CN101208079B - 抑制紫外光诱导的皮肤癌发生的药物 - Google Patents
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Abstract
给予异硫氰酸酯抵抗紫外光诱导的皮肤癌发生。具体的说,在暴露于紫外光辐射后局部给予或膳食给予萝卜硫素这种异硫氰酸酯,能提供抗皮肤肿瘤形成的有效保护作用。还可应用萝卜硫素类似物和芥子油苷。还提供了可用于抑制紫外光诱导的皮肤癌发生的洗剂。
Description
发明背景
皮肤癌发生率稳步上升,已达到流行性比例:新皮肤癌诊断的平均上升率自上世纪六十年代以来每年为3-8%,非黑素瘤皮肤癌目前是美国最普通类型的癌症,每年新病例超过100万(1,2)。预期这个发生率的稳步增加将继续,主要原因在于同温层臭氧损耗,人们暴露于阳光辐射增加和平均寿命更长。根据美国国家癌症研究所的估计,年龄65岁以上的美国人40-50%会发生皮肤癌至少一次,发生另外的肿瘤的风险也很高(1,2)。因此,急切需要详细了解潜在的风险因素和开发新的预防策略。
广为认同的是,紫外光辐射是造成大多数非黑素瘤皮肤癌的主要因素。紫外光辐射可能是最普遍存在的环境诱癌剂和导致非黑素瘤皮肤癌的主要因素。紫外光辐射暴露至少有三种不同作用促使皮肤中的癌发生过程:(i)直接DNA损伤,其导致DNA光产物例如环丁烷-嘧啶二聚体和嘧啶-嘧啶酮产物的形成(37);(ii)氧化应激相关DNA损伤,其由活性氧中间体(ROI)的形成所致(39);(iii)免疫抑制,其导致对遗传不稳定性的容忍度提高(40)。在人皮肤癌样品中已检测出原癌基因(ras)以及肿瘤抑制基因(p53和PTCH)的突变(41,42)。p53的点突变据认为代表了许多形式的癌发生,包括皮肤肿瘤的发展的早期事件(1,38,41)。具有这种突变的细胞可产生显示遗传不稳定性的克隆,发生克隆扩充后最终就发展成癌症。
在多个涉及多种化学致癌剂的动物模型中,在不存在任何化学引发剂或促进剂下显示皮肤癌的预防。预防剂的抑制作用的机理在于直接抗氧化活性及对凋亡和信号传导途径的变更。差不多30年前就证明,一些据认为主要是抗氧化剂的物质例如丁羟甲苯,能显 著抑制小鼠中紫外光辐射诱导的红斑和肿瘤发展(5,6)。预防剂的范围已逐渐扩大到包括硒、锌以及植物抗氧化剂,例如水飞蓟素(silymarin)、大豆异黄酮、茶叶多酚,并已提出它们的局部给予可补充防晒剂保护皮肤免受紫外光辐射的用途(51)。绿茶、红茶和它们的成分例如多酚、咖啡因和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯在局部给予或膳食给予时,能有效预防紫外光处理的高风险小鼠的癌发生(24,25,52)。绿茶多酚处理还能抑制人皮肤中紫外光辐射引起的红斑和DNA嘧啶二聚体的形成(53)。奇特的是,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯和萝卜硫素(sulforaphane,1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷)非常相似,能显示多种生物效应:抗氧化剂应答元件(ARE)介导的2相(phase 2)基因表达的诱导、促细胞分裂剂激活的蛋白激酶的激活、胱天蛋白酶-3活性的刺激和细胞凋亡(54)。此外,用(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯对人皮肤进行预处理,能预防紫外光诱导的红斑和相关炎症以及过氧化氢和氧化氮的产生,修复紫外光诱导的谷胱甘肽(GSH)和GSH过氧化物酶的损耗(50)。
早期在小鼠模型中进行的研究表明,补充抗氧化剂的膳食(例如含有丁羟甲苯[BHT]的膳食)能显著抑制由紫外光辐射(4,5)或多环芳烃/佛波酯(6)诱导的皮肤癌发生。已证实BHT和其它酚类抗氧化剂能诱导2相解毒酶,保护啮齿动物免受苯并[α]芘的诱变性代谢物的影响(7)。另外,BHA的局部给予或膳食给予能抑制小鼠表皮中鸟氨酸脱羧酶(肿瘤促进作用的早期指标)的佛波酯依赖性诱导。
产生反应性中间体(例如亲电体、反应性氧和氮物类(species))的细胞内过程与相对立的解毒和自由基清除反应之间的平衡,决定了最终的致癌剂暴露结果(9)。设计出化学手段和膳食手段来将该平衡偏移向后一途径,即诱导能催化2相解毒反应的酶,这是保护免于肿瘤形成的主要策略(10)。特别引人注目的是通过使用存在于可食植物的诱导剂来实行这一策略,因为这些诱导剂已知是人类膳食的成分而被认为毒性低。
萝卜硫素这种异硫氰酸酯就是一种这样的诱导剂。从嫩茎花椰菜(broccoli)分离出了萝卜硫素,由其诱导2相酶的能力得知它是主要的诱导剂(11)。整株植物含有萝卜硫素的前体——萝卜苷(glucoraphanin)这种芥子油苷。植物细胞受到损伤时,萝卜苷会接触到本来被区室化的黑芥子酶(myrosinase,一种催化其水解的硫葡糖苷酶),导致作为主要反应产物的萝卜硫素的形成。后来的研究揭示,3天龄嫩茎花椰菜芽中该诱导剂的活性比成熟植株高20-50倍,且该活性90%以上可归因于萝卜苷(12)。
