CN101268367A - 卵巢癌的生物标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供以蛋白质为基础的多个生物标记(protein－basedbiomarkers)及多个生物标记组合物，其适用于定性病患卵巢癌状态。特别是，本发明的生物标记适用于分类受验者样本为卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、良性卵巢疾病或其他恶性病症。所述多个生物标记可利用SELDI质谱法来侦测。

Description

卵巢癌的生物标记

【相关申请】

本发明相关于2005年6月24日申请的美国临时申请案第60/693,755号和2006年3月22日申请的美国临时申请案第60/785,031号，这两案所揭示的技术并入本文作为参考。

【技术领域】

本发明一般是关于临床诊断法，且特别是，关于卵巢癌的临床诊断法。

【技术背景】

在发达国家中，卵巢癌为最致命妇科恶性肿瘤的一种。光在美国，每年就有大约23,000名妇女被诊断患有所述疾病，其中有接近14,000名妇女因此死亡(Jamal，et al.，CA Cancer J.Clin，52：23-47(2002))。尽管癌症疗法有进展，卵巢癌死亡率在过去二十年(同上)实际上保持不变。由于诊断卵巢癌的阶段越早、存活的可能性迅速升高，因此早期侦测仍然是提升卵巢癌病患长期存活可能性的最重要因素。

晚期诊断出来的卵巢癌的预后差、与确诊过程有关的费用和风险性、及其于一般民众人口中相对低的普遍率，这些共同造成对于一般民众卵巢癌筛检测试的敏感度和特异性有非常严苛的要求。

适用于癌症早期侦测和诊断的肿瘤标记的识别，对于改善病患的临床结果具有很大前景。对于病征模糊或没有病征或对于物理侦测相对无法达到的肿瘤的病患来说尤为重要。虽然在早期侦测上付出大量努力，但是目前还没有一种花费经济的筛检方法(Paley，Curr OpinOncol.，13(5)：399402(2001))，而且诊断时妇女通常表现为已播散疾病(disseminated disease)。(Ozols et al.，Epithelial ovariancaner.In：Hoskins WJ，Perez CA，Young RC，editors.Principlesand Practice of Gynecologic Oncology.3rd ed.Philadelphia：Lippincott，Williams and Wilkins；p981-1057(2000))。

CA125是最具特征的肿瘤标记，其在大约30至40％的第I阶段卵巢肿瘤中为阴性的，而且在许多良性疾病中它的水平提高(Meyer etal.，Br J Cancer，82(9)：1535-8(2000)；Buamah，J Surg.Oncol.，75(4)：264-5(2000)；Tuxen et al.，Cancer Treat.Rev.，21(3)：215-45(1995))。由于CA125的低敏感度和特异性使得它作为以大众为基础的筛检工具以早期侦测和诊断卵巢癌之功用受阻(MacDonald et al.，Eur.J.Obstet.Gynecol Reprod.Biol.，82(2)：155-7(1999)；Jacobs et al.，Hum.Reprod.，4(1)：1-12(1989)；Shih et al.，Tumor makers in ovarian cancer，Diamandis，Fritsche，Lilja，Chan，and Schwartz，editor；Tumor markers physiology，pathobiology，technology and clinical applications，Philadelphia：AACC Press；in press)。虽然盆骨超音波以及最近的阴道超音波已用于筛检高风险病患，但其两者技术应用于一般民众都不具足够敏感度和特异性(MacDonald et al.，如前)。最近在癌症模型的风险度纵向评估中(Skates et al.，Cancer，76(10Supp.)：2004-10(1995))组合使用CA125与其它肿瘤标记(Woolas etal.，J.National Cancer Inst.，85(21)：1748-51(1993)；Woolas etal.，Gynecol.Oncol.，59(1)：111-6(1995)；Zhang et al.，Gynecol.Oncol.，73(1)：56-61(1999)；Zhang et al.，Use of Multiple Markersto Detect Stage I Epithelial Ovarian Cancers：Neural NetworkAnalysis Improves Performance，American Society of ClinicalOncology(2001)；Annual Meeting，Abstract)，并且协同使用超音波作为第二线试验(Jacobs et al.，Br.Med.J.，306(6884)：1030-34(1993)；Menon et al.，British Journal ofObstetrics and Gynecology，107(2)：165-69(2000))表明，在提升整体试验特异性得到很好的结果，而特异性对于具相对低普遍性的疾病(例如卵巢癌)为关键性指标。

由于晚期卵巢癌令人失望的预诊断，普遍认为主治医师将会接受积极预测值在至少10％的试验结果(Bast et al.，Cancer Treatmentand Research，107：61-97(2002))。将所述试验扩展到更广泛的族群，则一般筛检试验将需要敏感度为大于70％及特异性为99.6％。目前没有一种现有的血清学标记，例如CA125、CA72-4或M-CSF，单独地产生上述的功效(Bast et al.，Int.J.Biol.Markers，13：179-87(1998))。

因此，需要有新颖血清学上的生物标记，其单独地或与其它标记或诊断型物理疗法组合，以给予早期侦测卵巢癌所需要的敏感度和特异性(Bast et al.，Early detection of ovarian cancer：promise andreality，Ovarian Cancer：ISIS Medical Media Ltd.，Oxford，UK(2001)，in press)。若没有可接受的筛检试验，早期侦测仍然是改善患有卵巢癌病患长期存活最关键的因素。

因此，需要有可靠且准确测量病患卵巢癌状态的方法，然后其结果可用于处理受验者治疗。

【发明内容】

本发明通过提供新颖的生物标记及对诊断卵巢癌有用的生物标记的组合物，以及使用所述多个生物标记来诊断卵巢癌的方法及试剂盒以满足上述这些需求。

更特别的是，在一个态样中，本发明提供定性受验者卵巢癌状态的方法，包括：(a)测量取自受验者样本中的至少一种生物标记，其中所述的至少一种生物标记选自表1、表3及表4所组成的群组；及(b)关联测量与卵巢癌状态。在一个具体实施例中，所述的至少一种生物标记选自下列所组成的群组：ApoC1、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A、钙周期蛋白、转甲状腺素蛋白(transthyretin)(双电荷)及IgG重链。在另外的具体实施例中，所述的方法包括测量各种ApoC1、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A、钙周期蛋白、转甲状腺素蛋白及IgG重链。在另外的具体实施例中，所述的方法进一步包括测量卵巢癌的一些其他已知生物标记，例如CA125。

在另外的具体实施例中，所述的方法进一步包括测量卵巢癌的一些其他已知生物标记，例如CA125。在进一步的具体实施例中，所述的方法进一步包括测量及关联至少一种选自下列群组所组成的生物标记：CA125、转铁蛋白(transferrin)、结合珠蛋白(haptoglobin)、ApoAl、转甲状腺素蛋白、ITIH4内部片段、β2-微球蛋白、抗菌多肽(hepcidin)、波思塔亭(prostatin)、骨桥素(osteopontin)、嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(esoinophil-derived neurotoxin)、瘦素(leptin)、催乳素(prolactin)、IGF-II、血红蛋白及它们的修饰型式。在又一另外的具体实施例中，所述的方法进一步包括CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、肿瘤相关胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、唾液酸TN(Sialyl TN)、半乳糖转化酶、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生长因子受体细胞外区域110kD部分(p110EGFR)、组织激肽释放酶原(kallikreins)，例如激肽释放酶6和激肽释放酶10(NES-1)、丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶B(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽(UGP)、Dianon NB 70/K、组织肽抗原(TPA)、SMRP、骨桥素和结合珠蛋白、瘦素、催乳素、类胰岛素生长因子I及类胰岛素生长因子II。也可使用本发明的其他方法、试剂盒及软件来测量及关联这些额外的生物标记。

在上述方法的一个具体实施例中，所述的至少一种生物标记通过在SELDI探针的吸附剂表面上捕获所述生物标记及通过激光解吸-电离质谱法来侦测所获补的生物标记而测量。在另外的具体实施例中，所述的至少一种生物标记通过免疫分析法测量。当已知所述生物标记的身分时，所述方法的后者是特别有用的。在一个具体实施例中，样本为卵巢囊肿液。在相关的具体实施例中，吸附剂为选自下述群组所组成的成员：疏水性吸附剂、离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。在又一另外的具体实施例中，所述吸附剂为阳离子交换吸附剂。

在另外的具体实施例中，本发明的生物标记通过不同于质谱法或是不同于依赖测量所述生物标记的质量的方法来测量。例如，在某些具体实施例中，此发明的生物标记通过免疫分析法来测量。

如指示，上述方法是针对定性卵巢癌状态。在一个具体实施例中，通过软件分类演算法进行关联。一般来说，在本发明的方法中，卵巢癌状态选自良性卵巢疾病、低恶性潜能卵巢癌、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症。在一个具体实施例中，卵巢癌状态选自良性卵巢疾病及与卵巢癌(恶性)及其他恶性病症相对的低恶性潜能卵巢癌。在另外的具体实施例中，卵巢癌状态是选自与良性卵巢疾病相对的低恶性潜能卵巢癌、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症。在又一个具体实施例中，卵巢癌状态排除良性卵巢疾病的可能性。在又另外一个具体实施例中，卵巢癌状态排除卵巢癌(恶性)及其他恶性病症的可能性。

在另外的具体实施例中，本文所述侦测生物标记及关联测量与卵巢癌状态的方法进一步包括基于所述状态处理受验者治疗。在相关的具体实施例中，若所述测量与卵巢癌为关联，则处理受验者治疗包括投予化学治疗剂到所述受验者。在另外的具体实施例中，所述方法进一步包括在受验者处理后测量至少一种生物标记以及关联该测量与疾病发展，包含决定疾病发展的速率。

本发明也提供一种包括测量来自受验者的样本的至少一种生物标记的方法，其中，所述至少一种生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组。

本发明另外的具体实施例提供一种决定卵巢癌过程的方法，包括(a)第一次测量来自受验者的生物样本中的至少一种生物标记，其中，所述至少一种生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组；及(b)第二次测量来自受验者的生物样本中的至少一种生物标记；及(c)比较第一次测量与第二次测量；其中，所比较的测量决定所述卵巢癌的过程。

在又一个具体实施例中，所述至少一种生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在进一步具体实施例中，所述方法包括测量各种下列生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在相关的具体实施例中，所述方法包括额外地测量CA125。

在再一个具体实施例中，所述至少一种生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述方法包含测量各种ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述方法进一步包括测量卵巢癌的某些其他已知生物标记，例如CA125。

除此处所述方法外，本发明也提供一种包括选自表1、表3及表4的生物标记的纯化的生物分子的组合物。在另外的具体实施例中，本发明提供一种包括生物特异性捕获试剂，例如抗体的组合物，所述生物特异性捕获试剂特异性结合一种选自表1、表3及表4的生物标记的生物分子。在相关的具体实施例中，所述生物特异性捕获试剂结合至固体载体。在又一具体实施例中，本发明提供一种包括生物特异性捕获试剂的组合物，所述生物特异性捕获试剂结合至一种表1、表3及表4的生物标记。

在其他的具体实施例中，本发明提供试剂盒。例如，在一个具体实施例中，本发明提供一种试剂盒，包括：(a)固体载体，包括附着至其上的至少一种捕获试剂，其中，所述捕获试剂结合选自表1、表3及表4的生物标记所组成的第一群组的至少一种生物标记；及(b)使用所述固体载体来侦测表1、表3及表4的一种生物标记的说明书。在相关的具体实施例中，所述的试剂盒进一步包括使用所述固体载体来侦测选自下列所组成群组的一种生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链的说明书。在另外的具体实施例中，所述试剂盒包括使用所述固体载体来侦测下列各种生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链的多个说明书。在又一具体实施例中，所述试剂盒进一步包括使用所述固体载体来侦测CA125的说明书。

于再一个相关的具体实施例中，所述试剂盒包括使用所述固体载体来侦测选自下列所组成群组的至少一种生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)的多个说明书。在另外的具体实施例中，所述试剂盒包括使用所述固体载体来侦测下列各种生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)的多个说明书。在另外的具体实施例中，所述试剂盒包括使用所述固体载体来侦测卵巢癌的某些其他已知生物标记的多个说明书，例如CA125。

在另外的相关具体实施例中，所述试剂盒的所述固体载体包括为SELDI探针的捕获试剂，其中所述捕获试剂为疏水性吸附剂、阴离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。在又一具体实施例中，所述试剂盒额外地包括一种容器，所述容器含有至少一种表1、表3及表4的生物标记。在又一个具体实施例中，所述试剂盒额外地包括阳离子交换层析吸附物。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种试剂盒，包括(a)固体载体，包括附着于其上的至少一种捕获试剂，其中，所述捕获试剂结合至少一种选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组的生物标记；及(b)含有至少一种所述生物标记的容器。在相关的具体实施例中，所述容器包含至少一种生物标记，其选自下列所组成群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在又一具体实施例中，所述容器包含各种下列生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在相关的具体实施例中，所述容器进一步包含CA125。

