CN101240275A

CN101240275A - 核苷酸分子septin1sr2及其在制备免疫制剂中的应用

Info

Publication number: CN101240275A
Application number: CNA2007100371904A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 余文博; 唐丽莎; 丁向明
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2008-08-13

Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了一种核苷酸分子，即SEPTIN1SR2，本发明还提供了该核酸分子在制备免疫制剂中的应用。本发明的核苷酸序列包括：序列包括：GGAAGAGGAGAUCCACAUC、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC。本发明的SEPTIN1SR1可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。将SEPTIN1SR2用于自身免疫性疾病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、缩短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。

Description

核苷酸分子SEPTIN1SR2及其在制备免疫制剂中的应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，提供了一种核苷酸分子，即SEPTIN1SR2，本发明还提供了该核酸分子在制备免疫制剂中的应用。

背景技术

Septin是一个GTP酶家族，最早是在Saccharomyces cerevisiae酵母中被鉴定的。Septin的功能研究主要有两方面：首先是Septin蛋白形成10nm直径的颈丝环绕胞浆膜内侧的母芽颈一周，作为胞质运动相关蛋白的载物台[Bi，E.，Maddox，P.，Lew，DJ.，etal.(1998)J Cell Biol.142：1301-1312.；Boyne，JR.，Yosuf，HM.，Bieganowski，P.，et al(2000)J Cell Sci 113：4533-4543.]。次之，Septin与极性生长的调节有关[Barral，Y.，Mermall，V.，Mooseker，MS.，et al.(2000).Mol Cell.5，841-851；Takizawa，PA.，Derisi，JL.，Wilhelm，JE.，et al.(2000).Science.290，341-344]。然而，尚未有人报道关于Septin1在制备免疫制剂中的应用。

自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自从Donath与Landsteiner提出此概念以来，许多疾病相继被列为自身免疫性疾病，常见的自身免疫病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能元进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病、慢性肝病，等等。这些病名对许多人来说并不很陌生。这类疾病的治疗有一个共同点，都需要用免疫抑制剂来抑制针对自身机体的免疫反应。最常用的是肾上腺皮质激素类制剂，如：强的松、氢化可的松、地塞米松等，大家往往将其简称“激素”。如果疗效不佳，还可能用环磷酰胺、氨甲喋呤等所谓细胞毒性药物，这些药既可用来抑制免疫，又用于治疗癌症。所有免疫抑制剂有个主要的共同的不良作用，它们会不同程度地影响机体的抗感染、抗肿瘤免疫功能。因此，众多专家一直在研究其他治疗方法。

自身免疫性疾病的发病机制很复杂，但自身反应性T细胞、B细胞的激活，是自身免疫性疾病发病过程中一个必然的环节。因而，许多学者将自身免疫性疾病分为T细胞介导的、自身抗体介导的、及联合介导的自身免疫性疾病三种。B细胞激活后的重要产物——自身抗体已作为诊断自身免疫性疾病的标志物，而目前还没有常规检测自身反应性T细胞的特异性指标。因此，自身免疫性疾病的治疗和相关药物是目前医药界一个重要课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备免疫制剂的核酸分子。

本发明的另一个目的是提供上述核酸分子的应用。

本发明提供了一种用于制备免疫制剂的核酸分子，它的序列包括：GGAAGAGGAGAUCCACAUC、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC。在本发明中被称为SEPTIN1SR2。

在本发明中，术语“核苷酸分子SEPTIN1SR2”指具有抑制SEPTIN1蛋白活性并且含有与GGAAGAGGAGAUCCACAUC、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC序列高度同源的核苷酸序列。该术语还包括与GGAAGAGGAGAUCCACAUC、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括GGAAGAGGAGAUCCACAUC、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在GGAAGAGGAGAUCCACAUC或者GAUGUGGAUCUCCUCUUCC后(3‘端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。

本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括：GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。

本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括：5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3’或者5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’。

本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’或者5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’。

本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。

本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’和5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’ 。

本发明还提供了上述核酸分子的制备方法，即按本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团依次脱水缩合。

本发明还提供了上述核酸分子在制备免疫制剂中的应用。

本发明的SEPTIN1SR2是SEPTIN1蛋白的抑制剂，可以特异性的阻滞淋巴细胞的分裂或促进淋巴细胞其凋亡。

研究表明，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septin1蛋白只在外周血、胸腺和脾脏的淋巴细胞中大量表达，这说明Septin1蛋白主要在淋巴细胞中发挥功能，而不会对其它组织或者细胞起作用。

