CN101190939B - 具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-铜配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-铜配合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-铜配合物及其制备方法，Cuωψ2(式I)，其中，ω为活性肽；ψ为一般的配位阴离子。式I寡肽-铜配合物具有优良的舒血管和溶血栓活性，而且其舒血管和溶血栓活性的增强同样不是来自GRPAK与CuCl2活性的简单叠加，而是来自配合物本身，其可以用于治疗血管栓塞以及血管栓塞性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-铜配合物及其制备方法和应用。
背景技术
血管栓塞性疾病是最容易导致死亡的心脑血管疾病，血管栓塞也是导致死亡的一个最重要因素。因此，治疗血管栓塞的药物对于维系心脑血管病患者的健康有重要意义。
目前，用于治疗血管栓塞的药物一般都有不同程度的副作用，例如，临床使用的治疗急性血栓栓塞性疾病的链激酶、尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂等药物普遍存在全身出血倾向和免疫原性反应，因此寻求安全有效的溶血栓药物是新药研究的热点之一。
血管栓塞以后的血流再灌既取决于血栓溶解，也取决于血管舒张。因此，使已形成的血栓溶解和血管舒张是治疗血管栓塞的两个重要途径。
铜作为人体必需的微量元素或者参与多种酶的合成和激活，或者以辅酶的身份广泛参与机体的生命过程，例如在生物体内以铜蛋白和铜酶的形式采用氧气运送、O2 +歧化、Fe2+氧化、细胞色素C的有机底物氧化、单氧合作用及电子传递等。铜缺乏会导致Cu/Zn比值降低，使动脉壁弹力纤维和胶原纤维降解，破坏血管壁内膜的完整性。而Cu/Zn比值升高则可以抑制动脉壁弹力纤维降解而获得血管舒张作用。
纤维蛋白β链的降解产物—血管活性肽P6A(氨基酸序列为ARPAK)及其类似物(氨基酸序列为GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK的肽)作为小分子内源性寡肽不仅有良好的溶血栓活性，而且没有全身出血倾向和免疫原性反应等副作用，是理想的溶血栓先导药物结构。
配合物因具有特殊的药代动力学性质而有利于吸收和转运。例如通过与氨基酸形成铜-氨基酸配合物铜变得容易穿过肠道粘膜而在肠道被吸收。又例如肝脏内的胆酸盐是通过与铜离子形成可溶性配合物而在在胆汁中转运。
因此，希望能够将活性肽与铜结合起来使其具有溶血栓活性从而能够治疗血管栓塞。
发明内容
本发明的目的在于提供具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-铜配合物，其能够用于治疗血管栓塞性疾病。
本发明的另一目的在于提供上述配合物的制备方法。
本发明的另一目的还在于提供上述配合物的用途。
下面对本发明进行详细说明。
本发明提供了具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-铜配合物，
CuωΨ2
(式I)
其中，ω为活性肽，优选例如选自PAK、RPAK、ARPAK、GRPAK和QRPAK之一的活性肽；
Ψ为一般的配位阴离子，例如Cl-、Br-、I-、F-等，优选为Cl-。
上述字母A、P、K、R、G和Q是氨基酸的缩写。其中，A是指丙氨酸；P是指脯氨酸；K是指赖氨酸；R是指精氨酸；G是指甘氨酸；Q是指谷氨酰胺。在本文的上下文中，上述字母的意思如上所述。
本发明式I的寡肽-铜配合物的特别实例包括：Cu(PAK)Cl2、Cu(RPAK)Cl2、Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2或Cu(QRPAK)Cl2。
本发明提出具有舒血管和溶血栓活性的上述式I寡肽-铜配合物的理论依据在于：1)血流再灌既取决于血栓溶解也取决于血管舒张；2)Cu/Zn比值升高可以抑制动脉壁弹力纤维降解而获得血管舒张作用；3)ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK都是有效的溶栓寡肽；和4)ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK与铜形成的配合物可能会有利于吸收和转运。
发明人经过大量试验后合成的本发明的式I寡肽-铜配合物，并通过试验(具体参见试验例)证明其具有良好的舒血管和溶血栓活性，因此可以用于治疗血管栓塞性疾病。
本发明还提供了上述式I寡肽-铜配合物的制备方法，该方法包括：在水中将活性肽ω与铜化合物，例如CuΨ2铜盐或铜盐的水合物等溶解，将所得溶液用碱性试剂调节pH，过滤，将滤液浓缩，得到产物。
当然，本发明制备述式I寡肽-铜配合物的方法还可以包括将所得产物进行纯化的过程，例如，将产物脱盐、干燥。
在本发明式I寡肽-铜配合物的制备方法中：
调节溶液pH的碱性试剂优选使用Na2CO3溶液；
溶液的pH优选调节至约7-8，此时易于形成稳定的寡肽-铜配合物；
滤液浓缩优选通过减压浓缩进行；
产物脱盐时优选使用Sephadex G-10进行脱盐；
干燥优选通过冷冻干燥进行。
在本发明式I寡肽-铜配合物的制备方法的一个优选实施方案中，该方法包括：在水中将ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK与CuCl2·2H2O溶解，得到的溶液用约1N Na2CO3调pH值至7-8，使溶液由浅蓝色变为深蓝色，然后将溶液过滤，滤液减压浓缩，Sephadex G-10脱盐，冷冻干燥。
当然，本发明式I寡肽-铜配合物的制备方法中使用了活性肽ω，例如ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK等，这些活性肽可以从动物体和/或其代谢产物中分离得到，也可以预先进行合成。
本发明还提供了活性肽ω的合成方法，例如，通过逐步接肽的方式以及液相合成来合成活性肽ω方法，具体可以参见实施例。
因此，本发明式I寡肽-铜配合物的制备方法还可以包括上述活性肽ω的合成方法。
本发明提供的式I寡肽-铜配合物具有优良的舒血管和溶血栓活性，而且其舒血管和溶血栓活性的增强同样不是来自GRPAK与CuCl2活性的简单叠加，而是来自配合物本身，其可以用于治疗血管栓塞以及血管栓塞性疾病。
具体实施方式