在另外相关的具体实施例中，所述容器包含选自下列所组成群组的至少一种生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述容器包含各种下述生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述容器进一步包含CA125。

在又一具体实施例中，所述试剂盒的所述固体载体包括为SELDI探针的捕获试剂，其中所述捕获试剂为疏水性吸附剂、阴离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。在又一具体实施例中，所述试剂盒额外地包括一种含有至少一种表1、表3及表4的生物标记的容器。

本发明额外提供一种软件产品，包括存取隶属于样本的数据的编码，所述数据包括样本中至少一种生物标记的测量，所述生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成群组的生物标记；且进一步包括进行分类演算法的编码，其将所述样本的所述卵巢癌状态分类为所述测量的函数。在相关的具体实施例中，所述软件产品将所述样本的卵巢癌状态分类成为一种生物标记的测量的函数所述生物标记选自下列所组成群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在又一个具体实施例中，所述分类演算法将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为各种生物标记的测量的函数，所述各种生物标为：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。在另一具体实施例中，所述分类演算法将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为CA125的测量的函数。

在相关的具体实施例中，所述软件产品将样本的卵巢癌状态分类成为一种生物标记的测量的函数，所述生物标记选自下列所组成群组：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述分类演算法将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为各种生物标记的测量的函数，所述各种生物标记为：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白(双电荷)。在另外的具体实施例中，所述分类演算将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为CA125的测量的函数。

本发明额外提供一种包括通过质谱法或免疫分析侦测表1、表3及表4的生物标记的方法。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种包括将有关卵巢癌状态的诊断结果传达至受验者的方法，，其中，所述卵巢癌状态是通过来自受验者的样本的生物标记的关联性而决定的，且所述生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组。在相关的具体实施例中，所述诊断结果是透过计算机生成媒介传达至受验者。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种用于识别与表1、表3及表4的一种生物标记相互作用的化合物的方法，其中，所述的方法包括：(a)将表1、表3及表4的一种生物标记与测试化合物接触；及(b)决定所述的测试化合物是否与表1、表3及表4的该生物标记相互作用。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种用于调节细胞中钙粒蛋白C浓度的方法，其中，所述方法包括将所述的细胞与抑制剂接触，其中，所述抑制剂阻止钙粒蛋白C裂解。

本发明额外提供一种治疗受验者病症的方法，其中，所述方法包括投予受验者治疗上有效量的钙粒蛋白C的抑制剂，其中，所述的抑制剂阻止钙粒蛋白C裂解。在相关的具体实施例中，所述病症为卵巢癌。

通过以下详细的说明书、实施例及权利要求书，本发明的其他特征、目的及优点及其优选的具体实施例将很明白。

【图示简单说明】

第1图，患有良性(a，a’)、恶性上皮卵巢癌(b，b’)、及低恶性潜能癌的个体病患的囊肿液的代表性光谱(A)及其对应凝胶图示(B)。通过阴离子交换以下降pH值(pH值9.0、7.0、5.0、4.0、3.0)然后有机溶剂而分级(fractionated)，吸附至CM10蛋白质晶片(ProteinChip)阵列，并且在低激光强度读取结果。显示每位病患在pH值9.0的洗提分级。代表性散点和箱线图(C)显示m/z 10,840(钙粒蛋白A)在「波峰强度」中的变化性。各散点图的水平线为平均「波峰强度」。在患有恶性上皮卵巢癌的病患中波峰m/z10,840有显著较大的「波峰强度」。

发详细说明与优选的具体实施例

I.简介

生物标记是一种有机生物分子，所述生物分子区别呈现于取自一种表现型状态(例如患有疾病)受验者的样本及与其相比较的取自另一种显型状态(例如不患有疾病)受验者体的样本。如果经统计计算显示不同群组中的生物标记的平均或是中值表现水准具显著差别，则表示所述生物标记在不同显型状态之间是区别呈现的。用于统计上显著性的常见测试方法包括t-test、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。单独使用或组合使用的生物标记提供一种测量受验者是属于一种显型状态还是另一种显型状态的相对风险的方法。因此，它们对于作为疾病的标记(诊断上)、药物的治疗有效性(治疗诊断上(theranostics))以及药物毒性上是很有用的。

II.卵巢癌的生物标记

本发明提供以多肽为基础的生物标记，所述生物标记区别表现于患有卵巢癌的受验者，特别是，卵巢癌(恶性，例如侵略性上皮卵巢癌)、低恶性潜能卵巢癌((LMP)，边界疾病(borderline disease))、良性卵巢疾病及其他恶性病症(例如除了侵略性上皮卵巢癌之外的恶性肿瘤，包含转移癌(例如胃癌转移至卵巢)、间皮瘤、基质卵巢癌等))。生物标记的特征为如同经质谱法测定的质荷比、他们于飞行时间质谱法的光谱波峰的形状，以及他们结合至吸附剂表面的结合特性。这些特征提供一种决定一种特定侦测到的生物标记是否为本发明的生物标记的方法。这些特征表示这些生物分子的固有特性但并非用于限制所辨别的生物分子的种类。在一种态样中，本发明以单离型式提供这些生物标记。

这些生物标记是使用SELDI技术运用购自Ciphergen Riosystems，Inc.(Fremont，CA)(“Ciphergen″)的蛋白質晶片(ProteinChip)阵列而发现。收集取自诊断患有卵巢癌(侵略性上皮卵巢癌)、低恶性潜能卵巢癌(边界疾病)、其他恶性病症及良性卵巢疾病受验者的卵巢囊肿液。部份的样本保留而未经分级，而其他部份的样本通过阴离子交换层析分级。将未经分级和经分级的样本施用至SELDI生物晶片，且通过在Ciphergen PBSII质谱仪上的飞行时间质谱法来产生样本中多肽的光谱。由此获得的光谱将通过Ciphergen Biosystems，Inc.的Ciphergen Express^TMData Manager Software以Biomarker WizardandBiomarker Pattern Software来分析。对各组的质量光谱进行散点图分析。利用曼惠特尼(Mann-Whitney)测试分析来比较卵巢癌和控制组在所述散点图中的各蛋白质集群(cluster)，并选择于所述两组之间有显著区别(p＜0.0001)的蛋白质。此方法在实施例部份将进一步详细的描述。

由此所发现的生物标记呈现于表1中。按照所述实施例部份，“蛋白質晶片(ProteinChip)分析」栏表示于其中发现生物标记的层析分级(若有分级的话)、生物标记所结合的生物晶片的种类及生物标记在卵巢癌中是否上调节或下调节。

表1

¹须注意在实施例部份提出的血红蛋白α及血红蛋白β在SELDI侦测分析中为双电荷

²「于恶性肿瘤为上调节」表示所述生物标记在卵巢癌及其他恶性病症(例如除了侵略性上皮卵巢癌以外的恶性肿瘤，包含与良性卵巢疾病相对的转移癌(例如胃癌经常转移至卵巢)、间皮瘤、基质卵巢癌等)及低恶性潜能卵巢癌(LMP，边界疾病))为上调节

³「于LMP为下调节」表示所述生物标记在与其他三组(亦即良性卵巢疾病、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症)相对的低恶性潜能卵巢癌为下调节

⁴「排除良性」表示生物标记的出现将排除良性疾病的可能性，但单独却不足以于其他三组间作出诊断(卵巢癌LMP、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症)

⁵「排除恶性肿瘤」表示生物标记的出现将排除恶性疾病的可能性，但其本身单独却不足以作出良性卵巢疾病的诊断

⁶「于恶性肿瘤为下调节」表示所述生物标记在卵巢癌及与良性卵巢疾病及低恶性潜能卵巢癌(LMP)(边界疾病))相对的其他恶性病症为上调节

本发明的生物标记的特征为如同通过质谱法所测定的他们的质荷比。各生物标记的质荷比为提供于上表1、下表2及3的「M」后的数字。因此，例如，M6420表示具有测得的6420的质荷比。所述质荷比通过自Ciphergen Biosystems，Inc.PBS II质谱仪产生的质量光谱而测定。此仪器具有大约+/-0.15百分比的质量精确度。另外，此仪器具有大约400到1000m/dm的质量解析度，其中m为质量而dm为在0.5峰宽的光谱峰宽。生物标记的质荷比是通过使用Biomarker Wizard^TM软件(Ciphergen Biosystems，Inc.)而测定。Biomarker Wizard通过自所有经分析光谱(如同由PBSII所决定者)中将相同的质荷比的波峰集群、取集群中最大及最小的质荷比，再将其除以2而分配质荷比给生物标记。因此，所提供的质量反映出这些规格。

本发明的生物标记进一步以他们在飞行时间质法中的谱峰形状为特征。

本发明的生物标记进一步以他们在层析表面上的结合性质为特征。本发明的生物标记可结合的所述层析表面的实施例包含但不限定于疏水性吸附剂

阴离子交换吸附剂

阳离子交换吸附剂

及金属螯合物吸附剂(例

一些生物标记结合到使用10％乙腈的结合及清洗缓冲液的疏水性吸附剂

某些生物标记结合到使用pH8.0的50mM Tris缓冲剂的结合及清洗缓冲液的阴离子交换吸附剂

一些生物标记结合到使用，例如，50mM Tris pH8.0/500mM NaCl的结合及清洗缓冲液的金属螯合物吸附剂(例如以偶大部分的生物标记在以pH4的100mM醋酸钠清洗后结合到阳离子交换吸附剂(例如

本发明某些生物标记的身分已经确定并显示于表1中。作出所述确认的方法描述于实施例部份。对已经确定身分的那些生物标记来说，这些生物标记的出现可通过在本技术领域中其他已知方法来测定(例如免疫分析)。

由于本发明的生物标记以质荷比、结合性质及光谱的形状为特征，因此他们可通过质谱法来侦测而不需知道他们特定的身分。然而，若有需要，未经确认身分的生物标记可通过，例如，确认多肽的胺基酸序列来识别其身分。例如，生物标记可通过许多酶例如胰蛋白酶或V8蛋白酶来制成其肽图，且这些裂解片段的分子量可用于搜寻与通过多种酶所产生的裂解片段的分子量相匹配的序列的资料库。或者，蛋白质生物标记可使用串联质谱仪技术来定序。于这种方法中，所述蛋白质通过，例如，凝胶电泳而单离。切下含有生物标记的带，并将所述蛋白质以蛋白酶进行裂解。个别的蛋白质片段通过第一质谱仪来分开。然后所述片段进行碰撞引发冷却，其将肽片段化并产生多肽条带(ladder)。然后以串联MS的第二质谱仪来分析多肽条带。多肽条带成员质量的差异可识别出胺基酸的序列。整条蛋白质可以此方法定序，或将定序后片段进行资料组搜寻来找出其候选身分。

侦测生物标记的优选来源为卵巢囊肿液。然而，在其他的具体实施例中，所述生物标记是在其他的体液，例如血清、血液或尿液中侦测。

本发明的生物标记为生物分子。因此，此发明提供单离型式的这些生物分子。可自生物体液例如尿液或血清中单离生物标记。基于生物标记的质量和他们的结合特性，他们可通过本领域已知的任何方法单离。例如，可如同这里所描述般对包括生物分子的样本进行层析分离，并通过例如丙烯醯胺凝胶电泳进行进一步的分离。了解生物标记身分也使得他们能通过免疫亲和层析(immunoaffmity chromatography)来单离。

III.蛋白质的不同型式与生物标记

蛋白质通常以可测定的不同质量为特征的复数种不同型式存在于样本中。这些型式可能产自翻译前修饰及翻译后修饰其中一者或两者。翻译前修饰型式包含等位变异体、剪接变异体及RNA编辑型式。翻译后修饰型式包含由下列所导致的型式：蛋白酶裂解(例如亲蛋白质的片段)、糖基化、磷酸化、脂质化、氧化、甲基化、胱氨酸基化(cystinylation)、磺酸化(sulphonation)和乙醯基化(acetylation)。当侦测或测量样本中的蛋白质时，区分一种蛋白质的不同型式的能力取决于其差别的本质及用于侦测或测量的方法。例如，使用单株抗体的免疫分析将侦测含有表位(eptiope)的蛋白质的所有型式且不会区别他们。然而，使用针对在蛋白质上的不同表位的二种抗体的夹心免疫分析将能侦测同时包含这二种表位的蛋白质的所有型式且不会侦测那些仅含一种表位蛋白质的形式。在诊断分析中，当所使用的特别方法侦测到的这些形式可作为与任何特别型式一样良好的生物标记时，无法区分蛋白质的不同型式所产生的影响很小。不过，当蛋白质的特别型式(或特别型式的子集)是比通过特别方法所一起侦测收集的不同型式更好的生物标记时，可能牺牲这种分析法的强度。于这种情况下，利用一种于一种蛋白质的多种型式间区分及特异地侦测及测量蛋白质的一种所欲型式或多种型式的分析方法是有用的。区分分析物(analyte)的不同形式或是特异地侦测分析物的一种特别型式称为「解析」所述分析物。

