CN101189343A - 多rna聚合酶ⅲ启动子表达构建体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子的表达构建体，其中每个启动子与编码RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。本发明还提供包括与编码短发夹RNA分子的序列可操纵地连接的多个聚合酶III启动子的表达构建体，所述短发夹RNA分子可以包括单指和/或多指。所提供的构建体能用于体内输送能有效地实施基因沉默的RNA分子，所述基因包括病毒基因包括HBV和HCV。

Description

多RNA聚合酶Ⅲ启动子表达构建体

与相关申请的交互引用

本申请要求2004年8月23日提交的美国临时申请No.60/603,622、和2004年11月22日提交的美国临时申请No.60/629,942的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。

技术领域

本发明的通用领域是新的重组DNA分子的使用方法和组合物，所述重组DNA分子具有能有效地指导(在细胞、组织或生物体内)大量产生小的、经遗传学加工的RNA分子的能力，所述RNA分子能用于抑制涉及疾病或异常细胞功能的基因。具体地，本发明提供了用于利用适用于人类治疗性应用的设计从单个重组DNA分子中同时产生多个(2、3、4、5或更多个)不同的小RNA分子的方法。

背景技术

最近，已经认识到了RNAi或双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默现象，其中与细胞内或生物体内的靶基因的一个区域互补的dsRNA抑制了靶基因的表达(见例如Fire等的1999年7月1日公开的WO 99/32619；美国专利6,506,559：“双链RNA的遗传抑制”；Pachuk和Satishchandran的WO 00/63364：“用于抑制多核苷酸序列的功能的方法和组合物”；以及2002年10月18日提交的美国临时申请No.60/419,532(2004年4月29日公开的WO2004/035765：“双链RNA结构和构建体、以及产生和使用相同的双链RNA的方法”))。双链RNA(dsRNA)基因沉默提出了在基于核酸的技术方面中的特别令人兴奋的潜在应用。双链RNA已经显示出能诱导多种不同生物体体内的基因沉默。基因沉默可以通过不同的机制发生，其中一种是转录后基因沉默(PTGS)。在转录后基因沉默中，靶基因座的转录是不受影响的，但是缩短了RNA的半衰期。外源性RNA已经显示出作用为植物和动物(包括线虫、锥虫、昆虫、和哺乳动物)中的PTGS的强诱导剂。转录基因沉默(TGS)是调节基因表达的另一种机制。在TGS中，基因转录受到了抑制。在PTGS中，沉默复合物装置位于细胞的细胞浆内。在TGS中，效应dsRNA在细胞的核部分是有表面活性的。对于研究性的、治疗性的、和预防性的适应症而言，利用dsRNA介导的基因沉默的能力都是巨大的。靶mRNA降解的精确的序列特异性以及与PTGS相关的系统性能都使得这个现象用于功能基因组和药物开发都是非常理想的。

目前一些用于利用dsRNA沉默脊椎动物细胞的基因的方法造成了不需要的非特异的细胞毒性或细胞死亡，因为dsRNA介导的应激应答包括白介素应答。早期报道明确地提出了脊椎动物中的dsRNA介导的毒性仅仅与长度大于30bp的dsRNA有关，而与siRNA(21-23个bp的短的合成的双链dsRNA分子)或其它的小于30bp的双链dsRNA无关。尽管早先都接受这种观点，但是最近的报道认为外源性引入的siRNA分子也能发生非特异的沉默效应和其它的毒性，包括诱导细胞应激应答途径例如干扰素应答。但是，申请人已经证实在不触发dsRNA介导的毒性的条件下可以实现细胞内表达来自核酸表达构建体的dsRNA分子，包括所报道的能诱导脊椎动物细胞毒性的长dsRNA。见例如已公开的Satishchandran、Pachuk、和Giordano的美国专利申请No.2004/0152117。因此，长的和短的dsRNA分子(包括dsRNA发夹分子)都可以用于哺乳动物和其它脊椎动物，且不会诱导干扰素或其它dsRNA介导的应激应答，条件是dsRNA分子是在宿主细胞内表达的，而不是外源性地引入到细胞内的。但是，仍存在着挑战，实际完成这些dsRNA方法要求在细胞内从dsRNA表达构建体中有效地产生并输送dsRNA分子。

对于RNAi应用以及核酸在生物学活性的其它机制方面的用途，常常需要从核酸表达构建体中细胞内地表达生物学活性核酸。这些方法的有效性都依赖于在靶宿主细胞内以治疗相关的方式有效表达选定核酸的能力，例如对体内或体外的所需靶细胞为生物学活性的、无毒的形式，以及在所需亚细胞部位中的有效量和持续时间。这都给难以转染的和体内应用的细胞带来了特殊的挑战，例如原代细胞、某些细胞株例如K5625(一种人白血病细胞株)。在真核细胞内，从核酸表达载体中细胞内表达核酸需要改良的表达系统、表达构建体和方法。希望这些方法能用于提供能够实现它们的各种生物功能中的任一功能的核酸，包括在体外样品、细胞培养物和完整动物(例如脊椎动物例如哺乳动物包括人)中产生所需的多肽和/或所需的RNA效应分子例如核酶、反义RNA、三链RNA、和/或dsRNA。

从生物技术诞生的数十年来，已经开发出了用于原核细胞和/或真核细胞的大量的各种载体、表达构建体、和表达系统，包括环型质粒、线型质粒、质体、病毒基因组、重组病毒基因组、人工染色体等。这些表达系统在细菌培养物中的应用使得这些重组蛋白例如干扰素(α)、干扰素(β)、促红细胞产生素、VIII因子、人胰岛素、t-PA、和人生长激素成为了药品库的标准组成部分。

在生物技术和分子生物学领域已经开发出的大量的各种表达载体和表达系统中，有着在同一载体中含有多个启动子的表达系统。这种类型的多启动子表达系统利用了含有在原核细胞内或在真核细胞的同一亚细胞区室内具有活性的多个启动子(例如两个或更多个启动子)的载体。例如，在本领域已经开发出这种多启动子系统，以便容许在同一细胞的同一区室内表达超过一个的序列(例如两个不同的序列或被设计成形成dsRNA的有义和反义序列)，或者所述系统可以被用于在不同的细胞或生物体(例如原核细胞和真核细胞)内表达同一序列，或者被用于实现单个可操纵地连接的序列的更有效的转录。常常看到的是，例如同一质粒上的多个RNA聚合酶II启动子或噬菌体启动子，例如两个聚合酶II启动子例如CMV和SV40，或者噬菌体T7启动子和噬菌体SP6启动子。

此外，这些多个启动子可以按任何数目的定向和构型排列于载体内。例如，两种启动子都可以指导载体的同一链或相反链的转录。如果定向于同一链，它们则驱动载体内的同一方向上的转录。同样地，多个启动子可以被编码于同一载体的相反链上，并且被彼此汇聚地或趋异地排列，对于这种情况，在载体内按相反的方向进行转录。此外，在本领域已经开发出各种术语来描述多个启动子在单个载体内的相对位置。术语“串联的”已经被用于描述所有启动子都位于所转录序列的5’末端并且所有启动子都与所转录序列的5’末端可操纵地连接的多个启动子。串联启动子可以是相同的或不同的启动子。术语“侧向的(flanking)”启动子描述了多个启动子的定向，其中启动子位于所转录序列的5’和3’末端，这种方式使得每种启动子(当具有转录活性时)都能转录所转录序列的其中一条链的转录。侧向启动子可以是相同的或不同的启动子，例如一组侧向于序列的5’和3’末端的噬菌体T7 RNA聚合酶启动子是用于表达分离的能形成双链dsRNA的有义和反义链的常用方法(1999年7月1日公开的Fire等的WO99/32619)。

已经描述了多个串联启动子，例如在美国专利5,547,862中，描述了包括位于两个或两个以上串联启动子的下游的RNA转录序列的DNA载体，所述启动子被不同的RNA聚合酶识别，并且每种都能启动RNA转录序列的表达。

在美国专利6,472,171中，描述了制备哺乳动物胶原蛋白或前胶原的方法，其利用包括相反定向的与一元或二元趋异异源启动子(single or dual，divergent heterologous promotor(s))可操纵地连接的两个哺乳动物胶原蛋白基因的构建体。驱动两个胶原蛋白基因的启动子可以是相同的启动子或不同的启动子，以及可以被用于提供两个胶原蛋白基因的协调的(优选地是同时的)表达。

美国专利6,117,651描述了含有串联排列的并与编码所需多肽的异源核酸可操纵地连接的二元细菌启动子的表达载体。二元启动子包括第一个源自tac相关性启动子(其本身是lac和trp启动子的组合)的组分，以及第二个从编码涉及半乳糖代谢的酶的细菌基因或操纵子中获得的启动子组分。二元细菌启动子系统协同作用，提供了原核细胞例如大肠杆菌中的相连序列的高水平转录。

美国专利5,874,242描述了用于在真核和原核宿主细胞内翻译所插入的编码序列的载体。具体地，这些载体包括用于在原核和真核细胞内实现有效表达的双功能启动子(在真核和原核细胞中都能发挥功能)或二元启动子(在真核和原核细胞中分别发挥功能的启动子)。

本领域有着无数的其它实例，它们描述了关于用于同一载体的多个启动子的内容的变异。但是，对于人类的治疗性应用而言，仍然需要适用于表达多个小RNA效应分子(包括各种长度的多个dsRNA发夹例如shRNAs、双和多指dsRNA发夹、长dsRNA发夹等)的新型表达载体。已知当处于其中一种细胞天然采用的用于表达正常存在的小RNA分子的哺乳动物启动子的控制之下时，载体指导的短RNA效应分子(包括短发夹dsRNA)的表达是最为有效的。这些启动子通常包括RNA聚合酶III启动子家族。在文献中还定义了三种主要的RNA聚合酶III启动子的亚型：1型、2型和3型。在编码5s RNA(1型)、各种转移RNA(2型)和U6小核RNA(3型)的基因中都能找到各种类型启动子的原型化实例。细胞也专用另一种启动子家族(经RNA聚合酶I转录的)转录小的结构性RNA，但是该家族的序列比RNA聚合酶III启动子有着更小的差异。最后，RNA聚合酶II启动子被用于转录编码蛋白的信使RNA分子，这与如同上面所提及的小的结构性和调节性RNA有所不同。本领域已知的大多数启动子系统都利用RNA聚合酶II启动子，其对于产生小RNA并非是最佳的。

本领域已经描述了含有1个启动子的基于RNA聚合酶III启动子的载体(见，例如美国专利5,624,803，Noonberg等“In vivo oligonucleotidegenerator，and methods of testing the binding affinity of triplex formingoligonucleotides derived therefrom”)。在Lee等的Nat.Biotechnol.20：500-05(2002)中可以找到关于基于U6的载体系统的描述。Yu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-52(2002)描述了包括T7和U6启动子的短双链siRNA的表达载体。Miyagishi和Taira的Nat.Biotechnol.20：497-500(2002)描述了包括含有串联的U6启动子的表达盒的短双链siRNA的表达质粒，每个启动子都转录siRNA的有义或反义链，然后它们能退火形成双链siRNA。也描述了包括两种这些基于U6的siRNA表达盒的表达质粒。作者认为他们利用双链siRNA表达盒是因为它们的稳定性与包括不稳定回文序列的产生茎环或发夹类型dsRNA的表达盒的稳定性相当。

为了使得短RNA表达载体系统能够用于治疗性应用，其结构和功能就必须满足一些标准。对于人体应用，载体必须被设计成使得载体序列和基因组序列之间以及载体本身内出现的重组事件的可能性都被最小化。载体和细胞基因组序列或载体本身内的元件之间的序列相同的(或同源的)区域使得这些事件成为可能。已经开发出本发明的载体，以提供来自多启动子的多个RNA表达盒(例如发夹dsRNA，包括以及双指和/或多指dsRNA表达盒)的用途。通过不同启动子元件的选择，以及表达盒在重组表达载体内的间隔和定位可以进行对这些多个RNAPol III启动子载体的遗传学加工，使得分子内或分子间的重组事件的可能性最小化。先前已经描述了监测这些重组质粒的稳定性的检测法(例如Focus 16：78，1994，Gibco BRL Technical Bulletin(现在称为Invitrogen公司))。令人惊讶的是，已经实现了细菌发酵和真核细胞表达期间的质粒稳定性，尽管存在着相同或相反定向的多个拷贝的回文的或发夹的序列，例如在多个(例如2、3、4、5)发夹dsRNA中所发现的，以及多个拷贝的聚合酶III启动子序列，例如7SK及其变体。

本发明的多启动子部分是设计例如抗病毒药物的关键性能，其中每个启动子都控制独立的RNA表达盒(例如shRNA表达盒)的表达，这是因为病毒在人群中的以及在宿主内的短暂变异(由于突变事件)的性能。例如，本发明的这个部分提供了用于往宿主脊椎动物生物体的细胞或组织内输送包括一些不同的dsRNA病毒抑制剂分子的多药物疗法的方法，这样使得病毒抑制水平是高的，并且可以使得病毒内发生多个独立的突变事件以及造成dsRNA病毒复制抑制无效的可能性极小。

发明内容

总体而言，本发明涉及新的核酸表达构建体以及利用所述表达构建体制备生物学活性核酸(特别是短RNA效应分子)的方法。

在一个方面，本发明涉及用于表达短发夹RNA(shRNA)包括微RNA(miRNA)的方法和组合物，其中从同一载体内的2、3、4、5或更多个聚合酶III启动子中同时产生这些分子的多个不同的形式。shRNA(短发夹RNA)表示少于近400到500个核苷酸的RNA分子，优选地少于100到200个核苷酸，其中至少一串至少15到100个核苷酸(优选地17到50个核苷酸，更优选地19到29个核苷酸)与位于同一RNA分子上的互补序列形成碱基配对，以及其中所述序列和互补序列被至少约4到7个核苷酸(优选地约9到约15个核苷酸)的未配对区分离开，所述未配对区形成了两个碱基互补区所形成的茎结构之上的单链环。ShRNA分子包括至少一个茎-环结构，其包括约17到约100bp、约17到约50bp、约40到约100bp、约18到约40bp；或从约19到约29bp的与所抑制的靶序列同源和互补的双链茎区；以及至少约4到7个核苷酸的、优选地约9到约15个核苷酸的未配对的环区，其形成了在两个碱基互补区形成的茎结构之上的单链环。所包括的shRNA是二元的或双指的和多指的发夹dsRNA，其中RNA分子包括经单链间隔区所分离开的两个或两个以上这样的茎-环结构。在一个方面，本发明提供了包括多个RNA聚合酶III启动子，优选地包括人或哺乳动物RNA聚合酶III启动子的载体组合物，所述启动子控制与来自引起人体疾病的病毒的RNA序列同源的多个shRNA分子的表达。多个RNA聚合酶III启动子可以是相同的或不同的启动子。本发明提供了以遗传学稳定的模式往宿主细胞内输送治疗量和持久量的2、3、4、5或更多个不同的抗病毒的dsRNA发夹分子的方法，其抑制了利用2、3、4、5、或更多个独立的病毒序列元件的病毒复制，且不触发dsRNA应激应答。在一个方面，每个RNA聚合酶III启动子序列与编码不同的dsRNA发夹分子的序列可操纵地连接。在一个方面，所述聚合酶III启动子中的一个或多个启动子都表达RNA转录物，其形成了包括经单链区分离的两个或更多个shRNA(每种都包括一个茎环结构)的双指的或二元的dsRNA发夹分子。

