CN101246159A - 一种快速鉴别周围神经束性质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别周围神经束性质的方法，步骤为：①切取一段长度小于等于2mm的新鲜神经，放入浓度大于等于90％的乙醇中浸泡10～20分钟，然后放入浓度为20～40％的蔗糖溶液中浸泡10－20分钟；②在－20～－40℃的条件下，在冰冻切片机上切片，切片厚度为20～50μm；③利用相干成像的方法，对切片样品的三维结构做相干成像，根据成像样品的三维投影特征来进行神经束性质的判定，其中交错的条纹所占面积比例70～100％的神经束为运动神经束，否则为感觉神经束。本发明方法具有实验过程简单、制备时间短、能够直接显示神经束性质、识别率好的鉴别周围神经束性质的方法。

Description

一种快速鉴别周围神经束性质的方法

技术领域

本发明属于神经显微外科领域，具体涉及一种非染色标记、快速识别周围神经束性质的方法，它适用于神经断裂再接、神经移植等领域。

背景技术

周围神经中含有运动和感觉两种神经纤维成分。在神经移植和周围神经损伤后的神经修复中，难点之一是不能正确分辨出神经束的性质，由于不能实现两断端相同性质神经束正确缝合，严重影响了患者的神经功能恢复，手术的效果很差；若能实现神经两断端感觉束对感觉束、运动束对运动束正确吻合，将极大提高神经功能恢复率。因此术中如何快速准确地鉴别周围神经运动束和感觉束，成为当今显微外科研究中极其关注的难题。

(一)解剖组织学形态定位法

Bardeen(1906)最早观察了闭孔神经和坐骨神经的神经束性质，后来Sunerland等(1945)用组织学方法对人体主要神经干作了连续切片观察，钟世镇等(1980)用醋酸浸泡法在手术显微镜下分离追踪观察了成人尸体的神经束和束组。对于干内运动、感觉束的分布进行了规律性的描述，并绘制出四肢主要神经干断面功能束或束组的局部定位图，韩震等(1986)用自然分束分离法进行简易的功能束组定位。1991年Watchmake用计算机系统对神经分布做出分析并绘制出更加精确的图谱。但是，此方法在临床中由于创伤后出血、神经断裂后位置扭转及解剖位置变异等原因无法根据图谱来定位，在实际应用中有很大限制。

解剖形态图法是最早的一种神经功能束定位方法，但神经束位置常受外伤扭转、个体差异、肢体长短等因素影响，因而不能准确区别对合；而本方法不受个体差异性影响，可以直接显示出神经束性质的差异性；

(二)电生理方法

该方法是应用神经电生理传导的原理，对神经纤维进行电刺激，通过效应器官的反应来鉴别神经束的性质。Sunderland(1978年)指出，电刺激只可针对在神经断伤后的新鲜样本，损伤部位应是相对接近远端；其次整个过程需要病人配合，只能在局麻下进行；且刺激有时不能产生一个明确的感觉，偶然还会产生感觉异常。

电生理法需病人保持清醒，且对超过三天的陈旧性损伤无反应，亦不能准确区别功能束，因此近年来已很少应用于临床；本方法因为不需要神经反射活动，完全不受病人身体情况的影响，能够客观、快速、直接的显示出周围神经束的性质。

(三)酶组织化学法

1.乙酰胆碱脂酶组织化学法

乙酰胆碱脂酶(AchE)在周围神经中含量较高，尤其是在胆碱能神经。已知躯体运动神经，全部副交感神经和小部分交感神经节后纤维都属胆碱能神经。因此运动神经纤维中AchE远高于感觉纤维，通过AchE组织化学法来鉴别周围神经运动束与感觉束是可行的。虽然AchE组化法可大概区别两种神经纤维，但在临床上由于受损神经远端的华勒氏溃变(Walleriandegeneration)，AchE含量及活力降低而影响组化染色，只能对新鲜的或近期的损伤进行区别，因而临床难以推广。该方法对于陈旧性损伤往往难于鉴别。

