CN101164557B - 预防及/或治疗骨质流失的医药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种医药组合物，包括有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，且该医药组合物可预防及/或治疗骨质流失。

Description

预防及/或治疗骨质流失的医药组合物 

技术领域

本发明是关于一种医药组组合物，且特别关于一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物。 

现有技术 

骨质疏松症可分为两大类：一是因女性荷尔蒙缺乏所造成的“停经后骨质疏松症”，此病症好发于停经后的女性身上；而另一类发生的原因则是由于老化而产生的，我们称之为“老年型骨质疏松症”，此症不论男女只要活得够老，都可能会发生。从临床的研究报告中可发现，当更年期妇女的女性荷尔蒙分泌不足时，骨头流失的速率一年可高达百分之三至百分之五。骨头加速流失后，就会造成骨质疏松症，当骨头结构变的不良时，就可能在外力的作用下，造成骨折的发生。更年期后骨质疏松症有一些特定好发部位，人体的骨头可粗分为两大部份，一个是外层较坚硬致密的部份，我们称为硬骨；另外骨头中间较松软的部份也就是一般俗称骨髓的部位，我们称之为松骨，更年期后骨质疏松症好发的部位就是所谓松骨的部份。以人体来讲，不同部位骨头所含松骨和硬骨的比例都不相同，而更年期骨质疏松症好发于人体中松骨为主要构成成份的部位，其中最主要就是脊椎部位，所以容易造成腰椎的压迫性骨折；另外就是长骨的终端，即四肢骨的终端部位，亦容易造成手腕部的骨折。更年期后骨质疏松症的妇女，易造成骨折的类型就是此二种。 

停经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis)是老年妇女常患的一种代谢性骨病。临床的研究报告中可发现，当更年期妇女的女性荷尔蒙分泌不足时，骨头流失的速率一年可高达百分之三至百分之五，随着人类平均寿命的延长，停经后骨质疏松的发病率呈上升趋势。停经后妇女骨质疏松发病机转主要因停经所致女性贺尔蒙缺乏所导致熟知此的技术人员骨质大量流失(每年约下降3～6％甚至更高)。因正常时动情激素能刺激“造骨细胞”(osteoblast)产生细胞介质，一方面抑制“破骨细胞”(osteoclast)的活性，令一方面刺激“造骨细胞”以使骨质维持平衡状态。一旦缺乏女性激素，则骨 质大量流失，钙离子从骨中大量释出，压抑了副甲状腺浓度，引致活性维生素D合成减少，故减低了钙离子在胃肠道熟知此的技术人员吸收，导致钙离子“负平衡”，加速骨质疏松症的发生。 

台湾已渐渐步入高龄化社会，由此联想，将有更多人发生骨质疏松症。停经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis)是老年妇女常患的一种代谢性骨病。随着国人平均寿命的延长，停经后骨质疏松的发病率呈上升趋势。现代医学对停经后骨质疏松的治疗方法主要是雌激素替代疗法，但长期使用有一定副作用(Colditz GA，Hankinson SE，Hunter DJ.The use of estrogen andprogestins and the risk of breast cancer in postmenopausal women.N Eng J Med，1995，332：1589-1593；Grady D，Gebretsadik T，Kelikowske K.Hormonereplacement therapy and endometrial cancer risk：a meta-analysis.ObstetGynecol，1995，85：304-313)，因此，目前亟需一种可用来预防及/或治疗骨质流失的医药组合物。 

发明内容

本发明的目的为提供一种医药组合物，可用来预防及治疗老人或停经妇女的骨质流失。 

为达成上述目的，本发明提供一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，包括有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，其中各成份的重量比为甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角＝1-10∶2-10∶1-10∶1-10。 

为达成上述目的，本发明另提供一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，包括有效量的欧前胡素(imperatorin)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。 

为达成上述目的，本发明另提供一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，包括有效量的香柠檬烯(bergapten)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。 