除了是目前所知的最强效的天然2相酶诱导剂之一外,萝卜硫素还显示另外的抗癌活性。例如,萝卜硫素能刺激细胞凋亡和抑制增殖(13,14),具有抗炎作用(15)和能抑制组蛋白脱乙酰酶(16)。另外,萝卜硫素能保护几种类型的培养细胞免于各种生物氧化剂(例如4-羟基壬烯醛、过氧亚硝酸根、甲萘醌、叔丁基氢过氧化物)的毒性(17),以及抗全反式视黄醛和UVA光(长波紫外光)所产生的光氧化作用(18)。
但是,萝卜硫素是否能抵抗紫外光诱导的癌发生还有待确定。因此,需要另外的试验和方法。
发明概述
在一个实施方案中,萝卜硫素这种异硫氰酸酯的给予抵抗紫外光诱导的皮肤癌发生。在另一个方面,提供了抑制患者的紫外光诱导皮肤癌发生的方法,所述方法包括给予已暴露于紫外光的患者治疗有效量的萝卜硫素或萝卜硫素类似物。在一个实施方案中,萝卜硫素透皮给予或口服给予。在另一个实施方案中,萝卜硫素衍自嫩茎花椰菜苗芽(sprout),透皮给予或口服给予。
也可应用萝卜硫素类似物来抵抗紫外光诱导的皮肤癌发生。这种萝卜硫素类似物可选自6-异硫氰酰基-2-己酮(6-isothiocyanato-2-hexanone)、外-2-乙酰基-6-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-异硫氰酰基-6- 甲磺酰基降冰片烷、6-异硫氰酰基-2-己醇、1-异硫氰酰基-4-二甲基膦酰丁烷、外-2-(1′-羟乙基)-5-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-乙酰基-5-异硫氰酰基降冰片烷、1-异硫氰酰基-5-甲磺酰基戊烷、异硫氰酸顺-3-(甲磺酰基)环己基甲酯(cis-3-(methylsulfonyl)cyclohexylmethylisothiocyanate)和异硫氰酸反-3-(甲磺酰基)环己基甲酯。也可使用其它的异硫氰酸酯。同样,也可应用口服芥子油苷来抵抗紫外光诱导的皮肤癌发生。
在另一个实施方案中,提供了用于抑制患者的紫外光诱导皮肤癌发生的洗剂,所述洗剂包含治疗有效量的萝卜硫素。还提供了包含异硫氰酸酯或芥子油苷的洗剂。
由以下详细描述,本发明的其它目标、特征和优点将变得显而易见。此外,各实施例说明的是本发明的原理,不能预期它们能具体说明本发明在本领域技术人员明显知道有用的所有实际情况中的应用。
附图简述
图1示出PE鼠角质形成细胞(A)和人HaCaT角质形成细胞(B)中作为萝卜硫素浓度函数的NQO1诱导(■)和GSH升高(○)。将细胞接种于96孔板上(20,000个/孔),暴露于一系列浓度的萝卜硫素。分别在24小时和48小时后,测量细胞裂解液中的GSH和NQO1水平。每个数据点代表8个不同孔的测量值的平均值。所有数据点的标准偏差均小于5%。
图2的图表显示了PE鼠角质形成细胞中萝卜硫素所提供的抗UVA辐射产生的反应性氧中间体的保护作用。将细胞接种于24孔板上(50,000个/孔),用5μM萝卜硫素处理24小时,用DPBS洗涤,然后暴露于UVA(10J/cm2)。紫外光辐射所产生的反应性氧中间体通过荧光探针2′,7′-二氯二硝基荧光素定量,并测量荧光强度(以暴露细胞与非暴露细胞之比表示)。
图3显示健康人志愿者单次局部给予100nmol萝卜硫素后人皮肤中醌还原酶(NQO1)诱导情况的时程。
图4显示健康人志愿者以24小时间隔重复三次局部给予50nmol萝卜硫素后人皮肤中NQO1的诱导情况。
图5显示萝卜硫素对用γ-干扰素或脂多糖刺激的RAW 264.7细胞中的(A)NO产生、(B)iNOS mRNA和(C)iNOS蛋白质诱导所造成的抑制作用。用各种浓度的萝卜硫素和IFNγ(10ng/ml)或脂多糖(LPS;3ng/ml)处理细胞24小时。培养基中的NO通过Griess反应以亚硝酸盐计进行测量(A),iNOS诱导通过RNA印迹(B)和蛋白质印迹(C)进行检测。
图6A和6B显示萝卜硫素对高风险小鼠中UVB辐射诱导的皮肤癌发生的抑制作用。
图7示出透皮给予萝卜硫素对高风险小鼠中的总体肿瘤负荷的抑制作用。肿瘤负荷表示为所有肿瘤的总体积(mm3)除以风险小鼠的数量。显示了平均值±SE。在对数变换肿瘤体积时存在着令人注目的高度显著的浓度(处理)作用(p<0.0027)(以处理时间为嵌套变量对浓度进行的方差分析(ANOVA))。
图8的图表显示萝卜硫素对小肿瘤(<1cm3,白色柱条)和大肿瘤(>1cm3,黑色柱条)的个数的影响。用保护剂或介质处理11周后,对照组的肿瘤发生率为100%,从而终止实验。所有小鼠都在同一天处以安乐死,并测量肿瘤大小。每周5次向动物背部施用低剂量(0.3μmol)萝卜硫素或高剂量(1.0μmol)萝卜硫素。
图9提供的图表显示接受萝卜硫素膳食给予的高风险小鼠中的肿瘤发生率(带肿瘤小鼠的百分数)。对照组以圆形表示,低剂量组以正方形表示,高剂量组以三角形表示。与对照组相比,接受低剂量和高剂量萝卜苷的动物中其肿瘤发生率分别降低25%和35%。
图10提供的图表显示接受萝卜硫素膳食给予的高风险小鼠中的肿瘤个数(每只小鼠的肿瘤数量)。对照组以圆形表示,低剂量组以 正方形表示,高剂量组以三角形表示。与对照组相比,肿瘤个数分别降低47%和72%。
图11提供的图表显示接受萝卜硫素膳食给予的高风险小鼠的每鼠肿瘤负荷(总肿瘤体积)。对照组以圆形表示,低剂量组以正方形表示,高剂量组以三角形表示。与对照组相比,低剂量和高剂量萝卜苷处理均导致每鼠总肿瘤体积的70%抑制。
发明详述
萝卜硫素这种异硫氰酸酯的给予抵抗紫外光诱导的皮肤癌发生。具体的说,在紫外光辐射暴露后局部给予或膳食给予萝卜硫素提供抗皮肤肿瘤形成的有效保护。
