植物细胞或植物组织转化和再生表达载体和离体栽培方法。例如，见Gruber等，“植物转化的载体(Vectors for Plant Transformation)”，在植物分子生物学和生物技术学的方法，Glick B.R.and Thompson，J.E.Eds.(CRC Press，Inc.，BocaRaton，1993)第89页至第119页。

[0118]A.土壤杆菌介导的转化----将表达载体引入植物的一种方法是基于土壤杆菌的天然转化系统。例如，见Horsch等，Science227：1229(1985)。根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)和农根菌(agrobacterium rhizogenes)是植物致病的土壤细菌，其能通过基因转化植物细胞。农杆菌和农根菌的Ti和Ri质粒分别介导有植物基因转化的基因。例如，见Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant Sci.10：1(1991)。Gruber等，见前，Miki等，见前，和Moloney等，Plant Cell Reports 8：238(1989)提供土壤杆菌载体系统和以土壤杆菌介导的基因转化方法的说明。也见美国专利No.5,563,055(Townsend和Thomas)，1996年10月8日发布。

[0119]B.直接基因转移------植物转化的数种方法，共同称为直接基因转化，已经发展成为对土壤杆菌(或农杆菌)介导(agrobacterium-mediated)转化的选择。植物转化的通常基因上可用的方法是基因枪负载的转化，其中DNA负载于测量1-4μm的基因枪表面上。将表达载体引入具有将基因枪的速度加速至300于600米/秒的基因枪装置的植物组织，所述速度足以渗透植物细胞壁和膜。Sanford等，Part.Sci.Technol.5：27(1987)，Sanford，J.C.，Trends Biotech.6：299(1988)，Klein等，Bio/Technology 6：559-563(1988)，Sanford，J.C.，Physiol Plant 7：206(1990)，Klein等，Biotechnology 10：268(1992)。也见美国专利No.5,015,580(Christou等)，1991年5月14日发布；美国专利No.5,322,783(Tomes等)，1994年6月21日发布。

[0120]将DNA物理传递至植物的另一种方法是目的细胞的声波降解法，Zhang等，Bio/Technology 9：996(1991)。选择地，已经将脂质体或球形体用于将表达载体引入植物，Deshayes等，EMBO J.，4：2731(1985)，Christou等，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962(1987)。Hain等Mol.Gen.Genet.199：161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)已经报道了使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸(omithine)指引将DNA摄入原生质体。Donn等，Vllth InternationalCongress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC的摘要中A2-38，第53页(1990)；D′Halluin等，Plant Cell 4：1495-1505(1992)和Spencer等，PlantMol.Biol.24：51-61(1994)已经描述了原生质体和整个细胞和组分的电穿孔。

[0121]使用本领域公知的再生和选择方法，下列向日葵靶向组织的转化、上述可选择的标记基因的表达可以实现对转化的细胞、组织和/或植物优选的选择。

[0122]前述转化方法通常用于制造转基因品种。为了制造新的转基因品种，转基因的品种然后可以与另一品种(非转化的或转化的)进行杂交。可选择地，可以使用植物育种领域公知的传统回交技术，将已经使用前述转化技术被设计进入特殊的向日葵系中的基因特性移入另一个系。例如，回交方法可用于将设计的特性从公共的非原种的品种移入原种品种中，或从基因组中含有外源基因的品种移入不含所述基因的品种或多个品种。此处所用的“杂交”可指单一的X被Y的杂交，或回交过程依据上下文而定。

向日葵的组织培养

[0123]OI1601A，OI2653R和OI1601B栽培品种或E83329杂种进一步的产品可以通过自花授粉或通过组织培养或再生出现。已知向日葵的多种组织和植物再生的组织培养方法。例如，通过组织培养的向日葵栽培变种的繁殖在下列任何文献进行描述，但不限于Shin等，体内细胞和发展生物(In Vitro Cellular and Development Biology)-Plant，36：273-278(2000)；Hildebrandt和Riker，Amer.J.Bot，34：421-427(1947)；Rogers等，In Vitro，6：463-7(1974)；Fambrini等，Ann.Bot，92：145-152(2003)。