以下结合本发明的实施例来进一步描述本发明，本发明的特点和优点会随着描述而更清楚。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明精神和保护范围的情况下，任何对本发明进行的细节修改都落入本发明的保护范围内。
实施例1PAK的制备
1)制备Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水四氢呋喃(THF)，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)N-羟基苯并三唑(HOBt)和619mg(3mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将936mg(2.3mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，然后与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温搅拌24h，TLC(CHCl3：MeOH＝30：1)显示HCl·Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.204g(97％)标题化合物，为无色固体。Mp88～90℃，
(C＝0.2，CHCl3)，ESI-MS(m/e)565[M+Na]+。
2)制备HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.354g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
3)制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将538mg(2.5mmol)Boc-Pro-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将1.099g(2.3mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，然后与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温搅拌24h，TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.847g(98％)标题化合物。为无色固体。Mp82～83.4℃，
(C＝0.2，CHCl3)，ESI-MS(m/e)662[M+Na]+。
4)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
5)制备PAK
将1.437g(2.5mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5％)，反应瓶减压排气并通入氢气。该操作重复5次。反应混合物通氢气并室温搅拌24h，TLC(正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用C18柱纯化，得0.589g(75％)标题化合物，为无色固体。Mp150～152℃，
(C＝2.02，H2O)，ESI-MS(m/z)315[M+H]+。
实施例2RPAK的制备
1)制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，再与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温搅拌24h，TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.642g(85％)标题化合物。为无色固体。Mp83～85℃，
(C＝0.2，CHCl3)，ESI-MS(m/e)864[M+Na]+。
2)制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.099g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
3)制备RPAK
将1.941g(2.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5％)，反应瓶减压排气并通入氢气。该操作重复5次。反应混合物通氢气并室温搅拌24h，TLC(正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1)显示HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用C18柱纯化，得0.847g(72％)标题化合物，为无色固体。Mp158～160℃，
(C＝1.95，H2O)，ESI-MS(m/z)471[M+H]+。
实施例3ARPAK的制备
1)制备Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将1.785g(2.3mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，然后与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温反应24h，TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.802g(86％)标题化合物。为无色固体。Mp87～89℃，ESI-MS(m/e)934[M+Na]+。
2)制备HCl·Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.277g(2.5mmol)Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
3)制备ARPAK
将2.118g(2.5mmol)HCl·Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5％)，反应瓶减压排气并通入氢气。该操作重复5次。反应混合物通氢气并室温搅拌24h，TLC(正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1)显示HCl·Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用C18柱纯化，得0.988g(73％)标题化合物，为无色固体。Mp162～164℃，ESI-MS(m/z)542[M+H]+。