图式简单说明 

第1图显示本发明医药组合物对大鼠体重的影响。 

第2图显示服用本发明医药组合物大鼠熟知此的技术人员骨组织切片。 

第3A-3B图显示本发明医药组合物中各成份对细胞增殖的影响。 

第4图显示医药组合物中各成份对骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。 

第5A-5B图显示医药组合物中各成份对骨细胞矿化的影响。 

第6A图显示医药组合物中各成份对破骨细胞分化的影响。 

第6B图显示医药组合物中各成份对破骨细胞再吸收作用的影响。 

第7A图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞存活的影响。 

第7B图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞增殖的影响。 

第8A图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞ALP活性的影响。 

第8B图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞分泌胶原蛋白(collagen)的影响。 

第8C-8D图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞矿化的影响。 

第9A-9B图显示欧前胡素及香柠檬烯对骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP-2)基因的表达。 

第9C图显示欧前胡素、香柠檬烯及BMP拮抗剂(noggin)对骨细胞ALP活性的影响。 

第10A图显示欧前胡素对SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影响。 

第10B图显示香柠檬烯对SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影响。 

第11A-11B图显示p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)对p38及EPK蛋白磷酸化的影响。 

第11C图显示p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)对骨细胞ALP活性的影响。 

第11D图显示p38突变株(DN-p38)及ERK突变株(DN-ERK)对骨细胞ALP活性的影响。 

第12图显示欧前胡素及香柠檬烯进行动物实验。 

为了让本发明熟知此的技术人员上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特别列举优选实施例，并配合所附附图，作详细说明如下： 

实施方式 

本发明是提供一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物。在一种实施例中，本发明的医药组合物包括甘草、黑豆、蛇床子、鹿角等，其中各成份 的重量比为甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角＝1-10∶2-10∶1-10∶1-10，优选为2-4∶4-6∶1-3∶1-3。且本发明的医药组合物中亦包含蛇床子素(osthol)、欧前胡素(imperatorin)及香柠檬烯(bergapten)。 

本发明医药组合物的制作方法为特殊的加工制程，首先，将甘草加热以萃取液萃取，其中使用的萃取液可为水、乙醇等。再将黑豆和蛇床子以乙醇浸泡约2-40小时，优选约10-20小时，再加热萃取。之后，将黑豆、蛇床子萃取液与甘草萃取液合并，彼此的体积比为甘草∶黑豆+蛇床子＝1∶2，经减压浓缩后得浓缩液10-100公升，将10-40公斤的鹿角粉加至浓缩液中后并干燥，将干燥物粉碎、造粒并制成剂型，即为本发明医药组合物。 

本发明的医药组合物可用于预防及/或治疗骨质流失，其中骨质流失包括骨质疏松症或骨质疏松性骨折。此医药组合物可增加个体的骨密度(BMD)、骨含量(BMC)及骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。一般而言，本发明的医药组合物可增加5.15％的骨密度、3.77％的骨含量及30.0％的骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，在优选实施中可增加10.30％的骨密度、11.32％的骨含量及68.0％的骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。且此医药组合物亦可增加个体骨组织的最大应力(maximal load)、断裂力量(ultimate loading)、杨氏系数(young’s modulus)及断裂强度(ultimate stress)。一般而言，本发明的医药组合物可增加3.14％的最大应力、5.23％的断裂力量、7.49％的杨氏系数及15.65％的断裂强度，在优选实施中可增加10.24％的最大应力、13.15％的断裂力量、10.07％的杨氏系数及37.39％的断裂强度。 

本发明的医药组合物可依实际需要制作成各种不同形式的剂型，例如锭剂、胶囊、颗粒、粉末、液剂、或丸剂等。 

在另一种实施例中，本发明的医药组合物包括有效量的欧前胡素(imperatorin)以及药学上可接受的载体或赋形剂，其可为口服或注射剂型，注射剂型可为肌肉注射或皮下注射。此医药组合物可增加个体的骨密度、骨含量及骨细胞碱性磷酸酶活性，一般而言，本发明的医药组合物可增加12.22％的骨密度、28.91％的骨含量及6.0％的骨细胞碱性磷酸酶活性，在优选实施中可增加90％的骨细胞碱性磷酸酶活性。 

在另一种实施例中，本发明的医药组合物包括有效量的香柠檬烯(bergapten)以及药学上可接受的载体或赋形剂，其可为口服或注射剂型，注射剂型可为肌肉注射或皮下注射。此医药组合物可增加个体的骨密度、骨含 量及骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，一般而言，本发明的医药组合物可增加12.22％的骨密度、33.73％的骨含量及5％的骨细胞碱性磷酸酶活性，在优选实施中可增加75％的骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。 