在一个部分中，本发明涉及一种表达构建体，其包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子与编码RNA效应分子的核酸序列可操纵地连接。RNA效应分子可以是任一相关的RNA，包括但不限于shRNA、反义RNA、核酶RNA、形成三链的RNA、人工的高亲和力的RNA配体(适体)、短发夹双链RNA、微RNA等。多个RNA效应分子可以相同或者不同；但是申请人用“至少两个不同的RNA聚合酶III启动子”表示启动子中至少有两个是“不同的”启动子；至于不同的启动子，申请人并不是指位于构建体的不同部分中的同一启动子的两个拷贝。

在一个方面，本发明还涉及如在图4(e)中所给出的新的聚合酶III启动子序列。

序列说明

SEQ ID NO：1表示具有替代235-240位核苷酸而插入的Sal I限制性位点的人7SK启动子的1-240位核苷酸。

SEQ ID NO：2表示具有替代376-381位核苷酸而插入的Sal I限制性位点的人H1启动子的250-381位核苷酸。

SEQ ID NO：3表示具有替代330-335位核苷酸而插入的Sal I限制性位点的人U6启动子的65-335位核苷酸。

SEQ ID NO：4表示具有替代245-250位核苷酸而插入的Sal I限制性位点的人7SK启动子的1-250位核苷酸。

SEQ ID NO：5表示具有替代235-240位核苷酸而插入的Sal I限制性位点以及添加于Sal I限制性位点的3’端的4个腺嘌呤残基的新的人7SK启动子的1-244位核苷酸。

SEQ ID NO：6表示基于Hep-B的shRNA2791。

SEQ ID NO：7表示基于Hep-B的shRNA1907。

SEQ ID NO：8表示基于Hep-B的shRNA1737。

SEQ ID NO：9表示基于Hep-B的shRNA799。

SEQ ID NO：10表示基于Hep-B的shRNA1991。

SEQ ID NO：11表示基于Hep-B的shRNA1943。

附图说明

图1是含有3个RNA聚合酶III启动子的三顺反子质粒载体的示意图，包括2个不同的原核RNA聚合酶III启动子，其控制3个不同的HBV衍生的短发夹RNA分子的表达。7SK启动子驱动shRNA1737的表达，一个U6启动子拷贝驱动shRNA2791，以及第二个U6启动子拷贝驱动shRNA1907的表达。在载体40中，7SK_1737转录单元被放置于与U6_2791和U6_1907转录单元相同的功能方向上。在载体50中，7SK_1737转录单元的方向是“逆向的”，使得转录的方向朝向U6_2791转录单元。

图2是含有3个不同的真核细胞的RNA聚合酶III启动子的三顺反子质粒载体的示意图，其控制3个不同的HBV衍生的短发夹RNA分子的表达。7SK启动子驱动shRNA1737的表达，U6启动子驱动shRNA2791，以及H1启动子驱动shRNA1907的表达。在载体No.41中，7SK_1737转录单元被放置于与U6_2791和H1_1907转录单元相同的功能方向上。在载体No.51中，7SK_1737转录单元的方向是“逆向的”，使得转录的方向朝向U6_2791转录单元。

图3：结果显示了通过表达三种不同的短dsRNA发夹分子的三顺反子构建体的转染特异地降低了乙型肝炎的靶RNA水平。该检测采用了合成的RNA靶点，其融合了HepB序列和功能性萤光素酶mRNA(详细内容见文中的融合检测法及合成构建体)。

图4a、b、c、d、e：分别用于本发明的三顺反子构建体的人7SK(GenBank登记号X04992，碱基1-234[a，e]，碱基1-244[d])、人H1(GenBank

登记号X16612，碱基250-375)和人U6(GenBank

登记号M14486，碱基65-329)启动子的序列。用大写显示出了用于插入shRNA序列的限制性位点(给出了Sal I示例)。可以按需取代其它的限制性位点序列。a和d中的7SK启动子分别代表来自碱基1-234和碱基1-244的天然启动子，而e中的启动子是新的合成的改良启动子，其中用添加于限制性位点的3’末端的4A残基强化功能。

图5：编码本申请所述的载体所表达的基于HBV的shRNA的DNA序列(从5’到3’)。序列显示出包括对应于高度保守的HBV靶序列的21个碱基(shRNA1907中的19个碱基)，紧接着的是编码发夹的环部分的9个碱基，再之后依次是21个碱基，它们是头21个碱基的逆向互补物，并据此通过与头21个碱基的碱基配对形成了双链茎区。没有显示出dsRNA发夹分子中所具有的附加的5’和3’端序列：从转录起始位点下游的限制性位点序列或启动子序列中转录得到的5’前导核苷酸，以及多个与靶序列非同源的3’末端的T(U)残基，其在转录终止时被整合到了RNA转录体内。

图6：相对于仅有复制子对照，计算出的三顺反子构建体在HBV复制的细胞培养模型中抑制HBV表面抗原表达的抑制百分比(IC50值)的表。

图7：表示各种量的三顺反子载体构建体和HBV表面抗原表达抑制之间的剂量应答关系的图表。7a)对测试载体40抑制HBVsAg的剂量应答和IC50值的测定。7b)对测试载体50抑制HBVsAg的剂量应答和IC50值的测定。

图8：shRNA表达载体的分级系列，编号为从1到4，表示其中的聚合酶III启动子/shRNA表达盒的数目。每个载体都含有如文中所述的原核细胞的pUC衍生的复制起点和嵌合的卡那霉素耐药基因。作为shRNA命名的一部分，用4a或4A的命名表示载体4中的2种修饰的7SK启动子(7SK-4A)。

图9：pHB4载体的简图，其利用4个聚合酶III启动子表达4个短dsRNA发夹分子，即U6、7SK、和两个拷贝的变体7SK-4A启动子。也构建出了五顺反子载体pHB5，其利用5个聚合酶III启动子，包括4个7SK启动子(即，3个变体7SK-4A启动子以及1个如图4a所示的7SK启动子)和一个U6启动子，表达5种不同的短dsRNA发夹分子，每种发夹分子都包括与高度保守的HBV序列同源的和互补的双链的茎区。

图10：显示了测试pHB4载体和单链shRNA表达载体抗萤光素酶报告基因构建体中所具有的HBV序列靶点的结果。对于pHB4载体，显示了3个独立试验的结果，每个值包括3个转染的双份的平均值，其中每个数值包括3个萤光素酶测定的双份检测值。所给出的数值是在存在载体时所检测到的光单位与单独转染报告基因构建体所产生的光单位值的比值，乘以100。用Lipofectamine^TM(Invitron公司)进行转染，萤光素酶检测试剂购自Promega公司。

图11：显示出组合3个不同的启动子元件(U6、7SK或7SK-4a)和3个不同的HBV dsRNA发夹序列(1737、1943、和799)对表达HBV复制子的细胞表达HBV表面抗原(sAg)和e抗原(eAg)的影响的表。见文中的sAg检测描述。EAg ELISA检测与sAg检测基本相似，不同之处在于用eAg抗体取代sAg抗体。IC50值的单位为ng/ml。

图12：显示了sAg和eAg抑制的IC50值随着质粒载体(对应于图8所图示的载体)中的启动子/HBV shRNA表达盒数目的增加(从1到4)而逐步降低的表。

图13：经单个Pol III启动子转录的单个RNA分子(双指的和二元的发夹构建体)内的两个不同的shRNA区的表达。图的上方显示了短间隔物和长间隔物形式的RNA的示例图。表显示了含有完整的HBV基因组的萤光素酶报告基因以及仅含有1737或2791靶序列的报告基因的抑制水平。发夹之间的短间隔物含有16nt，以及发夹之间的长间隔物含有42nt。数据用每个报告基因构建体的光单位与仅转染萤光素酶(无HBV序列)报告基因构建体的光单位值的比值，乘以100。在一个方面，本发明的表达构建体可以从在此所含的一个或多个聚合酶III启动子转录单元中表达出2、3、或更多个的dsRNA发夹，如图13所示的那样。

图14：在不存在(实心)或存在共注射的pHB4载体时，从肝特异的启动子载体中体内表达HBV sAg，所述pHB4载体表达4个不同的HBVdsRNA发夹分子。数据是每组3只小鼠以及两个双份组的平均值(实验1和实验2)。所给出的数值是sAg ELISA光密度值与萤光素酶光单位的比值，即被标准化为共注射的萤光素酶表达质粒(见正文)。从肝细胞中测定出萤光素酶值，其中在小鼠血清中进行sAg检测。

图15：显示出数百种可获得的HBV分离株(见正文)中的序列保守区的位点以及说明对应于所选定的本申请所述的HBV dsRNA发夹靶点序列和区域的位置的示意图。示意图描述了HBV的同线转录物的性质以及说明了由每种转录物所制备得到的蛋白产物。因此，例如，可以看到仅仅1737dsRNA发夹靶向于HBV X-蛋白，而例如799dsRNA发夹可以抑制HBV eAg表达，但不能直接干扰HBV sAg表达。因此，通过同时输送不同的抗HBV的dsRNA分子的选择方案，本发明的表达构建体提供了抗HBV的多药物方案，这不仅造成了高水平的病毒抑制，也阻止了病毒耐药性的发生。

具体实施方式

本申请人具体地将所引用的所有文献的全部内容都并入到本申请中。此外，当数量、浓度或其它数值或参数被给出范围、优选范围或上限优选数值和下限优选数值的列表时，这应该被理解为具体地公开了由任一对任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值所形成的所有范围，无论范围是否是被分开描述。在叙述数字数值的范围时，除非有其它不同的说明，范围打算包括所述范围的终点，以及在此范围内的所有整数和分数。当在定义范围时，本发明的范围并不打算限定于所述的具体数值。

定义：在本说明书中，根据本领域人员的常规理解使用下面的术语，在此给出了更具体的定义。

“表达构建体”表示被设计用于转录相关RNA的任何双链的DNA或双链的RNA，例如含有至少一个启动子的构建体，所述启动子可操纵地连接于或者可以可操纵地连接于相关的下游基因、编码区、或多核苷酸序列(例如编码多肽或蛋白的cDNA或基因组DNA片段，或RNA效应分子例如反义RNA、形成三链的RNA、核酶、人工选择的高亲和力的RNA配体(适体)、双链RNA例如包括茎环或发夹dsRNA的RNA分子、或双指的或多指的dsRNA或微RNA，或任何相关的RNA)。“表达构建体”包括包括一个或多个启动子的双链DNA或RNA，其中一个或多个启动子事实上并非是与所转录的多核苷酸序列可操纵地连接，取而代之的是其被设计为能有效地插入启动子所转录的可操纵连接的多核苷酸序列。往受体细胞内转染或转化表达载体可以容许细胞表达表达载体所编码的RNA效应分子、多肽或蛋白。表达构建体可以是经遗传学加工的质粒、病毒、重组病毒、或源自例如噬菌体、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒或疱疹病毒、或者在下面的“表达载体”中所述的其它实施方式中的人工染色体。可以在活细胞中复制表达构建体，或者可以人工合成表达构建体。对于本申请的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”、“载体”、和“质粒“可以互换使用，以便说明本发明的应用是普遍的、举例说明的意义，并不打算将本发明限定于特殊类型的表达构建体。

“表达载体”表示含有至少一个启动子的DNA构建体，所述启动子可操纵地连接于或者可以可操纵地连接于所转录的下游基因、编码区、或多核苷酸序列(例如编码蛋白的cDNA或基因组DNA片段，任选地其可操纵地连接于位于编码区以外的序列、反义RNA编码区、或位于编码区以外的RNA序列)。“表达构建体”也是含有一个或多个启动子的DNA构建体，其中一个或多个启动子事实上并非是与所转录的多核苷酸序列可操纵地连接，取而代之的是其被设计为能有效地插入到启动子所转录的可操纵连接的多核苷酸序列。往受体细胞内转染或转化表达载体可以容许细胞表达表达载体所编码的RNA。表达构建体可以是经遗传学加工的质粒、病毒、重组病毒、或源自例如噬菌体、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒或疱疹病毒的人工染色体。这些表达载体可以包括来自细菌、病毒或噬菌体的序列。这些载体包括染色体的、附加型的和病毒衍生的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体(episome)、酵母染色体元件、和病毒的载体。源自上面的组合，例如那些源自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的载体。因此，一个示例性载体是双链DNA噬菌体载体。另一个示例性载体是双链DNA病毒载体。在一个方面，本发明涉及在此所述的表达载体、质粒、和构建体，它们是被分离的和纯化的，使得可以用于所有的各种应用，例如用作用于科学研究、用于人类和/或兽医的治疗性和/或预防性的药物目的的试剂。

在一些方面，两种或两种以上表达构建体可以被用作单个组合物，例如用作药物组合物、或研究试剂。在一些方面，两种或两种以上表达构建体被用于协同使用的两种或两种以上组合物中，例如同时施用或在彼此间隔数分钟、数小时或数天的时间段内施用所述组合物，例如在彼此间隔1、2、3天内或者甚至1周内，只要所输送到真核细胞内的每种构建体的产物之间存在着一些功能的或生理的相互作用。表达构建体共同地包括至少2、3、4或更多个RNA聚合酶III启动子，在一些部分包括至少2种不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子都可操纵地连接于或者可以可操纵地连接于编码RNA效应分子的核苷酸序列。在一个方面，表达系统作用为提供具有一个或多个表达构建体的单个细胞，所述包括至少两种不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子与编码RNA效应物分子的核苷酸序列可操纵地连接。在一个方面，表达系统可以是单个表达构建体或两个或两个以上表达构建体例如质粒，其包括两个或两个以上启动子，例如2、3、4、5、6、7、8、或更多个启动子，在一些部分其包括至少两种不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子都是或者可以可操纵地连接于编码RNA效应物分子的核苷酸序列。

“核酸分子”或“多核苷酸”表示由称作核苷酸的亚单位的线性序列组成的聚合化合物；每个核苷酸都有3种组分：一个或多个与糖基(例如五糖或六糖)连接的磷酸基团，所述糖基依次与源自嘌呤(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)或源自嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、或尿嘧啶)的含氮碱基相连接。核苷酸通过相邻糖单位之间的磷酸键一起连接成多核苷酸。多核苷酸分子可以是单链的，例如大多数天然存在的RNA(核糖核酸)分子，或者可以是双链的，例如大多数天然存在的DNA(脱氧核糖核酸)分子。在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。因为一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出链的序列。具体的天然存在的核酸分子包括基因组脱氧核糖核酸(DNA)和基因组核糖核酸(RNA)，以及后者的一些不同的形式，例如信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、和核糖体RNA(rRNA)、以及催化的RNA结构例如核酶和调节RNA例如微RNA(miRNA)。也包括与不同的RNA分子互补的不同的DNA分子(cDNA)。在“核酸分子”的定义中也包括合成DNA、或其与天然存在的RNA的杂合体，以及DNA/RNA杂合体、和PNA分子(Gambari，Curr.Pharm.Des.7：1839-62(2001))。