实施例4GRPAK的制备
1)制备Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将438mg(2.5mmol)Boc-Gly-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将1.785g(2.3mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，再与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温搅拌24h，TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.857g(90％)标题化合物。为无色固体。Mp85～87℃，ESI-MS(m/e)920[M+Na]+。
2)制备HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.242g(2.5mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
3)制备GRPAK
将2.084g(2.5mmol)HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5％)，反应瓶减压排气并通入氢气。该操作重复5次。反应混合物通氢气并室温搅拌24h，TLC(正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1)显示HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用C18柱纯化，得0.976g(74％)标题化合物，为无色固体。Mp160～162℃，ESI-MS(m/z)528[M+H]+。
实施例5QRPAK的制备
1)制备Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将615mg(2.5mmol)Boc-Gln-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。
将1.785g(2.3mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混合，再与上面的活泼酯溶液混合。反应混合物室温搅拌24h，TLC(CHCl3：MeOH＝10：1)显示HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.113g(50％)标题化合物。为无色固体。Mp91～92℃，ESI-MS(m/e)969[M+H]+。
2)制备HCl·Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.420g(2.5mmol)Boc-Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合、室温搅拌3h、TLC(CHCl3：MeOH＝20：1)显示Boc-Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩至干，残留物与无水乙醚混合再压浓缩至干。该操作重复5次。最后的残留物用无水乙醚研磨，得到的标题化合物用于下步反应。
3)制备QRPAK
将2.261g(2.5mmol)HCl·Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5％)，反应瓶减压排气并通入氢气。该操作重复5次。反应混合物通氢气并室温搅拌24h，TLC(正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1)显示HCl·Gln-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用C18柱纯化，得1.062g(71％)标题化合物，为无色固体。Mp166～168℃，ESI-MS(m/z)599[M+H]+。
实施例6Cu(PAK)Cl2的制备
0.072g(0.23mmol)PAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2·2H2O与0.5ml三蒸水的溶液、用1N Na2CO3调pH值至7-8，使反应液由浅蓝色变为深蓝色。40℃搅拌6h、滤去不溶物、得到的蓝色溶液减压浓缩、用Sephadex G-10脱盐、馏份冷冻干燥，得0.021g(20％)标题化合物。ESI-MS(m/e)400[M+Na]+。
实施例7Cu(RPAK)Cl2的制备
0.108g(0.23mmol)RPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2·2H2O与0.5ml三蒸水的溶液、用1N Na2CO3调pH值至7-8，使反应液由浅蓝色变为深蓝色。40℃搅拌6h、滤去不溶物、得到的蓝色溶液减压浓缩、用Sephadex G-10脱盐、馏份冷冻干燥，得0.021g(15％)标题化合物。ESI-MS(m/e)533[M+H]+。
实施例8Cu(ARPAK)Cl2的制备
0.125g(0.23mmol)ARPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2·2H2O与0.5ml三蒸水的溶液、用1N Na2CO3调pH值至7-8，使反应液由浅蓝色变为深蓝色。40℃搅拌6h、滤去不溶物、得到的蓝色溶液减压浓缩、用Sephadex G-10脱盐、馏份冷冻干燥，得0.029g(19％)标题化合物。ESI-MS(m/e)604[M+H]+。
实施例9Cu(GRPAK)Cl2的制备
0.121g(0.23mmol)GRPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2·2H2O与0.5ml三蒸水的溶液、用1N Na2CO3调pH值至7-8，使反应液由浅蓝色变为深蓝色。40℃搅拌6h、滤去不溶物、得到的蓝色溶液减压浓缩、用Sephadex G-10脱盐、馏份冷冻干燥，得0.032g(21％)标题化合物。ESI-MS(m/e)590[M+H]+。
实施例10Cu(QRPAK)Cl2的制备