在某些植物中已检测出化学保护活性,这些活性能够诱导将致癌剂解毒的酶(II相酶)的活性。在嫩茎花椰菜中已检测出一种这样的活性,该活性能诱导鼠肝癌细胞中和小鼠器官中的醌还原酶活性和谷胱甘肽S-转移酶活性。已从嫩茎花椰菜中纯化出该活性,经鉴定为萝卜硫素。另外,已合成了萝卜硫素的类似物,用来确定结构-功能关系。
已发现萝卜硫素能提供抗紫外光诱导的皮肤癌发生的保护作用。具体的说,在紫外光辐射暴露后给予萝卜硫素,能提供抗皮肤肿瘤形成的有效保护。
也可应用其它的异硫氰酸酯。异硫氰酸酯是含有异硫氰酸根(NCS)部分的化合物,本领域普通技术人员很容易就鉴别出来。有关异硫氰酸酯类似物的说明和制备在美国再颁专利36,784中描述,该专利通过引用整体结合到本文中。在一个优选的实施方案中,用于本发明的萝卜硫素类似物包括6-异硫氰酰基-2-己酮、外-2-乙酰基-6-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-异硫氰酰基-6-甲磺酰基降冰片烷、6-异硫氰酰基-2-己醇、1-异硫氰酰基-4-二甲基膦酰丁烷、外-2-(1′-羟乙基)-5-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-乙酰基-5-异硫氰酰基降冰片烷、1- 异硫氰酰基-5-甲磺酰基戊烷、异硫氰酸顺-3-(甲磺酰基)环己基甲酯和异硫氰酸反-3-(甲磺酰基)环己基甲酯。
在另一个实施方案中,还可使用异硫氰酸酯的前体芥子油苷来抑制紫外光诱导的皮肤癌发生。芥子油苷能容易地被本领域普通技术人员辨认和鉴别,在Fahey等,Phytochemistry,56:5-51(2001)中有综述,该文献的全部内容通过引用结合到本文中。
包含萝卜硫素、异硫氰酸酯、芥子油苷或它们的类似物的组合物可以通过多种途径给予,这种组合物还包含多种载体或赋形剂。
所谓“药物可接受的载体”意指但不限于无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、任何类型的包囊材料或配方助剂如脂质体。
用于胃肠外注射的本发明药物组合物可包括药物可接受的无菌水溶液剂或非水溶液剂、分散剂(dispersion)、混悬剂或乳剂以及无菌散剂,该无菌散剂在临用前可重构成无菌可注射溶液剂或分散剂。合适的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适混合物,植物油(如橄榄油)和可注射有机酯如油酸乙酯。适当的流动性可例如如下进行维持:使用包衣材料如卵磷脂,在分散剂的情况下维持所需的颗粒大小,使用表面活性剂。
本发明的组合物还可含有佐剂,例如但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。掺入各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如尼泊金酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等,能确保防止微生物的作用。还宜包括等渗剂如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可通过掺入能延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来达成。
在一些情况下,为延长药物的作用,宜延缓从皮下或肌肉内注射的吸收作用。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体混悬剂来实现。这样药物的吸收速度取决于其溶解速度,而溶解速度又取决于晶体大小和晶形。或者,胃肠外给予的药物形式的延 长吸收可通过将该药物溶解或悬浮于油介质来实现。
药物的透皮给予对患者来说往往方便和舒适。在这个实施方案中,萝卜硫素存在于载体中。术语“载体”指适合于促进透皮给药的载体材料,包括任何本领域公知的这种材料,例如任何无毒且不以有害方式与组合物的其它成分或与皮肤发生显著相互作用的液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂、聚合物等。
可注射储库形式(depot form)通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯中形成药物的微囊基质(microencapsule matrix)来制备。可根据药物与聚合物的比例和所采用的具体聚合物的性质,对药物释放的速度进行控制。其它的生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酐。可注射储库制剂还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳状液中来制备。
可注射制剂可例如通过将其滤过细菌滤器或者对其掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌,所述灭菌剂在临用前能溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