细胞水平实验显示，以表达正常Septin1的细胞为对照，Septin1S206A(即在Septin1蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A)突变体会使细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；Septin1S206E(即在Septin1蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为E)突变体使G2期细胞大大增加，即促进细胞分裂。这说明Septin1可调控细胞分裂，尤其是206位的丝氨酸残基。这也说明，如果将Septin1蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A、抑制Septin1蛋白活性或者使Septin1蛋白失活，就可以使细胞停止分裂增殖。因而，可以将Septin1蛋白作为药靶，筛选Septin1蛋白的抑制剂和失活剂。一旦筛选到了Septin1蛋白的抑制剂或者失活剂，施用于细胞，就可以使细胞停止分裂。另一方面，一旦筛选到了Septin1蛋白的增强剂，施用于细胞，就可以使细胞加速分裂生长。

综上所述，Septin1可调控细胞分裂，尤其是淋巴细胞的细胞分裂。Septin1的突变体或者抑制剂可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。而本发明的SEPTIN1SR2作为SEPTIN1蛋白的抑制剂，可以特异性的阻滞淋巴细胞的分裂或促进淋巴细胞其凋亡，因而，可以与适当的载体结合制成免疫制剂。

本发明中，所述的免疫制剂可以用于治疗和缓解自身免疫性疾病。

本发明中，所述的自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜和自身免疫性溶血性贫血等。上述疾病的共同点就是自身反应性T细胞、B细胞的激活。本发明的Septin1是淋巴细胞正常生长增殖所必需的。SEPTIN1SR2作为SEPTIN1蛋白的抑制剂，可以使细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；将其施用于上述自身免疫性疾病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，

骨髓移植(Bone marrow transplantation)是各种血液肿瘤、再生不良性贫血症、重度地中海型贫血症以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病救命的根本治疗方法。在骨髓移植手术期间，由于成熟免疫细胞被一率杀灭，患者的免疫力极其低下，需要住在无菌室进行治疗，给患者带来了非常大的痛苦。

SEPTIN1SR2作为SEPTIN1蛋白的抑制剂，可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡，将其用于骨髓移植及其前期准备工作，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、缩短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。

本发明的SEPTIN1基因可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的SEPTIN1基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的SEPTIN1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

在本发明中，术语“SEPTIN1基因”指编码具有SEPTIN1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列号为(NCBI登陆号NM_052838)的序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出神经元分化相关基因SEPTIN1的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与NM_052838开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NM_052838开放阅读框序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码序列号为NP_443070氨基酸序列的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

获得了SEPTIN1基因序列后，就可以将SEPTIN1基因序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。一旦获得了含有SEPTIN1基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。

本发明的SEPTIN1SR2，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

SEPTIN1SR2可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人SEPTIN1可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的SEPTIN1还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的SEPTIN1SR2被用作药物时，可将治疗有效剂量的该抑制剂施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明中，所述的免疫制剂是由含有效治疗量的SEPTIN1SR2和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。

本发明还提供了一种用于治疗自身免疫性疾病的试剂盒。该试剂盒中包括SEPTIN1SR2。

该试剂盒还可含有使用说明、分子标记、将Septin1蛋白的抑制剂引入细胞或者组织所需的其他试剂，例如缓冲液等。

将SEPTIN1SR2引入细胞或者组织，可以将细胞的有丝分裂停滞在S期，即使细胞不分裂，或者使细胞发生凋亡，从而抑制病变的淋巴细胞生长增殖。

本发明的SEPTIN1SR2可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。将SEPTIN1SR2用于自身免疫性疾病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、缩短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。

附图说明

图1为Septin1的组织表达谱图。其中，1为心脏、2为脑、3为胎盘、4为肺、5为肝、6为骨胳肌、7为肾、8为胰腺、9为脾脏、10为胸腺、11为前列腺、12为睾丸、13为卵巢、14为小肠、15为大肠、16为外周血白细胞。

