CN101234192A - 用活化的凝血因子ⅶ治疗血栓溶解疗法引起的大出血 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过向受试者给药有效量的活化的凝血因子VII(VIIa)或其功能衍生物，治疗由血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法所导致的大出血，包括颅内出血。

Description

用活化的凝血因子Ⅶ治疗血栓溶解疗法引起的大出血

背景技术

止血系统，包括血小板，血凝固和纤维蛋白溶解作用，在维持血流和限制血管损伤时血液的丢失方面起着至关重要的作用。血管损伤时，血小板粘附到血管壁上，聚集并形成栓(plug)，这种栓得到纤维蛋白网状物的固化，所述纤维蛋白网状物是血凝固活化时，通过凝血因子VII，凝血因子X和凝血酶原的活化而形成的。失血停止后，伤口的愈合开始，之后纤维蛋白溶解系统通过组织纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)诱导的纤维蛋白溶酶的产生将血凝块消散。

在病理情况下，如在心血管疾病时，该系统逃脱正常的生理调节，引起血管的完全堵塞，如同动脉粥样硬化斑块脱落后所观察到的一样。为治疗血栓形成的堵塞，恢复血流，常常应用血栓溶解疗法(参考文献1)。

血栓溶解疗法包括抗血小板剂(例如乙酰水杨酸)，抗凝血剂(例如肝素)和纤维蛋白溶解剂(例如，组织纤维蛋白溶酶原激活物，链激酶，葡萄球菌激酶，尿激酶或它们的衍生物)的联合治疗。这些制剂的联合应用虽然在治疗上非常有效，但仍然存在引起出血并发症包括出血性休克的极大危险(参考文献2，3)。在接受血栓溶解疗法的患者中有许多人出现严重的出血。根据最近大量的血栓溶解疗法的临床实验(即涉及16949名患者的Assent-2实验)发现，tenecteplase(组织纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)的衍生物)治疗的患者颅内出血的发生率是0.93％，alteplase(也是t-PA的衍生物)治疗的患者颅内出血的发生率是0.94％，对tenecteplase和alteplase而言，非脑出血并发症的发生率分别是26.43％和28.95％。有4.25％和5.49％的人需要输血。用Tenecteplase或alteplase治疗，在30天时死亡率或非致死性休克率分别是7.11％和7.04％(参考文献3)。

因此，有必要在所使用的血栓溶解药物以外给医生提供一种解毒剂，以扭转这种血栓溶解疗法所导致的大出血。

发明简述

本发明的一个目的是提供治疗受试者体内血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法引起的大出血(major bleeding)的组合物和方法，所述受试者例如是人或动物。

本发明是基于这一发现而进行的，即上述目的可以通过使用活化的凝血因子VII(VIIa)来实现。

凝血因子VII是维生素K依赖性糖蛋白，其通过肝细胞生理性合成，并以由406个氨基酸残基组成的单链分子形式分泌到血液中。凝血因子VII活化变成凝血因子VIIa的过程涉及在第152位精氨酸和第153位异亮氨酸之间单个肽键的水解，形成一个双链分子，所述分子由152个氨基酸残基的轻链和254个氨基酸残基的重链通过一个二硫键结合在一起形成。该蛋白处于活化形式时，作为丝氨酸蛋白酶起作用，参与凝血级联反应的备选途径(extrinsic pathway)。受损血管壁部位一旦接触到组织因子(TF)，该组织因子便与凝血因子VII形成复合物，产生活化的凝血因子VII(凝血因子VIIa)，TF和凝血因子VIIa的复合物将凝血因子X活化成Xa，继而将凝血酶原转变为凝血酶。凝血酶在血液凝固和伤口愈合方面起关键作用。在血管损伤的最初阶段，其诱导血小板聚集并诱导纤维蛋白形成，之后刺激细胞生长从而促进受损血管的修复(参考文献1)。

用编码凝血因子VII的人DNA转染幼龄仓鼠肾细胞可表达重组凝血因子VII(rFVII)，在纯化过程中可将其转变成活化的凝血因子VII(rFVIIa)(参考文献4)。市售的重组凝血因子VIIa有NovoSeven