[0124]当本发明的文中使用术语“向日葵植物”，这也包括所述品种的任何单基因转化。此处使用的术语“单基因转化的植物”指通过所谓回交的植物育种技术培育的那些向日葵，其中除了单基因通过回交技术转化入品种，基本上所有希望的所述品种的形态学和生理学特征得到恢复。回交方法可以与本发明一起使用以改进或将一个特征引入所述品种。此处所使用的术语“回交(backcrossing)”指杂种后代重复地杂交至当前的亲本，即，回交1、2、3、4、5、6、7、8或更多次至回交亲本(recurrent parent)。贡献希望的特征的基因的亲本向日葵术语称为“非回交(nonrecurrent)”或“供体亲本(donor parent)”。这种术语名词指非回交亲本在回交规约中用一次，因此而不回交的事实。来自非回交亲本的基因或多种基因被转化进入的亲本向日葵植物被已知为非回交基因，因为它在回交规约中使用数次轮回(Poehlman & Sleper，1994；Fehr，1987)。在一个典型的回交规约中，目的初始品种(回交亲本)与带有单一要转化的目的基因第二个品种(非回交亲本)杂交。由杂交形成的后代然后再与回交的亲本杂交，且该过程重复直至获得这样的向日葵，其中除了当生长在相同的环境条件下，从非回交亲本转化的单一转化的基因，如测定在5％显著水平外，基本上所有的希望的回交亲本的形态学和生理学特征在转化的植物中被恢复。

[0125]合适的回交亲本的选择是成功回交程序的重要的步骤。回交规约的目的是改变或取代初始品种的单一特性或特征。为了完成这个步骤，用来自非回交亲本的希望的基因改进或取代轮回品种的单基因，同时保留希望的基本上所有的初始品种的基因以及生理学和形态学构造的剩余部分。特别的非回交亲本的选择将依赖于回交的目的。一个主要的目的是将一些商业上希望的农艺学上重要的特性加入至植物。准确的回交规约将依赖于被改变以确定合适的测试规约的特征或特性。虽然回交方法得到简化，当转化的是优势等位基因，隐性的等位基因也可以被转化。在这种情况下，有必要引入后代的试验以确定是否希望的特征已经成功转化。

[0126]已经识别许多在新品种培育中不被有规律地选择的但可以通过回交技术改进的单基因特性。单基因特性会或不会是转基因的，这些特性的例子包括，但不限于，雄性不育、蜡质淀粉、除草剂抗性、细菌抗性、霉菌的、或病毒疾病、害虫抗性、雄性生育、增强的营养质量、工业应用、产量稳定性、和产量增加。这些基因通常通过核得到遗传。数个这些单基因特性在美国专利Nos.5,959,185、5,973,234和5,977,445中进行了公开。

[0127]可以通过组织培养和再生进一步繁殖该品种。向日葵的多种组织和这些植物的再生的组织培养是公知的并大量公开的。例如，参考的有Mayor等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，72：99-103(2003)和Baker等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，58：39-49(1999)。因此，本发明的另一方面是提供在生长和分化中产生具有向日葵栽培品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或向日葵杂种E83329的生理学和形态学特征向日葵植物的细胞。

[0128]如此处所使用，术语Atissue culture@表示包括分离的相同或不同类型的细胞或组织，在植物的内的这种细胞的集合的组合。示例型的组织培养是原生质体、胝、植物丛生、和可以产生在植物或植物的部分中是完整的组织培养的植物细胞，如晶胚、花粉、花、种子、荚、叶、茎、根、根末稍、花药等等。制备和保持植物组织培养的方法是本领域公知的。通过实施例，已经使用包括器官的组织培养来制造再生的植物。美国专利Nos.5,959,185、5,973,234和5,977,445公开确定的技术，其公开通过引用并入全文。

[0129]本发明也涉及通过将第一亲本向日葵植物与第二亲本向日葵植物进行杂交培育向日葵植物的方法，其中第一或第二亲本向日葵是品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或杂种E83329的向日葵植物。进一步，第一和第二亲本向日葵植物可以来自向日葵品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或杂种E83329。因此，使用向日葵品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或向日葵杂种E83329的任何这种方法是本发明的一部分：自交、回交、杂种生产、对种群的杂交等。用向日葵品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或向日葵杂种E83329作为亲本产生的所有的植物是在本发明的范围内，包括由源自向日葵品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或向日葵杂种E83329的品种发展的那些。有利地，向日葵品种可以用于与其它不同的向日葵的杂交中以产生第一代(F₁)向日葵杂种种子和具有超性征的植物。本发明的品种也可用于外源基因被本发明的品种引入或表达的转化中。使用品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或杂种E83329通过传统育种方法，或通过品种OI1601A、OI2653R、或OI1601B或杂种E83329的转化，通过任何本领域技术人员所公知的许多规约，创造的遗传性的变体在本发明的范围之内。