可以理解，如果所需的核酸分子是RNA，在此所提供的序列中的胸腺嘧啶(T)被U(尿嘧啶)取代。例如，shRNA2791、shRNA1907和shRNA1737在此被描述为DNA序列。对于本领域的一般人员显而易见的是，包括任一上面所提及的序列的RNA效应分子都将具有U对T的取代。

核酸通常具有两个或两个以上共价键连接的天然存在的或修饰的脱氧核苷酸或核糖核苷酸的序列。修饰核酸包括例如肽核酸和具有非天然碱基的核苷酸。

术语“可操纵地连接”指的是核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列、增强子或转录因子结合位点的阵列)和第二个核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子(例如转录活化分子)与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于第二个序列的核酸的转录和/或翻译。本发明的包括两个或两个以上RNA聚合酶III启动子的表达构建体可以包括与所述启动子中的一个、两个或每个启动子可操纵地连接的编码shRNA、dsRNA发夹或微RNA的核酸序列，或者在一个方面，本发明涉及包括2、3、4、5、或多个RNA聚合酶III启动子表达盒的表达构建体，所述启动子被设计用于能被便利地插入到每个所转录的选定序列的表达盒内，例如利用适当选定的例如包括选定的限制性位点的克隆位点。

在本发明的表达构建体或载体中，RNA聚合酶III启动子是“分离的”，意思是它们不与其在它们的正常细胞环境中所可操纵地连接的基因或RNA序列可操纵地连接，例如在本发明的表达构建体中，7SK启动子不与7SK基因可操纵地连接，U6启动子不与U6基因可操纵地连接，以及H1启动子不与H1基因可操纵地连接等等。

“启动子”表示足以指导可操纵地连接的核酸分子的转录的核酸序列。该定义也包括那些足以使得启动子依赖性基因的表达是细胞类型特异的、组织特异的或暂时特异的方式可控的或者由外在信号或试剂诱导的转录控制元件(例如增强子)；在基因的5’或3’区或内含子内都可以找到本领域普通技术人员公知的这些元件。见例如，2005年6月16日公开的Xu等的美国专利申请No.2005/0130184 A1涉及利用聚合酶II增强子元件的修饰的聚合酶III启动子；以及2005年6月16日公开的Xu等的美国专利申请No.2005/0130919 A1涉及可调控的聚合酶III和聚合酶II启动子，在此通过引用将其内容并入申请。令人希望的是，启动子与核酸序列例如cDNA或基因序列、或编码效应物RNA的序列可操纵地连接，据此使得能够表达核酸序列，或者表达盒提供了启动子，往表达盒内可以便利地插入选定的所需转录的核酸序列。

“RNA聚合酶III启动子”或“RNA Pol III启动子”或“聚合酶III启动子”或“pol III启动子”表示在细胞内的其天然背景下与RNA聚合酶III连接或相互作用以转录与其可操纵地连接的基因的任何的无脊椎动物、脊椎动物、或哺乳动物例如人、鼠、猪、牛、灵长类动物、猿猴等的启动子，或者它的任何的在选定的宿主细胞内与RNA聚合酶III相互作用以转录可操纵地连接的核酸序列的变体(天然的或遗传学加工的变体)。U6启动子(例如人U6、鼠U6)、H1启动子、或7SK启动子表示与RNA聚合酶III相互作用以分别转录其同源的RNA产物即U6RNA、H1RNA、或7SK RNA的任何的无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物的启动子或者在自然界可以找到的多态变体或突变体。在一些应用中所优选的是III型RNA Pol III启动子，包括U6、H1、和7SK，其存在于5’侧区，包括TATA盒，并缺少内在的启动子序列。pol III 5S rRNA、tRNA或VA RNA基因具有内在启动子。7SLRNAPol III基因含有弱的内在启动子以及位于基因的5’侧区的转录所必需的序列。RNA Pol IIII启动子包括任何高等真核细胞(包括任何的脊椎动物或哺乳动物)的含有天然的或实验室产生的任何一种序列变异或变更的启动子，所述变异或变更保持或增强了但没有消除RNA聚合酶III与所述启动子的结合，所述启动子能转录与所述启动子序列可操纵地连接的天然的或遗传学加工的基因或核苷酸序列。根据宿主细胞RNA聚合酶III的最佳结合力和转录，可以方便地选择出在用于特殊应用的表达构建体(例如用于表达RNA效应物分子例如抗鱼、鸟或无脊椎动物病毒的发夹dsRNA的构建体)中所用的Pol III启动子，例如包括在被设计用于转录多个抗禽类宿主细胞中的禽病毒例如西尼罗病毒或禽流感病毒(H5N1)的发夹dsRNA的表达构建体中的禽polIII启动子，以及在被设计用于转录多个抗人类宿主细胞中的禽病毒例如西尼罗病毒或禽流感病毒(H5N1)的发夹dsRNA的表达构建体中的替代使用的人或其它哺乳动物的polIII启动子。

“多聚合酶III启动子载体”或“多PolIII启动子表达构建体”或相似的表达式都表示含有至少两个聚合酶III启动子的任何载体、质粒或表达构建体。在一个方面，多聚合酶III启动子载体含有至少两个不同的聚合酶III启动子。“不同的”聚合酶III启动子表示任何两个RNA聚合酶III启动子，包括变体例如它的多态性和突变体，在具体的物种中，其将驱动不同的同源转录物的转录，例如人7SK启动子、U6启动子和人H1启动子，它们被认为是三个“不同的”聚合酶III启动子。本申请也打算将“不同的”聚合酶III启动子定义为来自不同物种的相应的聚合酶III启动子，例如人U6对鼠U6启动子将是不同的启动子；人H1对鼠H1启动子将是不同的启动子，或者人7SK启动子和鼠7SK启动子将被认为是不同的启动子。因此，在图4(a)、4(d)、和4(e)中所述的各种7SK启动子被认为是“相同”启动子(即，7SK启动子)的变体。在一些方面，在本发明的表达构建体中可以包含多个拷贝的“相同的”启动子，只要也包括两个“不同的”RNA聚合酶III启动子，例如三个7SK启动子(例如7SK 256启动子、两个7SK 4A启动子)和1个H1启动子；或者4个7SK启动子(7SK 256启动子、3个7SK 4A启动子)和1个U6启动子。在一些方面，本发明的表达构建体可以含有多个拷贝的相同的聚合酶III启动子，但没有含有“不同的”聚合酶III启动子，例如3、4、5、6、或更多个7SK启动子，每个启动子与编码shRNA的序列可操纵地连接。任选地，在一些实施方式中，除了两个或更多个聚合酶III启动子之外，还可以包括其它的启动子，例如一个或多个聚合酶I启动子和/或一个或多个聚合酶II启动子、一个或多个线粒体的启动子等。在一个方面，包括多聚合酶III启动子(2、3、4、5、或更多个)的表达构建体被遗传学加工成表达多个dsRNA发夹或shRNA，其中可以使用2、3、4、5或更多个拷贝的相同的Pol III启动子，无论是否包括“不同的”RNA聚合酶III启动子。

在重组DNA和合成载体用于在真核细胞中表达RNA的一般实践和用途中，大多数遗传学加工的努力均针对表达编码蛋白的RNA分子。随着反义RNA的出现以及更最近出现的RNA干扰沉默基因的现象(通过双链RNA，简写成“dsRNA”)，必须开发出适合于产生主要具有催化性能的短的、非编码蛋白的RNA分子的表达系统。这需要采用已经被开发出的用于产生天然的、小的RNA分子(例如核糖体RNA、剪接体RNA、RNAse P结构的RNA组分等)的一些类型的天然启动子，以及这些启动子通常被分类为RNA聚合酶I和RNA聚合酶III(“PolIII”)启动子。RNA聚合酶III启动子非常适合于表达这些短的RNA转录体，长度最长达约400到500个核苷酸。在RNAPolIII家族中，天然启动子还被亚分类成在结构上有所不同的3种亚型(1、2、和3)，但是这也反映了对利用其产物的亚细胞区室的专门化(specialization)。例如，U6基因编码小的核RNA，其在RNA剪接过程中在核内发挥作用，而各种tRNA基因编码tRNA分子，其在蛋白合成过程中在细胞浆内发挥作用。因此，本发明的一个部分是含有包括一种或多种3型启动子的代表物(例如，U6、H1、7SK以及其序列变体，例如在此所述的7SK 4A序列变体提供了短RNA效应物分子例如短dsRNA发夹分子的优先表达)和1型或2型亚型的成员(例如各种tRNA基因启动子)的多个Pol III启动子的载体的用途和构建。启动子的这些组合提供了用于调节shRNA和/或微RNA产物在细胞内的相对分布(核对细胞浆)的方法。在一些文献中已经描述了这种定位的试验实例，例如Ilvesetal.，Gene 171：203-08(1996)；Kawasaki andTaira，Nucleic Acids Res.31：700-07(2003)；和Boden et al.，Nucleic AcidsRes.31：5033-38(2003)。

本发明的更多方面涉及多个Pol III启动子的必要条件，其中载体被设计成表达多个(至少2个但优选地是3、4、5或更多个)“RNA效应物分子”。适合于被RNA聚合酶III启动子所表达的RNA效应物分子是长度最长到约400到500个核苷酸的短RNA转录物，包括但不限于反义RNA、核酶RNA、发夹dsRNA、微RNA和双链dsRNA分子。优选的RNA效应物分子是短发夹dsRNA(shRNA)分子、形成三链的RNA、核酶、人工选定的高亲和力的RNA配体(适体)、双链RNA，例如包括茎环或发夹dsRNA的RNA分子、或双指的或多指的dsRNA或微RNA，或任一相关的短RNA。

“shRNA”或“短发夹RNA”或“dsRNA发夹”表示长度小于约400到500个核苷酸的RNA分子，优选地是长度小于100到200个核苷酸，其中至少一串至少约15到100个核苷酸(优选地为17到50个核苷酸，更优选地为19到29个核苷酸)与位于同一RNA分子中的互补序列碱基配对，其中所述序列和互补序列被至少约4到7个核苷酸(优选地为9到约15个核苷酸)的未配对区分离开，所述未匹配区在两个碱基互补区所形成的茎结构上方形成了单链的环。ShRNA分子至少包括1个茎环结构，所述茎环结构包括约17到约100bp、约17到约50bp、约40到约100bp、约18到约40bp、从约19到约29bp的、与所抑制的靶序列同源的和互补的双链的茎区，以及至少约4到7个核苷酸，优选地约9到约15个核苷酸的未配对的环区，其在两个碱基互补区所形成的茎结构之上形成了单链的环。所包括的shRNA是二元的或双指的和多指的发夹dsRNA，其中RNA分子包括两个或两个以上经单链间隔区所分离开的这种茎环结构。申请人打算本发明的表达构建体可以表达多个拷贝的相同的短发夹RNA分子和/或一种或多种(包括多个不同的)短发夹RNA分子。被认为是彼此“相同的”短发夹RNA分子是那些仅仅包括相同的双链序列的短发夹RNA分子，以及被认为是彼此“不同的”短发夹RNA分子将包括不同的序列，不论每个不同的双链序列所靶向的序列是否位于相同的或不同的基因内，例如同一基因的启动子区和转录区(mRNA)的序列或者两种不同基因的序列。

在本发明的一个实施方式中，重组载体被遗传学加工成编码多个例如3、4、5或更多个短发夹dsRNA，每个短发夹dsRNA都表达自不同的包括聚合酶III启动子的表达盒，所含的一个或多个(包括全部的)启动子彼此都可以不同。在本发明的一个方面，转录3、4、5或更多个不同的shRNA分子(每个分子都包括与保守的HBV序列同源的和互补的双链的“茎”区)的重组表达载体被用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的复制，每种shRNA分子的表达都处于Pol III启动子的控制之下，例如7SK、H1、和U6，它们可以是相同的或不同的。在一个方面，本发明的重组表达载体可以从一种或多种聚合酶III启动子衍生的转录单元中表达出一种或多种双指的或多指的dsRNA发夹分子以及从一种或多种聚合酶III启动子衍生的转录单元中表达出一种或多种单个发夹dsRNA分子。要明白，在任一从聚合酶III启动子中转录出发夹dsRNA的本发明的表达构建体中，发夹dsRNA可以是单个发夹dsRNA，或者可以是如2004年4月29日公开的WO2004/035765所述的双指的或多指的dsRNA发夹，或者可以是如2004年2月5日公开的WO2004/011624所述的部分的或强制的(forced)发夹结构，在此通过引用将其内容并入本申请。

“受抑制的靶序列”或“靶序列”表示宿主细胞内的经任何机制以序列特异的方式被抑制的、下调的、调控的、阻抑的、或沉默的核苷酸序列，所述机制包括反义抑制、核酶解离、适体抑制、和/或通过RNAi或双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默现象，通过在所述宿主细胞内表达合适的RNA效应物分子。根据提供给宿主细胞的表达构建体的性质和质量、所产生的RNA效应物分子的相同性、性质和表达水平、施用后的时间等，所实现的抑制、调控、或沉默的程度将有所不同，但是始终是明显的，例如靶基因表达(mRNA或蛋白水平)和/或相关靶点或细胞的功能的可检测到的减低，或者例如病毒复制水平的减少等等，与未处理的细胞相比较，本发明所能获得的抑制程度大于10％、33％、75％、90％、95％或99％。受抑制的靶序列可以是受抑制或沉默的内源序列，例如与疾病或病变例如某些癌症、亨廷登病或衰老相关的黄斑退行性变相关的核苷酸序列，或者宿主细胞内存在的病原体相关的核苷酸序列。在一个方面，通过RNAi或双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默可以抑制靶序列，其中与细胞或生物体内的靶基因中的一个区域互补的dsRNA可以抑制靶基因的表达，包括转录后基因沉默(PTGS)，其中靶位点的转录不受影响，但是缩短了RNA半衰期，和/或转录基因沉默(TGS)，其中基因的转录受到了抑制(见例如1999年7月1日公开的Fire等的WO99/32619；美国专利6,506,559：“双链RNA的遗传抑制”；和WO00/63364：“用于抑制多核苷酸序列的功能的方法和组合物”，Pachuk and Satishchandran；包括在此定义的各种RNAi靶)。对于TGS诱导作用，选定的dsRNA靶序列优选地包括启动子序列、启动子序列的亚组、启动子序列/转录起点序列、或另一个调节区序列，任选地与可操纵地连接于DNA或RNA靶点中的这些启动子/调节区的序列的组合。对于PTGS的诱导作用，所选定的dsRNA靶序列可以仅仅包括编码和/或3’和/或5’UTR序列，或者可以优选地包括编码和/或UTR序列和/或启动子序列的组合。在一个方面，靶序列是病原体的序列例如病毒病原体，其感染宿主细胞例如无脊椎动物或脊椎动物的宿主细胞，优选地是哺乳动物细胞，包括人类细胞。在一个方面，靶序列是与选定宿主生物体中的慢性病相关的病毒病原体的核酸序列，例如肝炎病毒，例如HBV、HCV以及病毒例如HIV、SIV等。

