CN101177664B - 飞秒激光体细胞核移植的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种飞秒激光体细胞核移植的方法及装置，其是采用飞秒激光双光子诱发的光刀效应和高光子密度诱导的光镊梯度力作用的微纳操纵方法。开启泵浦激光器，将其产生的激光引入到飞秒激光器的谐振腔中，经振荡后产生的飞秒超短脉冲激光通过再生放大器将能量放大，并选择输出激光的脉冲个数和重复频率。发射的飞秒激光经半透半反镜分成实现飞秒光镊与飞秒光镊的功能的两束光，再经过一个半透半反镜耦合到光路中进行光斑面积的扩增，将激光束聚焦到目标细胞上进行无损的体细胞核移植操作。设置软件控制系统中控制光闸的开关，实现激光焦点在目标细胞上的操作，同时调整扫描速度，改变曝光时间，以满足不同的要求，可提高体细胞核移植的成功率。

Description

飞秒激光体细胞核移植的方法及装置
技术领域
本发明涉及一种生物细胞技术，是采用飞秒激光双光子诱发的光刀效应和高光子密度诱导的光镊梯度力作用的微纳操纵方法，适用于多种生物细胞核移植和不同细胞的核-质相互作用的研究。
背景技术
克隆技术已展示出广阔的应用前景，培育优良畜种和生产实验动物、生产转基因动物用于细胞和组织替代疗法等。尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离，实践中克隆动物的成功率还很低。
克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得-卡尔伊尔门泽和彼得霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎。1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功，它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。近来，应用该技术可以将转基因(GFP)的神经细胞核植入卵母细胞质中，可获得绿色荧光GFP转基因克隆鼠；还有学者将神经干细胞、成纤维细胞作为供体获得了克隆鼠。目前，体细胞核移植克隆技术已成为国际上研究的热点之一。
总之，体细胞核移植技术的成功及其应用前景无疑是激动人心的，随着体细胞核移植技术的进一步发展和完善，它将给世界带来巨大贡献。但是，目前细胞核移植技术本身还不完善，还存在许多问题，如核移植的总效率低、存活率低和核移植动物的异常发育等等。维尔穆特研究组在培育“多莉”的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％。而其中，移核和去核在核移植中起着决定性的作用，因为核很小且极脆弱，必须做到既不损伤细胞核，又不损伤细胞质，才能使移核卵正常地分裂发育。而传统的细胞核移植方法如基于微吸管的显微操作法和电融合移植法都不可避免的引起大面积细胞膜的破损、细胞质的流失、细胞核的不完全去除等缺陷，从而影响核移植的成功率。因此，体细胞核移植技术对核的操作提出了更高的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述在体细胞核移植技术中移核和去核中存在的缺点，提供一种飞秒激光体细胞核移植的方法及装置，该工作装置可以同时实现受体细胞核的蚀除和供体细胞核的迁移操作。它是一种集超快激光技术、高分辨成像技术、三维高精密扫描技术、软件控制技术于一体的体细胞核移植技术。
本发明的技术解决方案如下：