口服给药的固体剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这种固体剂型中,活性化合物与至少一种药物可接受的赋形剂或载体混合,如柠檬酸钠或磷酸二钙,和/或a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸,b)粘合剂例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶,c)保湿剂如甘油,d)崩解剂如琼胶、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠,e)溶液阻滞剂如石蜡,f)吸收加速剂如季铵化合物,g)湿润剂例如乙酰醇(acetyl alcohol)和甘油单硬脂酸酯,h)吸附剂如高岭土和膨润土,i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下,剂型还可包含缓冲剂。
还可这样应用相似类型的固体组合物,即将其作为填充物用诸如乳糖及高分子量聚乙二醇等的赋形剂填充在软明胶胶囊和硬明 胶胶囊中。
片剂、糖衣丸剂(dragee)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型,可以用包衣料(coating)和壳料(shell)如肠溶衣和药物制剂领域公知的其它包衣料来制备。它们任选含有遮光剂,并且它们的组成可以是使得它们仅仅或优先地在肠道的某个部位中,任选地以延迟方式,释放出活性成分。可以使用的嵌入组合物(embedding composition)的实例包括聚合物物质和蜡。
适当的话,活性化合物也可为与一种或多种上述赋形剂所成的微囊化形式。
口服给药的液体剂型包括但不限于药物可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外,液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂如水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂外,口服组合物还可包含佐剂例如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。
混悬剂除了含有活性化合物外还可含有悬浮剂,例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯类、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼胶和黄蓍胶以及它们的混合物。
本发明的膳食组合物是任何含有萝卜硫素、异硫氰酸酯、芥子油苷或它们的类似物的可摄取制品。例如,可将萝卜硫素、异硫氰酸酯、芥子油苷或它们的类似物与食物产品混合。食物产品可以是干燥的、烹调的、煮熟的、冷冻干燥的或焙烤的。所设想的众多不同食物产品包括面包、茶叶、汤、谷物、色拉、三明治、苗芽、蔬菜、动物饲料、丸剂、片剂。
本领域普通技术人员会认识到,本发明物质的有效量可以经 验确定,且可以以纯净形式应用,或者以药物可接受的盐、酯或药物前体形式(如果这种形式存在的话)应用。本发明组合物的“治疗有效”量可通过正在治疗的疾病、损伤或机能失调的不利状态或症状的预防或改善情况来确定。可将物质作为与一种或多种药物可接受的赋形剂组合而成的药物组合物给予暴露于紫外光辐射的患者。应认识到,当给予人患者时,本发明物质或组合物的总日剂量须由主治医师在可靠的医学判断范围内作出决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平会取决于多种因素:所要达到的细胞或生理响应的类型和程度;所采用的具体物质或组合物的活性;所采用的具体物质或组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;给药时间、给药途径和物质的排泄速度;治疗的持续时间;与具体物质组合使用或同时使用的药物;以及医疗领域公知的类似因素。例如,本领域的做法是,物质一开始的剂量水平低于为达到所需治疗作用而要求的水平,然后逐渐增加剂量,直到达到所需的作用。
本公开制品的潜在商业应用包括例如(i)保护性/预防性应用、(ii)美容应用和(iii)医疗应用。在一个实施方案中,提供了供局部给予的保护性洗剂和乳剂(crème),它们或为油基(萝卜硫素),或为水基(萝卜苷加水解剂)。在另一个实施方案中,可将含萝卜硫素的组合物与防晒剂组合。
实施例
实施例1.从嫩茎花椰菜芽制备萝卜硫素
按Fahey等(12)的描述,对经认证没有用任何杀虫剂或其它种子处理化学药品处理过的嫩茎花椰菜(Brassica oleracea italica,cv.DeCicco)种子进行发芽和处理。简单的说,用含有微量ALconox去污剂的Clorox漂白剂的25%水溶液对种子进行表面消毒,用水彻底清洗。然后将种子在倾斜的打孔塑料盘中铺成一层,用过滤水喷雾30秒钟,每小时约6次,上有荧光灯照明。3天后将苗芽直接投入蒸汽 夹套锅中的沸水中使其停止生长,使蒸汽夹套锅再沸腾并搅拌约5分钟。这个处理将苗芽的内源黑芥子酶灭活并提取芥子油苷。经过HPLC测定(26)发现,萝卜硫素的前体萝卜苷是初始提取物中的主要芥子油苷。接着按Fahey等,1997和Shapiro等,2001(12,27)的描述,加入萝卜苗芽黑芥子酶,以将芥子油苷定量转化成异硫氰酸酯。