图2为septin1蛋白在17种人类细胞系中的表达情况图。

图3为septin1蛋白与CK2互作IB-免疫印迹杂交试验的结果。

图4为septin1蛋白在Jurkat细胞株的定位结果。

图5为septin1蛋白被CK2体内磷酸化的结果。

图6为septin1蛋白被CK2体外磷酸化的结果。

图7为septin1蛋白在Jurkat细胞株内被SEPTIN1SR抑制的结果。

图8为SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂受PHA浓度影响的结果。

图9为在相同PHA浓度条件下SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂的结果。

图10为空载体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图11-13的空白对照，由流式细胞仪分析而得。

图11为野生型septin1蛋白转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图12-13的对照，由流式细胞仪分析而得。

图12为septin1蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞几乎没有。

图13为septin1蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞明显增加。

图14为Jurkat细胞株中转入对照siRNA的的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。此图为图15的对照。

图15为Jurkat细胞株中转入有效siRNA的的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，如Sambrook等人的《分子克隆》实验室手册(New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或者按照生产商建议的条件进行操作。

实施例1 Septin1的组织中的表达情况

1.1 Northern探针制备

用Clontech Multiple Tissue northen膜检测成人组织中septin1基因的分布情况，所用探针为克隆到的septin1全长开放阅读框(即NCBI登陆号NM 052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。

1)用septin1基因的特异的引物从构建好并已经测序的质粒中扩增得到PCR产物。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后，用GeneQuant II型紫外分光光度计测定纯化后DNA的浓度。

2)DNA模板经100℃热变性2min后，用随机引物标记试剂盒以随机引物标记法掺入【γ-32P】dCTP。标记反应结束后，加入EDTA至终浓度20mmol/L中止反应，100℃热变性5min，置于冰上。

3)将探针用MicroSpin G-25纯化柱纯化。纯化前后分别取样1μl稀释100倍，取3μl稀释液点样在Whatman DE81滤纸上，用Monitor 900型放射性检测仪测定其放射强度(cps)。将纯化后的放射性强度除以纯化前的放射性强度记为掺入率，掺入率大于30％则认为探针制备合格。

1.2 Northen杂交

1)将杂交膜用2×SSC液润湿后将膜带RNA的一面朝上放入杂交管中，每10cm2膜面积加入1ml甲酰胺预杂交液，预杂交液含50％甲酰胺，5×SSPE，10×Denhardt试剂，2％SDS，1000mg/L小牛胸腺DNA。42℃预杂交2-4小时。

2)预杂交结束后，将纯化后的标记探针加入剩余的预杂交液中。42℃杂交48小时。

3)杂交反应结束后，将杂交液弃去，加入杂交洗脱液1(2×SSC，0.05％SDS)室温洗涤3次，每次30min，其间不停晃动膜。然后加入杂交洗脱液2(0.1×SSC，0.1％SDS)，50℃洗涤2次，每次30min。用Monitor900型放射性检测仪测定整张膜上的放射强度。如果背景的放射强度过高，可以适当的提高洗膜温度，再次洗涤。

4)将洗涤完毕的膜放入保鲜袋中封口，进行放射自显影.

结果显示，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septin1的mRNA仅在外周血、胸腺、脾脏等组织中有表达，而且在胸腺中表达量最高。详见图1。

实施例2western-blot分析septin1蛋白在17种人类细胞系中的表达情况

1、17种人类细胞系的培养

所选17种细胞均来自中国科学院细胞库，其组织来源及培养条件如下：

名称	种属	组织来源	培养条件
名称	种属	组织来源	培养条件	HEK293T	人类	胚胎肾	90％DMEM高糖完全培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
HELA	人类	子宫颈	同HEK293T	HEK293T	人类	胚胎肾	90％DMEM高糖完全培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
HELA	人类	子宫颈	同HEK293T	U2OS	人类	肌肉	90％5A培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
PANC	人类	胰腺	同HEK293T	U2OS	人类	肌肉	90％5A培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
PANC	人类	胰腺	同HEK293T	SMMC7721	人类	肝脏	同HEK293T
MCF7	人类	乳腺	同HEK293T	SMMC7721	人类	肝脏	同HEK293T
MCF7	人类	乳腺	同HEK293T	H1299	人类	肺	90％RPMI1640培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
ECV	人类	血管内皮	同HEK293T	H1299	人类	肺	90％RPMI1640培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂
ECV	人类	血管内皮	同HEK293T	PC12	人类	神经元	80％RPMI1640完全培养基，15％马血清，5％胎牛血清，37℃，5％CO₂
Jurkat	人类	T细胞	90％RPMI1640培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂	PC12	人类	神经元	80％RPMI1640完全培养基，15％马血清，5％胎牛血清，37℃，5％CO₂
Jurkat	人类	T细胞	90％RPMI1640培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂	EB-3	人类	B细胞	同Jurkat
RPMI8226	人类	骨髓	同Jurkat	EB-3	人类	B细胞	同Jurkat
RPMI8226	人类	骨髓	同Jurkat	NB-4	人类	粒细胞	同Jurkat
U937	人类	组织淋巴结	同Jurkat	NB-4	人类	粒细胞	同Jurkat
U937	人类	组织淋巴结	同Jurkat	Thp-1	人类	单核细胞	同Jurkat
K562	人类	成红细胞组细胞	同Jurkat	Thp-1	人类	单核细胞	同Jurkat
K562	人类	成红细胞组细胞	同Jurkat	6T-CEM	人类	T细胞	90％αMEM培养基，10％胎牛血清，37