本发明中所提及的个体为动物，包括人类或非人类的动物，如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、或非人熟知此的技术人员灵长类。在一种实施例中，哺乳类动物为人，在另一种实施例中，哺乳类动物为啮齿类动物，如小鼠或大鼠。 

以下通过实施例以更进一步说明本发明的特征及优点。 

实施例 

1.本发明医药组合物熟知此的技术人员制备

本发明的医药组合物，由甘草(购自金保安贸易有限公司)30公斤、黑豆(购自迪泰贸易有限公司)60公斤、蛇床子(购自易承贸易有限公司)10公斤、鹿角(购自迪泰贸易有限公司)8公斤组成。首先，将甘草加热至100℃，以水萃取，取萃取液150公升。再将黑豆和蛇床子以30％的乙醇浸泡20小时，再加热至80℃萃取，与甘草萃取液合并，彼此的体积比为甘草∶黑豆+蛇床子＝1∶2，经减压浓缩得浓缩液30公升，于浓缩液中加入鹿角粉后于60℃下干燥48小时。干燥物粉碎后造粒并制成剂型。 

2.动物实验熟知此的技术人员步骤

采用国科会国家实验动物繁殖及研究中心，Sprague-Dawley品种、8周龄的雌性大鼠，经饲养4周后，进行切除卵巢手术。随机分为(1)假手术组，(2)卵巢切除控制组和(3)卵巢切除给予医药组合物治疗三组，将Sprague-Dawley大鼠用400mg/kg的三氯乙醛(trichloroacetaldehyde)麻醉，无菌操作，经腰椎旁切口进入大鼠腹腔背侧，将去卵巢控制组及卵巢切除+股立补组的大鼠双侧卵巢完全切除，假手术组不切卵巢，止血缝合。术后摄食和饮水如前。隔天后医药治疗组开始经口灌服医药组合物，每公斤体重每天1.2克，每天1次，假手术组和去卵巢组则灌服羧基甲基纤维素(Carboxymethylcellulose，CMC)。给药剂量每周按体重校正1次，共喂养、给药6周，6周后处死全部大鼠。 

3.医药组合物对骨长度及重量的影响

上述大鼠处死后，将二侧股骨(femur)及胫骨(tibia)取出储存于-80℃熟知此的技术人员冰箱，且将股骨及胫骨外的肌肉与结缔组织剃除，利用微量天平测量骨头的重量，骨头长度则是利用微量表尺测量(±0.05mm)，骨密度(BMD)及骨含量(BMC)是以dual-energy X-ray absorptiometer(DEXA，XR-26；Norland，Fort Atkinson，WI)测量。且将股骨于4％福尔马林中固定二天后，置于4℃的EDTA(10％)脱钙二星期，利用酒精脱水后将股骨包埋至石蜡中做5mm切片。利用Mayer’s hematoxylin-eosin溶剂染色，再使用Image-proplus(3.0ed)软件定量二级海绵骨(secondary spongiosa)的骨量(bone volume)。参照第1图，去卵巢组的体重比假手术组重，且服用本发明的医药组合物并不会抑制大鼠体重的增加。参照第2图，由骨组织切片中可发现本发明的医药组合物有防止骨质流失的作用。其它数据如表一所示。 

表一、医药组合物对骨组织的影响 

4.骨生物力学的分析

使用material testing system(MTS-858，MTS System Inc.，Minneapolis，MN)三点折断(three-point bending test)来量测骨组织生物力学。骨头二端的距离为20mm，压垂下降的速度为每分钟1mm，将所得速度及压力做回归线及带入下方公式后即可得到杨氏系数及断裂强度。 

5.初代成骨细胞的培养

取自于怀孕第18天Spraque-Dawley鼠胚胎的顶骨架(parietal bone)，母鼠处死后，整个子宫取下放于无菌的培养皿中，由子宫取出胎鼠并将其头颅骨(calvarium)分离出来，剪下顶骨且避免取到骨缝(suture)，将骨片两侧的骨膜层去除，再将骨片切成碎片，以0.1％的胶原蛋白酶(collagenase)将骨片做每次20分钟共5次的序列性消化，以便使细胞从骨片释放出来。收集最后三次消化出来的细胞，混合这三次消化的细胞即为成骨细胞悬浮液。细胞培养于α-MEM，其中含1％的盘尼西林-链霉素(penicillin-streptomycin)及10％的FBS，置于37℃含5％CO₂的培养箱中，当细胞长满时，进行继代培养，所有实验只取用第一代至第五代作为实验材料。 

