CN101223902B - 植物乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用，同时也提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)新菌株A18，其保藏号为CGMCC No.2227。该菌株具有良好的培养特性，其发酵液具有良好的抑菌能力，可用于食品保鲜领域，特别是冷却肉的保鲜。

Description

植物乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用 

技术领域

本发明属于食品防腐领域，具体地，涉及植物乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用。 

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类可发酵糖并产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌在自然界中分布很广泛是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，不仅具有许多对人和动物健康有益的生理功能，而且能够产生有机酸(如乳酸、丁酸和醋酸等)、过氧化氢和细菌素等抑菌物质(杨洁彬和葛兴华，1996)。这些抑菌物质不仅对食品的风味和组织状态有很好的保持效果，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。乳酸菌产生的细菌素以其对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂(朱小乔和刘通讯，2001)。乳酸菌的抑菌物质主要有下列几类： 

1酸性物质 

除利用可发酵碳水化合物大量生成乳酸外，乳酸菌在代谢中还产生乙酸和丙酸等有机酸(Baird-parker，1980)。一般细菌生长的最适pH值为6～7，若低于该值，细菌的生长速率将大大降低或不生长甚至死亡，这在腐败性微生物上尤为可见。乳酸菌产生的酸性物质对食品中微生物的抑制作用已在许多实验中得到证实，这种抑菌作用取决于3个相互影响的因素：(1)介质的pH值；(2)酸的离解程度；(3)酸的种类。 

Sorrells等(1989)报道了乙酸、丙酸、乳酸这几种有机酸抑制食品致病菌的相对效率。他们指出，在pH值为4.4～5.2范围内，李斯特单胞菌受到抑制的效果是乙酸＞乳酸＞盐酸。Minet和Marth(1961)的研究表明，乙酸比乳酸有更好地抑制金黄色葡萄球菌生长和存活的效果。有机酸的抑菌活性与其分子非解离状态有关，只有未离解的弱有机酸进入细菌细胞才能有效的发挥抑菌作用。在低pH值条件下，有机酸的非解离分子占有更大的比例，从而提高了有机酸的抑菌能力。因此，不同酸的混合使用可加强对微生物的抑制作用，如乙酸和乳酸混合使用的抑菌能力大于等量乙酸或乳酸的单独使用(Adams和Hall，1988)。因为两者混合后，乳酸除了其本身的抗菌作用外还降低了介质的pH值，这就减少了乙酸离解，使得更多非离解状态的乙酸进入细菌细胞发挥抑菌作用。这也解释了虽然异型发酵的乳酸菌产生酸的总量比同型发酵的乳酸菌少，但前者对细菌的抑制作用却大于后者的原因。 

为了有效抑制食品中腐败菌和致病菌的生长，必须需要有一定数量的乳酸菌来产生足够量的酸性物质。只有当食品中的乳酸菌达到一定数量，pH下降至一定程度，方可有效的抑制一些致病菌的生长。但Yusof等(1993)把乳酸菌(乳酸乳球菌)产生的酸性物质与大肠杆菌一起接种到一类婴幼儿食品中培养发现，虽然介质的pH明显下降，但大肠杆菌仍可生长并达到10²CFU。这说明仅靠乳酸菌产生酸性物质的抑菌作用是有限的。 

2过氧化氢 

过氧化氢属于强氧化剂，乳酸菌具有黄素蛋白氧化酶活性，在有氧条件下可产生过氧化氢。由于乳酸菌不含过氧化氢酶，产生的过氧化氢可以在食物环境中不断的积蓄，而对其他微生物(如假单胞菌和金色葡萄球菌等)产生抑制作用。但是这种过氧化氢的产生和积蓄有赖于介质中氧的浓度、介质的形态和温度等，一般以在较低温度、具有较高氧浓度的液态或半液态的介质环境为佳。 

Dahiya和Spech(1968)研究了乳酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的抗菌活性，证实发酵滤液中所含有的过氧化氢对金黄色葡萄球菌具有抑制效果。Price和Lee(1970)分离鉴定的几株植物乳杆菌菌株均有抑制假单胞杆菌、芽孢菌和变形杆菌的作用，且经盐析后的植物乳杆菌滤液在300AU/mL的过氧化物酶处理下完全失去活性。 

3双乙酰 

双乙酰是乳球菌、明串珠菌、链球菌、片球菌的乳杆菌中的某些菌株发酵的食品(奶制品)的风味物质，且有一定的抑菌效果。与非乳酸菌的革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌和酵母菌对双乙酰更加敏感，而且双乙酰是唯一一类能有效抑制革兰氏阴性菌、酵母和霉菌的抑菌化合物(Jay，1982)。 