0.138g(0.23mmol)QRPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2·2H2O与0.5ml三蒸水的溶液、用1N Na2CO3调pH值至7-8，使反应液由浅蓝色变为深蓝色。40℃搅拌6h、滤去不溶物、得到的蓝色溶液减压浓缩、用Sephadex G-10脱盐、馏份冷冻干燥，得0.034g(20％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：661[M+H]+。
试验例
试验例1舒张血管活性测定
1)实验动物
SD雄性大鼠，体重200-260g(购自北京医科大学实验动物部，许可证号为医动字第01-3056)。
2)实验仪器
恒温槽CS501(中国重庆银河试验仪器有限公司生产)、肌肉张力换能器(杭JZ101型，碑店市新杭机电设备有限公司生产)、LMS-2B型二道生理记录仪(成都仪器厂生产)。
3)测定方法与结果
体重250-300g雄性SD大鼠，术前禁食12小时，自由饮水，颈椎脱位致死，开胸迅速摘取胸主动脉，剥离附着的结缔组织，将血管剪成3-5mm长的动脉环，置于15ml灌流浴槽内，浴槽盛有通以95％O2-5％CO2气体的37℃恒温Krebs-Henseleit(KH)液15ml，固定动脉环的挂钩连接张力换能器，在二道记录仪上描记血管舒缩曲线，纸速为1mm/min。调整静止张力为1.0g，平衡30min后给予终浓度为6.26×10-8mol/L去甲肾上腺素(NE)使动脉收缩以起预激作用，洗去NE，平衡30min后给予终浓度为6.26×10-8mol/L NE，待收缩张力持续稳定于平台水平后，加入15μl不同浓度(终浓度分别为5×10-5，5×10-6，5×10-7mol/L)的本发明的化合物溶于K-H缓冲液的溶液，舒张能力以终浓度为6.26×10-8mol/LNE产生的最大收缩张力降低的百分比表示，结果如下表1所示。
表1 经本发明的化合物处理的大鼠的动脉环对NE产生的收缩的抑制作用
n＝6；a.与CuCl2组比，P<0.001。
从表1的数据可以看到，在5×10-5mol/l、5×10-6mol/l和5×10-7mol/l三种浓度下，只有5×10-5mol/l的RPAK和QRPAK的舒张血管活性明显强于CuCl2。5×10-5mol/l的CuCl2具有微弱的血管舒张活性。ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物在5×10-5mol/l浓度下都具有强血管舒张活性。在5×10-6mol/l浓度下ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物都具有中等以上强度的血管舒张活性。在5×10-7mol/l浓度下三种，PAK-Cu和ARPAK-Cu配合物仍然具有微弱的血管舒张活性。ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物的血管舒张活性显著强于ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK和CuCl2，说明ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物，即Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2、Cu(QRPAK)、Cu(RPAK)Cl2、和Cl2Cu(PAK)Cl2和的血管舒张活性不是来自ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK与CuCl2的简单叠加作用，而是ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物本身的作用。
试验例2溶血栓活性测定
本发明的化合物在大鼠溶血栓模型上的溶血栓活性
1)大鼠手术与器械
SD大鼠(雄性，220～230g)按1200mg·kg-1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血，装在1ml子弹头中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精确称重。
2)大鼠颈动静脉旁路插管
旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm，另一端的外部套一段长7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU·kg-1)，备用。
继续分离麻醉大鼠的气管，并做气管插管。分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU·kg-1)，此时注射器不要撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。
3)给药
用头皮针将生理盐水(剂量为3ml·kg-1)、尿激酶的生理盐水溶液(剂量为20000IU·kg-1)或ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK、CuCl2、Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2、Cu(QRPAK)Cl2、Cu(RPAK)Cl2和Cu(PAK)Cl2的线性肽生理盐水溶液(剂量为10μmol·kg-1)通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或线性肽(治疗剂)通过血液循环，按静脉—心脏—动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计各组的血栓质量差值(X±SD)，并做t检验。
4)结果
血栓质量差值列入下表2。
表2 经药物治疗引起的血栓减重
| 组别 | 血栓减重(X±SDmg) |
| NS | 6.35±3.76 |
| CuCl<sub>2</sub> | 7.44±3.12 |
| UK | 19.35±5.50<sup>a</sup> |
| PAK | 15.52±5.28<sup>a</sup> |
| Cu(PAK)Cl<sub>2</sub> | 19.98±1.66<sup>b</sup> |
| RPAK | 12.83±1.88<sup>a</sup> |