实现本发明的装置由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成。激光发生系统由泵浦激光器、谐振腔和再生放大器依次组成。外光路系统由全反镜、半透半反镜、双分支光路、半透半反镜、扩束镜依次组成。双分支光路的一支由光闸和衰减镜依次组成，另一支由全反镜、可移动凸透镜、固定凸透镜、可旋转全反镜、光闸和衰减镜依次组成。高精度成像系统由白光源、显微物镜阵列、二向色镜、电子耦合组件和计算机依次组成。软件控制系统由计算机、高精度三维扫描平台和培养盒依次组成，计算机与高精度三维扫描平台相连，且计算机与光闸相连。
工作时，首先，开启泵浦激光器，将其产生的激光引入到飞秒激光器的谐振腔中，经振荡后产生的飞秒超短脉冲激光通过再生放大器将能量放大以满足光镊和光刀同时工作的需要。可以通过再生放大器来选择输出激光的脉冲个数和重复频率。发射的飞秒激光经半透半反镜实现分束，一束用于实现飞秒光镊的功能，另一束用于实现飞秒光刀的功能。这两束光经过一个半透半反镜耦合到一个光路中，然后经过一个扩束镜实现对光斑面积的扩增，后经过一个二向色镜将耦合的光束传输到高数值孔径的显微物镜中将激光束聚焦到目标细胞上。在实现光镊和光刀的分支光路上分别插入一个衰减镜用于调节操作过程中所需的激光能量，插入一个光闸用来控制飞秒激光的通断。软件控制系统中计算机驱动高精度三维扫描平台运动，且计算机控制光闸的开关，因而可以实现激光焦点在目标细胞上的操作，另一方面可灵活地调整扫描速度，改变曝光时间，以满足不同的要求。整个操作过程由电子耦合组件实时监控。
该装置是飞秒光镊和飞秒光刀的组合系统。飞秒光刀可以实现供核体细胞膜的切割与打孔、卵细胞透明带的打孔和细胞核的蚀除；飞秒光镊可以将供核体细胞的细胞核从细胞内捕获、迁移、组装到卵细胞内。因此，该装置可以实现体细胞核移植的全部过程。
本发明的优点是：与传统的体细胞核移植方法相比，本装置可以实现微损甚至是无损的体细胞核移植操作。飞秒激光脉冲具有极短的脉冲宽度和极高的峰值功率，飞秒激光脉冲与靶标的相互作用，具有极高的时间和空间分辨率，并可以高精度地控制作用能量。当飞秒激光光镊作用于细胞核时，它具有非机械接触的优点，不会机械地损伤细胞核及核周围其它细胞器；同时，由于飞秒激光的高峰值功率具有非线性的特点，使其能够实现细胞核的精确定位和避免激光传输过程中非焦点处引起的损伤。当飞秒激光光刀进行细胞膜和透明带的打孔以及卵细胞核蚀除的时候，由于高强度飞秒激光引起的多光子效应可以在焦点处引起超高精度的损伤区域，实现尺寸小于波长的亚微米级或纳米级蚀除，因此可以对卵细胞的细胞膜和胞内各细胞器产生最小的损伤，从而提高体细胞核移植的成功率。
附图说明
图1飞秒激光光镊与手术体细胞核移植系统装置示意图。
1泵浦源，2飞秒激光器，3再生放大器，4全反镜，5半透半反镜，6光闸，7衰减镜，8半透半反镜，9全反镜，10可移动凸透镜，11固定凸透镜，12可旋转全反镜，13光闸，14衰减镜，15扩束镜，16二向色镜，17显微物镜阵列，18高精度三维扫描平台，19培养盒，20白光源，21电子耦合组件，22计算机。
具体实施方式
结合图1示例的飞秒激光光镊与手术系统装置示意图对本发明的具体装置和体细胞核移植方法的细节和实施情况作如下说明：
实现飞秒激光体细胞核移植的装置主要由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成。其中激光发生系统由泵浦光源1、飞秒激光器2和再生放大器3依次组成。外光路系统分为两支，一支由全反镜4、半透半反镜5、光闸6、衰减镜7、半透半反镜8、扩束镜15依次组成；另一支由全反镜4、半透半反镜5、全反镜9、可移动凸透镜10、固定凸透镜11、可旋转全反镜12、光闸13、衰减镜14、扩束镜15依次组成。高精度成像系统由白光源20、样品盒19、显微物镜阵列17、二向色镜16、电子耦合组件21和计算机22依次组成。软件控制系统主要由计算机22、高精度三维扫描平台18和培养盒19依次组成。