因为RNA干扰以序列特异性的方式发挥作用，用作为药物的RNAi分子必须特异于其靶点。本领域已知的是，病毒基因组是可变的，以调节对其环境变化的抗性。因此，为了用RNAi阻断病毒基因组复制，需要鉴定出病毒基因组中的保守的和独特的区域。同样重要的是，要保证本发明的沉默作用所靶向的保守的病毒序列与任何天然存在的、正常发挥功能的、宿主多核苷酸序列基本上不同源，使得dsRNA分子不会负向地影响任何重要的、天然存在的、宿主多核苷酸序列的功能，当用于本发明的方法时。这些天然存在的功能的多核苷酸序列包括编码所需蛋白的序列以及非编码的、但作为健康宿主生物体中的重要调节序列的序列。

通过引用2005年2月17日公开的WO2005/014806、和2004年12月22日提交的美国临时申请No.60/638,294(用于基因沉默的保守的HBV和HCV序列)、以及2004年9月24日提交的美国临时申请No.60/613,065(RNAi靶向于单链病毒的相反链的辅助中间物)将关于选择用于shRNA设计的HBV和/或HCV序列的方法和组合物。多个shRNA方法的主要治疗优点是重要的病原体例如HBV、HCV、和HIV病毒在其感染宿主或患者的过程中以及在整个人群中都进行着突变。通过在基于多个短发夹dsRNA的治疗药物中包括多个靶序列，使得病毒逃离多个shRNA的检测和灭活的突变可能性事实上为零。

对于在同一表达载体或表达系统中包括多个启动子的情况，在载体设计中必须结合遗传学加工处理，以避免在使用多个启动子中会出现的两个类型的问题。用“转录干扰”举例说明的一个问题涉及同时转录DNA质粒模板上的多个位点的酶学和拓扑学。第二个类型的问题涉及在同一质粒内具有多个拷贝的同源序列元件可能发生的重组事件。已经进行了对本发明组合物中的启动子元件的选择和配置，以便最小化或消除每个这些有害的可能性。下面提供了关于这些现象的更多的细节。

DNA分子的转录会影响位于延伸链前面的以及刚刚转录的链后面的模板DNA的超螺旋(Dunaway and Ostrander，Nature 361：746-48(1993)；Krebs and Dunaway，Mol.Cell.Biol.16：5821-5829(1996))。这些超螺旋的变化影响着整个质粒。超螺旋的变化可以有害地影响着多个启动子的活性，并且事实上能剥夺活性。这表示表达构建体中的一个启动子的活性可以负向地影响另一个启动子的活性，反之亦然。当单个表达构建体中的多个启动子在同一区室中都有活性并且以相同的方向运行时，这会造成启动子阻塞或启动子干扰。当启动子的位置彼此接近时(在数百个核苷酸内)，会发生启动子干扰。一个启动子上的转录因子和其它因子的集结立体地妨碍了第二个启动子上的因子的集结。启动子阻塞对于其中终止子没有位于一个顺反子的末端以及下一个启动子之前的系统是个特殊的问题。因为RNA pol II没有有效的终止系统，这对于多个RNA pol II启动子在同一表达构建体中的应用是个潜在的问题。当一个顺反子的转录没有在顺反子的末端终止并且运行通过第二个启动子，阻止了第二个启动子的转录起始，这就发生了启动子阻塞。

当在同一亚细胞的区室中都有活性的两个活性启动子按汇聚方向彼此面对时，就发生了转录干扰。当上游启动子抑制了下游启动子时(两种启动子应当在同一分子上同时具有活性)，也会发生转录干扰。起始于上游启动子的延伸转录抑制了下游启动子的起始，因为延伸转录物妨碍了下游启动子(Proudfoot，Nature 322：562-65(1986))。一个启动子的转录可以干扰另一个启动子的转录，并造成转录的过早终止。

通过对质粒载体内的序列中的主要的同源串的序列特异性识别，可以发生重组，如果将相同启动子或具有主要同源性的启动子的多个拷贝整合到质粒内，就是上述的那种情况。这种重组事件可以负向地影响任一基于质粒的治疗药物的疗效(例如通过使得质粒控制元件丧失功能)，并且对所述载体在人体治疗中的安全性也具有负面后果。在质粒载体的细菌发酵过程中的重组提出了更多的问题。重组被认为是编码dsRNA发夹的质粒中的特殊问题，因为存在着容易发生重组事件的反向重复或回文序列。Miyagishi and Taira，Nat.Biotechnol.19：497-500(2002)。仅仅预期在编码2、3、4、5或更多个发夹的质粒或其它载体以及2、3、4或更多个拷贝的同一启动子或彼此具有基本上同源性的启动子中增加了这种潜在的问题。因此，在一个方面，本发明提供了序列不相同的多个启动子元件的用途。在另一个方面，本发明提供了包括多个启动子元件(其中2、3或更多个启动子的序列可以是相同的)或同一启动子元件的变体序列的表达构建体，例如，如果需要，除了其它不同的RNA Pol III启动子外，单个表达构建体还可以使用2、3或更多个7SK、和/或修饰的7SK启动子序列，其中每个启动子序列转录选定的dsRNA发夹序列，它们可以是相同的或不同的序列。令人惊讶的是，根据在此所述的可以制备和使用包括2、3、4、或更多个聚合酶III启动子的质粒表达构建体，所述启动子可以是序列和定向上相同的或不同的、转录2、3、4、5、或更多个dsRNA发夹分子的启动子。

利用本领域普通技术人员已知的标准的重组DNA技术可以构建出本发明的载体。产生这些构建体需要三种主要类型的组分：1)质粒“骨架”；2)启动子元件；和3)编码相关RNA的核苷酸序列，例如短发夹RNA序列元件。通过从细菌培养物中分离出质粒DNA，载体骨架可以直接源自保藏于保藏单位例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)的各种细菌菌株。同样地，被设计用于多用途的重组DNA遗传学加工的质粒骨架可以商品化地购自多个供应商，例如Stratagene(SanDiego，CA)、New England Biolabs(Beverly，MA)、或Invitrogen(San Diego，CA)。质粒包括基本元件：1)细菌的复制起点；2)细菌的抗生素耐药标记物；和3)用于插入其它DNA元件的克隆位点。

用于本发明的RNA聚合酶启动子是本领域已知的，通过搜索公共序列数据库例如GenBank可以获得这些RNA聚合酶启动子。已发现的3型Pol III启动子的实例包括那些称作H1、7SK、U6和MRP的启动子。作为这些启动子和基因的一部分的变体形式即拷贝可以存在于这个数据库内，并且可以在本发明中同样地或更有效地发挥作用。例如，在本申请中描述了本发明的组合物和方法所用的7SK启动子的可选择的、合成的变体形式(见图4(a)、(d)和(e))，相对于如GenBank

中所示的规范的7SK启动子，其包括截短或延伸的长度和/或核苷酸取代。对于涉及在哺乳动物宿主细胞内表达内源性RNA III聚合酶的应用，人或其它哺乳动物3型RNA Pol III聚合酶启动子是优选的，例如人或小鼠7SK、H1、和U6。对于涉及在非哺乳动物宿主细胞例如禽、鱼、或无脊椎动物宿主细胞内表达内源性RNA III聚合酶的应用，优先选择同源的RNA pol III启动子，例如禽、鱼等的启动子。

RNA Pol III启动子特别适合于表达小的经遗传学加工的RNA转录物的一个原因是RNA Pol III在DNA编码链的一短串胸腺嘧啶残基处可有效并精确地发生终止，且不需要其它蛋白因子，T4和T5是酵母和哺乳动物体内最短的Pol III终止信号，比T5更长的寡(dT)终止子在哺乳动物体内是非常罕见的。因此，本发明的多聚合酶III启动子表达构建体将包括合适的寡(dT)终止信号，即4、5、6或更多T的序列，其与DNA编码链中的每个RNA Pol III启动子的3’端可操纵地连接。然后例如将编码经遗传学加工的RNA和所转录的RNA效应物分子例如dsRNA发夹或RNA茎环结构的DNA序列插入到Pol III启动子和终止信号之间。

为了分离对应于这些启动子元件的DNA，习惯从DNA保藏单位例如ATCC或商业来源中获得质粒形式的所述序列的克隆拷贝。同样，用聚合酶链反应(PCR)产生多个拷贝的启动子也是通用的和便利的，它们通过仅仅使用小片段序列设计“PCR引物”以及酶学地扩增并物理地分离出每个启动子的基本上纯化的溶液。对于特殊的限制性酶的应用以及所述引物的合理设计，习惯插入(重组)这些启动子元件使之成为质粒载体的一部分。本领域普通技术人员要明白，在实施将启动子插入到DNA骨架质粒的策略的过程中，也包括通常需要精确地插入更多的相关元件。对于本发明，这些元件是短的DNA段(长度优选地小于50、60、70、80、或100个碱基对)，经PCR或合成DNA聚合方法或者两个DNA的组合制备，并将编码相关的RNA效应物分子，例如在一些方面，包括约19到29个核苷酸(约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29个核苷酸)的互补链的shRNA序列能够杂交形成约19到29个碱基对的dsRNA序列(“茎”)，其与所抑制的靶核酸区域基本上相同和互补，所述靶核酸是细胞、病毒或病原体产生的DNA或RNA分子。对启动子元件的克隆也可以包括在规范的启动子序列和编码所表达的RNA分子的序列之间引入限制性位点或其它插入的短序列。这些元件能够修饰启动子和/或所表达的RNA的功能，并且可以包括新的启动子序列，只要其功能得到了保留或强化。例如，相对于图4(a)中的启动子，具有限制性位点的3’端的4个核苷酸延伸物插入的图4(e)中的7SK启动子序列证实比图4(a)中的7SK元件(7SK 256)具有更强的功能。这个特殊的7SK变体启动子利用了4个插入的A残基，但是同样可以使用4个G残基。

在组装了重组DNA质粒之后，细菌被用作生产大量终载体的“工厂”。大肠杆菌常常被用于质粒发酵，大肠杆菌被用于这个目的的一个优点是大肠杆菌菌株具有简化的基因组，如在Blattner等公开的美国专利申请No.2005/0032225中所述的那样，在此通过引用将其内容并入本申请。通过各种方法(在此统称为“转染”)，可以将根据本领域已知的方法以这种方式生产的、分离的和纯化的载体引入到活细胞内。一旦进入到细胞内，启动子元件可以被进行基因转录的细胞结构所识别，并产生RNA效应物分子例如shRNA。

其它能被便利地用于增殖本发明的质粒表达载体的细菌菌株包括大肠杆菌GT116，其是从InvivoGen，San Diego，CA商品化获得的感受态细胞。GT116是被特异地遗传学加工成支持携带发夹结构的质粒DNA的生长的sbcCD缺陷的菌株，例如被遗传学加工成表达一种或多种RNA效应物分子(发夹RNA)的本发明的质粒。已知发夹结构在大肠杆菌内是不稳定的，因为它们会被一种称作SbcCD的能识别并解离发夹的蛋白复合物所清除(Connelly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：7969-74(1998))。在大肠杆菌GT116中，缺失了sbcCD和sbcD基因，这提高了其用于克隆具有发夹或其它含回文序列的结构的功效。

各种化学和物理的方法都可以被用于将质粒表达载体引入到细胞或组织或活体生物体内，照此，包括治疗表达载体的组合物和可药用载体或剂型构成了药物组合物。对于作为药物组合物的质粒DNA的制备，这些方法包括与阳离子的两亲性的局部麻醉剂例如布比卡因、带正电荷的核酸结合剂例如聚胺(例如精胺)或大量的脂质体的或含脂质的试剂(促进了DNA更新通过细胞膜)的制剂。包括这些表达载体的药物组合物的其它组分包括试剂例如保证DNA载体在适用于药物施用的均质溶液中的化学稳定性和可溶性的缓冲剂和稳定剂。

RNA pol III启动子载体编码RNA分子(它可以具有一个或多个内含子或不含内含子以及可以具有polyA尾或不含polyA尾)，所述RNA是在核内制备的并主要保留于核内。这些核dsRNA效应物分子可以被用于诱导转录基因沉默(TGS)。但是，一定百分比的所转录的dsRNA达到了细胞浆内，并因此诱导了转录后基因沉默(PTGS)。对于TGS诱导，dsRNA需要含有启动子序列、启动子序列的亚组、启动子序列/转录起始位点序列、或其它的调节区序列(任选地与可操纵地连接于如下所述的DNA或RNA靶点中的这种启动子/调节区的序列的组合)，并保留于核内。同样，dsRNA可以只含有编码序列和/或3’和/或5’UTR序列，或者可以含有编码和/或UTR序列和/或启动子序列的组合。这种“融合靶”dsRNA可以含有例如编码启动子序列和所连接的被靶向的基因序列的dsRNA，以同时进行TGS和PTGS，。被设计用于输送多个短发夹dsRNA的本发明的RNA pol III表达构建体非常适合于输送一种或多种靶向dsRNA的启动子和/或其它调节序列以及一种或多种靶向dsRNA的编码区和/或3’UTR和/或5’UTR。也包括如在PCT/US2004/026999(WO2005/040388)中所述的一种或多种启动子，以产生本发明的多区室的表达系统，通过使用区室特异性启动子启动转录，可以保证在所有的相关区室例如细胞浆、核、和核仁中都表达这种“融合靶”序列。对于PTGS，dsRNA含有源自RNA(例如mRNA的编码序列或UTR序列)的序列，以及并非一定要含有启动子序列。另外，通过包括能够进行细胞浆转录的启动子(例如线粒体启动子)或者通过包括能形成更有效的细胞浆输送RNA的载体，例如通过包括CTE(组成型输送元件)例如Mason-Pfizer猴病毒或的CTE或另一种猿猴逆转录病毒的输送元件都可以诱导更有效的PTGS，见例如美国专利5,585,263和美国专利5,880,276。如果需要，利用在此所述的方法和本领域普通技术人员已知的技术通过这些载体的组合可以同时诱导PTGS和TGS。

其它的表达控制序列包括合适的转录起点、终止序列(例如作为聚合酶III终止子的4或5个Ts的序列)、启动子和增强子序列、有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号、稳定细胞浆mRNA的信号、增强翻译效率的序列(例如Kozak共有序列)、增强蛋白稳定性的序列、以及如果需要还包括增强所编码产物的的序列。