6.分析医药组合物中各成份对细胞增殖的作用

将上述成骨细胞培养在96孔培养皿中，分别加入5、15、50、100μg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)医药组合物的浓缩物，作用48小时后，小心吸除细胞上培养液，依照Cell Proliferation ELISA，BrdUkit(Roche Applied Science)的过程来测定细胞增殖作用。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的细胞增殖率定为100％。结果如第3A-3B图所示，所有的成份均可增加骨细胞的增殖。 

7.分析医药组合物中各成份对骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

将上述成骨细胞分别以5、15、50、100μg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)医药组合物的浓缩物处理后，加入0.2％ NP-40将细胞溶解，溶解液经过振荡再离心1500×g五分钟，利用ALP kit测量上清液中ALP的活性。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的ALP的活性定为100％。结果如第4图所示，除了黑豆之外，其它成份均会增加骨细胞ALP的活性。 

8.分析医药组合物中各成份对骨细胞矿化的影响

对成骨细胞分别给予分化培养液(含50μg/ml的维生素C及10mM的β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate))及5、15、50、100μg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)医药组合物的浓缩物，培养液每三天更 换一次，14天后细胞加入75％乙醇固定三十分钟，再加入40mM的茜素红(Alizarin red-S)在室温下作用一个小时，以去除未与钙键结的染剂，最后加入10％的氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)溶解，利用550nm吸光值测量骨小结含量。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的矿化程度定为100％。结果如第5A-5B图所示，除了黑豆外，其它4种成份均可增加矿化作用。 

9.分析医药组合物中各成份对破骨细胞分化的影响

利用针筒抽出6-8周Spraque-Dawley老鼠的骨髓，经过一天的沉降，计算漂浮的细胞(hematopoietic cell)1×10⁶颗于培养皿中，分别加入分化剂(含50ng/ml的RANKL及20ng/ml的M-CSF)以及150μg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)医药组合物的浓缩物，每三天更换分化剂，培养8天后，以耐酒石酸的酸性磷酸酵素(tartrate-resistant acidphosphatase，TRAP)染色，在显微镜下计算染到TRAP且细胞核多于3个的细胞。以加入0.1％ DMSO做为对照组。参照第6A图，仅有黑豆成份会少许地抑制破骨细胞的分化。 

10.分析医药组合物中各成份对破骨细胞再吸收作用的影响

将五天大的纽西兰兔处死，利用剪刀剪碎长骨且分离出骨壁上成熟的破骨细胞，将细胞收集并种于OAAS盘中，分别给予150μg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)医药组合物的浓缩物，经培养3天后，加入1N的氢氧化钠(NaOH)将细胞溶解后清洗3次，利用数字相机在显微镜下取得影像，使用影像分析软件(Image-Pro Plus 3.0)计算破骨细胞吸收的区域面积。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的破骨细胞再吸收率定为100％。参照第6B图，上述5种分份均不会影响破骨细胞再吸收的作用。 

11.分析欧前胡素(imperatorin)及香柠檬烯(bergapten)对骨细胞存活的影响

将骨细胞铺在96孔培养皿中，分别以0.3、1、3、10μM的欧前胡素及香柠檬烯作用48小时后，小心吸除细胞上培养液，加入MTT(0.5mg/ml) 溶液于37℃下作用30分钟，接着吸掉溶液，以100μl的二甲基亚枫(DMSO)来溶解细胞，最后用Bio-Kinetic Elisa Reader(BIO-TEK)于波长550nm下测定其吸光值。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的细胞数定为100％。参照第7A图，欧前胡素及香柠檬烯均不会影响骨细胞的存活。 