| Cu(RPAK)Cl<sub>2</sub> | 18.22±1.67<sup>c</sup> |
| ARPAK | 13.34±1.85<sup>a</sup> |
| Cu(ARPAK)Cl<sub>2</sub> | 19.28±2.41<sup>d</sup> |
| GRPAK | 19.22±1.31<sup>a</sup> |
| Cu(GRPAK)Cl<sub>2</sub> | 19.40±3.09<sup>a</sup> |
| QRPAK | 15.37±1.82<sup>a</sup> |
| Cu(QRPAK)Cl<sub>2</sub> | 18.85±2.86<sup>e</sup> |
N＝12；NS剂量为3ml/kg，UK剂量为20000IU/kg，ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK、CuCl2、ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物的剂量为10μmol/kg；a)与NS及CuCl2组比P<0.001，b)与PAK组比P<0.01，c)与RPAK组比P<0.001，d)与ARPAK组比P<0.001，e)与QRPAK组比P<0.01。
从表2的数据可以看到，在10μmol/kg剂量下CuCl2无溶血栓活性，而GRPAK、ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物显示与20000IU/kg剂量UK相同的溶血栓活性。在10μmol/kg剂量下ARPAK、QRPAK、RPAK和PAK的溶血栓活性都明显低于ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu的溶血栓活性。从这些比较可以看出，ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物的溶血栓活性增强不是来自ARPAK、QRPAK、RPAK、PAK与CuCl2的简单叠加作用，而是来自ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物本身。
试验例2Cu(GRPAK)Cl2的溶血栓量效关系
按照试验例2的方法，将GRPAK和Cu(GRPAK)Cl2以10μmol/kg、1μmol/kg和0.1μmol/kg三种剂量分别给药。血栓质量差值列入下表3。
表3 不同剂量GRPAK及Cu(GRPAK)Cl2引起的血栓减重
| 组别(剂量) | 血栓减重(X±SD mg) |
| NS(3ml/kg) | 6.35±3.76 |
| CuCl<sub>2</sub>(10μmol/kg) | 7.44±3.12 |
| GRPAK(10μmol/kg) | 19.22±1.31<sup>a</sup> |
| Cu(GRPAK)Cl<sub>2</sub>(10μmol/kg) | 19.40±3.09<sup>a</sup> |
| GRPAK(1μmol/kg) | 9.81±1.48<sup>b</sup> |
| Cu(GRPAK)Cl<sub>2</sub>(1μmol/kg) | 13.98±1.35<sup>c</sup> |
| GRPAK(0.1μmol/kg) | 6.29±3.84 |
| Cu(GRPAK)Cl<sub>2</sub>(0.1μmol/kg) | 11.20±1.36<sup>d</sup> |
N＝12；a)与GRPAK(1μmol/kg)组及Cu(GRPAK)Cl2(1μmol/kg)组比，P<0.001；b)与GRPAK(0.1μmol/kg)组及Cu(GRPAK)Cl2(0.1μmol/kg)组比，P<0.01；c)与GRPAK(1μmol/kg)组及Cu(GRPAK)Cl2(0.1μmol/kg)组比，P<0.001；d)与NS组比，P<0.001及与CuCl2(10μmol/kg)组比，P<0.01.
从表3的数据不仅可以看到GRPAK和Cu(GRPAK)Cl2的溶血栓活性具有剂量依赖性，而且可以看到虽然在10μmol/kg剂量下GRPAK和GRPAK-Cu的溶血栓活性没有差异，但是在1μmol/kg剂量下GRPAK的溶血栓活性显著低于GRPAK-Cu的溶血栓活性。在0.1μmol/kg剂量下虽然GRPAK已经没有溶血栓作用，但是GRPAK-Cu的溶血栓活性仍然确切。GRPAK-Cu的溶血栓活性增强同样不是来自GRPAK与CuCl2的简单叠加作用，而是来自GRPAK-Cu配合物本身。
Claims (7)
1.具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-铜配合物，
式I：Cuωψ2
其中，ω为选自PAK、RPAK、ARPAK、GRPAK和QRPAK之一的活性肽；
ψ为Cl-。
2.制备权利要求1所述式I寡肽-铜配合物的方法，该方法包括：在水中将活性肽ω与Cuψ2铜盐或铜盐的水合物溶解，将所得溶液用碱性试剂调节pH，过滤，将滤液浓缩，得到产物；
或者，该方法还包括将所得产物进行纯化的过程。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于：
调节溶液pH的碱性试剂使用Na2CO3溶液；
和/或
溶液的pH调节至约7-8；
和/或
滤液浓缩通过减压浓缩进行；
和/或
产物脱盐使用Sephadex G-10进行；
和/或
干燥通过冷冻干燥进行。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于，该方法包括：在水中将ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK与CuCl2·2H2O溶解，得到的溶液用约1N Na2CO3调pH值至7-8，使溶液由浅蓝色变为深蓝色，然后将溶液过滤，滤液减压浓缩，Sephadex G-10脱盐，冷冻干燥。
5.权利要求1所述式I寡肽-铜配合物在制备用来舒血管药物中的应用。
6.权利要求1所述式I寡肽-铜配合物在制备用来溶血栓药物中的应用，其中当ω为PAK、RPAK、ARPAK或QRPAK时，其剂量为10μmol/kg；当ω为GRPAK时，其剂量为1μmol/kg或0.1μmol/kg。
7.权利要求1所述式I寡肽-铜配合物在制备用于治疗血管栓塞性疾病的药物中的应用。
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