要知道，在此所述的任一载体或任何其它的标准载体都可以用于产生任一所需的本发明的生物学活性的核酸结构例如dsRNA、包括微RNA、mRNA(如果需要，翻译成多肽)、反义RNA和核酶RNA，以及都可以用于本发明。

增强转录后基因沉默的方法

为了增强RNA pol II在核内所转录的dsRNA的PTGS，可以往dsRNA中加入一个或多个内含子和/或多聚腺苷酸化信号，以便使得能加工处理所转录的RNA。这种加工处理是合意的，因为剪接和多核苷酸都促进了其从核向细胞浆的输送。另外，多聚腺苷酸化稳定了RNA pol II转录物。这些相同的策略可以被用于表达将被翻译成蛋白的功能性mRNA。在一些实施方式中，原核细胞的抗生素耐药基因例如Zeomycin表达盒位于内含子内。其它示例性的原核选择标记物包括其它的抗生素耐药基因例如卡那霉素包括美国专利5,851,804的嵌合的卡那霉素耐药基因、四环素和氨苄青霉素。Zeomycin基因是处于原核启动子的调控之下，以及位于起始ATG上游的约10个碱基对内的Shine-Dalgarno序列的存在保证了Zeomycin在宿主细菌中的翻译。同样，Zeomycin表达盒可以被放置于所插入的发夹的反向重复序列之间(即位于与待沉默的靶核酸基本上相同的有义和反义序列之间)的任一位置。

尽管在细菌中增殖载体时通常用DNA重组方法从DNA中缺失反向重复序列，但是少数细菌可以具有重组途径中的突变，以容许细菌稳定地保持具反向重复序列的DNA。为了筛选出这些少见的细菌，往培养物中加入Zeomycin选择。能够清除反向重复序列的非所需的细菌被杀死，因为Zeomycin表达盒在重组过程中也被缺失。仅仅所需的具有完整Zeomycin表达盒的细菌可以在选择中存活。

在从所选的细菌中分离出DNA并将其插入到用于表达RNA的真核细胞(例如哺乳动物细胞培养物)或动物(例如哺乳动物)体内之后，剪接了RNA转录物中的内含子。如果Zeomycin表达盒位于内含子内，通过RNA剪接去除该表达盒。在无效的剪接事件中，没有表达Zeomycin表达盒，因为不存在用于转录和翻译该基因的原核细胞信号。抗生素耐药性表达盒的清除对于涉及短dsRNA分子的应用是需要的，因为表达盒的去除缩小了dsRNA分子的大小。Zeomycin表达盒也可以位于内含子的两侧而不是内含子内。在这种情况中，在剪接了内含子之后仍保留有Zeomycin表达盒，其能被用于参与发夹的环结构。在核内制备出这些RNApol II转录物，并将其转运到了细胞浆内，在此它们可以实现PTGS。但是，一些RNA分子仍保留于核内。这些核RNA分子可以实现TGS。对于TGS应用，所编码的dsRNA优选地含有启动子序列或启动子序列的亚组、优选地包括启动子/转录起点序列。为了更有效地将RNA保留于核内，可以去除内含子和/或多聚腺苷酸化信号。

对于细胞浆和核定位的另一种策略是使用“上游的”或内在的RNApol III启动子(见，例如Gene regulation：A Eukaryotic Perspective，3th ed.，David Latchman(Ed.)Stanley Thornes：Cheltenham，UK，1998)。这些启动子形成了核转录的RNA转录物，其中一些被转运出来，而另一些仍保留于核内，因此可以被用于PTGS和TGS。通过使用汇聚的启动子或者通过使用两个载体或两个顺反子系统，可以用这些启动子产生发夹，包括如在2004年2月5日公开的WO 2004/011624中所述的部分的和强制的发夹结构、或双链RNA。一个启动子指导有义链的合成，另一个启动子指导反义链的合成，通常来自两个不同的基因序列的拷贝。这些启动子所转录的RNA的长度一般被限定于数倍个核苷酸(例如250到500个核苷酸)。另外，在这些载体中，可以用转录终止信号实施有效的转录终止。

在Sambrook J.et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，2000中可以找到本申请所需的多数命名法和常用的实验室方法。手册在此后被称作“Sambrook et al”。

用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应的标准技术以及各种分离技术对于本分子生物学领域的技术人员是熟知的并常常使用的，例如在下面的参考文献中所述的，在此通过引用将其并入本申请：在Ausubel etal.(1994)Current Protocols in Molecular Biology.Green Publishing，Inc.，and Wiley and Sons，New York，N.Y.；Sambrook et al.(above)；Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NewYork；Wu(ed.)(1993)Meth.Enzvmol.218，Part I；Wu(ed.)(1979)Meth.Enzvmol.68；Wu et al.(eds.)(1983)Meth.Enzvmol.100and 101；Grossmanand Moldave(eds.)Meth.Enzvmol.65；Miller(ed.)(1972)Experiments inMolecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old and Primrose(1981)Principles of Gene Manipulation.University of California Press，Berkeley；Schleif and Wensink(1982)Practical Methods in Molecular Biology；Glover(ed.)(1985)DNA CloningVol.I and II，IRL Press，Oxford，UK；Hames and Higgins(eds.)(1985)Nucleic Acid Hybridization.IRL Press，Oxford，UK；和Setlow andHollaender(1979)Genetic Engineering：Principles and Methods.Vols.1-4，Plenum Press，New York中描述多种标准技术。在Pachuk等的美国专利申请No.6,143,527“Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide andDNA ligase”中描述了在此所采用的被称作“链反应克隆”的特别有用的技术。所采用的简写和命名在本领域被认为是标准的，并且常常被在此所引用的科学杂志所使用。

药物组合物

本发明的多RNA聚合酶III启动子表达系统可以被优选地用于在此所述的各种药物应用。在各个实施方式中，药物组合物包括约1ng到约20mg的核酸例如RNA、DNA、质粒、病毒载体、重组病毒、或其混合物，其提供了所需量的核酸分子(与靶核酸同源和互补的dsRNA，mRNA、微RNA、反义RNA、三链形成的RNA等)。在一些实施方式中，组合物含有约10ng到约10mg核酸、约0.1mg到约500mg、约1mg到约350mg、约25mg到约250mg、或约100mg核酸。临床药物领域的技术人员通过常规试验就可以容易地达成这些给药方案。

合适的载体包括但不限于盐、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。组合物应该适合于给药模式，可以是例如丸剂、片剂、胶囊、喷雾剂、粉末或液体的形式。在一些实施方式中，药物组合物含有一种或多种适合于所选定的给药途径和模式的可药用的添加物。可以通过不受限制的肠外途径例如静脉内(IV)、动脉内、肌肉内(IM)、皮下(SC)、皮内、腹腔内、鞘内以及局部、口服、和通过输送途径例如鼻内、吸入、直肠、阴道、颊粘膜和舌下途径施用这些组合物。在一些实施方式中，可以制备本发明的药物组合物，以便给脊椎动物(例如哺乳动物包括人、犬、猫、牛、马、猪)对象施用液体(包括无菌的、无致热原的注射用液体)、乳剂、粉末、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶片剂、或栓剂形式的药物组合物。

可以如在此所述的制备药物组合物，例如包括DNA质粒构建体在2、3、4、或更多个RNA聚合酶III启动子的控制之下表达2、3、4、或更多个与例如来自靶病原体(例如病毒例如HBV、HCV、HIV、HPV、天花病毒)的一种或多种基因的序列、或者与另一种病原体或者人类、兽医学和农业相关的其它核酸序列相关的序列例如炭疽病毒的人细胞受体序列、或者与哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物疾病或病变例如亨廷登病或VEGF相关的其它基因序列，或者与黄斑变性或被遗传学加工用于治疗人、马或禽宿主细胞的禽流感病毒或西尼罗病毒序列相关的其它基因序列)基本上同源的短发夹dsRNA分子。表达构建体可以包括附加的启动子序列，例如噬菌体T7启动子，其中它对于共输送或共表达同源启动子是必需的。例如，在合适启动子例如RNA聚合酶II启动子例如hCMV、猿猴CMV或SV40的控制之下，可以从相同的或另一个质粒中共输送及表达T7RNA聚合酶。在一些实施方式中，同一个或另一个构建体同时表达靶基因(例如靶天花基因)以及与靶天花基因同源的dsRNA。用合适于特殊给药途径的药物载体制备药物组合物。对于IM、SC、IV、腹腔内、皮内、鞘内或其它肠外给药途径，常常使用无菌的、无毒的、无致热原的液体溶液例如注射用无菌水以及任选的各种浓度的盐例如NaCl和/或葡萄糖(例如氯化钠注射液、林格液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、和/或乳酸林格注射液)。任选地，也使用药物领域人员已知的其它可药用的合适的添加剂、防腐剂或缓冲剂。对于注射用的单剂量瓶，根据药物领域的技术人员所确定的那样，剂量可以有所不同，但是通常含有5mcg到500mcg之间的活性构建体。如果有必要，可以施用明显更大的剂量，且不具有毒性，例如最大到5到10mg。

本发明的药物组合物以及用于本发明的药物组合物可以包括可药用的赋形剂或载体。术语“可药用载体”在此表示无毒的、惰性固体的、半固体的或液体的填充剂、稀释剂、胶囊材料或任何形式的剂型辅助物。可以用作可药用载体的材料的一些实例是糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖、淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉、纤维素及其衍生物例如纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素、西黄蓍胶粉、麦芽、凝胶、滑石粉；根据剂型的不同，组合物中也可以具有赋形剂例如可可脂和栓剂石腊；油例如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；甘油例如丙二醇；酯例如油酸乙酯、和月桂酸乙酯；琼脂；去污剂例如Tween80；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝、海藻酸、无致热原水、等渗盐、林格液、乙醇和磷酸缓冲液以及其它无毒的可配伍的润滑剂例如月桂硫酸钠和硬脂酸镁；以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

例如通过经留菌滤器的过滤、或者通过将灭菌剂结合于无菌固体组合物形式中都可以将可注射剂型灭菌，其中无菌固体组合物可以在使用之前将其溶解或分散于无菌水或其它无菌的可注射介质内。

用于直肠或阴道施用的组合物优选地是栓剂，通过混合表达构建体和合适的无刺激的赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇、或栓剂石腊可以制备所述组合物，其在室温下为固体，但是在体温下为液体，因此可以在直肠或阴道腔内熔化，并释放出微粒。

用于口服施用的固体剂量形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和胶囊。在这些固体剂量形式中，表达构建体可以与至少一种惰性的、可药用的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或膨胀剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)结合剂例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、凝胶、聚乙烯吡硌酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂例如甘油；d)崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；e)溶液阻滞剂例如石腊油；f)吸收加速剂例如季铵类化合物；g)例如十六醇和单硬脂酸甘油；h)吸收剂例如高岭土和皂土；以及i)润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠、及其混合物混合。对于胶囊、片剂和丸剂而言，剂量形式也可以包括缓冲剂。

用于局部或经皮施用的本发明的药物组合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或片剂。在无菌条件下，混合表达构建体和可药用载体以及任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲液。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被包含在本发明的范围之内。

经皮的片剂具有给机体提供可控制的化合物输送的附加优点。通过将表达构建体溶解或分散于合适的介质中可以制备这些剂型。也可以用吸收增强剂增加化合物跨越皮肤的流动。通过提供可控速膜或通过将表达构建体分散于聚合物基质或凝胶中都可以控制速度。

施用表达构建体的所需方法

可以给宿主细胞/组织/生物体施用制剂于药物载体的且没有任何转染促进剂的“裸”DNA、RNA或DNA/RNA的本发明的DNA和/或RNA构建体。如RNA和/或DNA输送领域技术人员已知的那样，利用例如RNA和/或DNA输送领域技术人员已知的这些多核苷酸转染促进剂可以实现更有效的输送。下面是示例性试剂：阳离子两亲化合物包括局部麻醉剂例如布比卡因、阳离子脂质、脂质体或脂质颗粒、多聚阳离子例如聚赖氨酸、分支的、三维的多聚阳离子例如树突聚体、碳水化合物、去污剂、或表面活性剂包括苯甲基铵表面活性剂例如氯化苯甲烃铵(benzylkonium chloride)。在美国专利5,593,972、5,703,055、5,739,118、5,837,533、5,962,482、6,127,170、和6,379,965、以及2003年11月13日公开的国际专利申请Nos.WO03/093449(多功能分子复合物和油/水阳离子两亲性乳剂)、和1999年5月6日公开的WO99/21591(用于输送遗传物质的组合物和方法)中描述了这些促进剂或本发明所用的共用试剂的非排除性的实例；在此通过引用将其内容并入本申请。美国专利5,824,538、5,643,771、和5,877,159(在此通过引用将其并入本申请)描述了对非多核苷酸组合物的组合物的输送，例如转染的供体细胞或含有本发明的表达构建体的细菌。

在一些实施方式中，将本发明的表达构建体与一种或多种阳离子脂质或阳离子两亲性分子进行复合，例如在美国专利4,897,355(Eppstein等1987年10月29日提交)、美国专利5,264,618(Feigner等，1991年4月16日提交)、或美国专利5,459,127(Feigner等1993年9月16日提交)中所述的组合物。在其它实施方式中，表达构建体与脂质体/脂质体组合物进行复合，所述脂质体/脂质体组合物包括阳离子脂质以及任选地包括另一种组分例如中性脂质(见，例如美国专利5,279,833(Rose)、美国专利5,283,185(Epand)、和美国专利5,932,241(Gorman))。在其它实施方式中，表达构建体与美国专利5,837,533、6,127,170、和6,379,965(Boutin)的多功能分子复合物，或者优选地与2002年5月6日提交的美国临时申请序列No.60/378,191(2003年11月13日公开的WO03/093449，Satishchandran)中的多功能分子复合物或油/水两亲性乳剂进行复合，在此通过引用将其内容并入本申请。后一申请描述了包括核酸的组合物、包括胆固醇或脂肪酸的内体裂解性精胺(endosomolytic spermine)、以及包括细胞表面分子的配体的靶向精胺。组合物的正电荷对负电荷的比例是在01.到2.0之间，优选地在0.5和1.5之间；内体裂解性精胺组成了至少20％组合物中的含精胺分子；以及靶向精胺组成了至少10％组合物中的含精胺分子。优选地，正电荷对负电荷的比值是在0.8到1.2之间，例如0.8到0.9之间。靶向精胺被设计用于将组合物定位特殊的细胞或相关组织内。内体裂解性精胺破坏了内质网囊泡，并在内吞作用的过程中将组合物装入内部，促进了内质网囊泡释放出核酸并释放到细胞的细胞浆或核内。这种靶向精胺/内体裂解性精胺的混合物的用法不仅实现了转染，还增强了表达。