研究人员对双乙酰在液体培养基和食物中抑制、减少或杀死致病菌和食品腐败菌的效果进行了系统研究。当将大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌接种到低质量浓度(100mg/L)和高质量浓度(1000mg/L)的双乙酰营养琼脂中，37℃分别培养2h和24h后，Kulshrestha和Marth(1974)发现，与对照菌株的生长率相比，低质量浓度双乙酰并没有降低处理组菌株的生长率；而高质量浓度双乙酰在2h内能导致90％的菌体失活。 

双乙酰的抑菌机理目前还不是很清楚，但是其抑菌效果与pH值相关。在酸性条件下低质量浓度的双乙酰(几个mg/ml)就会对大肠杆菌产生抑菌作用，而且随着pH值的降低，其抑菌活性增加。 

4乳酸菌素 

乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽，产生菌对其细菌素有自身免疫性(Nettles等，1993)。近几年，乳酸菌对其他细菌拮抗作用的机理被研究最多的是乳酸菌素，这是由于乳酸菌产生的乳酸菌素被认为是一种“天然”的食品添加剂而容易为人们接受。国外关于乳酸菌素的报道很多，早在1926年Rosers发现一些乳链球菌产生的代谢产物(后被命名为Nisin乳链菌肽)可抑制其他乳酸菌的生长，1951年Hirsh提出将Nisin用于食品保藏，1961年FHO/WHO批准将Nisin作为食品添加剂(李铁军等，2002)。至此，国外学者对乳酸菌素展开了较为深入的研究，已被鉴定的乳酸菌素数以百计。

目前虽然关于乳酸菌的抑菌作用已经作了众多研究，但是目前在食品保鲜领域特别是冷却肉保鲜中还鲜有应用。此外，对获得行之有效的发酵菌株也是目前亟待解决的问题。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种在冷却肉保鲜中的应用。 

本发明的另一目的在于提供一种用于食品保鲜的新菌株。 

本发明从收集的乳酸菌中，通过对大肠杆菌(Escherichia.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、单核细胞增生李氏杆菌(Listeria monocytogenes)、荧光假单胞菌(Pseudomomas fluorescens)抑菌活性的筛选，得到几株具有较好抑菌活性的新菌株，将其中一株命名为A18，经鉴定，该菌株为植物乳杆菌的一个新菌株。该菌株已于2007年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)保藏，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏号为CGMCC No.2227。 

本发明菌株具有良好的培养特性，其发酵液具有良好的抑菌能力，可用于食品保鲜领域，特别是冷却肉的保鲜。 

附图说明

图1是筛选菌株生长曲线； 

图2是筛选菌株生长过程中pH变化曲线； 

图3是筛选菌株生长过程中抑菌活性的变化曲线； 

图4是硫酸庆大霉素标准效价曲线； 

图5是不同接种量下代谢物质粗品的相对效价； 

图6是不同氮源下乳酸发酵液的OD₆₀₀吸光值； 

图7是不同碳源下乳酸发酵液的OD₆₀₀吸光值； 

图8是4℃下经筛出乳酸菌代谢产物粗品处理冷却肉细菌总数的变化。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 

实施例1 

一、材料和方法 

1.1材料 

1.1.1菌种 

乳酸菌：环境中分离。 

指示菌：大肠杆菌(Escherichia.coli)ACCC10503、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ACCC10499、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC11108、单核细胞增生李氏杆菌(Listeria monocytogenes)ACCC11120、荧光假单胞菌(Pseudomomas fluorescens)ACCC10042均来自中国农业微生物保藏中心。 

1.1.2冷却肉原料 

双汇肉类集团生产并经24h冷却的猪里脊肉。 

1.1.3培养基 

1.1.3.1乳酸菌继代培养基(g/L) 

MRS：蛋白胨10.0；牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，葡萄糖20.0；K₂HPO₄ 2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，MgSO₄.7H₂O 0.58，MnSO₄.4H₂O 0.25，吐温80 1ml，琼脂20.0，pH 6.2～6.4，121℃高 压蒸汽灭菌15min 

1.1.3.2乳酸菌分离纯化培养基(g/L) 