(Novo Nordisk，Bagsvaerd，丹麦)，它已越来越多地用于治疗广泛多种流血性疾病的流血事件，尤其是带有凝血因子VII或IX的抑制物而其它疗法无效的血友病患者(参考文献5-10)。

尽管对该药的使用已积累了13年的经验，但却从未有人提出或研究过用凝血因子VIIa扭转血栓溶解疗法导致的大出血事件。

附图说明：

图1：载体处理的动物的出血时间。

图2：用rt-PA，ASA和肝素处理但未用凝血因子VIIa处理的动物的出血时间。

图3：用rt-PA，ASA和肝素以及(1mg/kg)凝血因子VIIa处理的动物的出血时间。

发明详述

第一方面，本发明涉及活化的凝血因子VII(VIIa)或其功能衍生物在制备治疗血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法导致的大出血，包括颅内出血的药物方面的应用。

第二方面，本发明涉及治疗血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法导致的大出血，包括颅内出血的方法，该方法包括给药患所述出血的受试者有效量的活化的凝血因子VII(VIIa)或其功能衍生物。该方法尤其可用于治疗哺乳动物，包括人。

适合用于本发明的人的纯化的凝血因子VIIa可从天然来源分离，或优选通过重组DNA技术制备，例如如参考文献20所描述的。通过重组技术制备的凝血因子VIIa可与天然的凝血因子VIIa基本相同，如来自NovoNordisk的产品NovoSeven

便是这样。术语“功能衍生物”是指凝血因子VIIa经过修饰的衍生物，具有基本相同的所需要的生物活性。这种凝血因子VIIa的功能性衍生物可如下制备：例如通过对编码凝血因子VII的核酸序列进行定点诱变产生修饰型重组蛋白，该蛋白具有与天然氨基酸序列相差一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。所述修饰可包含，例如氨基酸取代，插入，添加，置换，倒位或缺失。另外，还可进行有用的翻译后修饰，例如去除或改变糖基化模式。

用于血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法的血栓溶解/纤维蛋白溶解性药物可包含任何形式的天然或重组的组织纤维蛋白溶酶原激活物，如alteplase，reteplase，duteplase，saruplase，重组的DSPAα1(BAT PA)，链激酶，anistreplase，葡萄球菌激酶包括pegilated葡萄球菌激酶和无免疫原性或免疫原性降低的葡萄球菌激酶的突变体，尿激酶，单链尿激酶，本领域已知的任何第三代血栓溶解剂例如amediplase，tenecteplase，monteplase，lanoteplase，pamiteplase(参考文献2，3，11-15，19)，或上述药物的治疗上可接受的衍生物。

优选包含凝血因子VIIa的药物或药物组合物通过静脉推注注射或通过间歇的或连续的静脉输注来给药。另外，在单次静脉推注注射之后再静脉输注凝血因子VIIa可能是有益的。

用于注射或输注目的的适当的药物制剂包括无菌水溶液和无菌粉末，这种无菌粉末在使用时制备成无菌的可注射或输注的溶液。通常，终溶液还包含适当的盐和本领域已知的其它辅助剂。例如，Novo Nordisk制备并出售的NovoSeven

的重新配制的水溶液包含3mg/ml氯化钠，1.5mg/ml氯化钙二水合物，1.3mg/ml N-甘氨酰甘氨酸，0.1mg/ml polysorbate 80和30mg/ml甘露醇。

凝血因子VIIa的给药剂量可以根据，例如具体受试者的年龄和身体状况，所治疗的出血并发症的严重性以及所选择的给药途径而有所不同。适当的剂量可由本领域技术人员很容易地确定的。

通常，静脉推注注射凝血因子VIIa的适当剂量范围是约3000-6000IU(国际单位；与涉及凝血因子VIIa 89/688的第一国际标准相一致)，这相当于每公斤体重给药重组凝血因子VIIa约60-120μg。优选，静脉推注注射的剂量范围是约每公斤体重4500-6000IU。因为重组凝血因子VIIa的系统半寿期通常是仅约2-3个小时，所以，以相对短的时间间隔，优选以2-3小时的时间间隔，更优选以2小时的时间间隔，重复静脉推注注射可能是必要的。适当时，治疗过程中最初的时间间隔可以延长至例如4，6，8，12小时。

