CN101173239A - 采用黄铁矿(FeS2)作为能源共同培养微生物的组合体的方法 - Google Patents

采用黄铁矿(FeS2)作为能源共同培养微生物的组合体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了采用黄铁矿(FeS2)作为能源共同培养微生物的组合体的方法。本发明特别公开了黄铁矿作为能源在Acidithiobacillusferrooxidans和Acidithiobacillus thiooxidans型的分离的微生物(分别称为Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318)的组合体的共同培养中的用途。

Description

采用黄铁矿(FeS2)作为能源共同培养微生物的组合体的方法
技术领域
本发明涉及采用黄铁矿(FeS2)作为能源共同培养微生物的组合体的方法。本发明特别涉及黄铁矿作为能源在分离的Acidithiobacillus ferrooxidans和Acidithiobacillusthiooxidans型微生物(分别称为Wenelen DSM 16786和LicanantayDSM 17318)的组合体的共同培养中的用途。
背景技术
培养微生物时，人们常常使用人造的或特意配制的培养基，它们往往基于高纯度的有机和/或无机化学品。其目的通常是将与微生物的需要有关的变量控制到最大值，以及避免所有潜在的污染源和微生物生长抑制作用。
例如，At.ferrooxidans和At.thiooxidans的实验室规模的生长已经描述于Silverman，M.P.&Lundgren D.G.1959.“Studies onthe chemoautotrophic iron bacterium ferrobacillusferroooxidans I.An Improved Medium and a Harvesting Procedurefor Securing High Cell Yields”.Journal of Bacteriology.77：642-647，和Cook，T.M.1964.“Growth of Thiobacillusthiooxidans in shaken culture”.Journal of Bacteriology.88：620-623。
已经证明，以前的方法非产适合于实验室规模、甚至有时中试规模的微生物培养，然而由于经济上的原因，这种方法就不实用了，特别是当应对大规模生物量生产的时候。对这个问题的一般解决方案是采用工业级的试剂，采用它降低了培养基的成本，但是增加了潜在的污染源，而且添加了可能抑制微生物生长的杂质。
因此，为了在工业条件下培养微生物，已经描述了基于技术级的硫酸铵和磷酸钾的配方(Hackl等，美国专利号US 5,089,412)。类似地，在智利专利申请CL 2731-2004和CL 2101-2005中分别使用被称为改进的9K(3.0g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的KCl和0.1g/L的Ca(NO3)2、30g/L的FeSO4·7H2O)和9KS(3.0g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的KCl、0.1g/L的Ca(NO3)2、1％的元素硫或者另一种还原硫化合物)的培养基。
人们已经知道这样一个事实，即，在例如上文提到的那些培养基中培养微生物时，最终生物量浓度受到用作能源的基质的浓度的限制，还受到所述基质和微生物生长过程中产生的基质代谢产物这两者所施加的生长抑制作用的限制[LaCombe，J.，Lueking，D.1990.“Growthandmaintenance of Thiobacillus ferrooxidans cells”.Applied andEnvironmental Microbiology.56：2801-2806；Nagpal，S.1997.“Astructured model for Thiobacillus ferrooxidans growth on ferrousIron”.Biotechnology and Bioengineering.53.310-319]。
另一方面，获得的微生物的类型取决于使用的能源的类型：Fe2+化合物形式的铁(对于铁氧化微生物)，以及硫化合物-呈氧化态-2、0和+4一(对于硫氧化微生物)。