℃，5％CO₂

2.Western印迹检测septin1蛋白的表达水平

(1)分别收获17种细胞各约10⁶个，加入500μl细胞裂解液，振荡混匀后4℃孵育30min。12000rpm/min离心15分钟，取上清。

(2)分别取每种上清10μl进行SDS-PAGE电泳。

(3)用BIORAD转移系统，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜上，冰浴中转移2hr，电压为100V。置于丽春红染色液中5～10min，水洗去染料，标记蛋白标准分子量条带。

(4)封闭：将膜放置于30ml封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡1hr。

(5)一抗反应：按推荐的稀释比加入septin1特异性抗体(购于SANTA CRUZ公司)，将膜浸于稀释好的一抗中，室温下摇床孵育2hr；用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min；

(6)二抗反应：按1∶1,0000的稀释比加入HRP耦联的抗羊抗体，将膜浸于稀释好的二抗中，室温下摇床孵育1hr；用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min。

(7)ECL发光反应：把膜用三倍稀释或不稀释的ECL发光试剂显影曝光。

结果显示，Septin1主要在T细胞(Jurkat，ATCC；6T-CEM，购自中国科学院生命科学学院)和B细胞(EB-3，ATCC)中表达。

实施例3 Septin1在Jurkat细胞中的定位

本发明中，首先将全长septin1的cDNA构建入Ds-Red-C1荧光表达载体。将所得的RFP-septin1重组子转染入Jurkat细胞中，培养48小时，经过固定处理后，激光共聚焦显微镜下观察。具体步骤如下：

(1)收取悬浮培养的Jurkat细胞，充分打散后滴加在涂有多聚赖氨酸的载波片上，静置5min后置于4％的多聚甲醛中室温固定10min(分钟)。

(2)PBS洗三遍，于0.2％Triton X-100中室温打孔15min。

(3)PBS洗三遍，于含有10％马血清、1％BSA的TBS中室温封闭1hr(小时)。

(4)TTBS洗一遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的一抗(抗septin1抗体，1∶20)，37℃孵育2hr。

(5)TTBS洗三遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的二抗(Rhodamine-抗羊，1∶100)，37℃孵育1hr。

(6)TTBS洗三遍，于1μg/μl DAPI溶液中37℃染色20min。

(7)TTBS洗三遍，封片，上荧光显微镜观察。

结果显示，发现septin1呈细胞质分布(如图4)，且其分布具有一定的极性，另外，其分布随细胞周期的变化有所不同，在细胞分裂的全过程中，septin1极有可能在纺锤体两极的中心粒周围分布，在中期以后，septin1还会在两细胞分裂沟处聚集。

实施例4 pull-down检测septin1蛋白与CK2激酶的互作

1、将瞬时转染有PCMV-Myc-CK2α的细胞裂解液(细胞数5×10⁶)与50μl 50％的谷胱甘肽琼脂糖珠和20μg的GST在摇床上4℃孵育2h.