然后将这一制品冻干,溶于乙酸乙酯中,旋转蒸发至干,溶于少量的水中,加入丙酮至终浓度为80%丙酮∶20%水(v/v)中含50mM萝卜硫素。总异硫氰酸酯含量通过环化缩合反应(28)来测定(12,27),芥子油苷的完全消失通过HPLC(26)来确认,黑芥子酶反应所释放的各种异硫氰酸酯的精确比例通过HPLC以乙腈梯度进行确定,发现与提取物的芥子油苷概况(profile)相匹配。萝卜硫素占异硫氰酸酯含量的90%以上。将这一制品稀释在80%丙酮(v/v)中,产生“高剂量”(1.0μmol/100μl)和“低剂量”(0.3μmol/100μl)。Prochaska试验中的生物测定(29,30)产生的CD值(使NQO1的活性翻倍所要求的浓度)与先前的试验一致(11)。
实施例2.用萝卜硫素处理角质形成细胞
谷胱甘肽是主要的和最丰富的细胞非蛋白质硫醇,构成细胞防卫的关键部分:它能容易地与潜在危害性亲电体反应,通过清除自由基和还原性过氧化物参与反应性氧中间体及其毒性代谢物的解毒。增加细胞GSH水平的能力对于抗击氧化应激至关重要。为此,我们研究了角质形成细胞培养物中萝卜硫素诱导的2相应答抵抗UVA所致氧化应激的能力。本研究之所以选择UVA,是因为它的基因毒性据认为主要由于反应性氧中间体的产生所致。
细胞培养
将HaCaT人角质形成细胞(G.Tim Bowden,Arizona CancerCenter,Tucson惠赠)在补充有5%FBS的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养;将PE鼠角质形成细胞(Stuart H.Yuspa,National Cancer Institute,Bethesda,MD惠赠)在补充有8%FBS、用Chelex树脂(Bio-Rad)处理以除去Ca2+的Eagle极限必需培养基(EMEM)中培养。
醌还原酶(NQO1)和谷胱甘肽测定
使细胞在96孔板中(20,000个/孔)生长24小时,然后暴露于萝卜硫素系列稀释液24小时(谷胱甘肽测定)或48小时(NQO1测定),最后在0.08%洋地黄皂苷中裂解。取等分试样(25μl)进行蛋白质分析。NQO1的活性通过Prochaska试验(29,30)测定。为测量胞内谷胱甘肽水平,以25μl的细胞裂解液接受50μl用冰预冷的偏磷酸(50g/升,于2mM EDTA中),使细胞蛋白质沉淀。在4℃下10分钟后,将板在1,500g下离心15分钟,所得上清液部分取50μl转移到平行板中。向这些孔的每一个中加入50μl的200mM磷酸钠缓冲液(pH7.5,含10mM EDTA),通过循环测定法(recycling assay)中的速度测量(31,32)来测定总细胞谷胱甘肽。
细胞的紫外光辐射和反应性氧中间体的测定
将PE细胞(50,000个/孔)接种到24孔板中,生长48小时。然后将细胞暴露于1μM或5μM萝卜硫素24小时。在实验的当天,除去培养基后,将细胞与100μM 2′,7′-二氯二硝基荧光素二乙酸酯在500μl新鲜培养基(Molecular Probes,Eugene,OR)中温育30分钟。然后除去含有荧光探针的培养基,将细胞用DPBS洗涤,暴露于UVA辐射(10J/em2)。对照细胞保持在暗处。用胰蛋白酶解离细胞,悬浮在2.0mlDPBS中,将细胞悬浮液在Perkin-Elmer LS50分光荧光计的2ml比色皿中,以485nm激发波长在520nm下测定荧光强度。
当HaCaT人角质形成细胞或PE鼠角质形成细胞暴露于萝卜硫素时,NQO1和谷胱甘肽的胞内水平以剂量依赖性方式增加(图1A,B),这与先前的观察结果(Ye和Zhang,2001)一致。特别惊人的是,HaCaT细胞中NQO1诱导的幅度高(大于10倍)而无任何明显的细胞毒性迹象。通过荧光探针2′,7′-二氯二硝基荧光素(35)定量分析表明, 用5μM萝卜硫素处理24小时,造成紫外光辐射所产生的反应性氧中间体大大(50%)降低。
实施例3.小鼠中萝卜硫素的局部给予对NQO1和GSH的作用
接下来在SKH-I无毛小鼠中体内评估2相应答。雌性SKH-I无毛小鼠(4周龄)获自Charles River Breeding Laboratories(Wilmington,MA),实验开始前在我们的动物设施中适应2周。将动物以12小时光照/12小时黑暗循环、35%湿度进行圈养,自由获取水和丸状AIN76A膳食(Harlan TekLad,无诱导物)。所有动物实验均符合美国国立卫生研究院指南(National Institutes of Health Guidelines),并得到约翰-霍普金斯大学动物管理与使用委员会(Johns Hopkins University AnimalCare and Use Committee)的批准。
用100μl标准化的黑芥子酶水解的嫩茎花椰菜苗芽提取物(含1μmol萝卜硫素)或介质(100μl 80%丙酮∶20%水,v/v),在7周龄SKH-I无毛小鼠(每组5只)的背上进行局部处理。24小时后对动物处以安乐死,用矩形模板(rectangular template,2.5×5cm)切出背部皮肤,在液氮中冻藏。将皮肤样品在液氮中研磨成粉,取100mg所得粉末在1ml的0.25M蔗糖(用10mM Tris-HCl,pH7.4缓冲)中匀浆,以作NQO1酶活性和蛋白质含量分析,或在1ml的冰预冷的偏磷酸(50g/升,2mM EDTA中)中匀浆,以作谷胱甘肽分析。在4℃下14,000g离心20分钟,产生澄清的上清液部分,其等分试样用于按下文对细胞培养实验所述进行蛋白质含量、酶活性和总谷胱甘肽水平的测定。