[0130]向日葵栽培品种OI1601A、OI2653R、和OI1601B和向日葵杂种E83329由位于明尼苏达州高速路北75号，Breckenridge，邮编56520的陶氏益农公司的农业基因公司d/b/a Mycogen Seeds保存。在授权美国专利和商标局局长根据37CFR 1.14和35USC 122条的规定任何人就该申请处于待批时，可以得到这些保藏物。根据该申请中的任何权利要求的允许，通过提供由美国ATCC(American Type CultureCollection，Manassas，Virginia)处得到每个相同品种的至少2,500颗种子将解除公众获得这些品种的限制。

[0131]尽管以上讨论了许多示例的方面和实施方案，本领域技术人员会认识到它们的某种改进、排列、增加和子组合。因此，对下列附上的权利要求和此后引入的权利要求进行解释包括在它们的本质精神和保护范围内的所有的这些改进、增补和子组合。

Claims (42)

1、一种向日葵种子，其具有咪唑啉除草剂抗性基因和油酸含量大于85％，其中所述的抗性基因是咪唑啉抗性基因。

2、一种根据权利要求1所述的种子的生长产生的向日葵植物，或其部分。

3、根据权利要求1所述的向日葵种子，其中所述的油酸含量为85％至88％。

4、根据权利要求1所述的向日葵种子，其中所述的油酸含量为88％至90％。

5、根据权利要求2所述的植物，其中所述的植物在商业上可接受植物。

6、根据权利要求2所述的植物的组织培养物。

7、由权利要求4所述的组织培养物再生的植物，其中所述的植物包括所述咪唑啉抗性基因。

8、产生杂种种子的方法，其中所述的方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获得到的杂种种子，其中所述的第一或第二亲本植物是根据权利要求2所述的植物。

9、一种杂种植物，其由生长根据权利要求6所述的种子产生的，其中所述的杂种植物包括咪唑啉抗性基因。

10、向日葵栽培品种OI1601A的种子，所述栽培品种的种子的代表性样品已保存为ATCC，保藏号为No.PTA-____。

11、一种通过权利要求10所述的种子的生长产生的向日葵植物或其部分。

12、一种由权利要求11所述的植物产生的可再生细胞的组织培养物。

13、一种向日葵植物，其由权利要求12所述的组织培养物再生，其中该植物具有栽培品种OI1601A所有的形态学和生理学特征。

14、一种产生杂种向日葵种子的方法，其中所述的方法包括将权利要求11所述的植物与不同的向日葵植物杂交，并收获产生的杂种向日葵种子。

15、一种将希望的特性引入向日葵栽培品种OI1601A的方法，其中所述的方法包括：

(a)将OI1601A植物，其代表性的种子已经保存在ATCC，

保藏号为No.PTA-___，与另一种包括希望的特性的向日葵栽培品种的植物杂交以产生后代植物，其中希望的特性选自雄性不育，除草剂抗性，或对细菌疾病、霉菌疾病或病毒疾病的抗性；

(b)选择具有希望的特性的后代植物以产生选择的后代植物；

(c)将选择的后代植物与OI1601A植物杂交，以产生回交后代植物；

(d)选择具有希望的特性和向日葵栽培品种OI1601A生理学和形态学特征的回交后代植物，以产生选择的回交后代植物；和

(e)一次或多次接连地重复步骤(c)和(d)，以产生选择的第二代或更高代数的包括希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI1601A生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长，如测定在5％显著水平的回交后代植物。

16、一种由权利要求15所述的方法产生的植物，其中所述的植物具有希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI1601A生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平。

17、一种向日葵栽培品种OI2653R的种子，所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

18、一种通过权利求17所述的种子的生长产生的向日葵植物，或其部分。

19、一种由权利要求18所述的植物产生可再生细胞的组织培养物。

20、一种向日葵植物，其由权利要求19所述的组织培养物再生，其中所述的植物具有栽培品种OI2653R所有的生理学和形态学特征。

21、一种产生杂种向日葵种子的方法，其中所述的方法包括将权利要求18所述的植物与不同的向日葵植物杂交，并收获产生的杂种向日葵种子。

22、一种将希望的特性引入向日葵栽培品种OI2653R的方法，其中所述的方法包括：

(a)将OI2653R植物，其代表性的种子已经保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___，与另一种包括希望的特性的向日葵栽培品种杂交以产生后代植物，其中希望的特性选自雄性不育，除草剂抗性，或对细菌疾病、霉菌疾病或病毒疾病的抗性；