MRS培养基，CaCO₃含量20.0 

SL培养基 

酪朊水解物        10g        酵母提取物        5g 

葡萄糖            20g        柠檬酸二胺        2g 

CH₃COONa·3H₂0    25g        KH₂PO₄            6g 

FeSO₄·7H₂O       0.03g      MgSO₄·7H₂O       0.58g 

MnSO₄·4H₂O       0.25g      琼脂              15g 

pH5.4  115℃灭菌20-30min 

酪朊培养基 

酪朊水解物        10g         酵母提取物        5g 

肉膏              10g         葡萄糖            20g 

柠檬酸钠          5g          乙酸钠            5g 

MgSO₄·7H₂O       0.58g       MnSO₄·4H₂O       0.25g 

山梨酸            0.4g        琼脂              20g 

pH5.0  115℃灭菌20-30min 

1.1.3.3指示菌生长培养基(g/L) 

LB液体培养基：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min 

1.1.3.4抑菌活性检测培养基(g/L) 

LB半固体培养基：配方同上，琼脂含量12.0 

1.1.3.5生理实验基础培养基 

PY培养基(100ml)：蛋白胨1.0g，酵母提取物1.0g，无机盐溶液4.0ml 

盐溶液成分(1000ml)：无水CaCl₂ 0.2g，MgSO₄.7H₂O 20.48g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaHCO₃ 10.0g，NaCl 2.0g 

将CaCl₂和MgSO₄.7H₂O一起溶解于300ml蒸馏水中，再加500ml蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加蒸馏水定容至1000ml，混合后贮备于4℃。 

PYG培养基(100ml)：在PY基础培养液内加入1.0g葡萄糖 

1.1.3.6菌落总数计数培养基(g/L) 

营养琼脂：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0；琼脂20.0，pH 7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min 

1.1.4主要设备 

                            表1.1仪器和设备 

1.1.5主要试剂 

(1)DNA回收试剂盒：购自V-gene生物技术有限公司。 

(2)Tris平衡酚：购自北京欣经科公司。 

(3)50×TAE buffer：先用300ml蒸馏水溶解Tris 242.2g，加入57ml冰乙酸，100ml 500mmol/L EDTA(pH 8.0)，用冰乙酸调节pH至8.0，然后加蒸馏水定容至1000ml，使用时稀释50倍。 

(4)STE buffer：10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1mol/L NaCl。 

(5)溶菌酶(100mg/ml)：用10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)溶解溶菌酶，配制成100mg/ml的贮存液，-20℃保存。 

(6)Taq酶：购自TaKaRa公司。 

(7)10％SDS：称取10g十二烷基磺酸纳(SDS)，溶于90ml蒸馏水，加热到68℃，并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解，定容至100ml。 

(8)dNTP：Amerso公司产品。 

(9)通用引物：P0(5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、PC3(5’-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3’)，北京奥科生物技术公司。 

(10)硫酸庆大霉素：560AU/mg，购自sigma公司。 

1.2方法 

1.2.1生物保鲜乳酸菌的筛选 

1.2.1.1菌种活化 

在无菌的条件下，取不同种肉类食品(鲜肉、腊肉、香肠)小部分，切成细小的颗粒，放在盛有MRS培养基、SL培养基、酪朊培养基液体培养基中的250ml三角瓶中富集培养，40℃200转摇床震荡培养1h。将培养好的液体培养液接于三种固体培养基的平板上涂布分离，封口膜封口置于37℃培养24～36h。挑取单菌落，反复纯化至纯种挑至MRS斜面中保藏。 

1.2.1.2乳酸菌代谢产物粗品的制备 

将传代活化的乳酸菌接种在MRS液体培养基中，37℃培养16h后，将发酵液在12000r/min(4℃)离心10min，弃菌体取上清即为代谢产物粗品。 

1.2.1.3抑菌试验 

采用单层琼脂平板扩散法，其中小孔孔径约为5mm，以抑菌圈平均直径(mm)来描述抑菌效果。 

1.2.1.4乳酸菌生长曲线的测定 

将传代活化的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养，每隔2h取样，在600nm波长下测光密度值，用pH计测pH值，同时做抑菌试验测定抑菌活性。 

1.2.2筛出乳酸菌的鉴定 

1.2.2.1革兰氏染色和培养特征的观察 

参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》(凌代文，1999)。 

1.2.2.2生理生化特征鉴定 

(1)过氧化氢酶测定 

将实验菌接种于PYG培养基斜面上，37℃培养18-24h，取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加3-15％的过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。 

(2)葡萄糖产酸产气实验 

在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和0.5％吐温80，再添加6g琼脂和1.6g/100ml的溴甲酚紫1.4ml作指示剂，分装试管。把菌液滴加入上述融化的培养基中，充分混匀，再在上面加一层7mm厚的2％的琼脂，置37℃培养6d。指示剂变黄表示产酸，软琼脂柱内有气泡或出现将2％的琼脂层向上顶的现象，表示产气。 