质谱法是一种解析不同蛋白质型式特别有效的方法，这是因为这些不同型式典型具有不同质量，而可通过质谱仪来解析。因此，若蛋白质的一种型式相较于生物标记的另一型式而言是疾病的最优良生物标记，则当传统的免疫分析不能区分这些形式且也不能特异侦测有用的生物标记，质谱仪能够特异侦测及测量这种有用的型式，。

一种有用的方法学将质谱法与免疫分析结合。首先，生物特异性捕获试剂(例如辨别所述生物标记及它的其他型式的抗体、核酸适体(aptamer)或亲和体(affibody))用来捕获兴趣生物标记。优选地，所述生物特异性捕获试剂结合到固体相，例如珠、平板、膜或阵列。在将未结合的材料冲掉后，以质谱法侦测及/或测量所捕获的分析物。(这种方法也将导致捕获结合到所述蛋白质的蛋白质相互作用物(interactors)或是以其他方式被抗体辨别(它们本身可以作为生物标记)的蛋白质相互作用物(interactors))。各种型式的质谱法适于侦测蛋白质型式，其包含激光吸附法，例如传统的MALDI或SELDI，以及电喷洒(electrospray)电离。

因此，当本文提及侦测特别蛋白质或为测量特别蛋白质的量时，其意指在解析或是不解析蛋白质的各式型式下侦测或测量蛋白质。例如，「测量钙粒蛋白C 」的步骤包含通过不区分出样本中所述蛋白质的各式型式的方法(例如一些免疫分析)以及通过将一些型式与其他型式区分或测量所述蛋白质的特定型式(例如质谱法)的方法来测量任何及/或所有型式的钙粒蛋白C。相反地，当欲测量一种蛋白质的特定的一种或是多种型式时(例如钙粒蛋白C的特别型式包含经截断化、磷酸化、糖基化等修饰后的型式)，所述特别的一种型式(多种形式)是特定的。例如，「测量M10430」表示测量具有明确为10430Da分子量的多肽，因此，自钙粒蛋白C的其他型式区分出M10430。

IV.侦测卵巢癌的生物标记

本发明的生物标记可通过任何适合的方法侦测。可用于此目的的侦测范例包含光学方法、电化学方法(伏安法(voltametry)和安培法(amperometry)技术)、原子力显微镜及射频方法，例如多极共振光谱。除显微镜以外，例示性光学方法，共焦和非共焦显微镜也侦测萤光、冷光、化学冷光、吸收率、折射率、透射率、双折射或折射率(例如表面电浆共振、椭圆术(ellipsometry)、共振镜象法、光栅偶合器波导法或干涉法)。

在一个具体实施例中，样本通过生物晶片的手段来分析。生物晶片一般包括固体基材且具有捕获剂(也称为吸附剂或亲和试剂)黏附于其上的一般平坦表面。有时，生物晶片的所述表面包括复数个可定址位置，每个可定址位置上结合有吸附剂。

蛋白质生物晶片为适用于捕获多肽的生物晶片。在本领域内已揭示许多蛋白质生物晶片。那些蛋白质生物晶片包含，例如，由CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont，CA)、Zyomyx(Hayward，CA)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、Biacore(Uppsala，Sweden)及Procognia(Berkshire，UK)生产的蛋白质生物晶片。这类蛋白质生物晶片的例子描述在下述已公开的专利申请案中：美国专利第6,225,047号(Hutchens等人)；美国专利第6,537,749(Kuimelis等人)；美国专利第6,329,209号(Wagner等人)；PCT国际公开号WO 00/56934(Englert等人)；PCT国际公开号WO 03/048768(Boutell等人)及美国专利第5,242,828号(Bergstrom等人)。

通过质谱法来侦测

在优选的具体实施例中，本发明的生物标记是通过质谱法而侦测，质谱法为一种利用质谱仪检测气相离子的方法。质谱仪的实例为飞行时间式、扇形磁场式、四极滤质器式、离子阱式、离子绕行共振式、静电扇形分析仪以及牠们的组合。

在进一步优选的方法中，质谱仪为激光解吸/电离源质谱仪。在激光解吸/电离源质谱法中，将分析物置于质谱法的探针表面上，使装置适于将质谱仪的探针介面接合并提供电离能于分析物以将其电离及引入质谱仪。激光解吸质谱仪利用激光能(典型来自紫外线激光，但也可来自红外线激光)以自表面解吸附分析物、以挥发及电离分析物并使他们适用于质谱仪的离子光学仪器。以LDI分析蛋白质可采取MALDI的型式或SELDI的型式。

在单一个TOF仪器中的激光解吸/电离典型以线性提取模型(linear extraction mode)进行。串联质谱仪能利用正交提取模型。

SELDI

用于本发明优选的质谱技术为「表面强化激光解吸及电离」或「SELDI 」，例如描述于美国专利第5,719,060号和美国专利第6,225,047号，皆由Hutchens等人申请。此提及一种解吸/电离气相离子光谱法(例如质谱法)的方法，在这种方法中，分析物(此处指一种或多种的生物标记)被捕获在SELDI质谱法探针的表面上。SELDI的版本有数种。

一种SELDI的版本称为「亲和捕获质谱法」。它也称为「表面强化亲和捕获」或「SEAC」。此版本包含使用一种于探针表面上具有一种材料的探针，这种探针通过所述材料和分析物间的非共价亲和作用(吸附)而捕获分析物。所述材料各式名称为「吸附剂」、「捕获试剂」、「亲和试剂」或「结合份(binding moiety)」。这类探针可称为「亲和捕获探针」且有「吸附剂表面」。捕获试剂可为能够结合分析物的任何材料。捕获试剂通过物理吸附或化学吸附而附着至探针表面。在某些具体实施例中，所述探针具有已经附在表面上的捕获试剂。在其他具体实施例中，所述探针为预活化的且包含能够结合捕获试剂的反应部分，例如透过反应形成共价键或配位共价键。环氧化物和醯基-咪唑为共价结合多肽捕获试剂例如抗体或细胞受体的有用的反应部份。氮川三乙酸和亚氨基二乙酸为有用的反应部份，其作用为螯合剂以结合会与含有组胺酸的肽非共价作用的金属离子。吸附剂一般被归类为层析吸附剂及生物特异性吸附剂。

「层析吸附剂」是指典型用于层析法的吸附材料。层析吸附剂包含例如，离子交换材料、金属螯合物(例如氮川三乙酸、亚氨基二乙酸)、固定化金属螯合物(immobilized metal chelate)、疏水性作用吸附剂、亲水性作用吸附剂、染料、简单生物分子(例如核甘酸、氨基酸、单糖和脂肪酸)以及吸附剂的混合形式(例如疏水吸引/静电排斥吸附剂)。

「生物特异性吸附剂」是指包括例如核酸分子(例如核酸适体(aptamer))、多肽、多糖、脂质、类固醇或它们的耦连物(conjugate)(例如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(例如DNA)-蛋白质耦连物)的生物分子的吸附剂。在某些实施例中，所述生物特异性吸附剂可以是大分子架构，例如多蛋白复合体、生物膜或病毒。生物特异性吸附剂的实例为抗体、受体蛋白质以及核酸。生物特异性吸附剂典型比层析吸附剂对于目标分析物具有更高的特异性。用于SELDI的吸附剂的进一步实例可在美国专利第6,225,047号中发现。「生物选择性吸附剂」为一种以至少10^-8M的亲和性结合到分析物的吸附剂。

由Ciphergen Biosystems，Inc.生产的蛋白质生物晶片包括于其可定址位置上附着有层析或生物特异性吸附剂的多个表面。Ciphergen

列阵包括NP20(亲水性)；H4及H50(疏水性)；SAX-2、Q-10及LSAX-30(阴离子交换)；WCX-2、CM-10及LWCX-30(阳离子交换)；IMAC-3、IMAC-30及IMAC-50(金属螯合物)；以及PS-10、PS-20(具有醯基-咪唑、环氧化物的反应表面)及PG-20(透过醯基-咪唑偶合的蛋白质G)。疏水性蛋白質晶片(ProteinChip)阵列具有异丙基或壬基苯氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯官能性。阴离子交换蛋白質晶片(ProteinChip)阵列具有季铵官能性。阳离子交换蛋白質晶片(ProteinChip)阵列具有羧酸酯官能性。固定化金属螯合物蛋白質晶片(ProteinChip)阵列具有氮川三乙酸官能性(IMAC-3和IMAC-30)或O-甲基丙烯醯基-N，N-双-羧甲基酪胺酸官能性(IMAC-50)，其藉螯合作用吸附过渡金属离子，例如铜、镍、锌及镓。预活化蛋白質晶片(ProteinChip)阵列有醯基-咪唑或环氧化物官能基，其可与蛋白质上的基团反应而共价结合。

这类生物晶片进一步描述于：美国专利第6,579,719号(Hutchens等人，“Retentate Chromatography，″June 17，2003)；美国专利第6,897,072号(Rich等人，“Probes for a Gas Phase IonSpectrometer，″May 24，2005)；美国专利第6,555,813号(Beecher等人，“Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase MassSpectrometer，″April 29，2003)；美国专利公开号2003 0032043Al(Pohl等人，“Latex Based Adsorbent Chip，″July 16，2002)；PCT国际公开号WO 03/040700(Um等人，“Hydrophobic Surface Chip，″May15，2003)；美国专利公开号2003/0218130 A1(Boschetti等人，“Biochips With Surfaces Coated With Polysaccharide-BasedHydrogels，″April 14，2003)及美国专利第7,045,366号(Huang等人，“Photocrosslinked Hydrogel Surface Coatings，″May 16，2006。

一般来说，将具有吸附剂表面的探针与样本接触一段足够使可能存在于样本中的一种或多种生物标记结合到吸附剂的时间。反应一段时期后，清洗基材以移去未结合的材料。可使用任何适合的清洗液；优选为利用水溶液。分子维持结合的程度可通过调节清洗严格度来操作。清洗液的洗提特征可依例如pH值、离子强度、疏水性、混乱度(chaotropism)、清洗剂强度和温度而定。除非探针同时具有SEAC及SEND性质(如此处所述)，否则接着将能量吸收分子施用至具有已结合的生物标记的基材。

在另外方法中，可使用含有固体相结合免疫-吸附剂的生物标记(具有结合生物标记的抗体)来捕获生物标记。在清洗吸附剂以移去未结合的材料后，从所述固体相洗提出生物标记，并施加到结合所述生物标记的SELDI生物晶片上，再通过SELDI分析。

结合到基材的生物标记以气相离子光谱仪例如飞行时间质谱仪侦测。生物标记通过电离源例如激光来离子化，所产生的离子由离子光学配件所收集，然后再由质量分析仪分散并分析通过的离子。然后侦检器将经所侦测的离子资讯转换为质荷比。生物标记的侦测典型包含信号强度的侦测。因此，生物标记的数量和质量皆可被测定。

SEND

激光解吸质普法的另外方法称为表面强化净解吸(Surface-Enhanced Neat Desorption)(SEND)。SEND包括使用包括化学结合到探针表面的能量吸附分子的一种探针(「SEND探针」)。术语「能量吸附分子(Energy absorbing molecules，EAM)」是指能够从激光解吸/电离源吸收能量并且之后促成与其接触的分析物分子的解吸和电离的分子。EAM种类包含用于MALDI的分子，通常称为「基质(matrix)」，且所举的例子为肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羟基-肉桂酸(CHCA)及二羟基苯甲酸、阿魏酸(ferulic acid)及羟基乙酮(hydroxyaceto-phenone)衍生物。在某些具体实施例中，所述能量吸附分子并入直链或交联聚合物中，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，组合物可为α-氰基-4-甲基丙烯醯氧肉桂酸及丙烯酸酯的共聚物。在另外的具体实施例中，所述组合物为α-氰基-4-甲基丙烯醯氧肉桂酸，丙烯酸酯及3-(三乙氧基)甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯(3-(tri-ethoxy)silyl propyl methacrylate)的共聚物。在另外的具体实施例中，所述组合物为α-氰基-4-甲基丙烯醯氧肉桂酸及十八烷胺甲基丙烯酸酯的共聚物(「C18 SEND」)。SEND进一步描述于美国专利第6,124,137号及PCT国际公开号WO 03/64594(Kitagawa，“Monomers And Polymers Having Energy Absorbing Moieties of UseIn Desorption/ionization Of Analytes，″August 7，2003)。