上述情况构成了混合的生物量生产过程(铁和硫氧化)的设计中的限制因素，因为不同的菌株要求不同的生产条件例如不同的基质和pH。
因此，在需要培养两种或两种以上微生物菌种的情况下，采用同一种培养基或者甚至在一起培养这些微生物是有吸引力的构思。这样，方法步骤的数目减少了，操作的复杂性简化了，而且在一些情况下，有可能收益于代表基础化学的特点。
在如下研究中，在实验室规模上显示了微生物(例如At.ferrooxidans)在作为能源的黄铁矿上的生长，获得了大约108个细胞/毫升的微生物浓度：Chong，N.，Karamanev，D.G.，Margaritas，A.2002.“Effect of particle-particle shearing on the bioleachingof sulfide minerals”.Biotechnology and Bioengineering.80：349-357。
Schippers，A.，Jozsa，P.G.，Sand，W.1996.“Sulfur chemistryin bacterial leaching of pyrite”.Applied and EnvironmentalMicrobiology.62：3424-3431，提出了在黄铁矿降解(degradation)循环期间硫代硫酸根(S2O3 2-)的形成。该化合物可以经历一系列的非生物反应，或被硫氧化细菌用作能源，这提供了提出在黄铁矿上共同培养铁氧化和硫氧化微生物的原因。
例如，在如下研究中提出了在黄铁矿上混合培养铁氧化和硫氧化微生物：Bacelar-Nicolau，P.&Jonson，B.1999.“Leaching ofpyrite by a cidophilic heterotrophic iron-oxidizing bacteria inpure and mixed cultures”.Applied andEnvironmental Microbiology.65：585-590。
从化学角度看，对于分解要被Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物用作能源的黄铁矿，这些微生物的活性用下式表示：
FeS2+6Fe3++3H2O→7Fe2++S2O3 2-+6H+
7Fe2++7/4 O2+7H+→7Fe3++7/2 H2O+At.ferrooxidans
FeS2+7/4 O2+H+→Fe3++S2O3 2-+1/2 H2O+At.ferrooxidans反应(i)
如反应(i)中观察到的那样，产物之一是硫代硫酸盐，它涉及中间氧化态的硫，而且它可以按照如下反应用作Acidithioba cillusthiooxidans型微生物的能源：
S2O3 2-+H2O+2O2→2SO4 2-+2H++At.thiooxidans反应(ii)
最后，关于黄铁矿或含有它的物质的用途，现有的研究提出了不同的方法，例如，在专利WO0136693、WO0071763和WO2004027100中提出了它作为硫酸来源的用途。在文献WO0136693中，将黄铁矿与其中没有添加硫酸的浸滤系统联系起来；在文献WO0071763中，将其与酸的替代(当矿石显示出对它的高需求时)联系起来；而在文献WO2004027100中，用它代替一部分所需的酸。在其它文献例如专利US6,110,253和申请US2005103162中，黄铁矿被用作升高矸石堆(heap)温度的机制，因为当它被生物氧化时，它产生热量，根据这些内容，这使它可能与嗜热微生物一起实施生物浸滤。
据我们所知，仍然没有能使可用于生物浸滤的微生物的大规模生产可行的更低费用的培养基；而且我们也不知道其中黄铁矿被实际地用作混合生物量的生长用能源的过程。
发明内容
为了更好地理解所述那些过程，如下表述应理解为：
a)ATCC：“American Type Culture Collection”，美国典型微生物培养物保藏中心
b)槽中的矿石生物浸滤：在带有假底层的槽内进行的一个过程，矿石装在槽内并用浸滤液淹没，在嗜酸微生物的存在下使所述浸滤液循环通过矿石颗粒，并且提取溶解在酸溶液中的铜。
c)堆积场中的矿石生物浸滤：在“矿厂运行时”或采用预破碎收集从露天了开采操作提取的、在边际品位以下的矿石被贮存在具有适合于控制溶液渗入的凹槽中或者贮存在已经预先安装了防水遮盖物的表面上。在嗜酸微生物的存在下，用浸滤液灌注表面，并且从底部提取溶解在酸溶液中的铜。
d)矿石堆中的生物浸滤：在该过程中，已经被碾碎至特定分级的矿石被收集在轻微斜坡上的防水表面上。在嗜酸微生物的存在下用浸滤液灌注所述表面，并且从底部提取溶解在酸溶液中的铜。