(3)淀粉水解实验 

接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中，取少许培养液于比色盘内，同时取未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液。不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。 

(4)七叶苷水解实验 

在PY基础培养基中加入七叶苷使最终浓度为5g/L，接种新鲜的菌种于上述培养基中。取培养液置于比色盘内，同时以未接种的七叶苷培养基作为对照，分别在其中滴加柠檬酸铁试剂，显黑色表示七叶苷水解，不显色为阴性反应。 

(5)明胶液化实验 

将实验菌接种于明胶基础培养基中，置37℃培养，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。 

(6)产硫化氢实验 

将新鲜的培养物接种于含有半胱氨酸或胱氨酸的培养基中，用无菌的镊子夹取一柠檬酸铁滤纸条悬挂于接种试管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，实验中设空白对照，在没接种的试管培养基上悬挂柠檬酸铁滤纸条，置于37℃培养，进行观察比较，纸条变黑色为阳性反应。 

(7)葡聚糖的产生 

将新鲜的培养物接种于含有10％蔗糖的MRS培养基斜面上，37℃培养2-4d。斜面上培养物形成粘稠的菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。 

(8)精氨酸水解实验 

接种新鲜的实验菌种于精氨酸水解液体培养基上，并在其上层加盖无菌的石蜡矿物油，在37℃培养72h。接种后培养基变黄色，表明葡萄糖产酸，为阴性反应，培养基内指示剂显示紫色，表明精氨酸经细菌酶水解，释放碱性物质，为阳性反应。 

(9)精氨酸产氨实验 

接种新鲜的实验菌种于含精氨酸的培养基中，并同时接种不含精氨酸的培养基作对照，置37℃培养1-3d，取少许培养液于比色盘中，加奈氏试剂数滴，当产氨时会出现橙黄或黄褐的沉淀。含精氨酸培养液与试剂的显示强于对照液才能是阳性反应。 

(10)石蕊牛奶 

牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在其中加入石蕊作指示剂和氧 化还原指示剂，石蕊在中性时呈淡紫色；酸性时呈粉红色；碱性时呈蓝色；还原时，则自上而下使牛奶褪色还原为白色。乳酸细菌发酵乳糖产酸，石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。观察接种和培养后的石蕊牛奶实验结果，通常37℃培养1-3d即可观测石蕊牛奶产酸和凝固反应。 

(11)V-P实验 

接种新鲜的实验菌种于PYG培养基中，37℃培养2d，取1ml培养液在其中加入1ml萘酚和1ml KOH，置于不加盖的试管中混合，并陆续振荡30min，显示红色为阳性反应。 

1.2.2.3糖发酵实验 

将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中，按表2.2分装含5ml培养基的试管。分别取0.2ml，被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃，100r/min振荡培养。 

            表1.2碳水化合物培养基表 

表1.3pH指示范围与样品颜色的关系 

检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照，滴加试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。其中用到的试剂为BTB-MR试剂，由于该试剂显色的差异可指示产酸的强弱程度，见表2.3。 

1.2.2.4乳酸菌16S rDNA同源性比较鉴定 

1.2.2.4.1模版DNA的提取 

(1)挑取单菌落接种至50ml壳聚糖液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养24h； 

(2)取1.5ml培养物离心，12,000r/min、1min收集菌体，加入STE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，再次离心，菌体重悬于1mlSTE溶液中； 

(3)加入100mg/ml溶菌酶溶液1μL(终浓度为100μg/ml)，37℃保温1-2h； 

(4)加入1/10体积10％SDS溶液，混合均匀，静置片刻，60-65℃水浴，不超过10min； 

(5)加入1/10体积5mol/L NaCl，至终浓度为1mol/L，充分混匀； 

(6)加入等体积的Tris平衡酚，混匀，12,000r/min离心5min，取上清于另一洁净离心管中，重复操作一次； 

(7)上清液中加入等体积的氯仿，混匀，12,000r/min离心5min，取上清于另一个洁净离心管中； 

(8)加入2倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃静置大于30min后，12,000r/min离心5min； 

(9)70％乙醇洗涤2次，室温下晾干后冷冻抽干，于-20℃保存备用。 

1.2.2.4.216S rDNA的PCR扩增 

以提取的各菌株DNA为模板，采用通用引物P0和PC3，扩增各菌株的16S rDNA序列，PCR反应体系见表2.4。 

                表1.4PCR反应体系的配制 

PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，45℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸8min，4℃保温3min。PCR扩增结果，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