SEAC/SEND为SELDI的一种版本，其中捕获试剂及能量吸附分子皆附着于样本呈现表面。因此SEAC/SEND探针允许透过亲和捕获而捕获分析物且不需应用基质来电离/解吸。C18 SEND生物晶片为SEAC/SEND的一种版本，包括作为捕获试剂的C18部分及作为能量吸附部分的CHCA部分。

SEPAR

LDI的另外版本称为表面强化光布稳定附着和释放(Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release)。SEPAR包括一种探针的使用，该探针具有附着至表面且可共价结合分析物的部份，以及接着暴露到光后，例如暴露于激光后，使光不稳定键结断裂而释放出所述分析物(参见美国专利第5,719,0620号)。SEPAR及SELDI的其他型式易适用于侦测依照本发明的生物标记或生物标记图谱。

MALDI

MALDI为一种用于分析生物分子例如蛋白质及核酸的传统激光解吸/电离方法。在一种MALDI方法中，样本与基质混合并直接放置在MALDI阵列上。然而，在没有预先将样本分级的情况下，生物样本(例如血清和尿液)的复杂性使此方法达不到最佳化。因此，在某些具体实施例中，生物标记优选为先以偶合到固体相载体例如树脂(例如旋转柱)上的生物特异性(例如抗体)或层析材料捕获。结合本发明生物标记的特异亲和材料已描述于上文。在亲和材料上纯化后洗提生物标记，再通过MALDI侦测。

在另外的质谱法中，生物标记在具有结合所述生物标记的层析特性的层析树脂上先被捕获。在目前的实施例中，这可以包含多种方法。例如，能在阳离子交换树脂，例如CM陶瓷HyperD F树脂，上捕获，清洗树脂，洗提生物标记及通过MALDI侦测。或者，此方法在应用到阳离子交换树脂前先以阴离子交换树脂分级样本。在另外替代方案中，能够以阴离子交换树脂上分级并直接通过MALDI侦测。在又一种方法中，能够在包括与生物标记结合的抗体的免疫-层析树脂上捕获生物标记，清洗树脂以移去未结合的材料，自所述树脂洗提生物标记再通过MALDI或SELDI侦测所洗提出的生物标记。

质谱法中电离的其他型式

在另外的方法中，通过LC-MS或LC-LC-MS侦测生物标记。这牵涉到在样本中透过一次或二次通过液体层析法而解析蛋白质，接着通过质谱法分析，典型为电喷洒离子化。

数据分析

经飞行时间质谱仪法对分析物分析产生飞行时间光谱。最后分析的飞行时间光谱典型不表示来自样本对离子能的单一脉波的信号，而是来自许多脉波的信号总合。这将降低杂讯并增加动态范围。然后对飞行时间数据进行数据处理。在Ciphergen的

软件中，数据处理典型包含TOF对M/Z转换以产生质量光谱、基线扣除以排除仪器偏移，以及高频杂讯过滤以降低高频杂讯。

通过解吸及侦测生物标记产生的数据可使用可编程数字计算机分析。计算机程式分析数据以指出侦测到的生物标记的数目及视需要指出信号强度及所侦测到的各生物标记的已测定分子质量。数据分析可包含决定生物标记的信号强度及移除偏离预定统计分布的数据的步骤。例如，观察到的的波峰可通过计算各峰相对于一些参考物的宽度来标准化。

计算机可转换所得数据为多种形式以供显示。可显示标准光谱，但在一种有用形式中以光谱角度仅保留峰高和质量资讯，以产生更清晰图像并使得具有接近分子量的生物标记更容易被看见。在另一种有用的型式中，比较二种或更多种光谱，便利地突显出样本间上调节或下调节的独特的一种与多种生物标记。使用任何这些形式，能马上决定样本中是否存在生物标记。

分析一般包含对代表来自分析物的信号的光谱谱峰的识别。峰的选定可透过肉眼来完成，且也可使用软件，如Ciphergen’s

软件套组的某部分可自动的侦测所述峰。通常，这种软件的运作是通过识别出具讯号对杂讯比大于选定阙值的讯号，并对标记出所述峰信号中央的谱峰质量。在一个有用的应用中，比较许多光谱以识别出现质谱的某些选定比例中的相同谱峰。这种软件的一个版本将于特定质量范围内以不同光谱出现的所有谱峰集群，并指派质量(M/Z)给靠近所述质量(M/Z)群的中点的所有谱峰。

用于分析数据的软件可包含将信号分析进行演算法以决定所述信号是否代表对应于根据本发明的生物标记的信号峰波的编码。所述软件也可对关于观察到的生物标记的数据进行分类树或ANN分析以决定生物标记峰或生物标记峰的组合是否存在，其指明在所检查的特别临床参数的状态。分析数据可能对直接或间接自样本的质谱法所获得的多种参数是「关键」的。这些参数包含，但不限定于，一个或多个峰的存在或不存在、一峰或峰的群组的形状、一个或多个峰的峰高、一个或多个峰的峰高的对数及其他峰高数据的计算操作。

用于卵巢癌生物标记的SELDI侦测的通用操作规则

本发明用于侦测的生物标记的优选操作规则如下文。在另外的具体实施例中，待测生物样本例如卵巢囊肿液，优选为在SELDI分析前进行预分级。所述预分馏步骤经常简化样本并改善敏感度。优选的预分级方法包含将样本与阴离子交换层析材料(例如Q HyperD(BioSepra，SA))接触。然后将结合的材料使用pH9、pH7、pH5及pH4的缓冲液进行逐步pH洗提。(洗提出生物标记为哪个分级也表示于表1中)。收集含有生物标记的多个分级。在另外的具体实施例中，待测生物样本，例如卵巢囊肿液样本，不进行预分级步骤，而是以未分级状态用于晶片结合步骤。

然后将待测(不论是未分级或预分级)样本与亲和捕获探针接触。与本发明生物标记结合的层析表面的亲和捕获探针的实例包含但不限定于，疏水性吸附剂

阴离子交换吸附剂

阳离子交换吸附剂

及金属螯合物吸附剂

以缓冲液清洗探针，其于冲掉未结合分子同时将保留生物标记。适合各种生物标记的清洗液为定义于实施例部份的缓冲液。生物标记通过激光解吸/电离质谱法测定。

或者，为了侦测各分析物，样本可在经变性或不经变性下稀释于适当的阵列结合缓冲液中，并在最适条件下结合及清洗。

或者，若可取得识别生物标记的抗体，例如就载脂蛋白Cl(ApoCl)、血红蛋白α、血红蛋白β、载脂蛋白AII(ApoAII)、载脂蛋白CII(ApoCII)、钙粒蛋白C(全长型及截断型二者)、钙粒蛋白A、IgG重链、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白而言，它们可黏附至探针表面，例如预活化PS10或PS20蛋白質晶片(ProteinChip)阵列(Ciphergen Biosystems，Inc.)。这些抗体可自样本中捕获生物标记到探针表面。然后这些生物标记可通过例如激光解吸/电离质谱法侦测。

执行流体操作的任何自动装置可应用于这些分析，例如可购自Hewlett Packard以及Hamilton的那些自动装置。

免疫侦测

在本发明的另外具体实施例中，本发明的生物标记的测量是通过除了质谱法或是依赖测量生物标记量的量的方法以外的方法。在另外的具体实施例中，此发明的生物标记通过免疫分析测量。免疫分析需要生物特异性捕获试剂，例如抗体，来捕获生物标记。抗体可通过本领域已知方法来制造，例如以生物标记使动物产生免疫。可基于生物标记的结合特征将其自样本中单离出来。或者，若多肽生物标记的胺基酸序列为已知，则可合成所述多肽并通过本领域的已知方法来产生抗体。

本发明考量的传统免疫分析包含，例如夹心免疫分析，包含ELISA或以萤光为基础的免疫分析，以及其他酶免疫分析。浊度法(nephelometry)是在液相中完成的分析，其中抗体在溶液中。测量抗原结合到抗体所导致的吸收度的改变量。在以SELDI为基础的免疫分析中，将生物标记的生物特异性捕获试剂黏附到MS探针的表面，例如预活化蛋白質晶片(ProteinChip)阵列。然后透过这种试剂而特异性将所述生物标记捕获在生物晶片上，且捕获的生物标记通过质谱法侦测。

V.受验者卵巢癌状态的侦测

本发明的生物标记可用于诊断试验以评估受验者卵巢癌状态，例如诊断卵巢癌。术语「卵巢癌状态」包含这种疾病的任何可区分表现形式。例如，卵巢癌疾病状态包含但非限定于，疾病的存在或不存在(例如卵巢癌(恶性)对低恶性潜能卵巢癌对良性卵巢疾病对其他恶性病症)、发展成疾病的风险、疾病阶段、疾病的发展(例如一段时间疾病的增长或及疾病的舒缓)及疾病治疗的效果或反应。基于所述状态，可指示进一步程序，包含额外的诊断试验或治疗程序或食物疗法。

测试的结果与卵巢癌状态的关联性对所述结果应用某种分类演算法来产生所述状态。分类演算法可以很简单，就如同决定一种给定生物标记所测量到的量是高于或低于特定反折数目(cut-off number)般。当使用多个生物标记时，所述分类演算法可能是线性回归公式。或者，所述分类演算法可能是这里所描述的任何数量的学习演算法的产品。

就复杂的分类演算法情况来说，使用计算机来对数据执行演算法以决定分类可能是必要的，例如可编程数字计算机。无论哪种情况，接着能在有形的媒介上以例如计算机可读的形式记录所述状态，例如存储驱动器或硬碟或仅在纸上列印。也能够于计算机萤幕上报告所述结果。

单一标记

一种诊断测试正确预测状态的能力通常被测量以作为分析的敏感度、分析的特异性或在受试者操作特性(「ROC」)曲线下的面积。敏感度是经测试预测为阳性的真阳性百分比，而特异性是经测试预测为阴性的真阴性百分比。ROC曲线将一种测试的敏感度提供作为1-特异性的函数。在ROC曲线下的区域越大，这种测试的预测值越有力。一种试验的有用性的其他有效测量为阳性预测值及阴性预测值。阳性预测值指测验阳性者是实际阳性的百分比。阴性预测值指试验阴性者为实际阴性的百分比。

本发明的生物标记显示不同的卵巢癌状态的至少p≤0.05、p≤10^-2、p≤10^-3、p≤10^-4或p≤10^-5的统计差异。单独或组合使用这些生物标记的诊断测试显示至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％及约100％的敏感度及特异性。

列举于表1、表3及表4的各种生物标记为差别存在于卵巢癌(恶性)、卵巢癌LMP、良性卵巢疾病或其他恶性病状中，因此，各种生物标记分别有助于决定卵巢癌状态。所述方法包含，首先，使用本文所述方法，例如先在SELDI生物晶片上捕获然后用质谱法侦测，来测量受验者样本的被选择的生物标记，其次，将所述测量与能将阳性卵巢癌状态与阴性卵巢癌状态区别的诊断量或反折量相比较。诊断量表示生物标记的测量的量高于或低它则受验者将被分类为具有特定卵巢癌状态。例如，若与正常相比，在卵巢癌期间生物标记为上调节，则高于诊断反折的测量量作出卵巢癌的诊断。或者，若生物标记在卵巢癌期间为下调节，则低于诊断反折的测量量作出卵巢癌诊断。如本领域中所熟知般，通过调节测试所使用的特定诊断反折，则可依照诊断医师喜好提升诊断分析的敏感度与特异性。决定所述特定诊断反折可通过如本文做的一般，例如测量来自不同卵巢癌状态受验者的统计显著样本数中生物标记的量再绘制出适合诊断者所欲特异性及敏感程度的反折。

标记组合

当各种单独的生物标记为有用的诊断标记时，可发现这些生物标记的组合能提供比单一生物标记更大的特定状态的预测价值。尤其，样本中多个生物标记的侦测能提升测试的敏感度及/或特异性。至少两个生物标记的组合有时称为「生物标记图谱(profile)」或「生物标记指纹(fingerprint)」。可侦测描述于表1、表3及表4中的生物标记的组合。相同地，描述于表1、表3及表4中的一种或多种生物标记也可与其他已知卵巢癌生物标记例如CA125组合而测定。可用于与本发明生物标记组合的已知卵巢癌生物标记的实例包含但不限定于，那些揭示于PCT申请公开号WO 03/057014及WO 2004/012588者，为了所有的目的，二案内容皆倂入本文作为参考。