可以如2003年11月13日公开的WO03/093449所述的，将本发明的DNA表达构建体与35％甘露糖基精胺和65％胆固醇精胺的混合物复合，当给小鼠IV施用时，通过甘露糖受体可以实现对免疫细胞例如巨噬细胞的靶向转染。通过IV注射包括如上所述的与(例如35％/65％比值的)乳糖精胺(单或三乳糖酰基)和胆固醇精胺的混合物相复合的DNA或RNA表达载体(精胺对DNA的投料配比为0.8)的组合物可以完成肝细胞的体内靶向转染，以输送抗HBV和/或HCV的dsRNA。这些化合物特别适合于药物应用，并且可以被容易地制剂于合适的无菌的、无致热原的载体中，例如用于注射、用于肠外施用例如IV(包括IV输注)、IM、SC和用于腹腔内施用、以及用于经吸入肺部输送的雾化剂型的缓冲液。在某些特殊的剂型中，本发明的DNA表达构建体可以与内体裂解性精胺例如胆固醇精胺单独地复合，而不与靶向精胺复合；一些施用途径例如腹腔内注射或输注可以实现有效的肝输送以及转染本发明的DNA构建体，和表达RNA效应物分子例如有效地抗HBV和/或HCV的多dsRNA发夹。

本发明的DNA表达载体也可以被配制成用于体内口服或肠外例如静脉内输送的微乳剂，如在2003年11月13日公开的WO03/093449中所述的那样，在此通过引用将其内容并入本申请。制剂优选地包括两亲性化合物例如局部麻醉的布比卡因、胆固醇精胺、氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、或辛烷基精胺。小鼠中的体内试验说明口服施用造成了肝内的显著输送。静脉内施用微乳剂造成了具有大毛细血管床的器官例如肺、肝、脾和肾脏的转染。

在其它的实施方式中，表达构建体与药物和分子生物学领域的一般人员所设计出的任何其它的组合物复合。在一些实施方式中，构建体或载体没有与阳离子脂质复合。

通过多种方法可以实现对细胞的转化/转染，所述方法包括但不限于脂染、DEAE-葡聚糖介导的转染、微注射、原生质体融合、磷酸钙沉淀、病毒或逆转录病毒输送、电穿孔、或基因枪(Biolistic)转化法。表达构建体(DNA)可以是裸DNA或局部麻醉剂复合的DNA(Pachuk et al.，Biochim.Biophvs.Acta 1468：20-30(2000))。优选地，真核细胞例如脊椎动物(例如哺乳动物)是体内的或者是仅仅已经被培养少数几代(少于例如直接来自ATCC的细胞株的30代)的细胞，或者是原代细胞。

所需的细胞

仍在本发明的任一部分的实施方式中，细胞是真核植物细胞或动物细胞。优选地，动物细胞是无脊椎动物或脊椎动物(例如哺乳动物细胞，例如人类细胞)。细胞可以是体外的或体内的。细胞可以是分化的或未分化的、配子、胚胎细胞包括胚胎干细胞、体细胞例如癌症细胞、成体或体细胞干细胞、免疫系统的细胞、神经元细胞、肌肉细胞包括平滑肌或心肌细胞、产激素细胞、血细胞、肝细胞、和脂肪细胞等。在一些实施方式中，参与基因沉默的一种或多种蛋白例如Dicer或Argonaut在细胞或动物内被过度表达或激活，以增加基因表达的抑制量。

引入哺乳动物复制起点

虽然通常认为包含哺乳动物复制起点对于人药物应用并非是必需的，但是因为其它的应用例如非临床研究，本发明的表达构建体可以引入人或哺乳动物复制起点。复制起点使得DNA质粒在核定位之后可以被复制并因此强化表达的水平和表达的持续时间。优点是更多的质粒被用于了核转录以及因此制备出了更多的效应物(例如更多的反义、mRNA、dsRNA发夹、微RNA和/或更多的dsRNA双链)。许多起点都是物种特异性的，并且在一些哺乳动物物种但非所有物种中发挥作用。例如，SV40T复制起点(例如来自Clontech的质粒pDsRedi-Mito，美国专利5,624,820)在小鼠中是有功能的，但在人体内却没有功能。因此该起点被用于在小鼠中使用或研究的载体。其它能被用于人体应用的其它起点是那些起点例如Epstein-Barr核抗原(EBNA)起点(例如来自Qiagen的质粒pSES.Tk和pSES.B)。含有这些元件的DNA载体是商品化可获得的，并且用标准方法通过分离含有起点的限制性片段或者通过PCR扩增起点都可以获得编码起点的DNA片段。这些载体的限制性图谱和序列是可以公开获得的，并使得本领域普通技术人员能扩增这些序列或分离出合适的限制性片段。这些载体在表达合适的辅助因子例如SV40TAg和EBNA的细胞的核内进行复制。可以容易地完成这些因子的表达，因为一些含有相应复制起点的商品化可获得的载体(例如Qiagen的pSES.Tk和pSES.B)也表达SV40Tag或EBNA。本领域普通技术人员可以容易地将含有复制起点的这些DNA分子克隆到相关载体内(例如表达dsRNA例如发夹或双链体RNA的载体)。然后与表达EBNA或Tag的载体一起共转染、注射或施用这些载体，使得能够分别复制带有EBNA或Tag复制起点的质粒。同样，利用标准方法可以将编码EBNA或Tag的基因克隆到被设计用于在相关细胞、动物或生物体内工作的任一其它的表达载体内。也可以将编码EBNA或Tag的基因克隆到带有复制起点的同一载体内。合适的复制起点是但不限于Tag和EBNA，例如REPLICor公司(Montreal，Quebec)已经鉴定出36个碱基对的哺乳动物起点共有序列，其容许所连接的DNA序列的复制(如Bio World Today.August 16，1999，Volume 10，No.157所综述的那样)。该序列不需要共表达辅助序列就可以进行复制。

本发明的范围也包括试剂盒，其包括含有本发明的表达构建体的组合物；这些试剂盒可以包括包括多个Pol III启动子并被设计用于预备编码所转录的RNA效应物分子的序列的插入，或者被设计用于多个Pol III启动子驱动的表达盒的预备插入(例如通过放置于经合适选择的限制性位点的表达载体内)的本发明的表达构建体，以及可以任选地包括介质、溶液和其它有助于表达构建体的稳定、输送、使用便利或效率的组合物。

利用包括编码多个dsRNA发夹的多个RNA聚合酶III启动子的表达载体 治疗乙型肝炎

病毒性肝炎是一种主要的世界性的健康难题，因为目前还没有有效的治疗方法。已经获得了预防人乙型肝炎病毒的疫苗，但没有获得预防人丙型肝炎病毒的疫苗，乙型或丙型肝炎病毒例如人乙型肝炎病毒(HBV)或人丙型肝炎病毒(HCV)的感染经常造成慢性病毒性肝病。

针对丙型肝炎的药物治疗包括利巴韦林和干扰素都只是部分有效。估计75-85％的感染患者都将发生慢性感染，预计70％慢性感染患者会发生慢性肝病包括肝细胞肝癌。慢性HCV相关性肝病是肝移植的主要适应症。

尽管在1982年已经获得了人乙型肝炎病毒疫苗，但是估计全世界有350万人慢性感染了HBV。虽然美国的每年新发感染数目已经从80年代的平均260,000例下降到了2001年的约78,000例，但是估计仍有125万乙型肝炎病毒携带者，其定义是患者体内的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性超过6个月。这些HBV携带者具有增加了的发生肝硬化、肝功能失代偿和肝细胞肝癌的危险。尽管大多数携带者都不发生慢性乙型肝炎的肝脏并发症，但是15％到40％患者在其生命周期内会发生严重的后遗症，15-25％慢性感染者死于慢性肝病。因此，迫切需要对患有HBV和/或HCV感染(特别是慢性感染)的患者有效的治疗性药物，估计这些患者加在一起占有全世界肝病总数的75％。能有效地抗HCV的预防性方法和药物也是极为需要的。

虽然HBV和HCV是基于dsRNA的治疗(RNAi)的非常有希望的病毒靶点，但是病毒的可变性和突变性以及病毒的高转录率都使得HBV和HCV是任何治疗性和/或预防性方法的非常有挑战性的靶点。为了用RNAi阻断病毒基因组复制，需要鉴定出病毒基因组中的保守的和独特的区域。同时，为了避免毒性，被选定用于基因沉默的任何序列都是人类基因组所缺少的也是非常重要的。在2005年2月17日公开的WO2005/014806以及在2004年12月22日提交的美国临时专利申请序列No.60/638,294“Conserved HBV and HCV Sequences Useful for GeneSilencing”中都描述了适合用作本发明的多聚合酶III启动子构建体所表达的dsRNA发夹的保守的HBV和HCV序列，在此通过引用将其内容并入本申请。

尽管存在着各种小分子药物，例如已知这些病毒的复制酶的药物，但是这些药物一般不能治愈该疾病，常常仅仅是临时减轻，因为1)药物不能破坏病毒核酸基因组，它能基序复制和/或产生病毒蛋白；和2)药物随着时间变得无效，因为病毒基因组突变并产生了抗抑制剂的变体复制酶。

HBV属于肝DNA病毒属。HBV基因组是近似3200个碱基对的疏松环状的、部分双链的DNA。具有4个部分重叠的编码被膜(前S/S)、核心(前核心/核心)、聚合酶和X蛋白的开放阅读框。前S/S开放阅读框编码大(L)、中(M)和小(S)表面糖蛋白。前核心/核心开放阅读框被翻译成了前核心多肽，其被修饰成了可溶性蛋白乙型肝炎病毒e抗原(HbeAg)和核壳体蛋白乙型肝炎病毒核心抗原。已经显示出核心启动子和前核心区内的突变减少或剥夺了HbeAg的产生。聚合酶蛋白作用为逆转录酶和DNA聚合酶。X蛋白是强的反式作用因子，可以在肝癌的发生中发挥作用。

HBV复制循环开始于病毒与肝细胞的粘附。在肝细胞的核内，完成了正链HBV DNA的合成，病毒基因组被转化成了共价闭合的环形DNA(cccDNA)。至今已经检验过的大多数药物都cccDNA都只有很小的作用或没有作用，这造成了停止抗病毒治疗后的血清HBV DNA的快速复现。治疗慢性乙型肝炎的目标是实现对HBV复制和/或HBV抗原表达的持久抑制以及缓解肝病。

当被输送到受病毒感染的细胞内时，本发明的多聚合酶III表达载体具有直接破坏病毒核酸产物的独特能力。此外，这些多聚合酶载体(表达多个靶向于病毒基因组的不同部分的不同的抑制性短发夹dsRNA)的设计和意向的固有的和整体的性能是同时产生多个不同的病毒拮抗剂。拮抗剂(shRNA)靶向于病毒基因组内的不同的基因组序列。这些拮抗剂中的一种可能足以杀灭病毒，但是其它的拮抗剂作为“后备”机制，使得如果病毒序列发生突变使得一种拮抗剂无效时，还有2、3、4或更多种其它的拮抗剂。另外，通过靶向于病毒基因组中的多个位点，可以同时攻击在疾病病理中发挥不同作用的病毒的不同的DNA或RNA产物。

对于乙型肝炎，例如在一个实施方式中，本发明使用4、5或更多个包括如2004年12月22日提交的美国临时申请序列No.60/638,294中所述的高度保守的HBV序列的shRNA分子(例如图5中称作“799”、“1907”、“2791”、“1737”、“1991”、“1943”)。可以选择在此描述其它的保守HBV序列，包括例如19到29个核苷酸的序列，其包括所有的或部分的“799”、“1907”、“2791”、“1737”、“1991”、或“1943”，将其包含于本发明的多聚合酶III表达载体所表达的dsRNA发夹内。因为HBV基因表达和重叠转录产物的性能，容许其靶向于多个RNA转录物以及病毒的复制模板，这将干扰超过一种的病毒蛋白的复制和表达。其中一种shRNA分子“1737”可以独特地灭活编码称作X蛋白(HbX)的产物的RNA。在生物医学文献中有着很强的证据，说明X蛋白在肝癌的发生和/或维持中发挥作用。因为能一定程度上抑制病毒复制的现有药物不能清除含有病毒基因组的整体或其它残余拷贝或一部分的细胞，这些药物不能终止HbX的产生，甚至在已经“治愈”了感染性HBV的患者体内，因此不能直接降低静止HbX介导的任一癌症的发生率。本发明的多个抗HBV dsRNA发夹表达构建体可以攻击病毒的复制以及所有病毒蛋白的表达，一些蛋白引起了造成肝炎的炎症损伤，相信另一些蛋白例如HbX通过特殊的但还没有完全清楚的机制触发了肝细胞癌。要知道在此所述的原理可以用于设计本发明的构建体，其被特定地用于治疗这些“感染后”患者，其表达抗Hbx和任何其它的残余的HBV抗原的dsRNA。

实施例

下面的实施例进一步地说明了本发明。要知道，虽然这些实施方式说明了本发明的优选的实施方式，但这些实施方式是以举例说明为目的而给出的。对于上面的讨论和这些实施例，本领域普通技术人员可以确定出本发明的优选的特征，因此本领域普通技术人员无需脱离本发明的精神和范围，即可以对本发明作出各种变化和修饰，使得其适合于各种用途和条件。

多Pol III启动子表达载体的构建和描述

利用标准的重组DNA技术，含有细菌的抗生素选择标记物和复制起点的质粒被选定作为用于插入下面的具体启动子/shRNA组合的起点。通过首先组合广泛可获得的pUC18载体(Yanisch-Perron et al.，Gene33：103-19(1985)，erratum in Gene 114：81-83(1992))的近似1kb片段(在氨苄青霉素耐药基因和多克隆位点之间含有细菌的复制起点)和如在美国专利5,851,804中所述的嵌合的卡那霉素耐药基因制备质粒。各种从供应商例如Invitrogen、Clontech、Stratagene等获得的商品化可获得的质粒载体可以被用作载体元件的其它来源，或者取代申请人的载体作为原材料，以产生下面所述载体的功能等价的变体。用于用源序列装配载体的方法包括限制性酶消化、凝胶电泳、PCR(聚合酶链反应)、DNA测序、酶连接、和如Pachuk等的美国专利6,143,527“Chain reaction cloning usinga bridging oligonucleotide and DNA ligase”所述的“链反应克隆”、和其它本领域普通技术人员熟知的和常见的方法。

申请人发现在产生多启动子构建体之前制备单个Pol III启动子载体构建体是方便的。通过次序步骤地连接上面的复制起点限制性片段(ori)与嵌合的卡那霉素耐药基因，然后与所需的Pol III启动子/shRNA表达盒连接，产生了用于表达单个短发夹RNA(shRNA)的基本的单启动子RNApol III载体。通过连接启动子与包括从商业定制的、被制备成合成的、双链的寡核苷酸的相关shRNA的短片段(近50到60bp)。构建作为多启动子载体的前体的单启动子载体的目的实现了数个有益的方面。首先，这容许在检测目标启动子/shRNA对或元件的方法不会受到干扰的情况下对每个启动子/shRNA对进行功能验证。其次，这容许利用测序引物对每个表达盒的全部或一部分进行DNA测序，否则所述引物在多启动子载体中将具有多个退火位点，使得这种情况下的测序是不可能的。第三，通过故意设计出对于每个启动子元件而言是独特的克隆限制性位点对，可以有效地动员经验证的单启动子表达盒，用于克隆到任何数量的初始的多启动子载体内。