e)“原位”(现场)矿石生物浸滤：直接地浸滤其中矿石呈天然状态或由于前面的采矿操作而被破碎的矿床，在嗜酸微生物的存在下，用浸滤液灌注表面，并且从底部提取溶解在酸溶液中的铜。
f)在釜或搅拌的容器中的矿石生物浸滤：该生物浸滤过程发生在机械搅拌的反应器中，其中在嗜酸微生物的存在下，细分的矿石与浸滤液混合，形成固体含量至多20％的矿浆，提取溶解在酸溶液中的铜。
g)尾矿坝生物浸滤：起源于浮选过程并且含有少量存在于矿石中的金属的尾矿被收集在坝中，然后从坝提取矿石，在嗜酸微生物的存在下，用于在矸石堆内或通过搅拌进行浸滤，并且提取溶解在酸溶液中的铜。
h)生物量：在特定面积或体积内产生的活生物体的质量。
i)DSM：“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”德国典型微生物培养物保藏中心。
j)接种物：纯的或混合的细菌培养物，在生物浸滤过程中它将充当活性生物物质。
k)钝化：由于硫和聚硫层在矿石表面的堆积而造成的矿石浸滤速率的降低。
l)PLS：在生物浸滤过程中产生的水溶液，它含有从矿石中浸出的金属离子。该溶液构成溶剂提取工厂进料。
m)萃余液：由于溶剂提取过程而贫铜的水溶液。
n)混合的能源：允许铁和硫氧化微生物同时生长的基质。
o)混合的生物量：能够氧化被还原的铁和硫化合物的微生物的质量。
为了实现能用于硫化物金属矿石生物浸滤的分离的微生物的大规模生产，已经开发了一种基于生物反应器的使用的方法，通过采用混合的能源，用这种方法可能降低为生长这些微生物而使用的培养基的费用。
这种方法在于，使用含黄铁矿的物质代替一部分标准培养基，作为一起生长的两种不同类型的微生物(即，Acidithiobacillusferrooxidans和Acidithiobacillus thiooxidans)的混合能源。
这种方法还提供了关于微生物的量、它们对固相的适应性的优点，还提供了与铜回收和获得+3氧化态的铁有关的优点。
根据本发明，采用用黄铁矿改进的培养基，一起培养Acidithiobacillus ferrooxidans和Acidithiobacillus thiooxidans型微生物连同其它微生物，所述黄铁矿利用了可用作能源的物质的存在和形成：分别是铁(氧化态+2)和硫(氧化态+2)，而且提供了关于微生物培养方法的一系列优点。
考虑到一部分常规培养基已经被低成本的物质所替代，该培养物显然比采用常规培养基的培养物费用低。此外，通过同时培养两种微生物，所以与房产、反应器、控制系统等有关的费用也得以降低，如果没有本发明这些费用就不得不加倍。
另外，采用黄铁矿的共同培养法使人们可以获得比分别培养同样的微生物时通常可以获得的浓度更高的微生物。这具有经济上的重要性，这是可以通过如下优点得以评价的事实：当设计新设备时为实现特定的目标浓度所需的装置的减少，或者在目前操作的设备中更高的生产能力。
基于下文实施例中进行的研究可以确认，微生物组合体(它包括与矿石中天然的微生物混合的分离微生物)在用含黄铁矿的物质改进的培养基中正常地生长。这与现有技术相比的进步，因为它通过降低培养基费用而降低了培养费用。
另一方面，根据前文讨论的反应，必将实现Acidithiobacillusthiooxidans菌种的更高浓度，或同等地，Acidithiobacillusthiooxidans菌种的更高相对生长。这可能是也可能不是一个优点，要取决于关于其中使用产生的生物量的后继过程的考虑因素。然而，如果需要或必要，可以通过掺入硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)形式的Fe+2来平衡微生物生长。
如已经指出的那样，在实践中，本发明是通过用含有黄铁矿的物质代替一部分标准微生物培养基得到证实的。被替代的培养基比例是这样的，它对应于铁和硫物质，而且它可能在广泛的回旋余地内被替代，例如，在根据本发明改进的培养基中，可以使用1至20g/L的黄铁矿(基于100％基准)。
另一方面，而且由于含有黄铁矿的物质大部分是固体，所以微生物实现了对固相硫氧化的适应。这种适应性是有用的，而且也代表了技术上的进步，理由是，当微生物适应了固相时，它们将迅速地移居在位于其中使用它们的矸石堆、堆积场、尾矿坝或其它“原位”(现场)操作中的物质上，缩短与它们的浸滤有关的时间。
最后，而且根据前文所述的反应，产生了培养基中+3氧化态的铁的富集。正如技术上已知的那样，Fe3+的存在有利于次生矿的浸滤，因此这也代表了相对于其它方法的优点。