1.2.2.4.3PCR产物的纯化及序列测定 

PCR产物按Omega Bio-Tek公司试剂盒操作方法纯化后，由北京奥科生物技术有限公司完成测序，测序引物为P0、PC3。将序列结果提交到GenBank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中搜索比对。 

1.2.3乳酸菌代谢产物的初步分析 

乳酸菌产生的抑菌物质种类繁多，包括蛋白质类和非蛋白质类物质。因此本课题设计了对菌液的多种处理方式，以大肠杆菌为指示菌来初步研究筛选出的乳酸菌的抑菌物质的性质。 

1.2.3.1酸性末端产物的分析 

以乳酸调MRS液体培养基至pH 4.0，以6mol/L的NaOH调代谢产物粗品至pH 4.0，做抑菌试验。 

1.2.3.2过氧化氢的检测 

取1ml代谢产物粗品，加入适量的过氧化氢酶，使终浓度为5mg/ml，37℃水浴反应1h后，做抑菌试验。 

1.2.3.3蛋白类物质的检测 

取1ml代谢产物粗品，分别用6mol/L的HCl和6mol/L的NaOH 调pH至各蛋白酶作用的最适pH，加入适量的蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，使终浓度为1mg/ml，37℃水浴反应1h后，调pH至代谢产物粗品初始pH，做抑菌试验。 

1.2.3.4抑菌物质的热稳定性 

为了检测细菌素的热稳定性，分别将粗细菌素液在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃中水浴加热20min，121℃高压加热20min，然后做抑菌试验。 

1.2.3.5抑菌物质显示活性的pH值范围 

为了检测细菌素在不同的pH范围内的活性，将粗细菌素液用6mol/L HCl或NaOH调pH，分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和7.0，然后做抑菌试验。 

1.2.4乳酸菌抑菌效价的测定 

以硫酸庆大霉素作为对照，制作硫酸庆大霉素的标准曲线，乳酸菌抑菌效价以对大肠杆菌具有相同抑菌效果的硫酸庆大霉素标准品的效价定义。 

1.2.5乳酸菌发酵条件的研究 

1.2.5.1初始pH对产抑菌物质的影响 

用6mol/L HCl或NaOH调培养基pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0在37℃下，接种量为1％，培养各乳酸菌至稳定状态，检测代谢产物粗品的抑菌活性。 

1.2.5.2接种量对产抑菌物质的影响 

调培养基至最适初始pH值，分别按0.5％、1％、2％、3％、4％和5％的接种量接种，37℃下培养至稳定状态，检测代谢产物粗品的抑菌活性。 

1.2.5.3培养温度对产抑菌物质的影响 

调培养基至最适初始pH值，以最佳接种量接种，分别置30℃、37℃和42℃下培养16h后，检测代谢产物粗品抑菌活性。 

1.2.5.4氮源对产抑菌物质的影响 

氮源分别选取蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硝酸钠和柠檬酸铵代替MRS培养基中的氮源成分进行单因素试验，以1.5％(质量比)的含量添加。在以上试验确定的最佳培养条件下，培养16h，检测代谢产物粗品的抑菌活性。 

1.2.5.5碳源对产抑菌物质的影响 

碳源分别采用乳糖、麦芽糖、果糖、木糖和蔗糖代替MRS培养基中的葡萄糖，以2％(质量比)的含量添加。 

1.2.5.6金属离子对产抑菌物质的影响 

以前面试验确定的最佳培养条件，单一缺省其中的金属离子K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺和Mn²⁺其他营养成分不变。 

1.2.5.7氮源、碳源和金属离子组合优化设计 

对单因素筛选出的氮源、碳源和金属离子通过四因素三水平L9-3-4正交实验，得出最优发酵条件。 

1.2.6乳酸菌代谢产物粗品保鲜冷却肉的效果的研究 

1.2.6.1冷却肉的处理 

将冷却肉原料一双汇肉类集团生产并经24h冷却的猪里脊肉在无菌操作台进行切分，切分(刀具和案板)工具均事先用75％酒精棉充分擦拭，将猪里脊肉切分成重约25g的肉块，分为两组，处理组在乳酸代谢产物粗品中浸泡1min后沥干1min，用保鲜膜包裹后，放入保鲜盒后立即将样品放入4℃冰箱和28℃培养箱；参照组用无菌水做相同处理。肉块之间平行放置，不堆压。 