结果显示,受处理动物与对照相比,萝卜硫素的局部给予产生约50%的NQO1诱导(P<0.001)和约15%的总谷胱甘肽水平升高。
实施例4.人体中萝卜硫素的局部给予对NQO1和GSH的作用
这个由健康的人志愿者参与的研究按照约翰-霍普金斯大学的机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的方案进行。研究了 将单剂量的嫩茎花椰菜苗芽提取物局部给予到健康人志愿者皮肤的安全性。将提取物在80%丙酮∶20%水中制备,其萝卜硫素含量通过环缩合测定法进行精确测定,该测定法是我们实验室日常使用的对异硫氰酸酯及其二硫氨基甲酸酯代谢物进行定量的方法。在每个参与者的前臂手掌皮肤上画一个圆圈(直径1cm),然后用正位移移液管将提取物施用到圆圈内。两个受试者参与了所给予的8个递增剂量的每一个(0.3、5.3、10.7、21.4、42.7、85.4、170和340nmol萝卜硫素)。各受试者充当自己的对照,接受安慰剂“介质涂敷(vehicle spot)”。在任何这些剂量没有观察到不良反应。
还进行了功效研究。终点是在单剂量施用嫩茎花椰菜苗芽提取物后,测定2名健康人志愿者的3mm皮肤点啄活检(punch biopsy)中醌还原酶(一种原型2相蛋白质(prototypic Phase 2 protem))的酶活性。同样,各受试者充当自己的对照,接受“介质涂敷”。醌还原酶活性和蛋白质含量在这些样品中都得到可靠的检测。在施用含100nmol萝卜硫素的提取物24小时后,醌还原酶的比活性增加约2倍(图3)。引人注目的是,诱导作用是长效的,因为即使当在施用提取物后72小时进行活组织检查,残留的醌还原酶活性也仍比安慰剂处理部位要高。
接着研究三次重复局部施用(每次间隔24小时)含有50nmol萝卜硫素的嫩茎花椰菜苗芽提取物的作用。这导致2名健康人志愿者的下层皮肤中的醌还原酶(NQO1)比活性更大的上升(图4)。
实施例5.萝卜硫素对可诱导氧化氮合酶的作用
我们最近在一系列的合成三萜类化合物当中,发现了炎症反应的抑制功效(γ-干扰素对iNOS和COX-2的激活)与2相酶的诱导之间跨越6个数量级的线性相关性(20)。
将RAW 264.7巨噬细胞(5×105个细胞/孔)接种到96孔板中,与萝卜硫素和10ng/ml IFN-γ或3ng/ml LPS温育24小时。通过Griess 反应以亚硝酸盐计测量氧化氮(NO)。当将RAW 264.7细胞与γ-干扰素或脂多糖(LPS)以及各种浓度的萝卜硫素一起温育24小时时,存在对NO形成的剂量依赖性抑制作用,对两种细胞因子的IC50为0.3μM(图5A)。
与这个结果一致的是,RNA印迹和蛋白质印迹分析揭示iNOSmRNA和蛋白质的合成也被抑制(图5B,C)。将RAW 264.7巨噬细胞(2×106个细胞/孔)与萝卜硫素和10ng/ml IFN-γ或3ng/ml LPS温育过夜。对于RNA印迹,按先前的描述(33)用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA,并加以制备以作印迹分析。iNOS和GAPDH的探针用随机引物放射标记以[γ-32P]dCTP。对于蛋白质印迹,使总细胞裂解液进行SDS/PAGE,转移到膜上,用iNOS和β-肌动蛋白抗体(Santa CruzBiotechnology)探测。
这些发现表明,暴露于萝卜硫素能通过γ-干扰素或脂多糖抑制iNOS的诱导,削弱在癌发生过程中起到作用的炎症反应。
实施例6.萝卜硫素的局部施用对紫外光诱导的癌发生的作用
使SKH-I无毛小鼠每周两次连续20周暴露于相对低剂量的UVB辐射(30mJ/cm2),导致产生“高风险小鼠”,它们随后在没有进一步的紫外光处理下发展了皮肤肿瘤(24,25)。这个动物模型高度对应于童年时大量暴露于阳光、成年后暴露得到限制的人们。另外,它使得可以在辐射安排完成后对潜在的化疗保护剂进行评估,从而排除或许稍带颜色的苗芽提取物保护性制品的“滤光效应”的可能性。因此,用100μl含有0.3μmol(低剂量)或1μmol(高剂量)萝卜硫素的标准化黑芥子酶水解嫩茎花椰菜苗芽提取物,对UVB预处理的高风险小鼠进行每周5天每天1次连续11周的局部处理。对照组接受介质处理。每周测定体重和直径大于1mm的肿瘤形成。
UVB辐射由能发射UVB(280-320nm,占总能量的65%)和UVA(320-375nm,占总能量的35%)的一排紫外灯(FS 72T 12-UVB- HO,National Biological Corporation,Twinsburg,OH)提供。UVB的辐射剂量用UVB Daavlin Flex Control Integrating剂量计定量并用IL-1400辐射计(International Light,Newburyport,MA)进一步校准。