根据如下的操作步骤和条件定义了本发明的采用(FeS2)作为能源共同培养Acidithiobacillus thiooxidans和Acidithiobacillusferrooxidans型微生物的组合体的方法：
a)通过用黄铁矿替代一部分培养基而制备用于Acidithiobacillus thiooxidans型和Acidithiobacillusferrooxidans型微生物的培养基；
b)将该培养基的pH值调节在1.5至2.5的范围内；
c)在有或没有其它微生物的情况下用Acidithiobacillusthiooxidans型和Acidithiobacillus ferrooxidans型分离的微生物的混合物接种所述培养基；
d)在25℃到35℃的范围内调节温度；
e)使含0.20％至0.80％CO2的富含CO2的空气流通过。
在步骤a)中，被替代的那部分培养基是相应于还原的铁和硫化合物的那部分，例如硫酸亚铁和元素硫。
在本发明的方法中，含有黄铁矿的培养基中黄铁矿的量相当于1至20克/升。被培养的所述Acidithiobacillus thiooxidans andAcidithiobacillus ferrooxidans型微生物是分离的微生物，而且优选的Acidithiobacillus thiooxidans型微生物是Licanantay DSM17318而优选的Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物是WenelenDSM 16786。微生物接种物体积与培养基体积之比在从1∶20到1∶5的范围内。
附图说明
图1：该图显示，根据实施例1中的描述，含有硫酸亚铁和黄铁矿精矿(I)的不同混合物的培养基上微生物组合体的生长曲线。
图2：该图显示，在如实施例2中所述通过掺入黄铁矿精矿(II)而改进的培养基中微生物组合体的间歇方式生长曲线。
图3：该图显示，在生物量增殖生物反应器中At.ferrooxidansWenelen DSM 16786(黑条)和At.thiooxidans Licanantay DSM 17318(白条)的含量，所述生物反应器按连续方式操作，采用如实施例3中所述通过掺入黄铁矿精矿(III)而改进的培养基。
具体实施方式
实施例1
为了确定Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318微生物组合体的生长动力学和生物量性能，采用通过掺入黄铁矿精矿(I)而改进的培养基，使用下述方案进行实验：
方案
为了实现所述目的，进行了振荡器-烧瓶型生长测定。在100ml烧瓶中补充有如下两种能源的混合物的25ml培养基中进行菌株混合物的生长：黄铁矿精矿(I)(其特征如表1中所述)和硫酸亚铁(FeSO4)。所用的能源混合物如表2中详述。培养基营养物组成如下：0.99g(NH4)2SO4/L、0.128g NaH2PO4·H2O/L、0.0525g KH2PO4/L、0.1gMgSO4·7H2O/L、0.021g CaCl2/L。将培养基pH调节到1.8。每一个烧瓶中Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318菌株的浓度为2.5×107个细胞/毫升。
在200rpm下操作的轨道式振荡器中、在30℃下进行烧瓶培养。
借助显微镜计数法在Petroff-Hausser室中、以6天的间隔进行烧瓶中生物量浓度的定期跟踪。
表1：黄铁矿精矿(I)的矿物学组成
矿物     ％重量     ％Vol.     ％S     ％Cu     ％Fe     ％As   ％Mo   ％Zn     ％Pb
黄铜矿     11.24     10.98     3.93     3.888     3.42
辉铜矿     10.41     7.50     2.09     8.315
铜蓝     5.57     4.97     1.87     3.705
斑铜矿     7.74     6.23     1.98     4.902     0.86
Cu G砷铜矿     0.17     0.15     0.04     0.088     0.034
硫砷铜矿     4.30     4.01     1.40     2.075     0.816
黄铁矿     32.09     26.35     17.13     14.95
辉钼矿     2.34     2.04     0.94   1.40