在确定出单启动子载体的的表达水平和基因沉默作用之后，按逐步构建的方式从单启动子载体启动子/shRNA盒构建出含有2、3、4、或5个启动子的多启动子载体，每个启动子都驱动不同shRNA的表达。因此，表达shRNA的有效的单启动子构建体被修饰成添加了第二个启动子-shRNA盒。通过产生数个可选择的两启动子质粒的2-启动子形式经验地选择出第二个盒(见图8)相对于第一个盒的位置(第一个和第二个盒的相对位置随着其它载体元件有所不同，以及随着每个盒相对于转录方向的定位而有所不同)。本领域普通技术人员要知道，当尝试组合2个盒以实现单载体内的最佳表达时，环型载体周围的位置以及盒的“后向”或“前向”转录方向可以有所不同，以产生多达8种不同的变体，所有变体都含有相同的元件。此外，当尝试在这个载体内从不同启动子中表达两个不同的shRNA元件时，shRNA序列与两个启动子中的每种启动子的不同组合可以产生所述载体的16种不同的变体，所有变体仍都含有相同的元件，但是元件的排列有所不同。申请人已经观察到这些不同的构型可以造成每种shRNA的表观表达水平的显著变异。然而，对于表达具有有效的基因沉默作用的多效应物RNA(特别是shRNA)的目的，本发明的多聚合酶III启动子构建体证实不需要过度的试验就能完成对这些元件的相对最佳构型的有效选择。

就本发明而言，优选地从一个表达构建体有效地产生至少3、4、5、或更多个不同的RNA效应物分子(例如shRNA分子)。前面对2-启动子载体的描述因此意味着提供了对遗传学加工所述构建体时的组合可能性的简单例举。鉴于并非所有的排列都同样地发挥作用，且如果要系统地评价所有可能的排列，则产生具有超过3个shRNA盒的载体需要测试大量的载体排列，因此申请人寻求建立一种策略(方案、公式、方法、系列步骤)，可以用其实用地获得多pol III启动子表达构建体，其中按强到所有元件都独立地以及协调地实现哺乳动物细胞内的基因沉默的方式表达所有的shRNA元件。按反复的方式添加启动子盒这种逐步的方法，其涉及仅仅产生多启动子载体的所有可能排列的一部分，且将在下面的实施例中进一步地说明，申请人已经证实，这是一种实现从这些多启动子载体中同时强表达shRNA的可靠的、可重复的和有效的方法。这不同于普遍的认识，即认为因为(启动子之间的)转录干扰问题，多启动子元件的这种程度的组合是不能维持的，且由于启动子之间的重复元件以及shRNA元件内的反向重复元件，在细菌内维持这些质粒的问题会加重这种转录干扰。

Pol III启动子的选择

实施例1：用于产生减少乙型肝炎病毒RNA产生和复制的shRNA的基于三顺反子RNA聚合酶III的表达构建体

构建出一系列质粒，以便在3个分离的RNA聚合酶III启动子的控制之下表达3种不同的靶向于乙型肝炎病毒的shRNA。在载体的多克隆位点中，彼此邻近地放入U6和7SK启动子/shRNA盒，同时用远处的克隆位点(邻近于卡那霉素耐药基因)置入第三个启动子序列(U6启动子的第二个拷贝或H1启动子)。利用通过在启动子的3’末端和shRNA序列的起点之间引入6nt加工处理过的方便的限制性位点例如Sal I或Hind III可以将每个shRNA元件的5’端与每个启动子的3’端相连接。图4给出了每个启动子元件的序列。图5显示了源自HBV保守区、并被置入于称作2791、1907和1737的三顺反子载体内的三个shRNA序列。每个shRNA都开始于21bp的HBV序列，随后是9个碱基的环元件(AGAGAACTT)，紧接着的是21bp序列，其是头21bp的反向互补物。每个启动子盒在其3’末端都含有作为转录终止子的一串5个胸腺嘧啶核苷。因此，含有dsRNA发夹的预定转录物实际上都含有附加的5’和3’序列：由6个碱基(例如Sal I或Hind III或其它所选的识别序列)组成的5’前导序列，之后是dsRNA发夹序列、之后是短的3’末端的U束，通常是在转录终止时所结合的2(1、2、3、或4个)U残基。选择Sal I或Hind III是因为便利的原因，要知道可以取代使用任何数目的其它限制性位点，优选地是6或8个切割点(例如Aat II、Acc65I、Acl I、Afl II、AgeI、Apa I、ApaL I、Asc I、AseI、AsiS I、Avr II、BamH I、Bcl I、BfrB I、Bgl II、BmgB I、BseY I、BsiW I、BspD I、BspE I、BspH I、BsrB I、BsrG I、BssH II、BssSI、BstB I、BstZ17I、Cla I、Dra I、Eag I、EcoR I、EcoR V、Fse I、Fsp I、Hind III、Hpa I、Kas I、Kpn I、Mfe I、Mlu I、Msc I、Nae I、Nar I、NcoI、Nde I、NgoM IV、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pac I、PaeR7I、Pme I、Pml I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Sac I、Sac II、Sal I、Sbf I、Sca I、Sfo I、Sma I、SnaB I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Swa I、Tli I、Xba I、Xho I、Xma I；优选地是Avr I(CCTAGG)、BamH I(GGATCC)、EcoR I(GAATTC)、Hind III(AAGCTT)、Kpn I(GGTACC)、Nde I(CATATG)、Not I(GCGGCCGC)、Pst I(CTGCAG)、Sal I(GTCGAC)、或Xba I(TCTAGA))，其中dsRNA发夹转录物将包括不同的5’前导序列。dsRNA发夹侧面的5’和3’转录序列的长度和组成的差异没有表现出会负向地影响dsRNA发夹实施dsRNA介导性基因沉默的能力，这说明不同于合成的dsRNA双链，内源性表达的dsRNA发夹构建体是有效的，尽管这些构建体在很多方面都有所不同，例如约19-29bp之间的dsRNA“茎”的长度、单链环的长度和组成、是否存在附加的短的5’和/或3’序列。虽然选择的靶序列明显代表的是大量不同的HBV分离株(株)内的那些相同的序列，但是因为参照的目的，shRNA可以被定位回到HBV分离株AYW，这样的话shRNA2791含有起始于AYW分离株(GenBank

编号V01460)的2791位点的21bp序列，而shRNA1907，相应地起始于GenBank

参照序列的1907位点，等等，唯独shRNA799不同，其包括起始于位点779并延伸通过799的序列。对于保守HBV和HCV序列的选择，见例如2005年2月17日公开的WO2005/014806、以及2004年12月22日提交的美国临时申请No.60/638,294“Conserved HBV and HCVSequences Useful for Gene Silencing”。对于在在此所述的所表达的dsRNA发夹中的应用，可以选择优选地具有19到29个核苷酸的HBV靶序列，例如18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29个连续的保守核苷酸。在本实施例的实验1中，质粒载体含有一个拷贝的7SK启动子和2个拷贝的U6启动子。在实验2中，载体使用3个不同的RNA聚合酶III启动子(除了7SK和U6启动子之外，还有H1启动子)。在两个实验中，使用了每个质粒的更多的变体，其中保留了7SK启动子的定位。实验在此使用了基本的7SK启动子(图4A)，但是在标注为7SK启动子的地方可以被7SK启动子的两个变体(称作7SK-e和7SK-4A)的序列所取代(分别为图4d和4e)。因此，本实施例所用的载体组含有4个不同的质粒，并在两个实验系统中检测了所有4种载体降低HBV RNA表达的作用，其中在转染组织培养细胞中产生了HBV RNA。第一个系统采用无关的质粒构建体组，其被用于产生与编码萤光素酶蛋白的mRNA相连的合成的HBV RNA分子(融合构建体)。通过测定转染细胞内产生的萤光素酶酶活性的量可以检测出用于评估的质粒载体降低HBV RNA融合构建体的表达的能力。在第二个实验系统中，用克隆的HBV共转染HBV复制子模型以及用于评估的质粒载体。通过测定HBV表面抗原(HBV sAg)检测出质粒载体抑制HBV复制和功能的能力。

用萤光素酶融合检测法评估载体：为了评估每个载体抑制HBV RNA序列表达的能力，用一系列载体(“Luc-融合”载体)共转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞，所述载体编码附加于萤光素酶的完整编码序列的3’末端的HBV RNA片段。在2004年9月10日公开的WO2004/076629“Methodsand Constructs for Evaluation of RNAi Targets and Effector Molecules”中已经描述了用于制备这些载体的方法以及其在融合检测法中的用途。在这些实验中使用了如下的5种不同的luc-融合载体：Luc-AYW含有HBV的AYW株的完整的基因组序列；Luc是不含HBV序列的阴性对照载体；以及Luc-2791、Luc-1907和Luc-1737都分别是与含有shRNA序列2791、1907、和1737的靶点的短HBV(近似200个bp)片段融合的萤光素酶基因。

对于共转染，将细胞种植到6孔板内，使得它们在转染时能达到约80-90％的融合。根据厂家的指导说明，用Lipofectamine^TM聚阳离子脂质/中性脂质体制剂(Invitrogen)进行所有的转染。在本实验中，用200ng每种Luc-融合质粒和800ng实验质粒转染细胞。在转染后48个小时时，收集并裂解细胞，用Bright-Glo

萤光素酶检测系统(Promega Inc.，Madison，WI)测定出萤光素酶活性。萤光素酶活性用每mg总蛋白的相对光单位(RLU)表示。

图3给出了这些实验的结果。如通过比较不含HBV序列的质粒与HBV-luc融合质粒(Luc-awy)所产生的萤光素酶活性所证实的那样，虽然所有4种形式的shRNA三顺反子载体都显示出显著地降低了HBVRNA表达，但是并非所有的shRNA-启动子盒都在载体的所有启动子构型中发挥作用。仅仅在eiRNA载体41中，所有的三种shRNA都能沉默萤光素酶融合构建体中的它们的同源的测试序列。在对载体40与50、以及41与51的比较中注意到，通过逆转盒的定向可以恢复至少一种启动子-shRNA盒的功能；但是，如在载体50中所见的，1737shRNA功能的恢复伴随着2791shRNA功能的丧失。不需要测试载体元件的所有可能的排列和组合就可以获得载体41所例举的成功产物：通过使用3种不同的启动子以及反复变化一个或多个盒的定向指导获得所需的结果，就能达到目的。结果中要注意到，没有在评估每种载体构建体的相对能力的条件下进行这些实验，即没有考虑到每种shRNA产物的固有的能力以及其产生速度。事实上，萤光素酶活性值被所有载体都减少到了相似的程度，无论它们表达所有的3种shRNA或者仅仅表达2种。虽然如此，载体41比其它所示的载体更大程度地具体化了本发明，其通过整合多核酸靶序列使得抗病毒药物更为优越(避免逃逸突变体)。

在HBV复制子模型中评估载体：在本组实验中，用pHBV2(一种HBV的感染性分子克隆)和所评估的单个效应物RNA构建体一起共转染Huh7细胞(源自人肝细胞株)。用于转染的总DNA是2.5μg，其包括50ng pHBV2、可变量的测试构建体(如图6所示)以及可变量的惰性的、“填充”DNA质粒(pGL3，Promega Corp，Madison，WI)(使得所用转化中的量多为2.5μg)。在转染后5到6天，收集细胞培养基，并用AuszymeMonoclonal试剂盒(Abbott Laboratories，Inc生产)检测出分泌到培养基中的HBV表面抗原(sAg)的量。sAg的量已经被接受为是HBV感染细胞中的病毒复制和病毒转录的间接检测。进行两组试验，每组都包括不同量的shRNA表达载体40和50的多次转染。对照转染只包括HBV复制子，不含有测试载体，提供了没有载体40和50时的sAg分泌量的测定值。通过取存在测试质粒时的sAg表达量与对照(仅有HBV复制子)转染时的sAg表达水平的比值可以计算出简单的“抑制百分比”。通过进一步的数学转化以及数据的图解说明，构建剂量-应答抑制曲线和计算IC50值(抑制50％表面抗原分泌时的载体浓度)是有可能的，其反过来是比较不同测试载体在多个试验中的疗效的工具。利用EnzFitter软件Biosoft，Ferguson，MO，USA)产生曲线、数据转化和IC50值。

图6和7显示出了这些试验的结果。值得注意的是，中等剂量的测试载体(25ng)获得了对sAg表达的近100％的抑制。此外，非常少的剂量lng就足以显著地降低sAg表达(约30到40％)。图7给出了对这些质粒的剂量应答的更为详细的分析，其中明显的是中等剂量的测试载体获得了抑制作用的饱和状态，以及IC50值(获得50％抑制作用时的载体浓度)近似为5ng。

实施例2：用于产生减少乙型肝炎病毒RNA产生和复制的shRNA的基于四个RNA聚合酶III启动子的表达构建体

图9是含有4个聚合酶III启动子-shRNA盒的载体pHB4的示意图。图中的标记说明了启动子名称、相连的shRNA(靶向于HBV基因组)和每个盒的转录方向。如上所述的，利用逐步添加shRNA盒的重复方法构建出载体。图10中的数据(与实施例1所用的基本相似的萤光素酶检测法)说明所有4种启动子/shRNA盒对于沉默提供有载体和可检测底物(实施例1中的萤光素酶融合构建体，现在包括shRNA-799构建体)的细胞内的靶序列都是有活性的。图10中的表显示了pHB4和阳性对照的三个独立的试验，同时给出了单个发夹载体的结果。图12的数据显示相同的构建体能沉默经测试载体和HBV复制子转染的细胞内的HBV基因表达，IC50测定值如实施例1所示的那样。图12总结了试验的结果，其中评估了各个载体(如图8所示的从1到4种shRNA)在不同输入浓度的载体时复制细胞培养物的能力和活性。首先，在仅接受HBV复制子的细胞中，用ELISA免疫检测法测定了HBV抗原(表面抗原“sAg”或“e”抗原“eAg”)的产生。对于一些测试输入量(浓度)的每种载体，将其所产生的ELISA抗原量与没有测试载体时产生的水平进行比较。将与没有提供载体的细胞相比较，其中所产生的抗原减少了50％的载体浓度被定义为IC50(获得50％抑制的抑制浓度)。IC50值越低，说明试剂或药物越强。图显示当从1启动子/shRNA盒载体增加到含有4个启动子/shRNA盒的pHB4实例时，IC50值显著下降。应当注意到，IC50值也受到了每个shRNA分子的相对能力和转录水平的影响，它不会仅仅反映出与载体浓度的简单关系，其事实上反映了四种药物进入细胞并表达出四种所编码的dsRNA分子之后的所作所为。换句话说，增加的效力不仅反映出了载体所产生的更大数目的总shRNA转录物，也反映出了每个shRNA经降解靶向的病毒RNA分子实现sAg或eAg产生的减少的单个的效力。结合图12的IC50数据以及图10的萤光素酶报告基因数据，shRNA盒的渐增的添加显然增加了载体的表观数量上的效力，此外还通过抑制HBV靶的4个不同的位点增加了抗HBV靶的药物活性。但是，重要的是要认识到本发明的多聚合酶III表达构建体表达多个单个的抗病毒的dsRNA发夹分子的能力本身就是非常有价值的，而不仅仅是因为相关的“效力”的增加。虽然抗病毒的效率水平是高的，但是每个添加的dsRNA分子所获得的渐增量的病毒抑制的增加不入本发明的构建体所实现的能力重要，其实际上是多药方案，其固有的优点是对病毒耐药性发生的高抗性。