描述于下文实施例中的操作规则用于产生来自65位病患的样本的质谱，其中有30位诊断出患有卵巢癌而有35位没有呈现出卵巢癌。取其波峰质量及高度作为发现数据组(discovery data set)。此数据组用于训练实施分类及回归树分析(CART)(Ciphergen BiomarkerPatterns Software^TM)的学习演算法。特别是，CART随机选择这些峰的多个子集。对各子集来说，CART产生最佳或接近最佳的决策树来将样本分类为卵巢癌(恶性)、卵巢癌LMP、良性卵巢疾病或其他恶性病症。于通过CART所产生的多个决策树中的数种对于将卵巢癌(恶性，例如侵略性上皮卵巢癌)与低恶性潜能卵巢癌(相对于良性卵巢疾病)区分具有优异的敏感度及特异性。

也注意到所述决策树的细节，尤其是用于作出分支决策的反折值是依用于产生发现数据组的分析法的细节而定。于实施例中提供用于产生目前分析所使用的数据的所述分析法的数据取得参数。在从例如新颖的样本组或不同分析操作规则中发展分类演算法时，操作者使用一种操作规则，其侦测这些生物标记并键入学习演算法以将他们包含于其中。

此外，卵巢癌状态的诊断试验也包括对本发明任何生物标记与于表2中所识别的任何下列卵巢癌生物标记(包含他们的适当修饰型式)的组合的测量。

表2

标记	注释(于癌症中为上调节或是下调节)
		CTAP3	上调节；9293DIMAC-Cu 100mM磷酸钠，pH7.0
转铁蛋白	下调节；79kD于装有镍的IMAC蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上侦测WO03/057014
		血红素祖蛋白片段	下调节；9.2kD于装有镍的IMAC蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上侦测WO03/057014
ApoAl	下调节；预测的质量为28078.62D；于IMAC或H50蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上侦测WO2004/013609

转甲状腺素蛋白与转甲状腺素蛋白δN10	下调节；预测的质量分别为13761D与12887D；于Q10蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上侦测WO 2004/013609
		ITIH4内部片段	上调节；于其他的片段间：MNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO：1)、横跨人类间α胰蛋白酶抑制剂氨基酸660-689的片段、重链H4；预测的质量为3273.72D于IMAC蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上侦测WO 2004/013609与WO2005/098447
β2-微球蛋白	上调节；于IMAC-Cu蛋白質晶片(ProteinChip)阵列的11.7KD侦测到2005年6月24日申请的美国临时申请案第60/693,679号
		抗菌多肽及其修饰型式	上调节；于SELDI上侦测-与ITIH4片段共沉淀抗菌多肽-25((SEQ ID NO：2)：DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT抗菌多肽-24((SEQ ID NO：3)：THFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT抗菌多肽-22((SEQ ID NO：3)：FPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT抗菌多肽-20((SEQ ID NO：4)：ICIFCCGCCHRSKCGMCCKT
结合珠蛋白	上调节；于装有铜的IMAC蛋白質晶片(ProteinChip)阵列的11,600D至11,700D侦测到WO 02/100242
		波思塔亭	上调节USP 6,846,642
骨桥素	上调节尿液中-糖基化-US 2005-0009120 A1血清中-US 2005-0214826

嗜酸性粒细胞衍生神经毒素	尿液中上调节。于WCX2蛋白質晶片(ProteinChip)阵列的17.4KDa侦测到糖基化。US 2005-0009120 A1
		瘦素	下调节；US 2005-0214826
催乳素	上调节；US 2005-0214826
		IGF-II	下调节；US 2005-0214826
血红蛋白(α-血红蛋白，β血红蛋白)	上调节；WO 2006-019906
		CA125	上调节

可与本发明生物标记组合的其他生物标记包含但不限定于CTAP3、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂(TATI)、CEA、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、唾液酸TN(Sialyl TN)、半乳糖转移酶、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生长因子受体细胞外区域110kD部分(p110EGFR)、组织激肽释放酶原、例如激肽释放酶6和激肽释放酶10(NES-1)、丝氨酸蛋白水解酶、HE4、肌酸激酶(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、组织肽抗原(TPA)、SMRP、骨桥素及结合珠蛋白、瘦素、催乳素、类胰岛素生长因子I或II。

卵巢癌状态

决定卵巢癌状态典型包含基于诊断试验的结果将个体分类为二种或更多种群组(状态)的其中任一。这里所述的诊断测试可用于数种不同状态数间的分类。

卵巢癌的存在

在一个具体实施例中，本发明提供决定受验者卵巢癌的存在的方法(状态：与低恶性潜能卵巢癌或良性卵巢疾病相对的卵巢癌)。卵巢癌的存在与否是通过测量相关的一种或多种生物标记然后将它们以分类演算法处理或将他们与生物标记的参考量及/或与特定风险程度有关的型态(pattern)比较。

决定发展成疾病的风险

在一个具体实施例中，本发明提供决定受验者发展为疾病的风险的方法。生物标记量或型态以多种风险状态为特征，例如高风险、中度风险或低风险。发展为疾病的风险是通过测量相关的一种或多种生物标记然后再将它们以分类演算法处理或将他们与生物标记的参考量及/或与特定风险程度有关的型态(pattern)比较。

决定疾病的阶段

在一个具体实施例中，本发明提供决定受验者疾病的阶段的方法。疾病的各阶段具有生物标记的特征量或生物标记组(型态)的相对量。疾病的阶段是通过测量相关的一种或多种生物标记然后再将它们以分类演算法或将他们与生物标记的参考量及/或与特定风险程度有关的型态比较。例如，可于卵巢癌及非卵巢癌早期阶段之间或于第I阶段卵巢癌、第II阶段卵巢癌及第III阶段卵巢癌中分类。

决定疾病的进程(增长/舒缓)

在一个具体实施例中，本发明提供决定受验者疾病的进程的方法。疾病进程意指随着时间疾病状态的改变，包含疾病增长(恶化)及疾病舒缓(改善)。随着时间生物标记的量或相对量(例如型态)会改变。因此，这些生物标记的趋势，不论是随着时间增加或减少而朝向疾病或非疾病，其用于指示疾病进程。因此，本方法包含在至少两个不同时间点测量受验者的一种或多种生物标记，例如第一次及第二次，以及比较其量的改变(若有任何改变的话)。基于这些比较决定疾病的进程。

同样地，疾病增长(或舒缓)速率的改变也可通过在不同时间测量生物标记(例如表1的肽生物标记)量，以及计算生物标记水平改变的速率来监控。用于测量疾病状态或疾病增长的速度的能力对于目的为透过治疗来减慢或停止疾病的增长的药物治疗研究来说很重要。

报告状态

本发明的另外具体实施例是关于将分析结果或诊断结果或两者传达给例如技术专家、内科医师或病患。在某些具体实施例中，将使用计算机将分析结果或诊断结果或两者传达给感兴趣的群体，例如内科医师及其病患。在一些具体实施例中，做试验或分析出试验结果所在的国家或管辖区与被传达所述试验结果或诊断结果的国家或管辖区会不同。

在本发明优选的具体实施例中，基于表1、表3或表4的任何一种肽生物标记于测试受验者中差异性存在所做出的诊断结果，一旦被获得后就立即传达给受验者。诊断结果可由受验者的治疗医师传达给受验者。或者，诊断结果可透过邮件发送给测试受验者或透过电话传达给受验者。计算机可用于透过邮件或电话传达诊断结果。在某些具体实施例中，使用为通讯技术的技术人员所熟悉的计算机硬体与软件的组合自动产生并传达含有诊断测试结果的信息给受验者。在美国专利第6,283,761号中描述了一种健康看顾导向的通信系统的实例；然而，本发明并不仅限于利用这种特定通信系统的方法。在本发明的方法的某些具体实施例中，所有或一些方法步骤包含可在不同管辖区(例如国外)进行的样本分析、疾病的诊断以及测试结果或诊断结果的传达。

受验者处理(management)

在定性卵巢癌状态的方法的某些具体实施例中，所述方法进一步包括基于状态处理受验者治疗。这类处理包含于测定卵巢癌状态后医生或临床医生的所采取的动作。例如，若内科医生作出患有卵巢癌诊断，然后可进行某几种治疗的食物疗法，例如处方或投予抗化学治疗剂可。或者，作出卵巢癌LMP或良性卵巢疾病的诊断可进一步测试以决定病患可能患有的特定疾病。此外，若诊断测试在卵巢癌状态给出不确定结果，则需要进行进一步测试。

本发明的另外具体实施例是关于将分析结果或诊断结果或两者传达给例如技术专家、内科医师或病患。在某些具体实施例中，将使用计算机将分析结果或诊断结果或两者传达给感兴趣的群体，例如内科医师及其病患。在一些具体实施例中，做试验或分析出试验结果所在的国家或管辖区与被传达所述试验结果或诊断结果的国家或管辖区会不同。

在本发明优选的具体实施例中，基于表1的任何生物标记是否存在于测试受验者中所做出的诊断结果一旦获得后就立即传达给受验者。诊断结果可通过受验者的治疗医师传达给受验者。或者，诊断结果可透过邮件发送给试验受验者或透过电话传达给受验者。计算机可用于透过邮件或电话传达诊断结果。在某些具体实施例中，使用为通讯技术的技术人员所熟悉的计算机硬体与软件的组合自动产生并传达含有诊断测试结果的信息给受验者。在美国专利第6,283,761号中描述了一种健康看顾导向的通信系统的实例；然而，本发明并不仅限于利用这种特定通信系统的方法。在本发明的方法的某些具体实施例中，所有或一些方法步骤包含可在不同管辖区(例如国外)进行的样本分析、疾病的诊断以及测试结果或诊断结果的传达。

VI.决定医药药品的治疗效果

在另外的具体实施例中，本发明提供决定医药药品的治疗效果的方法。这些方法对执行药物的临床试验以及监控对所述药物病患的增长有用。治疗或临床试验与以特别食物疗法投予药物有关。食物疗法可包含药物的单一剂量或一段时间药物的多个剂量。医生或临床研究人员监控投药过程中药物对病患或受验者的影响。若药物对病症有药理学的作用，则本发明的生物标记的量或相对量(例如型态或图谱)朝非疾病图谱变化。例如，生物标记ApoCI和血红蛋白随着疾病增加，而生物标记M32600则在疾病中减少。因此，可在治疗过程期间密切注意受验者的这些生物标记量的进程。因此，本方法包含在受验者接受药物治疗后测量一种或多种生物标记，并关联生物标记量与受验者的疾病状态。本发明的一个具体实施例包含在药物治疗期间的至少两个不同时间点，例如第一次及第二次，决定生物标记的水平，以及比较生物标记的量的变化，若有变化的话。例如，可在药物投予前或药物投予后测量生物标记，或在药物投予期间的两个不同时间点测量生物标记。治疗的效果基于这些比较决定。若治疗是有效的，则生物标记朝向正常，而若治疗是无效的，则生物标记趋势为朝向疾病病症。若治疗是有效的，则生物标记朝向正常，而若治疗是无效的，则生物标记趋势为朝向疾病病症。

VII.产生用于定性卵巢癌状态的分类演算

在一些具体实施例中，由使用例如为「已知样本」的样本所产生的光谱(例如质谱或飞行时间光谱)所衍生的数据，接着可用于「训练」分类模型。「已知样本」是指已事先分类的样本。由所述光谱所衍生且用于形成分类模型的数据称为「训练数据组」。一旦经过训练，则分类模型可辨识由使用未知样本所产生的光谱所衍生来的数据的型态。然后分类模型可用于将未知样本分类。这对于例如，预测特定生物样本是否与某一种生物病症(例如疾病对非疾病)相关时是很有用的。

用于形成分类模型的训练数据组可包括原始数据或预处理数据。在一些具体实施例中，原始数据可直接从飞行时间光谱或质谱得到，然后可如上述般视需要地对其进行「预处理」。

可使用任何适当的统计分类(或「学习」)方法来形成分类模型，其试图基于存在于数据中的客观参数将数据主体分隔成多个类别。分类方法可以是监督式或非监督式。监督式与非监督式分类处理的实例记述于Jain，“Statistical Pattern Recognition：A Review，”IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence，Vol.22，No.1，January 2000，将此技术并入本文参考。