治疗上需要时，可以在约2-5分钟之内静脉推注注射给药。

凝血因子VIIa的间歇输注的适当剂量方案可以是每2-6小时每公斤体重约4500-6000IU。

凝血因子VIIa的连续输注的适当剂量可以是约500-1500IU/kg/h，这相当于约10-30μg rFVIIa/kg/h。适当时，在连续输注凝血因子VIIa之前可给予一次剂量为每公斤体重约4500-6000IU的推注。连续输注重组凝血因子VIIa的在先研究的结果(参考文献17，18)提示，与推注相比，连续输注凝血因子VIIa的治疗达到有效时所需的药物总量较低。

时至今日，凝血因子VIIa的已知应用中副作用的发生率低，并且生物化学征象提示不发生血栓或消耗性凝血病，所以人们期待着通过活化的凝血因子VIIa可有效扭转与血栓溶解疗法有关的大出血，而又不对受试者产生明显的损害。

实施例：凝血因子VIIa对大鼠中标准血栓溶解处理所诱导的大出血时 间的逆转作用

方法

动物：大鼠Chbb Thom雄性雌性，200-300g

麻醉：Narcoren 60mg/kg(腹膜内注射)+连续输注0.6ml/h(腹膜内注射)(Narcoren+生理盐水，比例1∶5)

化合物：

重组的组织纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA)

rt-PA的用法：100nM/kg，静脉给药：

10％静脉推注：10nM/kg(1ml/kg)

90％静脉输注：90nM/kg/小时(3ml/kg/h)

肝素/Ratiopharm：

肝素用法：

50U/kg与rt-PA一起静脉内推注

+输注：40U/kg/h

ASA＝乙酰水杨酸：

30mg/kg与rt-PA一起静脉内推注

凝血因子VIIa(如下称为：Novoseven)：

剂量：1mg/kg    (Vol.1.667ml/kg)

实验组：

1)生理盐水对照

2)rt-PA+肝素+ASA+凝血因子VIIa 1mg/kg i.v.

3)rt-PA+肝素+ASA+生理盐水

实验设计

分别向左右颈静脉插入导管以输注rt-PA和肝素(或生理盐水作为对照)。另外，插入气管插管来利于自主呼吸。将大鼠置于37℃的温热盘(thermoplate)上。通过用全自动切口装置Surgicutt作的标准化切口来估计出血时间。Surgicutt是一种无菌的标准化的一次性装置，其所作切口为5mm长、1mm深的均一切口。切口距大鼠尾根部3cm。每隔15秒用滤纸从伤口处吸取血液。注意不要让滤纸碰到切口以免阻碍血小板栓的形成。

试验进行方案：

0分钟：测量出血时间：

推注生理盐水或rt-PA、肝素和ASA；开始输注rt-PA和肝素。

15分钟：测量出血时间

45分钟：测量出血时间

60分钟：停止输注；用生理盐水冲洗两条导管并推注生理盐水或凝血因子VIIa

65分钟：在用凝血因子VIIa后5分钟测量出血时间

统计结果：

所有结果都表示为均值±标准误差。用方差分析(ANOVA)和Dunnett′s检验作多重比较来确定统计学显著性。

结果：

用载体处理的动物：

用rt-PA的载体但没用ASA和肝素处理的动物的出血时间，在整个实验过程中都在正常范围内，与输注前对照的值无不同(图1)。

用无凝血因子VIIa的血栓溶解方案处理的动物：

将rt-PA与ASA和肝素联合给予会显著延长出血时间，分别从116±14秒到196±18秒和201±10秒。停止输注rt-PA，ASA和肝素并输注凝血因子VIIa载体后，出血时间仍基本无改变(188+12秒)(图2)。

用含凝血因子VIIa的血栓溶解方案处理的动物：

将rt-PA与ASA和肝素联合给予会显著延长出血时间，分别从123±4秒到231±10秒和232±9秒。停止输注rt-PA，ASA和肝素并给予(1mg/kg)凝血因子VIIa后，出血时间降至接近正常的水平(138±4秒)。