2.碳酸酐酶(CA)法

该法是利用组织化学方法显示其活性差异，以区别周围神经功能束的方法。Riely在1984年用此法对大鼠脊神经进行研究时发现，在感觉神经轴突明显着色而运动神经纤维轴突不着色，仅髓鞘染色，整个操作时间3h。也有学者报道利用乙酰胆碱脂酶法和碳酸酐酶同时对神经束进行染色，效果优于以往的单一的一种方法。但是酶组化法共有的缺点，即仅对新鲜损伤效果较好，染色时间较长，限制了临床进一步应用。

用酶组织化学法区别感觉与运动神经束，只能对新鲜的或近期的损伤进行区别，需要染色标记，需时较长、特异性较差，而且不同受伤程度神经酶活性的影响较大；本方法过程简单，不需要进行任何染色操作，时间短(仅15分钟)，分辨性好，不受酶活性的影响，而通常的酶组织化学方法需要几个小时；

(四)放射生物化学方法

通过测量酶催化底物所产生的产物，来进行酶活性测定的生化方法就是放射生物化学法。如果将底物用放射性同位素标记，则酶活性可根据酶反应所产生的放射性产物来测定。AchE和胆碱乙酰转移酶(ChAT)在运动纤维中活性比感觉纤维中要大，故二者均可用放射化学方法测定鉴别运动束和感觉束。这种方法从取材到结果需70-80min，但是只对新鲜损伤有效，对于陈旧性损伤常因酶活性下降效果欠佳。同时由于ChAT放射化学技术要求高，代价大，故临床应用有一定困难。

放射生物化学方法同样只对新鲜损伤有效，并且技术要求高，代价大，临床应用价值较小；本方法整个实验过程简单实用，使用的均为医院常规仪器，成本低，不需额外投入。

(五)免疫学方法

该法鉴别神经束性质的原理是通过分离提取神经组织中感觉或运动神经元特异性抗原，制备特异性抗体，通过特异性的抗原抗体反应，利用免疫细胞化学技术，来分辨周围神经中的运动与感觉神经纤维。该方法需要提取特异性的物质，并且需要染色标记，区分神经束时缺乏特异性的依据。

免疫学方法虽较以上几种方法先进，由于需要组织浸泡固定、染色及显微镜下观察与分析，过程繁琐，缺少可靠的特异性依据，，由于需要染色过程，免疫学方法与本方法相比时间花费较长，几个小时的组织染色耗时太久，会给病人带来较大痛苦，而且由于标记物特异性差异的原因，识别效果不好。

(六)近红外光谱分析方法

该方法采用近红外光谱分析技术对于神经递质的纯品进行扫描(专利申请号：200510038492.4)，然后扫描大量的神经束样品，将神经束波谱与纯品波谱进行主因子和聚类分析，建立模型来识别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴别周围神经束性质的方法，该方法不需要染色，过程简单，时间短，能直接地显示神经束的性质，不受损伤后周围神经内酶活性的影响，不受个体差异的干扰。

本发明提供的快速鉴别周围神经束性质的方法，其步骤包括：

(1)切取一段长度小于等于2mm的新鲜神经，放入浓度大于等于90％的乙醇中浸泡10～20分钟，然后放入浓度为20％～40％的蔗糖溶液中浸泡10-20分钟；

(2)在-20℃～-40℃的条件下，在冰冻切片机上切片，切片厚度为20～50μm；

(3)利用相干成像的方法，对切片样品的三维结构做相干成像，根据成像样品的三维投影特征来进行神经束性质的判定，其中交错的条纹所占面积比例为70％～100％的神经束为运动神经束，否则为感觉神经束。