在监督式分类中，提交含有已知分类实例的训练数据于学习机制中，其学习一组或多组定义各已知分类的关系。然后将新数据应用于所述学习机制中，然后所述学习机制使用学到的关系分类那些新数据。监督式分类处理的实例包含线性回归处理(例如多重线性回归(multiple linear regression)(MLR)、部份最小平方回归(partialleast squares regression)(PLS)与主成分回归(principlecomponents regression)(PCR))、二元决策树(例如递归分布处理(recursive portioning process)，诸如CART-分类及回归树)、类神经网路(artificial neural networks)例如倒传递网路(backpropagation networks)、辨别分析(例如贝丝分类器(Bayesianclassifier)或费舍分析(Fisher analysis))、逻辑分类器以及支援向量分类器(support vector classifier)(支援向量机(support vectormachine))。

优选的监督式分类方法是递归分布处理。递归分布处理使用递归分布树来分类由未知样本所衍生的光谱。关于递归分布处理进一步详细内容提供于Paulse等人的美国专利申请案号2002/0138208A1，“Method for analyzing mass spectra”中。

在其他的具体实施例中，所产生的分类模型可使用非监督式学习方法形成。非监督式分类基于训练数据组中的相似性试图学习分类，而无须预先分类光谱，其中训练数据组是由所述光谱衍生而来的。非监督式学习方法包含集群分析。集群分析试图将数据分成「群集」或群组，其理想上应有彼此非常相似的成员而所述成员又对其它集群的成员为非常不相似。接着使用一些测量数据物件间距离的距离度量来测量相似性，并且将彼此靠近的数据物件集群起来。集群技术包含MacQueen的K-平均值演算法与Kohonen的自我组织映射图(Self-Organizing Map)演算法。

宣称用于分类生物资讯的学习演算已揭示于例如PCT国际公开号WO 01/31580(Barnhill等人，“Methods and devices for identifyingpatterns in biological systems and methods of use thereof”、美国专利申请第20020193950A号(Gavin等人，“Method or analyzingmass spectra”)、美国专利申请号2003 0004402A1(Hitt等人，“Process for discriminating between biological states based onhidden patterns from biological data”)、以及美国专利中请号20030055615A1号(Zhang等人，“Systems and methods for processingbiological expression data”)。

分类模型可在任何适合的数字计算机上形成并使用。适合的数字计算机包含使用任何标准或特殊作业系统，例如以Unix、Windows^TM或Linux^TM为基础的作业系统的微型、迷你或大型计算机。所使用的数字计算机在实体上可能与用于制造兴趣光谱的质谱仪分开，也可能与质谱仪耦合。

根据本发明的具体实施例，训练数据组与分类模型可通过由数字计算机所执行或是使用的计算机编码而具体化。所述计算机编码可存储于任何适当的计算机可读取媒介，其包含光碟或磁碟、棒、卡带等，并能以任何适当计算机编程语言包含C、C⁺⁺、visual basic等编写。

上述的学习演算法对于为了已发现生物标记的发展分类演算法或是对发现卵巢癌的新颖生物标记皆是有用的。依次所述分类演算法通过为单独或组合使用的生物标记提供诊断值(例如反折点)而形成诊断测试的基础。

VIII.使用用于显影的生物标记

非侵入性医药影像技术，例如正电子发射断层成像技术(positronEmission Tomography)(PET)或单电子发射型计算机断层扫描(singlephoton emission computerized tomography)(SPECT)影像技术对于发现癌症、冠状动脉疾病以及脑部疾病尤为有用。PET影像以及SPECT影像可显示器官和组织的化学功能，而其它影像技术，例如X射线、CT和MRI则显示结构。使用PET影像及SPECT影像逐渐成为定性和监控脑部疾病，例如阿兹海莫症(Alzheimer’s disease)的发展的有用方法。在一些例子中，使用PET影像或SPECT影像允许阿兹海莫症在征状开始的数年前被侦测。例如参见Vassaux and Groot-wassink，“In Vivo Noninvasive Imaging for Gene Therapy，”J.Biomedicineand Biotechnology，2：92-101(2003)。

使用不同策略来发展适用在活体内显影于人类脑部的淀粉样沉积。当于AD病患中测试时，已知对抗A-β和肽片段的单株抗体有限地为脑所吸收。迄今用于淀粉样成像的小分子方法是最成功的，例如Nordberg A，Lancet Neurol.，3(9)：519-27(2004)；Kung MP et al，Brain Res.，1025(l-2)：98-105(2004)；Herholz K et al，MoI ImagingBiol，6(4)：239-69(2004)；Neuropsychol Rev.，Zakzanis KK et al，13(1)：1-18(2003)；Herholz K，Ann Nucl Med.，17(2)：79-89(2003)所揭示者。

本文所揭露的肽生物标记、或其片段可用于PET影像及SPECT影像应用的背景。在以适当的示踪剂残基为PET或SPECT成像应用进行修饰后，与淀粉样斑蛋白相互作用的肽生物标记可用于成像阿兹海莫症病患体内淀粉样斑。

反义(antisense)技术可用来侦测转录的表现，所述转录的翻译是相关于本文所识别出的生物标记。例如，使用以适当放射性核素例如^IIIIn标记且耦连到以脑为标的的药物系统而能够穿过生物膜障壁来运输的反义肽核酸(PNA)，已证明其能够使脑癌中的内生性基因表达成像。参见Suzuki et al，Journal of Nuclear Medicine，10：1766-1775(2004)。Suzuki等人利用包括单株抗体的运送系统，所述抗体以位在血脑障壁上的转铁蛋白受体为标的，并促进PNA穿过所述障壁的传输。

IX.物质的组合物

在另外的态样中，此发明提供基于本发明生物标记的物质的组合物。

在一个具体实施例中，本发明以纯化的型式提供本发明的生物标记。纯化的生物标记适用于作为抗原以产生抗体。纯化的生物标记也适用于作为在分析程序中的标准物。如本文所用的，「纯化的生物标记」是从其他蛋白质和肽中，及/或从来自发现生物标记的生物样本的其他材料中所单离的生物标记。生物标记可使用任何本领域已知方法来纯化，包含但不限定于，机械分离(例如离心)、硫酸铵沉淀、透析(包含尺寸排除(size-exclusion)透析)、尺寸排除层析法、亲和层析法、阴离子交换层析法、阳离子交换层析法及金属螯合物层析法。这些方法可以任何适当规模执行于例如色层层析柱中或在生物晶片上。

在另外的具体实施例中，本发明提供视需要为纯化型式的生物特异性捕获试剂，其特异地结合本发明的生物标记。在一个具体实施例中，所述生物特异性捕获试剂为抗体。这类组合物适用在侦测分析中侦测生物标记，例如诊断。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种包括结合本发明生物标记的生物特异性捕获试剂的物品，其中所述试剂固定于固体相上。例如，本发明预期包括小珠、晶片、膜、独块体(monolith)或微量滴定板衍生有生物特异性捕获试剂的装置。这类物品适用于生物标记侦测分析。

在另外的态样中，本发明提供包括结合本发明的生物标记的生物特异性捕获试剂(例如抗体)的组合物，所述组合物视需要地为纯化型式。这类组合物适用于纯化生物标记或是适用于侦测生物标记的分析。

在另外的具体实施例中，本发明提供一种物品，其包含于其上黏附有吸附剂的固体基材，吸附剂例如为层析吸附剂或生物特异性捕获试剂，本发明的生物标记进一步结合至其上。在一个具体实施例中，所述物品为生物晶片或用于质谱法的探针，例如SELDI探针。这类物品适用于纯化生物标记或侦测生物标记。

X.用于侦测卵巢癌的生物标记的试剂盒

在另外的态样中，本发明提供定性卵巢癌状态的试剂盒，所述试剂盒用于侦测根据本发明的生物标记。在一个具体实施例中，试剂盒包括固体载体，例如晶片、微量滴定板或有捕获试剂黏附于其上的小珠或树脂，其中捕获试剂结合本发明的生物标记。因此，例如，本发明的试剂盒可包括SELDI的质谱法探针，例如

阵列。就生物特异性捕获试剂来说，试剂盒可包括一个含有活性表面的固体载体以及一种包括所述生物特异性捕获试剂的容器。

所述试剂盒也包括清洗溶液或制备清洗溶液的说明书，其中捕获试剂与清洗溶液的组合允许为了随后通过例如质谱法的侦测而将一种或多种生物标记捕获在固体载体上，。所述试剂盒可包含多于一种类型的吸附剂，各类型出现在不同固体载体上。

在进一步的具体实施例中，这类试剂盒可包括标签或附加夹页的适当操作参数的说明书。例如，所述说明书可指示消费者关于如何收集样本、如何清洗探针或所能侦测的特定生物标记。

在又一具体实施例中，所述试剂盒可包括一种或多种含有生物标记样本的容器，其可作为校准的标准物。XI.生物标记于卵巢癌筛选分析的应用及治疗卵巢癌的方法

本发明的方法还有其它应用。例如，生物标记可用于筛选调节活体内或活体外生物标记的表达的化合物，这类化合物接着可适用于治疗或阻止病患体内的卵巢癌。在另外的实施例中，生物标记可用于监测对卵巢癌治疗的回应。在又一实施例中，生物标记可用于遗传研究以决定受验者是否有发展成卵巢癌的风险。

因此，例如，本发明的试剂盒可包含具有疏水性能的固体基材，例如蛋白质生物晶片(例如Ciphergen H50蛋白質晶片(ProteinChip)列阵，如蛋白質晶片(ProteinChip)阵列)以及用于清洗基材的醋酸钠缓冲液，也包含说明书，其提供用于测量在晶片上的本发明的生物标记，以及利用这些测量结果来诊断卵巢癌的操作规则。

一开始可透过识别与一种或多种表1、表3及表4所列举的生物标记相互作用的化合物而筛选适用于治疗测试的化合物。例如，筛选过程包含重组表达表1、表3及表4所列举的生物标记、纯化所述生物标记以及将所述生物标记固定于基材上。然后可将测试化合物与所述基材接触，典型在水溶液环境，接着测量所述测试化合物与所述生物标记间的相互作用，例如通过测量作为盐浓度函数的的洗提率。某些蛋白质可能识并裂解一种或多种表1、表3及表4的生物标记，这这种情况下，可通过在标准分析中监控一种或多种生物标记的切割情况，例如通过蛋白质的凝胶电泳法来侦测蛋白质。

在相关的具体实施例中，可测量一种测试化合物其抑制一种或多种表1、表3及表4的生物标记的活性的能力。熟习本领域技术的人员将知道用于测量特定生物标记活性的技术将会依所述生物标记的功能与性质而变化。例如，如果可取得适当的基质以及如果已可很容易地测量基质的浓度或反应产物的出现则可分析生物标记的酶活性。潜在治疗测试化合物抑制或增进给定生物标记的活性的能力可通过测量所述测试化合物存在或不存在下的催化效率而决定。也可测量测试化合物干扰非酶(例如架构)功能或表1、表3及表4的其中一种生物标记的活性的能力。例如，在测试化合物存在或不存下可透过光谱学监控于其中包含表1、表3及表4的一种生物标记的多重蛋白质复合物的自组装。或者，若所述生物标记是转录的非酶增强子，则可通过测量所述测试化合物存在或不存在下活体内或活体外的生物标记倚赖转录水平而识别具有干扰所述生物标记以促进转录的能力的测试化合物。

可将能够调节表1、表3及表4的任何生物标记的测试化合物投予到患有卵巢癌或其它癌症病患或具有发展成为卵巢癌或其它癌症风险的病患。例如，若于活体内特定生物标记的活性阻止卵巢癌蛋白质的堆积，则投予会增加特定生物标记活性的测试化合物将可降低病患卵巢癌的风险。相反，若生物标记的活性增强至少为造成卵巢癌发病的一部分原因，则投予降低特定生物标记活性的测试化合物可降低病患卵巢癌的风险。

在其它态样中，本发明提供一种识别出适用于治疗与钙粒蛋白C的修饰型式的水平的增加有关的失调的化合物的方法，所述失调诸如卵巢癌。例如，在一个具体实施例中，为了找出能催化全长钙粒蛋白C(M10430)裂解成截断型的钙粒蛋白C(M10210)的化合物，可对细胞抽出物或表达库(expression libraries)作筛选。在这类筛选分析的一个具体实施例中，可通过将萤光基团(fluorophore)黏附到钙粒蛋白C上来侦测钙粒蛋白C的裂解，其中当钙粒蛋白未裂解时，萤光基团保持淬火，但当所述蛋白质被裂解后，则其发出萤光。或者，将全长钙粒蛋白C修饰以使得氨基酸x和y之间的醯胺键不可断裂的一种变体可被用于选择性地结合或「捕获」可在活体内的这个位置分割全长钙粒蛋白C的细胞蛋白酶。用于筛选和决定蛋白酶及其目标物的方法在科学性文献中已被完整记录成册，例如Lopez-Ottin等人(NatureReviews，3：509-519(2002))。