方铅矿     0.13     0.52     0.02    0.11
闪锌矿     4.13     4.23     1.36   2.77
赤铁矿     0.09     0.07     0.07
褐铁矿     0.27     0.30     0.17
金红石     0.15     0.15
脉石     21.38     32.50
总计     100.00     100.00     30.77     22.972     19.47     0.850   1.40   2.77    0.11
表2：实施例1的生长测定中使用的能源混合物
    烧瓶     FeSO4·7H2O[g/L]     黄铁矿精矿(I)黄铁矿[g/L]
    1     7.5     0
    2     15.0     0
    3     7.5     1
    4     7.5     2
    5     7.5     5
    6     7.5     10
结果
如图1中能观察到的那样，添加2和5g/l的浓度水平的黄铁矿精矿(I)能够增加在初始硫酸亚铁浓度为7.5g/l的培养基中获得的自由生物量繁殖速率和最终的生物量。添加10g/L精矿(I)只能提供最终在生物量，可能由于自由生物量繁殖的延迟，可能由于细胞在固体表面上的吸附。在7.5g/l硫酸亚铁+精矿(I)5g/l混合物的情况下，在6天内获得的自由生物量比采用不含精矿(I)而含有1.5g/l浓度的硫酸亚铁的培养基更多。换句话说，清楚地证明了，可以用黄铁矿精矿(I)代替培养基的一部分硫酸亚铁。
实施例2
为了确定Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318微生物组合体的生长动力学和生物量性能，采用通过掺入黄铁矿精矿(II)而改进的培养基，使用下述方案进行实验：
方案
细菌生长发生在6m3反应器中。
通过在由下列物质组成的营养液中悬浮特征如表3所示的黄铁矿精矿(II)(在1.25％矿浆浓度下)而制备用于微生物繁殖的培养基：75gFeSO4/L、0.99g(NH4)2SO4/L、0.128g NaH2PO4·H2O/L、0.0525g KH2PO4/L、0.1g MgSO4·7H2O/L、0.021g CaCl2/L。将培养基的pH调节到1.8。
表3：黄铁矿精矿(II)的矿物学组成
    矿物     ％重量     ％Vol.     ％S     ％Cu     ％Fe     ％Mo     ％Zn
    黄铜矿     2.08     1.51     0.73     0.72     0.63
    辉铜矿     0.53     0.29     0.11     0.43
    铜蓝     0.62     0.41     0.21     0.41
    斑铜矿     1.37     0.82     0.35     0.86     0.15
    黄铁矿     19.28     11.76     10.30     8.98
    辉钼矿     0.94     0.61     0.38     0.57
    闪锌矿     0.05     0.04     0.02     0.04
    磁铁矿     0.21     0.12     0.15
    褐铁矿     0.20     0.16     0.13
    金红石     0.17     0.12
    脉石     74.54     84.16
    总计     100.00     100.00     12.08     2.42     10.05     0.57     0.04
为了开始培养，将5,400L的培养基与带有Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318微生物的600L细菌接种物混合。
为了使微生物能在反应器中生长，该反应器提供富含0.5％CO2的空气。将反应器的温度控制在30℃。通过添加H2SO4来控制反应器中的pH。
按间歇方式操作反应器15天。在反应器操作过程中，采用Petroff-Hausser室、通过显微镜计数法来监测微生物生长。
结果
如图2中所观察到的那样，在用黄铁矿精矿改进的培养基中微生物的浓度迅速升高，在6天内达到最高微生物浓度1.7×109个细胞/毫升。基于指数生长期间获得的数据，可以确定0.069h-1的比生长速率。