实施例3：其中单个启动子表达含有短RNA的2-发夹(双指)的多RNA聚合酶III启动子载体。

在本发明的另一个实施方式中，包括多Pol III启动子载体，从单个启动子表达超过1个的shRNA效应物分子是有可能的，因此增加了RNA序列，靶向于更节约的启动子元件是有可能的。例如，仅仅用2个Pol III启动子就能用本发明表达3个shRNA分子；仅仅用3个Pol III启动子就可以表达4、5、或6个shRNA分子；用4个Pol III启动子就可以表达5、6、7、或8个shRNA分子等。通过产生U6启动子载体在此验证了“双发夹”或“双指”dsRNA的表达，在U6启动子载体中，用短间隔元件连接两个靶向于HBV的shRNA编码序列(图5)，产生了含有两个活性shRNA元件的更长的RNA分子(用长间隔物的总长度近似为140个核苷酸，用短间隔物近似为60个核苷酸)，在此包括1737和2791序列。在本试验中使用了如在实施例1中所述的萤光素酶融合靶点，图13的下方显示了结果。在萤光素酶融合检测法中，两种形式的双发夹构建体都能有效地介导两种靶序列的显著降解。间隔序列在这些构建体中的作用表面上是将形成发夹的序列分离成两个不同的区，并有助于单链核糖核酸内切酶的降解。本领域普通技术人员知道大量的各种长度和序列的间隔物都容许形成合适的双发夹结构并实现二元的靶序列降解。但是，也要明白一定长度和组成的间隔序列本身就能形成二级结构并且能于shRNA侧面的序列碱基配对，这可能会干扰二元发夹分子的功能。

实施例4：与药物制剂组合的DNA载体介导了小鼠肝脏内的摄取和基因表达。

通过将在此所述的用于沉默HBV基因表达的多启动子发明的注射液与产生HBV表面抗原RNA和蛋白的DNA载体一起直接注射到小鼠的血流内，证实了所述多启动子发明的作为药物试剂的重要适应症。在这些试验中，经流动尾部静脉注射将pHB4载体(见图9)与在肝脏内特异地表达HBV表面抗原的sAg质粒(该质粒在白蛋白启动子的控制下表达sAg，并源自如Chisari et al.J.Virol.60：880-87(1986)所述的质粒pAlb-hGH)一起输送到小鼠内。本领域普通技术人员通常都用流动尾部静脉注射使得外来试剂快速地灌注活体动物体内的肝脏组织。因此在此模型中，肝细胞分泌sAg，因此在注射DNA4天之后测定小鼠血浆中的sAg水平。共注射第三个表达受CMV启动子控制的萤光素酶的载体，使得标准化sAg数值对肝脏萤光素酶，并据此控制肝脏内的总DNA摄取和DNA表达。图14显示了这个试验的结果。用两组小鼠进行共注射，并分别产生了血浆sAg值为0.07和0.08OD单位。因为sAg表达载体的单独引入(没有shRNA pHB4载体)产生了平均值为0.47OD单位，因此显而易见的是，pHB4在体内显著地沉默了sAg。

实施例5：7SK启动子/shRNA连接序列的变更显著地增加了shRNA表达载体的效力。

虽然已经报道人7SK启动子的功能主要依赖于“上游”序列(转录起点的5’序列)，但是位于转录起点下游的核苷酸序列也能调控启动子的功能(见Sandrock and Benecke，Gene Expr.8：105-14(1999)和Koper-Emde et al.，Biol.Chem.385：791-94(2004))。申请人已经观察到，甚至在RNA聚合酶III转录起点和靶序列的起点之间插入了一些并非对应于靶序列的附加核苷酸，靶向于用于基因沉默的序列的dsRNA发夹分子仍是有功能的。这容许保持其中加入了限制性位点或间隔元件的Pol III启动子/shRNA盒的改良功能。申请人已经产生了新的7SK启动子元件(图4e)，其利用天然启动子的头234个碱基，随后是含有Sal I限制性位点识别序列的10个合成碱基(或者另外的6个核苷酸，优选地包括限制性位点识别序列)和4个A残基。新的启动子序列元件称作7SK4a，主要插入了被转录的并因此附加于图5所示的shRNA分子的5’末端的序列GTCGACAAAA。如图11所示，在三个不同的启动子背景中测试了三种shRNA序列(1737、1943、和799)对HBV抗原表达的沉默作用：U6启动子(图4c)、7SK启动子(4a)和7SK4a启动子(4e)。用先前实施例所述的对sAg和eAg清除的IC50值评价了9种构建体的效力。对于所测试的所有3种shRNA，7SK4a构型比其它两种启动子得到了显著更低的IC50值。

序列表

<110>纽克利奥尼克斯公司

<120>多RNA聚合酶III启动子表达构建体

<130>26788-018

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>240

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Homo sapiens 7SK promoter，GenBank Accession No.X04992，bases1-234，with a Sal I restriction site at bases 235-240

<400>1

ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc     60

ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcattttggg aataaatgat atttgctatg    120

ctggttaaat tagattttag ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg    180

acctaagtgt aaagttgaga tttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcctgtcgac    240

<210>2

<211>132

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Homo sapiens H1promoter，GenBank Accession No.X16612，bases250-375，with a Sal I restriction site at bases 376-381

<400>2

gagggacagg ggagtggcgc cctgcaatat ttgcatgtcg ctatgtgttc tgggaaatca     60

ccataaacgt gaaatgtctt tggatttggg aatcttataa gttctgtatg agaccactct    120

ttcccagtcg ac                                                        132

<210>3

<211>271

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Homo sapiens U6 promoter，GenBank Accession No.M14486，bases65-329，with a Sal I restriction site at bases 330-335

<400>3

aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac     60

aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa    120

aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt    180

aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat    240

atcttgtgga aaggacgaaa caccggtcga c                                   271

<210>4

<211>250

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Homo sapiens 7SK promoter，GenBank Accession No.X04992，bases1-244，with a Sal I restriction site at bases 245-250

<400>4

ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc     60

ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcattttggg aataaatgat atttgctatg    120

ctggttaaat tagattttag ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg    180

acctaagtgt aaagttgaga tttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcctgggtac    240

ctcggtcgac                                                           250

<210>5

<211>244

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Homo sapiens 7SK-4A promoter，GenBank Accession No.X04992，bases1-234，with a Sal I restriction site at bases 235-240followed by4A residues

<400>5

ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc     60

ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcattttggg aataaatgat atttgctatg    120

ctggttaaat tagattttag ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg    180

acctaagtgt aaagttgaga tttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcctgtcgac    240

aaaa                                                                 244

<210>6

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 2791

<400>6

aaaacgccgc agacacatcc aagagaactt tggatgtgtc tgcggcgtttt     51

<210>7

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 1907

<400>7

ttccgcagta tggatcggca gagaacttgc cgatccatac tgcggaa         47

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 1737

<400>8

ggattcagcg ccgacgggac gagagaactt cgtcccgtcg gcgctgaatcc      51

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 799

<400>9

gcctcgcaga cgaaggtctc aagagaactt tgagaccttc gtctgcgaggc      51

<210>10

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 1991

<400>10

tgcgtcagca aacacttggc aagagaactt tgccaagtgt ttgctgacgca      51

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>HepB based shRNA 1943

<400>11

tccacgcatg cgctgatggc cagagaactt ggccatcagc gcatgcgtgga      51

Claims (46)

1.一种表达构建体，其包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子与编码至少一种RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。

2.权利要求1的表达构建体，其中所述至少两个不同的RNA聚合酶III启动子是病毒或真核细胞来源的。

3.权利要求1的表达构建体，其中所述至少两个不同的RNA聚合酶III启动子独立地选自1型RNA聚合酶III启动子、2型RNA聚合酶III启动子、和3型RNA聚合酶III启动子(包括H1、7SK、U6和MRP)。

4.权利要求1的表达构建体，其中所述至少一种RNA效应物分子是短发夹RNA。

5.权利要求4的表达构建体，其中所述短发夹RNA包括选自SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、和SEQ ID NO：11的核酸序列，其中用U取代T。

6.权利要求1的表达构建体，其中所述表达构建体包括3到8个RNA聚合酶III启动子。

7.权利要求6的表达构建体，其中所述表达构建体包括4个RNA聚合酶III启动子。

8.权利要求7的表达构建体，其包括7SK和U6启动子。

9.权利要求6的表达构建体，其中RNA聚合酶III启动子选自H1、7SK、和U6。

10.权利要求1的表达构建体，其中所述至少一种RNA效应物分子能够调控靶基因的表达。

11.权利要求10的表达构建体，其中所述靶基因是病毒基因。

12.权利要求11的表达构建体，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。

13.权利要求1的表达构建体，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码不同RNA效应物分子的序列可操纵地连接。

14.权利要求1的表达构建体，其中每个RNA聚合酶III启动子与编码相同的RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。

15.权利要求1的表达构建体，其中相同的RNA聚合酶III启动子的拷贝不超过2个。

16.权利要求15的表达构建体，其中相同的RNA聚合酶III启动子的拷贝不超过1个。

17.权利要求1的表达构建体，其中所述的RNA聚合酶III启动子中的至少一个包括SEQ ID NO：5。

18.权利要求1的表达构建体，其中所述的RNA聚合酶III启动子中的至少一个包括SEQ ID NO：5，不同之处在于241到244位核苷酸包括gggg。

19.一种分离的核酸序列，其包括SEQ ID NO：5。

20.权利要求19的分离的核酸序列，其包括SEQ ID NO：5，不同之处在于241到244位核苷酸包括gggg。

21.权利要求19的分离的核酸序列，其包括SEQ ID NO：5，不同之处在于开始于235位核苷酸的Sal I限制性位点被选自由Aat II、Acc65I、Acl I、Afl II、AgeI、Apa I、ApaL I、Asc I、AseI、AsiS I、Avr II、BamHI、Bcl I、BfrB I、Bgl II、BmgB I、BseY I、BsiW I、BspD I、BspE I、BspHI、BsrB I、BsrG I、BssH II、BssS I、BstB I、BstZ17 I、Cla I、Dra I、EagI、EcoR I、EcoR V、Fse I、Fsp I、Hind III、Hpa I、Kas I、Kpn I、Mfe I、Mlu I、Msc I、Nae I、Nar I、Nco I、Nde I、NgoM IV、Nhe I、Not I、NruI、Nsi I、Pac I、PaeR7 I、Pme I、Pml I、Pst I、Pvu I、Pvu II、SacI、SacII、SbfI、Sca I、Sfo I、Sma I、SnaB I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、SwaI、Tli I、Xba I、Xho I、和Xma I组成的组中的限制性位点取代。

22.7SK聚合酶III启动子核酸序列，其中所述序列在其3’末端包括aaaa或gggg。

23.一种表达构建体，其包括两个或两个以上RNA聚合酶III启动子，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码短发夹RNA分子的核酸序列可操纵地连接。

24.权利要求23的表达构建体，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码相同的短发夹RNA分子的核酸序列可操纵地连接。

25.权利要求23的表达构建体，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码不同的短发夹RNA分子的核酸序列可操纵地连接。

26.权利要求23、24或25的表达构建体，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个是相同的RNA聚合酶III启动子。

27.权利要求23、24或25的表达构建体，其中所述两个或两个以上RNA聚合酶III启动子包括至少两种不同的RNA聚合酶III启动子。

28.权利要求23的表达构建体，其中所述两个或两个以上RNA聚合酶III启动子包括3型RNA聚合酶III启动子。

29.权利要求23的表达构建体，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少一个与编码短发夹RNA分子的序列可操纵地连接，所述短发夹RNA分子是双指的或多指的dsRNA发夹。

30.权利要求23的表达构建体，其中RNA聚合酶III启动子选自H1、7SK和U6。

31.权利要求23的表达构建体，其能够调控靶基因的表达。

32.权利要求31的表达构建体，其中所述靶基因是病毒基因。

33.权利要求32的表达构建体，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。

34.一种用于治疗需要降低靶基因活性的哺乳动物的方法，包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的表达构建体，所述表达构建体包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子，其中每个启动子与编码至少一个能够降低靶基因的表达的RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。

35.一种用于治疗需要降低靶基因活性的哺乳动物的方法，包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的表达构建体，所述表达构建体包括两个或两个以上RNA聚合酶启动子，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码能够降低靶基因的表达的短发夹RNA分子的核酸序列可操纵地连接。

36.权利要求34或35的方法，其中所述靶基因是病毒基因。

37.权利要求36的方法，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。

38.权利要求34或35的方法，其中哺乳动物是人。

39.一种调控至少一种靶基因的表达的方法，包括用包括两个或两个以上RNA聚合酶III启动子的表达构建体转染包括所述至少一种靶基因的宿主细胞，其中所述RNA聚合酶III启动子中的至少两个与编码能够调节所述至少一个靶基因的表达的短发夹RNA分子的核酸序列可操纵地连接。

40.一种调控至少一种靶基因的表达的方法，包括用包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子的表达构建体转染包括所述至少一种靶基因的宿主细胞，其中每个启动子与编码至少一种能够调节所述至少一个靶基因的表达的RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。

41.权利要求39或40的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

42.权利要求39或40的方法，其中所述至少一个靶基因是病毒基因。

43.权利要求42的方法，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。

44.一种产生用于调控至少一个靶基因的表达构建体的方法，包括：

(a)产生至少两种表达构建体，其中每一种表达构建体包括一个与编码至少一种RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接的RNA聚合酶III启动子；

(b)测定步骤(a)的每一种表达构建体调控至少一个靶基因的表达的功能性；和

(c)根据步骤(b)的测定值，产生包括至少两个不同的RNA聚合酶III启动子的表达构建体，其中每个启动子与编码至少一种RNA效应物分子的核酸序列可操纵地连接。

45.权利要求44的方法，其中通过向所述表达构建体中反复添加RNA聚合酶III启动子/RNA效应物分子盒产生步骤(c)的表达构建体。

46.一种药物组合物，其包括权利要求1或23的表达构建体。

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