讨论：

本试验证明，当rt-PA在与ASA和肝素作为血栓溶解方案联合给予时，会使麻醉大鼠的出血时间显著延长。凝血因子VIIa作为经外源途径激活凝血级联的止血剂，能迅速扭转血栓溶解处理所诱导的延长的出血时间。由此提示，凝血因子VIIa是抵抗溶栓作用所诱导的出血并发症的有效解药。

参考文献

1.Stassen JM，Nystrm ANGSTROM.A historical review on thrombosisand hemostasis.Ann Plast Surgery 1997；39：317-329。

2.The GUSTO investigators.An international randomized trial comparingfour thrombolytic strategies for acute myocardial infarction.N Engl J Med.1993Sep 2；329(10)：673-82。

3.Assent-2.Single-bolus tenecteplase compared with front-loaded alteplasein acute myocardial infarction：the ASSENT-2 double-blind randomised trial.Assessment of the Safety and Efficacy of a New Thrombolytic Investigators.Lancet 1999 Aug 28；354(9180)：716-22。

4.Thim L，Bjoern S，Christensen M，Nicolaisen EM，Lund-Hansen T，Pedersen AH，Hedner U.Amino acid sequence and posttranslationalmodifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamsterkidney cells.Biochemistry.1988；27：7785-93。

5.Macik BG，Hohneker J，Roberts HR，Griffin AM.Use of recombinantactivated factor VII for treatment of a retropharyngeal hemorrhage in ahemophilic patient with a high titer inhibitor.Am J Hematol.1989；32：232-4。

6.Kenet G，Walden R，Eldad A，Martinowitz U.Treatment of traumaticbleeding with recombinant factor VIIa.Lancet 1999；354：1879。

7.White B，McHale J，Ravi N，Reynolds J，Stephens R，Moriarty J，SmithOP.Successful use of recombinant FVIIa(NovoSeven TM)in the managementof intractable post-surgical intra-abdominal haemorrhage.Br J Haematol1999；107：677-8。

8.Al Douri M，Shafi T，Al Khudairi D，Al Bokhari E，Black L，Akinwale N，Osman Musa M，Al Homaidhi A，Al Fagih M，Borum Andreasen R.Effect of theadministration of recombinant activated factor VII(rFVIIa；NovoSeven TM)inthe management of severe uncontrolled bleeding in patients undergoing heartvalve replacement surgery.Blood Coagul Fibrinolysis.2000 Suppl 1：S121-7。

9.Negrier C，Lienhart A，Overall experience with NovoSeven TM.BloodCoagul Fibrinolysis 2000 Suppl 1：S19-24。

10.Wong WY，Huang WC，Miller R，McGinty K，Whisnant JK Clinicalefficacy and reeovery levels of recombinant FVIIa(NovoSeven TM)in thetreatment of intracranial haemorrhage in severe neonatal FVII deficiency.Haemophilia 2000；6：50-4。

11.Gissi International Study Group.In-hospital mortality and clinical courseof 20，891 patients with suspected acute myocardial infarction randomisedbetween alteplase and streptokinase with or without heparin.The Lancet.1990；336：71-5。

12.The Global Use of Strategies to Open Occluded Coronary Arteries(GUSTO III)Investigators.A comparison of reteplase with alteplase for acutemyocardial infarction.N Engl J Med.1997；337：1118-2。

13.Van de Werf F，Cannon CP，Luyten A，Houbracken K，McCabe CH，Berioli S，Bluhmki E，Sarelin H，Wang-Clow F，Fox NL，Braunwald E.Safetyassessment of single-bolus administration of TNK tissue-plasminogen activatorin acute myocardial infarction：the ASSENT-1 trial.The ASSENT-1Investigators.Am Heart J.1999；137：786-91。

14.Collen D，Sinnaeve P，Demarsin E，Moreau H，De Maeyer M，Jespers L，Laroche Y，Van De Werf F.polyethylene glycol-derivatized cystein-substitutionvariants of recombinant staphylokinase for single-bolus treatment of acutemyocardial infarction.Circulation.2000；102：1766-72。