每周星期二和星期五以30mJ/cm2/期的辐射暴露剂量对小鼠进行辐射20周。一周后,将小鼠分成三组:每个处理组29只小鼠,对照组33只小鼠。两个处理组的小鼠接受100μl含有1μmol(高剂量)或0.3μmol(低剂量)萝卜硫素的嫩茎花椰菜苗芽提取物的局部施用,对照组小鼠接受100μl的介质。每周5天连续11周反复进行处理,期间对照组的所有小鼠都具有至少一个肿瘤而结束实验。每周记录肿瘤(定义为直径大于1mm的损伤)和体重。肿瘤体积通过测量直径大于1mm的每个肿块的长宽高来测定。将三个测量值的平均值当作直径计算体积(v=4πr3/3)。所有小鼠都在同一天处以安乐死,测定肿瘤的大小和个数。用矩形模板(2.5×5cm)切出背部皮肤,涵括小鼠的整个受处理区域。将各块皮肤钉到纸板上,照相,在用冰预冷的10%磷酸盐缓冲福尔马林中4℃下固定24小时。
各组间在平均体重和重量增加上没有差异。实验开始时的体重(平均值±SD)为:对照组22.3±1.9g,低剂量处理组22.2±1.9g,高剂量处理组23.0±1.9g。实验结束时(31周后),体重分别为:32.1±9.7g、31.9±8.8g和32.1±6.9g。在辐射结束后2周,即用保护剂进行的局部处理开始后1周,开始最早的大于1mm的损害。在这个时间点,对照组、低剂量处理组和高剂量处理组分别有3、6和4只小鼠发展其第一个肿瘤。
高剂量处理的小鼠极大地受保护免于紫外光辐射的致癌作用。因此,在实验终止时进行11周处理后,对照组100%的动物发展肿瘤,而每日用含有1μmol萝卜硫素的苗芽提取物处理的小鼠有48%不发展肿瘤(图6A)。值得注意的是,有三只动物(对照组2只,低剂量处理组1只)因为其肿瘤直径接近2cm在实验结束前1周被处于安乐死。对各个存活函数的同等性(equality of survivor functions)所 作的Kaplan-Meier存活分析和接着进行的分层对数秩检验和Wilcoxon检验表明,各个处理之间存在高度显著的差异(P<0.0001)。对于最后三个观察期(第9、10和11周)的每一个,1μmol处理与0.3μmol处理和对照处理都有差异,置信水平为95%。0.3μmol处理和对照处理之间在任何时间点都没有显著差异。
图6B显示处理对肿瘤数的总体作用高度显著(p<0.001)。对1.0μmol剂量水平与对照所作的ANOVA比较显示出高度显著的总体作用(p<0.001),但差异只在第9周后才变得显著:第9、10和11周所作观察分别为p<0.0794、p<0.0464和p<0.0087。显示了平均值±SE。
除了肿瘤发生率和个数减少外,肿瘤的出现也显著延迟。50%对照组风险动物在辐射结束后6.5周具有肿瘤,而50%的高剂量处理的风险动物要花10.5周才发展肿瘤。值得注意的是,保护剂延迟癌发生过程的能力正在成为日益受到重视的化疗预防概念。类似地,肿瘤个数减少了58%:处理组每只小鼠的平均肿瘤数为2.4个,而对照组为5.7个。
虽然低剂量处理组和介质处理组之间在肿瘤发生率和个数上没有差异(图6A,B),但在第9、10和11处理周低剂量处理组的每只小鼠其总体肿瘤负荷(以体积m3表示)分别大大地小了86%、68%和56%(图7)。随着处理时间的推移似乎出现有效性的降低,这是因为在实验的最后2周大肿瘤(>1cm3)快速生长。高剂量处理组的总体肿瘤负荷在第9、10和11处理周更是分别引人注目地减少91%、85%和46%。有趣的是,这个处理组的一些小鼠在没有施用提取物的头部发展了肿瘤,但在施用了保护性提取物的背部没有肿瘤。
尽管对各个肿瘤的组织学表征尚未完成,但这个动物模型始终是导致形成大约80%的小非恶性肿瘤(主要是角化棘皮瘤和一些乳头状瘤)和大约20%的大恶性肿瘤(鳞状细胞癌)(24,25)。我们将所有肿瘤按其体积分成两类:“小肿瘤”(<1cm3)(图8白色柱条)和“大肿瘤”(>1cm3)(图8黑色柱条)。用苗芽提取物进行处理并没有使各 实验组之间在大肿瘤个数上有差距,对照组的所有33只小鼠中有17个大肿瘤,低剂量处理组的所有29只小鼠中有19个,高剂量处理组的所有29只小鼠中有16个。与此对比,嫩茎花椰菜苗芽提取物对小肿瘤的数量产生剂量依赖性抑制作用:对照组、低剂量处理组和高剂量处理组分别为170个、123个和54个。可能的是,未受影响的肿瘤起源于直接紫外光辐射诱导DNA光产物所致的突变已积累的细胞,而提取物主要抑制由氧化应激诱导的DNA损伤所产生的致癌过程。已有类似的现象得到报道,该现象是染料木黄酮这一大豆异黄酮在小鼠皮肤中抑制了脂质过氧化产物H2O2和8-羟基-2′-脱氧鸟苷的产生,但对因响应紫外光辐射而形成的嘧啶二聚体没有作用(36)。
统计分析
用Kaplan-Meier存活分析接着是分层对数秩检验和Wilcoxon检验评估肿瘤发生率,用于存活函数的同等性。通过ANOVA评估肿瘤个数,对所有处理和对单个、成对处理作比较(t检验)。肿瘤体积通过ANOVA以处理时间为嵌套变量进行评估。这些计算用Stata7.0(College Station,TX)来进行。其它统计用Excel来计算。
实施例7.冷冻干燥的嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末的制备
按实施例1的描述,用嫩芽花椰菜(Brassica oleracea italica,cv.DeCicco)的种子长出苗芽。3天后,将苗芽投入沸水中,继续煮沸约30分钟,以使生长停止。这个处理将苗芽的内源黑芥子酶灭活并提取芥子油苷。经过HPLC测定(26)发现,萝卜硫素的前体萝卜苷是提取物中的主要芥子油苷。然后将该制品冻干,产生含有约8.8%重量萝卜苷的富含芥子油苷的粉末。将粉末与小鼠食物(粉末化的AIN 76A)混合,混合当量为每3克食物10μmol(低剂量)或50μmol(高剂量)萝卜苷。