作为本发明的一个优选方案，步骤(1)中，乙醇的浓度为95％，浸泡时间为15分钟。

作为本发明的另一个优选方案，步骤(2)中，切片温度为-20℃，切片厚度为40μm。

与现有技术相比，本发明方法是目前实验过程简单、制备时间短、能够直接显示神经束性质、识别率好的鉴别周围神经束性质的方法。相比以前长达几小时甚至几天的染色鉴别过程，我们的制备方法只需20min，大大缩短了手术和实验的进程，而干涉成像方法的应用让我们能够直接显示周围神经束的性质，鉴别出运动神经束和感觉神经束，从而实现运动束对运动束，感觉束对感觉束的正确对位缝合。由于新方法的采用，比起以前繁琐的浸泡固定、染色、脱水等步骤，整个鉴别周围神经束的过程变得极其简单。另外，此鉴定方法不需要特殊仪器，可以快速应用于临床，大大缩短神经断裂缝合和神经移植的时间，减少病人的痛苦和医生的手术时间；探求一种快速、有效而又简便的方法来鉴别周围神经束性质，使相同功能的神经束能配对吻合，提高神经修复的效率，一直是显微外科医生面临的难题。而本方法很好的解决了这个难题，极大的提高了神经修复的疗效。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的说明。

实例1：

病人甲由于意外事故上臂严重损伤，两端的神经已经断裂，必须要手术进行功能性缝合。但是在损伤的过程中，由于外力的挤压作用，运动和感觉神经束在上臂原本的位置都发生了改变，已经无法根据解剖图谱的方法来对位缝合；而且考虑到受伤时间离现在较长，酶活性影响较大，不太适合进行酶组织化学和免疫学等染色标记的方法，故采用本发明的方法：

(1)先用刀片切除神经断端神经瘤，然后用印度墨汁在神经外膜上作出方位标记，便于在区分出神经束的性质后进行功能对位；

(2)切取2mm长度的一段神经，放95％乙醇中浸泡固定15分钟；然后放入浓度30％的蔗糖溶液中浸泡15分钟；

(3)取出样品，在-20℃的温度条件下，在冰冻切片机上切片，切片厚度40μm；

(4)将切片封片，在干涉显微镜下观察；

其中交错的条纹所占面积比例70％～100％的神经束为运动神经束，否则为感觉神经束。根据先前的方位标记来实现运动束对运动束，感觉束对感觉束的准确功能对位。

实例2：

病人乙因为截瘫引起膀胱功能障碍并发症，只有通过马尾神经进行神经功能的再支配，才可以全面的解决膀胱贮尿和排尿功能障碍，而重建这种神经再支配面临着马尾神经性质快速鉴别的难题：如何才能快速区分神经束性质，以达到相同性质神经功能束的吻合。这个难题可以采用本发明的如下方法解决：

(1)切取一段2mm长度的马尾神经，放95％乙醇中浸泡15分钟，然后放入浓度30％的蔗糖溶液中浸泡15分钟；

(2)取出，在-20℃的温度条件下，在冰冻切片机上切片，切片厚度40μm；

(3)在实验中我们用干涉显微镜观察不同厚度的切片的三维投影图；

(4)将切片封片，在干涉显微镜下观察；

其中交错的条纹所占面积比例70％～100％的马尾神经为运动神经，否则为感觉神经。鉴别出马尾神经的性质后，就可以顺利的进行下一步的手术，重建自控性的膀胱神经再支配，恢复膀胱的功能。

Claims (3)

1、一种快速鉴别周围神经束性质的方法，包括以下步骤：

(1)切取一段长度小于等于2mm的新鲜神经，放入浓度大于等于90％的乙醇中浸泡10～20分钟，然后放入浓度为20％～40％的蔗糖溶液中浸泡10-20分钟；

(2)在-20℃～-40℃的条件下，在冰冻切片机上切片，切片厚度为20～50μm；

(3)利用相干成像的方法，对切片样品的三维结构做相干成像，根据成像样品的三维投影特征来进行神经束性质的判定，其中交错的条纹所占面积比例为70％～100％的神经束为运动神经束，否则为感觉神经束。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，乙醇的浓度为95％，蔗糖的浓度为30％，浸泡时间均为15分钟。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，切片温度为-20℃，切片厚度为40μm。