(b)选择具有希望的特性的后代植物以产生选择的后代植物；

(c)将选择的后代植物与OI2653R植物杂交，以产生回交后代植物；

(d)选择具有希望的特性和向日葵栽培品种OI2653R生理学和形态学特征的回交后代植物，以产生选择的回交后代植物；和

(e)一次或多次接连地重复步骤(c)和(d)，以产生选择的第二代或更高代数的包括希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI2653R生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长，如测定在5％显著水平的回交后代植物。

23、一种由权利要求22所述的方法产生的植物，其中所述的植物具有希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI2653R生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平。

24、一种向日葵栽培品种OI1601B的种子，所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

25、一种通过权利求24所述的种子生长产生的向日葵植物，或其部分。

26、一种由权利要求25所述的植物产生的可再生细胞的组织培养物。

27、一种向日葵植物，其由权利要求26所述的组织培养物再生，其中所述的植物具有栽培品种OI1601B所有的生理学和形态学特征。

28、一种产生杂种向日葵种子的方法，其中所述的方法包括将权利要求25所述的植物与不同的向日葵植物杂交，并收获产生的杂种向日葵种子。

29、一种将希望的特性引入向日葵栽培品种OI1601B的方法，其中所述的方法包括：

(a)将OI1601B植物，其代表性的种子已经保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___，与另一种包括希望的特性的向日葵栽培品种杂交以产生后代植物，其中希望的特性选自雄性不育，除草剂抗性，或对细菌疾病、霉菌疾病或病毒疾病的抗性；

(b)选择具有希望的特性的后代植物以产生选择的后代植物；

(c)将选择的后代植物与OI1601B植物杂交，以产生回交后代植物；

(d)选择具有希望的特性和向日葵栽培品种OI1601B生理学和形态学特征的回交后代植物，以产生选择的回交后代植物；和

(e)一次或多次接连地重复步骤(c)和(d)，以产生选择的第二代或更高代数的包括希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI1601B生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平的回交后代植物。

30、一种由权利要求29所述的方法产生的植物，其中所述的植物具有希望的特性和所有的向日葵栽培品种OI1601B生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平。

31、一种向日葵杂种E83329的种子，所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

32、一种通过权利要求38所述的种子生长产生的向日葵植物或其部分。

33、一种其由权利要求39所述的植物产生的可再生细胞的组织培养物。

34、一种向日葵植物，其由权利要求40所述的组织培养物再生，其中所述的植物具有栽培品种E83329所有的生理学和形态学特征。

35、一种产生杂种向日葵种子的方法，其中所述的方法包括将权利要求39所述的植物与不同的向日葵植物杂交，并收获产生的杂种向日葵种子。

36、一种将希望的特性引入向日葵栽培品种E83329的方法，其中所述的方法包括：

(a)将E83329植物，其代表性的种子已经保存在ATCC保藏号为No.PTA-___，与另一种包括希望的特性的向日葵栽培品种杂交以产生后代植物，其中希望的特性选自雄性不育，除草剂抗性，或对细菌疾病、霉菌疾病或病毒疾病的抗性；

(b)选择具有希望的特性的后代植物以产生选择的后代植物；

(c)将选择的后代植物与E83329植物杂交，以产生回交后代植物；

(d)选择具有希望的特性和向日葵栽培品种E83329生理学和形态学特征的回交后代植物，以产生选择的回交后代植物；和

(e)一次或多次接连地重复步骤(c)和(d)，以产生选择的第二代或更高代数的包括希望的特性和所有的向日葵栽培品种E83329生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平的回交后代植物。

37、一种由权利要求43所述的方法产生的植物，其中所述的植物具有希望的特性和所有的向日葵栽培品种E83329生理学和形态学特征，如果在相同的环境条件下生长如测定在5％显著水平。

38、一种产生油的方法，所述的油包括大于85％的油酸含量，所述的方法包括以下步骤：

(a)提供具有咪唑啉除草剂抗性基因和油酸含量大于85％的向日葵种子，其中所述的抗性基因是咪唑啉的抗性基因。

(b)回收包括大于85％的油酸含量的油。

39、根据权利要求38所述的方法，其中向日葵种子是向日葵栽培品种OI1601A的种子和其中所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

40、根据权利要求38所述的方法，其中向日葵种子是向日葵栽培品种OI2653R的种子，其中所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

41、根据权利要求38所述的方法，其中向日葵种子是向日葵栽培品种OI1601B的种子，其中所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

42、根据权利要求38所述的方法，其中向日葵种子是向日葵栽培品种E83329的种子，其中所述栽培品种的种子的代表性样品已保存在ATCC，保藏号为No.PTA-___。

43、根据权利要求38所述的方法，其中包括大于85％的油酸含量的回收的油具有88％至90％的油酸含量。