计算机22与高精度三维扫描平台18相连，且计算机22与光闸6和13相连。上述各组成元件依次连接构成飞秒激光光镊与手术体细胞核移植系统装置。该装置可以同时实现飞秒光镊和飞秒光刀的功能。飞秒光刀功能由上述元件1、2、3、4、5、6、7、8、15、16、17、18、19、20、21和22来实现，飞秒光镊功能由上述元件1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22来实现。飞秒光刀可以实现供核体细胞膜的切割与打孔、卵细胞透明带的打孔和细胞核的蚀除；飞秒光镊可以将供核体细胞的细胞核从细胞内捕获、迁移、组装到卵细胞内。
进行核移植之前，首先打开光闸6和13，手动调节可移动凸透镜10和可旋转全反镜12的偏转，使得飞秒光镊产生的激光焦点和飞秒光刀产生的焦点在样品内重合。第二步，关闭光闸6和13，将盛有供核体细胞和卵细胞的的培养盒19夹持到高精度三维扫描平台18上。第三步，将显微物镜阵列17调整到10倍物镜，调节三维扫描平台18使得细胞平面在激光焦点平面，同时粗调所要选择的细胞到激光焦点附近，然后选择100倍显微物镜精调三维扫描平台18使得细胞核与激光焦点在同一平面。第四步，调节飞秒光刀光路中的衰减镜7得到合适的激光功率，设定计算机22的控制程序，使精调三维扫描平台18和光刀光路中光闸6协调运动，从而实现卵细胞细胞核的蚀除而不损伤周围的细胞器和细胞膜。第五步，采用与第四步同样的方法，在卵细胞的透明带和供核体细胞的细胞膜上分别损伤与供核细胞核近似大小的区域。第六步，关闭光闸6，调节衰减镜14得到合适的激光功率，采用飞秒光镊捕获供核体细胞的细胞核，同时设定软件将细胞核从供核体细胞膜损伤区域中移出，最后穿过透明带的孔装配到卵细胞中去。第七步，将培养盒19取下，进行核移植细胞的培养。整个体细胞核移植过程通过电子耦合组件21进行实时监测。

Claims (1)

1.飞秒激光体细胞核移植装置，由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成，其特征在于激光发生系统由泵浦光源(1)、飞秒激光器(2)和再生放大器(3)依次组成；外光路系统分为两支，一支由第一全反镜(4)、第一半透半反镜(5)、第一光闸(6)、第一衰减镜(7)、第二半透半反镜(8)、扩束镜(15)依次组成；另一支由第一全反镜(4)、第一半透半反镜(5)、第二全反镜(9)、可移动凸透镜(10)、固定凸透镜(11)、可旋转全反镜(12)、第二光闸(13)、第二衰减镜(14)、第二半透半反镜(8)、扩束镜(15)依次组成；高精度成像系统由白光源(20)、样品盒(19)、显微物镜阵列(17)、二向色镜(16)、电子耦合组件(21)和计算机(22)依次组成；软件控制系统由计算机(22)、高精度三维扫描平台(18)和样品盒(19)依次组成，计算机(22)与高精度三维扫描平台(18)相连，且计算机(22)与第一光闸(6)和第二光闸(13)相连；泵浦光源(1)产生的激光经飞秒激光器(2)的谐振腔振荡后产生的飞秒超短脉冲激光通过再生放大器(3)将能量放大以满足光镊和光刀同时工作的需要，并通过再生放大器来选择输出激光的脉冲个数和重复频率，经再生放大器(3)能量放大的飞秒超短脉冲激光经第一半透半反镜(5)实现分束，一束用于实现飞秒光镊的功能，另一束用于实现飞秒光刀的功能，分别经过分为两支的外光路系统，两束光经过第二半透半反镜(8)耦合到一个光路中，然后经过扩束镜(15)实现对光斑面积的扩增，后经过高精度成像系统的二向色镜(16)将耦合的光束传输到高数值孔径的显微物镜阵列(17)中将激光束聚焦到目标细胞上。
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