15.Laroche Y，Heymans S，Capaert S，De Cock F，Demarsin E，Collen D.Recombinant staphylokinase variants with reduced antigenicity due toelimination of B-lymphocyte epitopes.Blood.2000；96：1425-32。

16.Hedner U.Dosing and Monitoring NovoSeven TM treatment，Haemostasis 1996；26(suppl 1)：102-108。

17.Schulman S，Bech Jensen M，Varon D，Keller N，Gitel S，Horoszowski H，Heim M，Martinowitz U.Feasibility of using recombinant factor VIIa incontinuous infusion.Thromb Haemost.1996 Mar；75(3)：432-6。

18.Baudo F，Redaelli R，Caimi TM，Mostarda G，Somaini G，de Cataldo F.The continuous infusion of recombinant activated factor VIIa(rFVIIa)in patientswith factor VIII inhibitors activates the coagulation and fibrinnolytic systemswithout clinical complications.Thromb Res.2000；99：21-4。

19.Verstraete M.Third-generation thrombolytic drugs.Am J Med.2000；109：52-8。

20.Hagen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986；83：2412-2416。

Claims (10)

1. 活化的凝血因子VII(VIIa)或其功能衍生物在制备治疗血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法引起的大出血的药物方面的用途。

2. 权利要求1的用途，其中所述出血是使用如下物质进行血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法引起的，所述物质是任何形式的天然或重组的组织纤维蛋白溶酶原激活物，如alteplase，reteplase，duteplase，saruplase，重组的DSPAα1(BAT PA)，链激酶，葡萄球菌激酶包括pegilated葡萄球菌激酶和无免疫原性或免疫原性降低的葡萄球菌激酶的突变体，尿激酶，单链尿激酶，第三代血栓溶解剂，或上述药物的治疗上可接受的衍生物。

3. 权利要求1或2的用途，其中所述出血是颅内出血。

4. 权利要求1-3任一项的用途，其中所述药物适宜于通过静脉推注注射或静脉输注方式给药有效量的凝血因子VIIa或其功能衍生物。

5. 权利要求4的用途，其中所述凝血因子VIIa或其功能衍生物的有效量包括一次或多次单剂静脉推注注射和/或静脉输注，其中所述单剂静脉推注注射剂量为每公斤体重约3000-6000IU，相当于约60-120μg的重组凝血因子VIIa，所述静脉输注的剂量为每公斤体重每小时约500-1500IU，相当于约10-30μg的重组凝血因子VIIa。

6. 权利要求4或5的用途，其中所述有效量的凝血因子VIIa或其功能衍生物是以约2小时的间隔进行多次静脉推注注射给药。

7. 一种治疗血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法引起的大出血，包括颅内出血的方法，该方法包括给药患所述出血的受试者有效量的活化的凝血因子VII(VIIa)或其功能衍生物。

8. 权利要求7的方法，其中所述出血是使用如下物质进行血栓溶解疗法/纤维蛋白溶解疗法引起的，所述物质是任何形式的天然或重组的组织纤维蛋白溶酶原激活物，如alteplase，reteplase，duteplase，saruplase，重组的DSPAα1(BAT PA)，链激酶，葡萄球菌激酶包括pegilated葡萄球菌激酶和无免疫原性或免疫原性降低的葡萄球菌激酶的突变体，尿激酶，单链尿激酶，第三代血栓溶解剂，或上述药物的治疗上可接受的衍生物。

9. 权利要求7或8的方法，其中所述有效量的凝血因子VIIa或其功能衍生物是通过静脉推注注射或静脉输注给药的，优选通过间隔约2小时的多次静脉推注注射给药。

10. 权利要求9的方法，其中所述凝血因子VIIa或其功能衍生物的有效量包括一次或多次单剂静脉推注注射和/或静脉输注，其中所述单剂静脉推注注射剂量为每公斤体重约3000-6000IU，相当于约60-120μg的重组凝血因子VIIa，所述静脉输注的剂量为每公斤体重每小时约500-1500IU，相当于约10-30μg的重组凝血因子VIIa。

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