2、4℃，2000rpm离心2分钟。

3、将上清转移到新的离心管中，分为两等份，各加入50μl谷胱甘肽琼脂糖珠，其中一管加入10μg的GST蛋白，另一管加入10μg的GST-septin1融合蛋白，4℃摇床孵育2小时。

4、2000rpm离心2分钟，上清取到新的离心管中，4℃保存，以备后用。

5、用1ml冰浴的裂解缓冲液(20mMTris-cl pH8.0，500mMNaCl，1mM EDTA，1％NP-40)洗珠子，2000rpm离心1分钟，弃上清，再重复洗3次。

6、用20μl 20mM的还原谷胱甘肽(在50mM的Tris-Cl pH8.0的缓冲液中)从珠子上洗脱GST融合蛋白和与它结合的蛋白。2000rpm离心2分钟。

7、洗脱的蛋白加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。

8、Western Blotting检测。

结果显示，如图3所示，Septin1与CK2能相互作用。

实施例5 CK2激酶在体外、体内磷酸化septin1

1、体外磷酸化

(1)取His-CK2α激酶0.2μg，底物蛋白5μg(GST-septin1，GST-septin1-206A)，加入1×Kinase buffer(cell signal公司)，反应体系中另含有200μM r-32p-ATP1μl(5μCi/μl)。

(2)在30℃让反应物作用30分钟，然后加5μl 5×SDS上样缓冲液终止反应。

(3)取20μl反应产物经12％SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，胶染色、脱色。

(4)真空干燥仪上干胶60℃2小时，冷却后，压上X-光片，-80℃曝光。

(5)显影

2、体内磷酸化

(1)将PCMV-HA-CK2α分别与PCMV-myc-septin1、PCMV-myc-septin1(206A)共转染人H1299细胞系

(2)37℃培养48hr后收获细胞并裂解。

(3)向每500μl细胞裂解液中加入3μl anti-myc一抗(sigma)，25μl Protein GPlus/Protein A Agarose(sigma公司)，置于4℃摇床缓慢震荡1小时。

(4)2000rpm离心1分钟后用1×PBS洗涤Agarose三次

(5)向Agarose中加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。取上清20μl进行SDS-PAGE电泳

(6)用磷酸化蛋白染色试剂盒(invitrogen)染色

结果显示，在体外和体内，Septin1均可被CK2激酶磷酸化。体外磷酸化详见图5，体内磷酸化详见图6。

实施例6检测septin1的磷酸化突变体对Jurkat细胞生长及周期的影响

1、分别将PCMV-myc，PCMV-myc-septin1，PCMV-myc-septin1(S206A)，PCMV-myc-septin1(S206E)质粒转染Jurkat细胞

2、37℃培养60hr后流式细胞仪检测个细胞的周期

结果显示，如图10-13所示，septin1(S-A)突变体(即将septin1蛋白第206位丝氨酸突变为丙氨酸(alanine，Ala，A))导致细胞凋亡增加，G2/M期细胞明显减少，而septin1(S-E，即将septin1蛋白第206位丝氨酸突变为谷氨酸(glutamic acid，Glu，E))突变体则不能诱导细胞凋亡，但引起细胞G2/M期增高。这提示，septin1可以维持细胞分裂的正常进行，septin1206位丝氨酸突变时，细胞不能正常分裂。

实施例7细胞中RNA干扰septin1的表达

1、将合成的siRNA溶于去RNAase的ddH₂O中，制成50mM的工作母液

2、取5μl脂质体(GIBCO公司脂质体Lipfectmine2000)与250μl OPTI-MEM培养基混合均匀，静置5min

3、取25μl siRNA工作母液与250μl OPTI-MEM培养基混合均匀

4、将2与3溶液混合均匀，室温静置20min

5、将1×10⁶的悬浮细胞离心收集并用1×PBS洗涤一次，用400μlOPTI-MEM培养基重悬后与4所得溶液混合，加入6孔板一孔

6、37℃培养5hr后更换完全培养基

7、继续培养48-60hr后收获细胞，取出一半细胞进行western-blot检测septin1的表达情况，同时另一半细胞用于流式细胞检测。

结果显示，在1μg/ml的PHA刺激下，60小时内干扰septin1的Jurkat细胞的增殖水平。在培养了60小时后，干扰组与对照组相比，细胞增殖幅度大大降低。

Claims

1. 一种分离出的核酸分子，其特征在于，它的序列包括：5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3’、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3’。

2. 一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括：GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。

3. 一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括：5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’或者5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC dTdT-3’。

4. 一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3’、GGAAGAGGAGATCCACATC 、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3’。

5. 一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。

6. 一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC dTdT-3’和5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3’。

7. 一种如权利要求1所述的核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权利要求1所述的核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团依次脱水缩合。

8. 如权利要求1所述的核苷酸分子在制备免疫制剂中的应用。