实施例3
为了证明可以采用通过掺入黄铁矿精矿(III)而改进的培养基能按连续方式有效地使Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318微生物组合体增殖，采用如下方案进行实验。
方案
细菌生长发生在50m3反应器中。
通过在由下列物质组成的营养液中悬浮黄铁矿精矿(III)(在0.125％矿浆浓度下)而制备用于微生物繁殖的培养基：8g FeSO4/L、0.99g(NH4)2SO4/L、0.128g NaH2PO4·H2O/L、0.0525g KH2PO4/L、0.1gMgSO4·7H2O/L、0.021g CaCl2/L。将培养基的pH调节到1.8。
为了开始培养，将44m3的培养基与带有Wenelen DSM 16786和Licanantay DSM 17318微生物的6m3细菌接种物混合。
为了使微生物能在反应器中生长，给反应器提供富含0.5％CO2的空气。将反应器中的温度控制在30℃。通过添加H2SO4来控制反应器中的pH。
在反应器操作过程中，采用Petroff-Hausser室、通过显微镜计数法来监测微生物生长。
使用定量PCR(qPCR)技术进行反应器中存在的微生物的鉴定。
按照间歇方式操作反应器7天，其后通过以360 L/h的速率提供所示组成的培养基而开始连续操作反应器。
在反应器的连续操作阶段期间，为了用qPCR法鉴定而进行取样。
结果
如图3所示，采用通过掺入黄铁矿精矿而改进的培养基的生物反应器的连续操作，有效地使At.ferrooxidans和At.thiooxidans微生物菌种得以增殖。
本发明的优点：
为了评价通过掺入黄铁矿精矿而导致的培养基费用降低，设想一个2,000吨的矸石堆，采用480L/h的流速进行灌注，采用1.3×108个细胞/毫升的浓度进行连续接种。
所述条件决定了，需要在360L/h下、以1.3×108个细胞/毫升的浓度生产微生物培养物。如果考虑每吨浓度为8g/l的硫酸亚铁价值为US$350，那么用黄铁矿精矿(I)完全替代该试剂就会每年节省8,830美元。典型的铜开采操作涉及每年浸滤两百万吨以上的矿石(例如，在智利的Cerro Colorado操作)，因此，与使用黄铁矿代替硫酸亚铁和单独硫源相关的费用节省达每年八百万美元以上。

Claims (9)

1.共同培养Acidithiobacillus thiooxidans和Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物的组合体的方法，该方法的特征在于，它包含如下步骤：
a)通过用黄铁矿替代一部分培养基而制备用于Acidithiobacillus thiooxidans型和Acidithiobacillusferrooxidans型微生物的培养基；
b)将该培养基的pH值调节到1.5至2.5；
c)用在有或没有其它微生物的情况下培养的Acidithiobacillusthiooxidans型和Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物的混合物接种所述培养基；
d)将温度调节到在25℃和35℃之间的水平；
e)用含0.20％至0.80％CO2的富含CO2的空气流充气。
2.权利要求1的方法，其特征在于，被替代的那部分培养基是这样的物质，它相应于还原的铁和硫化合物，例如硫酸亚铁和元素硫。
3.权利要求1的方法，其特征在于，含有黄铁矿的培养基中黄铁矿的量相当于1至20克/升。
4.权利要求1的方法，其特征在于，培养的Acidithiobacillusthiooxidans和Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物是分离的微生物。
5.权利要求4的方法，其特征在于，所述Acidithiobacillusthiooxidans型微生物是Licanantay DSM 17318，而所述Acidithiobacillus ferrooxidans型微生物是Wenelen DSM 16786。
6.权利要求1的方法，其特征在于，培养pH是1.8。
7.权利要求1的方法，其特征在于，培养温度被控制在30℃。
8.权利要求1的方法，其特征在于，空气富含0.5％CO2。
9.权利要求1的方法，其特征在于，微生物接种物与培养基体积之比为为1∶20至1∶5。
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