1.2.6.2指标测定 

放在4℃的样品分别在1d、2d和3d的时候取样检测菌落总数，每组3个平行；而放在28℃培养箱的样品则分别在0h，4h和8h时取样检测菌落总数。 

1.2.6.3菌落总数的检测 

样品(25g)于灭菌玻璃瓶中(用无菌剪剪碎)，加0.1％蛋白胨水225ml，摇船上充分振摇均匀，吸取稀释液1ml于试管中(内有0.1％蛋白胨水9ml)，将试管充分摇匀，按此做10倍递增稀释，根据样本污染情况估计选择2～3个稀释度。吸取适宜稀释度1ml于灭菌平皿中，将46℃营养琼脂15ml注入平皿中，转动平皿，均匀，待琼脂凝固，翻转平板，将平板置37℃培养箱中培养48h，平板菌落计数。 

二、结果与分析 

2.1生物保鲜乳酸菌的筛选 

大肠杆菌、荧光假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、单核细胞增生李氏杆菌和金黄色葡萄球菌是食品中的主要腐败菌，以这五株菌为指示菌，通过抑菌实验从环境中初筛抑菌效果好的菌株。由表2.1可见，A50、A52、A71、A95和A18这5株菌对指示菌都表现出良好的抑菌效果，因此选择这几株菌株进行进一步研究。 

                              表2.1乳酸菌抑菌效果 

注：数字表示抑菌圈直径，‘-’表示抑菌圈模糊 

2.2筛出乳酸菌的生长特性 

由图1可见，筛选的菌株A18、A52、A71和A95在接种6h后，OD600迅速上升，进入对数生长期，而菌株A50在接种8h后才进入对数生长期，但五株菌都在16h后进入稳定期。 

由图2可见，筛选出的五株菌在4h后，pH直线下降，由5.8左右降到4左右，而14小时后，pH值下降速度减缓而趋于平缓状态，稳定在3.5左右。可见五株菌的产酸与菌株的生长期基本一致，且产酸快、产酸能力强。 

由图1和3可见，筛除乳酸菌均在进入对数增长期后，表现出抑菌活性，且与随细胞量的增长而活性增强。在对数生长后期，各菌株抑菌活性趋于稳定，因此取16h为各菌株的培养时间。 

2.3筛出乳酸菌的鉴定 

2.3.1菌体形态 

筛出的5株乳酸菌在形态上有很大的相似性，均在MRS培养基上形成微小白色或乳白色菌落，圆形凸起，较光滑，边缘整齐，湿润不透明。革兰氏染色阳性规则杆状，无芽孢，细胞两端钝圆成对或成短链排列。 

2.3.2生理生化特性 

由表2.2可见，筛出菌株均精氨酸产氨、硫化氢、淀粉水解、精氨酸水解、葡萄糖产气、明胶液化阴性，石蕊牛奶、七叶苷水解和V-P实验阳性。由表2.3可见，A50和A52不发酵阿拉伯糖、木糖和棉籽糖。参照《伯杰细菌鉴定手册)》(第8版)和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(凌代文，1999)，初步鉴定A18、A71和A95为植 物乳杆菌(Lactobacillus planatarum)，而A52和A50为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。 

                表2.2乳酸菌生理学特性 

.注：“-”表示阴性，“+”表示阳性. 

            表2.3乳酸菌糖发酵实验结果 

注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵，“-”表示不发酵 

2.3.3筛出乳酸菌的16S rDNA同源性鉴定 

通过测序反应，得到筛选出的5株菌株16SrDNA的部分序列，使用BLAST软件(Basic Local Aligment Search Tool，Ver2.2.6)将各菌株的16S rDNA序列与DNA数据库中已注册的核酸序列进行同源性比较：A18与DQ089653.1(Lactobacillus planatarum)的相似性达到100％；A71(其序列如SEQ ID No.1所示)与多株Lactobacillus planatarum(如EF204952.1)的相似性达到100％；A95也与多株Lactobacillus planatarum(如DQ239697.1)；A50、A52与CP000423.1(Lactobacillus casei)的相似性达到100％。此鉴定结果与前面生理生化鉴定结果是相符的。 

2.4筛出酸菌抑菌物质的初步研究 

2.4.1酸性末端产物的分析 

                        表2.4排除乳酸的抑菌试验结果(mm) 