在又一具体实施例中，本发明提供用于治疗或减少一种疾病，例如卵巢癌的增进或可能性的方法，所述疾病与截断型钙粒蛋白C水平的升高有关。例如，在一种或多种分割全长钙粒蛋白C的蛋白质被识别后，可筛选组合库以找出具抑制所识别出的蛋白质的分割作用的化合物。用于筛选这类化合物的化学库的方法在本技术领域已为大众所知。例如参见Lopez-Ottin等人(2002)。或者，可基于钙粒蛋白C的架构而聪明地设计抑制性化合物。

在临床标准上，筛选测试化合物包括在受验者曝露于测试化合物的之前与之后，自测试受验者取得样本。可测量并分析样本中表1、表3及表4所列举的一种或多种生物标记的水平，以决定生物标记的水平在曝露于测试化合物后是否有改变。如本文所述，可通过质谱法分析样本，或者可通过本技术领域已知的任何适当手段分析样本。例如，可直接透过西方墨点法而使用特异性结合至生物标记的放射或萤光标识的抗体测量表1、表3及表4所列举的一种或多种生物标记的水平。或者，可测量编码一种或多种所述生物标记的mRNA的水平的变化，并且关联所述变化与投予受验者给定的测试化合物。在进一步的具体实施例中，可使用活体外方法和材料测量一种或多种所述生物标记的表达水平的变化。例如，可将表达或能够表达表1、表3及表4的一种或多种生物标记的人类组织的培养细胞与测试化合物接触。已经过测试化合物治疗的受验者将例行检查由治疗方法产生的任何生理效果。尤其，将评估测试化合物牠们降低受验者疾病可能性的能力。或者，若将测试化合物投予先前被诊断患有卵巢癌的受验者，则对测试化合物筛选其减缓或停止疾病增长的能力。

XII.实施例

实施例1.发现用于卵巢癌的生物标记

样本：

卵巢囊肿液样本是取自美国肯塔基大学(University ofKentucky)。这些样本是从术中病患收集并存于-80℃。样本分布如下：侵略性上皮卵巢癌(OvCa)，12；低恶性潜能卵巢癌(边界疾病)，13；其他恶性病症，6；及良性，39。

样本：血清图谱

使用直接晶片结合程序以及于阴离子交换分级后接着进行晶片结合程序两者来执行卵巢癌图谱化。使用Ciphergen Express软件程式来产生含有欲进行图谱化的样本的随机模板。在冰上解冻样本，加入96孔盘(依照模板的排列)，并在4000rpm离心20分钟。然后将囊肿液分装放到新的96孔盘并存放在-80℃直到使用。血清样本以三重复蛋白質晶片阵列(ProteinChip Array)，在10/06/2004于IMAC-Cu⁺⁺上以及在10/14/2004于Q10上(参见下文操作规则)图谱化。所有重复在同一天制备并于PCS 40000上读取。使用Biomek2000或Tecan Aquarius机器加工样本于阵列上。

直接晶片结合的操作规则：

1.以7.5微升(μl)U9缓冲液将5微升样本变性。

2.在4℃震荡20分钟。

3.加入112.5微升的50mM tris，pH9缓冲液以使最终体积为125微升。

4.将5微升变性后样本施加至所有四种晶片种类。

晶片结合：

IMAC30：以铜耦合的IMAC30蛋白質晶片(ProteinChip)阵列。结合及清洗缓冲液为50mM Tris pH8.0/500mM NaCl。

CM10：结合及清洗缓冲液为100mM醋酸钠pH4.0。

H50：结合及清洗缓冲液为10％乙腈缓冲液。

Q10：结合及清洗缓冲液为50mM tris缓冲液pH8.0。

结合时间：室温下60分钟。

基质为芥子酸(sinapinic acid)。

1.阴离子交换分级操作规则：

缓冲液表列：

1.U9(9M尿素，2％CHAPS，50mM Tris-HCl pH9)

2.U1(1M尿素，0.22％CHAPS，50mM Tris-HCl pH9)。

3.含有0.1％OGP pH9的50mM Tris-HCl(清洗缓冲液1)。

4.含有0.1％OGP pH7的50mM Hepes(清洗缓冲液2)。

5.含有0.1％OGP pH5的100mM醋酸钠(清洗缓冲液3)。

6.含有0.1％OGP pH4的100mM醋酸钠(清洗缓冲液4)。

7.含有0.1％OGP pH3的50mM柠檬酸钠(清洗缓冲液5)。

8.33.3％异丙醇/16.7％乙腈/0.1％三氟乙酸(清洗缓冲液6)。

注记：直到清洗液5用于树脂前不要将清洗液6分装到缓冲液托盘。这样确保挥发性有机溶剂的蒸发将不会造成问题。

材料表列：

滤板

6个v型孔96孔盘，标注F1-F6

A.清洗树脂

以5倍树脂体积(bed volume)的50mM Tris-HCl pH9清洗Hyper Q DF树脂3次来制备树脂。然后以50％悬浮状储存于50mM Tris-HCl中。

B.变性血清蛋白质

在4°将冷冻的血清解冻并以20000g离心10分钟。

分装20微升的血清到96孔盘的各孔。

加入30微升U9于各样本中。

在4°震荡20分钟。

C.平衡树脂

加入180微升(大鼠血清则是加240微升)Hyper Q DF到滤板中的各孔。

过滤缓冲液。

加入200微升U1到各孔。

过滤缓冲液。

加入200微升U1到各孔。

过滤缓冲液。

加入200微升U1到各孔。

过滤缓冲液。

D.以树脂结合血清

从各孔吸取50微升样本至过滤盘的相对应孔中。

加入50微升U1到样本盘的各孔中。

混合五次。

自样本盘的各孔中吸取50微升至过滤盘的相应孔中。

[包含这个步骤是因为以机器吸取时会有死腔量；当自动机器吸取以第一次收集样本时，自动机器将不会收集所有的材料。加入50微升U1并混合允许获得残余材料，并将其加到第1次的50微升中]于4°振荡30分钟。

E.收集分级

放置v型孔的96孔盘F1于过滤盘下方。

将滤液(flow through)收集于盘F1中。

加入100微升清洗缓冲液1到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

将pH9的洗提液收集于盘F1中。

分级1包含滤液及pH9洗提液。

加入100微升清洗缓冲液2到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

放置v型孔96孔盘F2于过滤盘下方。

将分级2收集于盘F2中。

加入100微升清洗缓冲液2到过滤盘的各孔中。

于室温(RT)震荡10分钟。

将分级2的残留物收集于盘F2中。

分级2包含pH7的洗提液。

加入100微升清洗缓冲液3到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

放置v型孔96孔盘F3于过滤盘下方。

将分级3收集于盘F3中。

加入100微升清洗缓冲液3到过滤盘的各孔中。

于室温(RT)震荡10分钟。

将分级3的残留物收集于盘F3中。

分级3包含pH5的洗提液。

加入100微升清洗缓冲液4到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

放置v型孔96孔盘F4于过滤盘下方。

将分级4收集于盘F4中。

加入100微升清洗缓冲液4到过滤盘的各孔中。

于室温(RT)震荡10分钟。

将分级4的残留物收集于盘F4中。

分级4包含pH4的洗提液。

加入100微升清洗缓冲液5到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

放置v型孔96孔盘F5于过滤盘下方。

将分级5收集于盘F5中。

加入100微升清洗缓冲液5到过滤盘的各孔中。

于室温(RT)震荡10分钟。

将分级5的残留物收集于盘F5中。

分级5包含pH3的洗提液。

加入100微升清洗缓冲液6到过滤盘的各孔。

于室温(RT)震荡10分钟。

放置v型孔96孔盘F6于过滤盘下方。

将分级6收集于盘F6中。

加入100微升清洗缓冲液6到过滤盘的各孔中。

于室温(RT)震荡10分钟。

将分级6的残留物收集于盘F6中。

分级6包含有机溶液洗提液。

冷冻这些分级直到进行晶片结合操作规则。

晶片结合操作规则：

缓冲液表列：

IMAC30晶片：

1.100mM磷酸钠+0.5M NaCl pH7.

2.100mM CuSO₄

3.100mM醋酸钠pH4.0

CM10晶片：

1.100mM醋酸钠pH4.0

材料表列：

生物处理器(Bioprocessors)。

IMAC30晶片。

CM10晶片。

放置晶片到生物处理器中。

A.以铜装填IMAC晶片

装填50微升CuSO₄至IMAC3晶片上的各点。

在700rpm离心生物处理器1分钟。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除CuSO₄。

以水润洗。

B.中和IMAC晶片

装填50微升醋酸钠pH4.0至IMAC3晶片上的各点。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除醋酸钠。

以水润洗。

C.平衡晶片

加入150微升适当晶片结合缓冲液到各孔。

对CM10来说，在700rpm离心生物处理器1分钟。

于室温(RT)震荡5分钟。

移除缓冲液。

加入150微升适当缓冲液到各孔。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除缓冲液。

D.结合分级到晶片

加入90微升相应缓冲液到各孔。

加入10微升Q管柱分级。

对CM10来说，在700rpm离心生物处理器1分钟。

于室温(RT)震荡60分钟。

移除样本及缓冲液。

E.清洗晶片

加入150微升相应缓冲液到各孔。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除缓冲液。

加入150微升相应缓冲液到各孔。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除缓冲液。

加入150微升相应缓冲液到各孔。

于室温(RT)震荡5分钟。

震荡后移除缓冲液。

以水润洗2次。

F.加入基质

移除生物处理器顶部及衬垫。

利用抽真空从这些点移除水。

使晶片干燥10分钟。

使用免疫组化笔(pap pen)沿点画圈。

对SPA来说：

加入400微升的50％ACN，0.5％TFA到SPA管。

于室温震荡5分钟。

加入1.0微升到各点。

风干10分钟。

加入1.0微升到各点。

风干。

数据分析：

使用CiphergenExpress获得数据。使用外部校准物进行质量校正，使用外部标准化因子而基于总离子流对强度进行标准化，并进行基线扣除。使用标准为峰需具有信号/杂讯比为3∶1及以出现于20％光谱中而在CiphergenExpress中执行峰的侦测。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)(用于二组别，例如良性对卵巢癌)或克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)(用于多组别的比较，例如对良性卵巢疾病、对卵巢癌、对带有低恶性潜能卵巢癌(LMP)的卵巢癌与对其他恶性病症(例如除侵略性上皮卵巢癌外的恶性肿瘤，包含转移性癌症(例如胃癌经常转移至卵巢)、间皮瘤、基质卵巢癌等等))。

结果/结论：

使用克鲁斯凯-沃利斯检验进行四种状况比较。这四组为良性卵巢疾病、侵略性上皮卵巢癌、边界卵巢癌(亦称为带有低恶性潜能卵巢癌)及其他恶性肿瘤(包含胃卵巢癌、转移性疾病及子宫癌)。

使用上表1中所提的方法来识别用于卵巢囊肿液中的卵巢癌的生物标记。最值得注意的是，基于疾病的恶性肿瘤(或非恶性肿瘤)特征已决定大多数显著的峰为相似地上调节或下调节。良性疾病及低恶性潜能卵巢癌(也称为边界疾病)倾向具有相同的峰强度分布，而侵略性上皮卵巢癌及其他恶性疾病则倾向具有相同的峰强度分布。本发明的这些生物标记可单独使用或与先前已被识别为对卵巢癌重要的生物标记的其他蛋白质一起使用。

实施例2  标记纯化及ID

使用多种层析技术的组合来纯化生物标记，所述技术利用一系列Biosepra吸附剂并典型接着进行SDS-PAGE。纯化方案是使用蛋白質晶片读取器(ProteinChip Reader)追踪兴趣生物标记来监控。对小于30kDa的蛋白质，从凝胶提取感兴趣完整带并使用蛋白質晶片读取器(ProteinChip Reader)再次分析以确定他们确切的质量与原始生物标记相匹配。经凝胶中提取出的蛋白质以胰蛋白酶在溶液中切割，而大于30kDa的蛋白质则在凝胶中切割。胰蛋白的切割物是使用蛋白質晶片读取器(ProteinChip Reader)的肽图谱以及使用装有PCI-1000蛋白質晶片界面(ProteinChip Interface)的Q-STAR(使用的生物系统)仪器的串联MS来分析。小于4kDa的生物标记通过多种色层技术的组合将其浓缩及在不经SDS-PAGE纯化及/或胰蛋白酶消化下以串联MS直接识别。在一些情况下(例如溶菌酶C)生物标记是使用抗体来识别。