实施例8.萝卜硫素的膳食给予对紫外光诱导的癌发生的作用
在本研究中,给经短波紫外光预处理的高风险小鼠连续13周饲喂掺入了根据实施例6制备的冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末(相当于10μmol/天[低剂量]和50μmol/天[高剂量]萝卜苷,萝卜苷是萝卜硫素的芥子油苷前体,存在于整株植物中,其被小鼠摄取后约10%被转化成萝卜硫素)。对照组的食物不含任何冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末。每周测定体重和直径大于1mm的肿瘤形成。
UVB辐射由能发射UVB(280-320nm,占总能量的65%)和UVA(320-375nm,占总能量的35%)的一排紫外灯(FS72T12-UVB-HO,National Biological Corporation,Twinsburg,OH)提供。UVB的辐射剂量用UVB Daavlin Flex Control Integrating剂量计定量并用IL-1400辐射计(International Light,Newburyport,MA)进一步校准。
每周星期二和星期五以30mJ/cm2/期的辐射暴露剂量对动物进行辐射20周。一周后,将小鼠分成三组:每个处理组30只小鼠,对照组30只小鼠。两个处理组的小鼠接受掺入了冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末的食物。低剂量处理组的食物包括相当于10μmol/天萝卜苷的冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末,而高剂量处理组的食物包括相当于50μmol/天萝卜苷的冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末。对照组的食物不含冻干嫩茎花椰菜苗芽提取物粉末。给小鼠饲喂这一食物13周。13周后,93%的对照组小鼠发展肿瘤,从而实验结束。
肿瘤体积通过测量直径大于1mm的每个肿块的长宽高来测定。将三个测量值的平均值当作直径,计算体积(v=4πr3/3)。所有小鼠都在同一天处以安乐死,测定肿瘤的大小和个数。用矩形模板(2.5×5cm)切出背部皮肤,涵括小鼠的整个受处理区域。将各块皮肤钉到纸板上,照相,在冰预冷的10%磷酸盐缓冲福尔马林中4℃下固定24小时。
与对照组小鼠相比,接受低剂量和高剂量萝卜苷的动物其肿瘤发生率(带肿瘤小鼠的百分数)分别降低25%和35%。(图9)
处理对肿瘤个数(每只小鼠的肿瘤数量)的作用更加大:与对照组小鼠相比,接受低剂量和高剂量萝卜苷的动物其肿瘤个数分别降低47%和72%。因此,对照组动物平均每鼠肿瘤数为4.3个,而对于低剂量和高剂量萝卜苷平均每鼠肿瘤数分别为2.3个和1.2个。(图10)
肿瘤负荷也受到明显的影响:低剂量和高剂量萝卜苷处理导致每只小鼠的总肿瘤体积受到70%抑制。(图11)
萝卜硫素及其代谢物的血浆水平非常相似:对于低剂量和高剂量萝卜苷处理分别为2.2μM和2.5μM,这表明萝卜苷被转化成萝卜硫素,长期的膳食处理导致萝卜硫素及其代谢物在动物血液中处于稳态水平。这些水平足以预期生物效应。
2相酶的水平在几乎所有检查的器官即前胃、胃、膀胱、肝脏和视网膜中都被诱导(对于醌还原酶1为2-2.5倍,对于谷胱甘肽S-转移酶为1.2-2.2倍)。
统计分析
用Kaplan-Meier存活分析接着是分层对数秩检验和Wilcoxon检验评估肿瘤发生率,用于存活函数的同等性。通过ANOVA评估肿瘤个数,对所有处理和对单个、成对处理作比较(t检验)。肿瘤体积通过ANOVA以处理时间为嵌套变量进行评估。这些计算用Stata7.0(College Station,TX)来进行。其它统计用Excel来计算。
总之,嫩茎花椰菜苗芽提取物作为萝卜硫素来源的局部给予或膳食给予,抵抗高度对应于人紫外光暴露的小鼠模型中的皮肤肿瘤形成。
本发明是在美国国家癌症研究所授予的CA06973号和CA93780号政府资助下作出的。政府拥有本发明的某些权利。
缩写:COX-2:环氧合酶2;GSH:谷胱甘肽;γ-IFN:γ-干扰素;iNOS:可诱导氧化氮合酶;LPS:脂多糖;NQO1:NAD(P)H-醌受体氧化还原酶,也称醌还原酶。
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Claims (4)
1.萝卜硫素在制备药物中的用途,所述药物用于抑制患者中紫外光诱导的皮肤癌发生,其中所述萝卜硫素以0.3μmol/100μl或1μmol/100μl的剂量局部给予。
2.权利要求1的用途,其中所述萝卜硫素透皮给予。
3.权利要求1的用途,其中所述萝卜硫素来自嫩茎花椰菜苗芽。
4.一种用于抑制患者中紫外光诱导的皮肤癌发生的洗剂,所述洗剂包含0.3μmol/100μl或1μmol/100μl的剂量的萝卜硫素。
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