由表2.4可见，筛出乳酸菌代谢产物粗品的抑菌活性远强于乳酸参照。因此，除乳酸外，代谢产物粗品中存在其他的抑菌物质。 

2.4.2过氧化氢产物的检测 

经过氧化氢酶处理的各菌株代谢产物粗品抑菌作用较原液几乎没有变化，这表明代谢产物粗品的抑菌活性不是过氧化氢作用的结果。 

2.4.3蛋白类物质的检测 

由表2.5可见，经各蛋白酶处理后，菌株A18和A52代谢粗品的抑菌活性降低了20％左右；菌株A50代谢粗品受蛋白酶影响较小，抑菌活性降低不到10％；菌株A95代谢粗品的抑菌活性受蛋白酶影响较大，活性降低了40％左右，且经木瓜蛋白酶处理后，失去抑菌活性；菌株A71代谢粗品经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后完全失去抑菌活性，却不受蛋白酶K和胃蛋白酶的影响。 

        表2.5经蛋白酶处理后筛出乳酸菌代谢产物粗品的抑菌效果(mm) 

2.4.5抑菌物质的热稳定性 

由表2.6可见，经过121℃高温处理20min后，5株乳酸菌的代谢产物粗品抑菌活性较原液活性下降大约10％～20％，均具有一定的热稳定性。 

表2.6经热处理后筛出乳酸菌代谢产物粗品的抑菌结果(mm) 

2.4.6pH值对抑菌物质活性的影响 

当pH值达5.0时，各乳酸菌的抑菌效果急速下降，抑菌圈模糊，因此抑菌物质在低pH值条件下表现抑菌活性。 

2.5抑菌物质抑菌活性的测定——一剂量法标准曲线的测定 

由图4可见，硫酸庆大霉素在效价10～200AU/ml范围内，抑菌圈直径和效价对数值呈良好的线型关系。回归方程为y＝0.165x-0.8142，其中y为效价对数值，x为抑菌圈直径(mm)，线型相关系数为0.9961。 

2.6发酵条件 

2.6.1初始pH值对产抑菌物质的影响 

由表3.7可见，初始pH值对乳酸菌抑菌物质的产生有很大的影响，偏酸或偏碱都不利于抑菌物质的产生。A18、A52的和A95培养的最佳初始pH值是6左右，而A50的最佳初始pH值是7左右，A71的最佳pH值是5左右。但是，A50和A71在初始pH6左右也表现良好的抑菌效果，因此选择5株菌的初始pH值均为6。 

    表2.7不同初始pH值代谢物质粗品相对效价(％) 

2.6.2接种量对产抑菌物质的影响 

由图5可见，接种量对各菌株代谢物质粗品的抑菌活性由很大影响。其中A18的最佳接种量为2％，A50的最佳接种量为3％，A52、A71和A95的最佳接种量均为4％。 

2.6.3培养温度对产抑菌物质的影响 

    表2.8不同培养温度下代谢物质粗品的相对效价(％) 

由表2.8可见，随着温度的升高，代谢物质抑菌活性增强；但温度过高，也会影响代谢物质中抑菌物质的生产，抑菌活性降低。所以，筛出乳酸菌的最适培养温度为37℃。 

2.6.4氮源对产抑菌物质的影响 

        表2.9不同氮源下代谢物质粗品的相对效价(％) 

由表2.9和图6可见，不同氮源对各筛出菌株生长量的影响与对抑菌物质产生的影响成一定的正相关。无机氮源无法满足细菌的生 长及抑菌物质的产生，有机氮源对细菌素的产生有重要影响，且不同氮源差异较大。其中A18、A50和A71的最适氮源是大豆蛋白胨，A95的最适氮源是胰蛋白胨，而A52的最适氮源是酵母膏(0.5％)和蛋白胨(1％)的混合物。 

3.6.5碳源对产抑菌物质的影响 

    表2.10不同碳源下代谢物质粗品的相对效价(％) 

由表2.10和图7可见，不同碳源对各筛出菌株生长量的影响与对抑菌物质产生的影响仍成一定的正相关，但是，这种正相关不是绝对的线性关系，如A50在以蔗糖为碳源时，有最大生长量，而其代谢物质的抑菌效果却不是最大的。根据统计分析，A18和A71的最佳碳源是蔗糖，A50是乳糖，A95是麦芽糖，而A52是葡萄糖。 

2.6.6金属离子对产抑菌物质的影响 

由表2.11可见，Na⁺和K⁺对抑菌物质的产生有较大影响，而Mg²⁺ 和NH₄ ⁺对其影响相对较弱，故选取Na⁺和K⁺为因素，与碳源和氮源一起通过正交试验设计最佳培养条件。 

      表2.11缺省不同金属离子下代谢物质的相对效价(％) 