先前段落所述的技术允许识别表1的生物标记。

实施例3  生物标记的发现

方法

蛋白质表达谱通过对从74位患有卵巢肿瘤(16位恶性、13位低恶性潜能、45位良性)的病患取得的卵巢囊肿液使用ProteinChip(Ciphergen Biosystems)(一种表面强化激光解吸/电离时间飞行质谱仪平台)而实施。对未分级卵巢囊肿液进行分析，另外也对进行阴离子交换分级后的卵巢囊肿液进行分析。在NP20、MAC30、CM10、H50和Q10蛋白質晶片(ProteinChip)阵列上以二重复分析每一分级的分装物。

软件是用来识别m/z峰及比较诊断组别间的峰强度。诊断组别间峰强度的统计显著差异是通过克鲁斯凯-沃利斯检验和ROC曲线分析来决定。

结果

超过100个卵巢囊肿液的蛋白质峰在良性、恶性、及低恶性潜能卵巢癌间峰强度具显著差异(参见下表2及表3)。在这些囊肿液蛋白质中，已通过MS/MS或免疫分析确认与MS/MS识别出下列这些：载脂蛋白CI(m/z＝6520，p＝0.0003)、载脂蛋白AII(m/z＝8690，p＝0.00006)及载脂蛋白CII(m/z＝8918，p＝0.0002)；钙粒蛋白A(m/z＝10840，p＝0.00001)及钙粒蛋白C(m/z＝10430，p＝0.00004)；转甲状腺素蛋白(双电荷)(m/z＝6880，p＝0.00005)；及钙周期蛋白(m/z＝10210，p＝0.00002)。

表3

来自个别病患以阴离子交换分级后的囊肿液于CM10蛋白质晶片(ProteinChip)阵列吸附并在高激光强度读取的SELDI-TOF MS分析，已识别出在患有良性及低恶性潜能卵巢癌相对于恶性上皮卵巢肿瘤病患间不同的35个生物标记。显示克鲁斯凯-沃利斯P值及ROC分析中的AUC值。

表4

来自个别病患以阴离子交换分级后的囊肿液于CM10蛋白质晶片(ProteinChip)阵列吸附并在低激光强度读取的SELDI-TOF MS分析，已识别出在患有良性及低恶性潜能卵巢癌相对于恶性上皮卵巢肿瘤病患间不同的28个生物标记。显示克鲁斯凯-沃利斯P值及ROG分析中的AUC值。

结论

卵巢囊肿液是卵巢癌的诊断性蛋白质生物标记的丰富来源。这些生物标记蛋白质中的某些为急性期反应物。如本文所证实，囊肿液蛋白质是适用于卵巢癌诊断测试的良好生物标记的来源。

皆了解本文所述的实施例及具体实施例的目的只是为了举例，且对于任何熟知本领域技艺的人来说，根据本发明的揭示，对本发明进行的各式修饰或改变将视为已建议，其应涵盖于如下列所提权利要求书以及本发明范畴及精神内。本申请中所引用的所有公开本、专利及专利申请案是以牠们的完整内容并入本案作为参考。

Claims (68)

1. 一种定性受验者卵巢癌状态的方法，包括：

(a)测量来自受验者的样本中的至少一种生物标记，其中所述的至少一种生物标记选自由表1、表3及表4所组成的群组；及

(b)关联测量结果与卵巢癌状态。

2. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

3. 如权利要求1所述的方法，包括测量各种ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

4. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

5. 如权利要求1所述的方法，包括测量各种ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

6. 如权利要求1所述的方法，进一步包括测量CA125。

7. 如权利要求2所述的方法，进一步包括测量及关联至少一种选自下列群组所组成的生物标记：CA125、转铁蛋白、结合珠蛋白、ApoAl、转甲状腺素蛋白、ITIH4内部片段、β2-微球蛋白、抗菌多肽(hepcidin)、波思塔亭(prostatin)、骨桥素、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素、瘦素、催乳素、IGF-II、血红蛋白及其修饰型式。

8. 如权利要求2所述的方法，进一步包括测量及关联至少一种选自下列群组所组成的生物标记：CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、肿瘤相关胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、唾液酸TN(Sialyl TN)、半乳糖转化酶、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生长因子受体细胞外区域110kD部分(p110EGFR)、组织激肽释放酶原，例如激肽释放酶6和激肽释放酶10(NES-1)、丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶B(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、组织肽抗原(TPA)、SMRP、骨桥素和结合珠蛋白、瘦素、催乳素、类胰岛素生长因子I及类胰岛素生长因子II。

9. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标记是通过在SELDI探针的吸附剂表面上捕获所述生物标记及通过激光解吸-电离质谱仪侦测所获补的生物标记而测量。

10. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标记是通过免疫分析法测量。

11. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样本为卵巢囊肿液。

12. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中是通过软件分类演算法进行所述关联。

13. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中卵巢癌状态选自良性卵巢疾病、低恶性潜能卵巢癌、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症。

14. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中卵巢癌状态选自良性卵巢疾病及与卵巢癌(恶性)及其他恶性病症相对的低恶性潜能卵巢癌。

15. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中卵巢癌状态是选自与良性卵巢疾病相对的低恶性潜能卵巢癌、卵巢癌(恶性)及其他恶性病症。

16. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述的卵巢癌状态排除良性卵巢疾病的可能性。

17. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述的卵巢癌状态排除卵巢癌(恶性)及其他恶性病症的可能性。

18. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括：(c)基于所述状态处理受验者治疗。

19. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括：(c)将所述状态告知所述受验者。

20. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括：(c)在有形的媒介上记录所述状态。

21. 如权利要求9所述的方法，其中所述吸附剂为选自下述所组成群组的成员：疏水性吸附剂、阴离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。

22. 如权利要求9所述的方法，其中所述的吸附剂为阳离子交换吸附剂。

23. 如权利要求18所述的方法，其中，若所述测量与卵巢癌为关联，则处理受验者治疗包括投予化学治疗剂到所述受验者。

24. 如权利要求18所述的方法，进一步包括：(d)在受验者处理后测量至少一种生物标记及关联所述测量与疾病发展。

25. 一种包括测量来自受验者样本中的至少一种生物标记的方法，其中所述至少一种生物标记选自表1、表3及表4所组成的群组。

26. 一种决定卵巢癌过程的方法，包括：

(a)第一次测量来自受验者的生物样本的至少一种生物标记，其中，所述至少一种生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组；

(b)第二次测量来自受验者的生物样本的至少一种生物标记；及

(c)比较所述第一次测量与第二次测量；其中，所比较的测量决定卵巢癌的过程。

27. 如权利要求26所述的方法，其中所述至少一种生物标记为选自下列所组成的群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

28. 如权利要求26所述的方法，进一步包括测量各种下列生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

29. 如权利要求26所述的方法，其中所述至少一种生物标记为选自下列所组成的群组：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

30. 如权利要求26所述的方法，进一步包括测量各种下列生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

31. 如权利要求26所述的方法，进一步包括测量CA125。

32. 一种包括选自表1、表3及表4的生物标记的纯化的生物分子的组合物。

33. 一种包括生物特异性捕获试剂的组合物，所述生物特异性捕获试剂特异性结合选自表1、表3及表4的生物分子。

34. 如权利要求33所述的组合物，其中所述生物特异性捕获试剂为抗体。

35. 如权利要求33所述的组合物，其中所述生物特异性捕获试剂结合至固体载体。

36. 一种包括生物特异性捕获试剂的组合物，所述生物特异性捕获试剂结合至表1、表3及表4的生物标记。

37. 一种试剂盒，包括：

(a)固体载体，包括附着至其上的至少一种捕获试剂，其中所述捕获试剂结合选自表1、表3及表4的生物标记所组成的第一群组的至少一种生物标记；及

(b)使用所述固体载体来侦测表1、表3及表4的生物标记的说明书。

38. 如权利要求37所述的试剂盒，其包括使用所述固体载体来侦测一种生物标记的说明书，所述生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

39. 如权利要求37所述的试剂盒，其包括使用所述固体载体来侦测各种生物标记的说明书，所述各种生物标记为：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

40. 如权利要求37所述的试剂盒，其包括使用所述固体载体来侦测一种生物标记的说明书，所述生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

41. 如权利要求37所述的试剂盒，其包括使用所述固体载体来侦测各种生物标记的说明书，所述各种生物标记为：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

42. 如权利要求39所述的试剂盒，进一步包括使用所述固体载体来侦测CA125的说明书。

43. 如权利要求37、38或39中任一项所述的试剂盒，其中所述固体载体包括为SELDI探针的捕获试剂。

44. 如权利要求37、38或39中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获试剂为疏水性吸附剂、阴离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。

45. 如权利要求37、38或39中任一项所述的试剂盒，额外地包括：(c)一种容器，所述容器含有至少一种表1、表3及表4的生物标记。

46. 如权利要求37、38或39中任一项所述的试剂盒，额外地包括：(c)阳离子交换层析吸附剂。

47. 一种试剂盒，包括：

(a)固体载体，包括附着于其上的至少一种捕获试剂，其中，所述捕获试剂结合选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组的至少一种生物标记；及

(b)含有至少一种所述生物标记的容器。

48. 如权利要求47所述的试剂盒，其中所述容器包含至少一种选自下列所组成的群组的生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

49. 如权利要求47所述的试剂盒，其中所述容器包含各种下列生物标记：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

50. 如权利要求47所述的试剂盒，其中所述容器包含至少一种选自下列所组成的群组的生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

51. 如权利要求47所述的试剂盒，其中所述容器包含各种下列生物标记：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

52. 如权利要求49所述的试剂盒，其中所述容器进一步包含CA125。

53. 如权利要求47、48或49中任一项所述的试剂盒，其中所述固体载体包括为SELDI探针的捕获试剂。

54. 如权利要求47、48或49中任一项所述的试剂盒，额外地包括：(c)阳离子交换层析吸附剂。

55. 如权利要求47、48或49中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获试剂为选自下述所组成的群组的成员：疏水性吸附剂、阴离子交换吸附剂、阳离子交换吸附剂及金属螯合物吸附剂。

56. 一种软件产品，包括：

a.存取隶属于样本数据的编码，所述数据包括于所述样本中的至少一种生物标记的测量结果，所述生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组；及

b.进行分类演算的编码，其将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为所述测量结果的函数。

57. 如权利要求56所述的软件产品，其中所述分类演算将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为一种生物标记的测量结果的函数，所述生物标记选自下列所组成的群组：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

58. 如权利要求56所述的软件产品，其中所述分类演算将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为各种生物标记的测量结果的函数，所述各种生物标记为：ApoCl、血红蛋白α/β、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白C、钙粒蛋白C(截断型)、钙粒蛋白A及IgG重链。

59. 如权利要求56所述的软件产品，其中所述分类演算将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为一种生物标记的测量结果的函数，所述生物标记选自下列所组成的群组：：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

60. 如权利要求56所述的软件产品，其中所述分类演算将所述样本的所述卵巢癌状态分类成为各种生物标记的测量结果的函数，所述各种生物标记选为：ApoCl、ApoAII、ApoCII、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、钙周期蛋白及转甲状腺素蛋白。

61. 如权利要求58所述的软件产品，其中所述分类演算将样本的卵巢癌状态分类成为CA125的测量结果的函数。

62. 一种包括通过质谱法或免疫分析来侦测表1、表3及表4的一种生物标记的方法。

63. 一种包括将有关卵巢癌状态的诊断结果传达至受验者的方法，其中，所述卵巢癌状态是通过来自所述受验者的样本的生物标记的关联性而决定的，且所述生物标记选自表1、表3及表4的生物标记所组成的群组。

64. 如权利要求63所述的方法，其中所述诊断结果是透过计算机生成的媒介传达至所述受验者。

65. 一种用于识别与表1、表3及表4的生物标记相互作用的化合物的方法，其中，所述方法包括：

a)将表1、表3及表4的生物标记与测试化合物接触；及

b)决定所述测试化合物是否与表1、表3及表4的生物标记相互作用。

66. 一种用于调节细胞中钙粒蛋白C的浓度的方法，其中所述方法包括：

a)将所述细胞与抑制剂接触，其中所述抑制剂阻止钙粒蛋白C裂解。

67. 一种治疗受验者病症的方法，其中所述方法包括：

投予受验者治疗上有效量的钙粒蛋白C的抑制剂，其中所述抑制剂阻止钙粒蛋白C裂解。

68. 如权利要求67所述的方法，其中所述病症为卵巢癌。