2.6.7氮源、碳源和金属离子组合优化设计 

以氮源、碳源、K₂HPO₄和乙酸钠4因素为研究对象，按L9-3-4设计正交试验(见表3.12)，以代谢产物粗品效价为指标。 

       表2.12氮源、碳源和金属离子正交试验因素水平表 

2.6.8菌株A18正交试验结果 

      表2.13菌株A18正交组合试验方案(L₉3⁴)试验结果分析 

         表2.14菌株A18四因素三水平试验方差分析表 

注：“*”表示0.05＜P＜0.1，“**”表示P＜0.05 

2.7筛出乳酸菌代谢产物粗品保鲜冷却肉的结果 

2.7.14℃下的保鲜结果 

    表2.154℃下经筛出乳酸菌代谢产物粗品处理冷却肉细菌总数的变化 

4℃下，各乳酸菌代谢产物粗品保鲜冷却肉的结果见表2.15和图8。各乳酸菌代谢产物粗品处理过的样品菌落总数较参照在1d、2d和3d的时候均低1个数量级左右；参照在第2d时，菌落总数即超过10⁶CFU，成为变质肉，而经处理的样品在第3d时，菌落总数仍低于10⁶CFU(A18处理的样品除外)。其中，A71处理的样品在第1d时，菌落总数最低，而A18处理的样品在第1d时，菌落总数最高，这是其保鲜期有差异的原因。 

2.7.2 28℃下的保鲜结果 

    表2.16 28℃下经筛出乳酸菌代谢产物粗品处理冷却肉细菌总数的变化 

由表2.16可见，4h后，经乳酸菌代谢产物粗品处理的冷却肉菌落总数较初始菌落总数降低，降低程度因菌株差异而不同；8h后，参照菌落总数超过10⁶CFU，经A50和A71处理的样品菌落总数低于10⁴CFU(属于新鲜肉)，而其它三组样品的菌落总数低于10⁵CFU。 

3结论 

本发明筛选并保藏的菌株为一种新的植物乳杆菌，一定的热稳定性，121℃高温处理20min，仍保持80％左右的抑菌活性，特别是在酸性条件下(pH4.0左右)抑菌效果良好。最佳接种量为2％，最佳培养基成分为蔗糖2.5％、大豆蛋白胨2.5％、乙酸钠0.7％、K₂HPO₄ 0.2％、吐温-80 0.1％(V/V)。 

4℃时，经筛出乳酸菌代谢产物处理的冷却肉较参照组的菌落总数低一个数量级，可延长保质期1d以上；处理组在28℃保持8h后，菌落总数仍低于1⁰5CFU，而参照组的高于10⁶CFU。本发明菌株可在pH值较低的环境下生长良好，对多种食品腐败微生物有很好的抑制作用，对肉类的保鲜具有良好的应用前景。 

序列表 

<110>中国农业科院区划所 

<120>植物乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用 

<130> 

<160>1 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>1224 

<212>DNA 

<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 

<400>1 

ccatatcggg tcaccattag gcggctggtt ctaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt  60 

acaaactctc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc  120 

atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc  180 

cgaactgaga atggctttaa gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc  240 

atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc  300 

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac  360 

tgataataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac  420 

gacaaccatg caccacctgt atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg  480 

catagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc  540 

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ggcggaatgc ttaatgcgtt agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc  660 

attcatcgtt tacggtatgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc  720 

gagcctcagc gtcagttaca gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata  780 

tctacgcatt tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagcttccc  840 

agtttccgat gcacttcttc ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc  900 

ctgcgctcgc tttacgccca ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg  960 

ctgctgcacg tagttagccg tgcctttctg gtaaataccg tcaatacctg aacagtactc  1020 

tcagaatatg ttcttcttaa caacagagtt acgagcgaaa tcctcctcac tcacgcgcgt  1080 

gctcatcaga actttcgtca ttgtgagatc ctactgctgc ctcccgtaga gtggccggtc  1140 

tcagtccagt ggccgatacc ctctcaggtg cgtacgtact gccatgggac attacccacc  1200 

acttactaat gccccgcggg gtat                                         1224 

Claims (3)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)A18 CGMCC No.2227。

2.权利要求1所述植物乳杆菌在冷却肉保鲜中的应用。

3.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其特征在于，接种量为2％，培养温度为37℃，培养基含有：乙酸钠0.7％、K₂HPO₄0.2％、蔗糖2.5％、大豆蛋白胨2.5％、吐温-800.1％，pH为6，其中乙酸钠、K₂HPO₄、蔗糖以及大豆蛋白胨的含量按照重量百分比计，吐温-80的含量按照体积比计。

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