12.分析欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞增殖的影响

将上述成骨细胞种在96孔培养皿中，分别以0.3、1、3、10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理48小时后，小心吸除细胞上培养液，依照CellProliferation ELISA，BrdU kit(Roche Applied Science)的过程来测定细胞增殖作用。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的细胞增殖定为100％。参照第7B图，欧前胡素及香柠檬烯均不会影响骨细胞的增殖。 

13.分析欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞ALP活性的影响

将上述成骨细胞分别以0.3、1、3、10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理后，加入0.2％ NP-40将细胞溶解，溶解液经过振荡再离心1500×g五分钟，利用ALP kit测量上清液中ALP的活性。加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的ALP的活性定为100％。结果如第8A图所示，欧前胡素及香柠檬烯均可增加ALP的活性。 

14.分析欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞分泌胶原蛋白(collagen)的影响

利用测量4-羟基脯胺酸(4-hydroxyproline)含量代表成骨细胞胶原蛋白合成的量。将上述成骨细胞分别以0.3、1、3、10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理后，在细胞分化后给予6N HCl溶解细胞，将溶解液置于玻璃管中在116℃下水解16小时。将水解液真空抽干，加入等量的水溶解，在550nm波长下测量4-羟基脯胺酸(4-hydroxyproline)的含量。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的胶原蛋白的量定为100％。结果如第8B图所示，欧前胡素及香柠檬烯均不会影响骨细胞分泌胶原蛋白的能力。 

15.分析欧前胡素及香柠檬烯对骨细胞矿化的影响

成骨细胞给予分化培养液(含50μg/ml的维生素C及10mM的β甘油磷酸酯( 

-glycerophosphate))，培养液每三天更换一次，且同时以0.3、1、3、 10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理，14天后加入75％乙醇固定三十分钟，再加入40mM的茜素红(Alizarin red-S)在室温下作用一个小时，去除未与钙键结的染剂，最后加入10％的氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)溶解，利用550nm吸光值测量骨小结含量。以加入0.1％的DMSO做为对照组，并以对照组的骨小结的矿化定为100％。结果如第8C-8D图所示，欧前胡素及香柠檬烯均可增加矿化作用。 

16.分析欧前胡素及香柠檬烯对骨形态发生蛋白(bone morphogeneticprotein，BMP-2)基因的表达

将骨细胞培养在6孔的培养皿之中，分别加入0.3、1、3、10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理1、3、6、12小时后，加入TRIzol reagent于室温静置5分钟使细胞溶解，将细胞溶解液体收集于离心管，加入0.5ml的氯仿(chloroform)振摇成均匀的乳白色液，于室温静置5分钟使溶液分层后，在4℃下以14000×g离心15分钟，之后小心抽取上清液，加入0.25ml的异丙醇(isopropanol)并翻转离心管使其混合，接着在4℃下以14000×g离心15分钟后可得到沉淀析出的RNA，倒掉上清液后再以75％酒精清洗沉淀物，再于4℃下14000×g离心10分钟，最后将RNA风干并加入适量的DEPC(diethylpyrocarbonate)水溶解，以OD_260/280定量。RNA转变为cDNA的过程是利用Supperscript^TM III反转录酶，而定量PCR则是使用ABI Prism 7900，而反应的试剂都来自Applied Biosystems公司。以甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehydephosphate dehydrogenase，GAPDH)为对照组，并以对照组的BMP-2mRNA的表达量定为100％。参照第9A图，BMP-2mRNA的表达量会随着欧前胡素及香柠檬烯的增加而增加，参照第9B图，在固定欧前胡素及香柠檬烯的浓度下，BMP-2mRNA的表达量也会随着时间的增加而增加。 

17.分析欧前胡素、香柠檬烯及BMP拮抗剂(noggin)对骨细胞ALP活性的影响

将上述成骨细胞分别以(1)10μM的欧前胡素、(2)10μM的香柠檬烯、(3)10μM的欧前胡素+noggin、(4)10μM的香柠檬烯+noggin及(5)1μg/ml的noggin处理48小时后，加入0.2％NP-40将细胞溶解，溶解液经过振荡再离心1500×g五分钟，利用ALP kit测量上清液中ALP的活性。以加入0.1％ 的DMSO做为对照组，并以对照组的ALP活性定为100％。结果如第9C图所示，noggin可抑制由欧前胡素及香柠檬烯所促进的ALP活性，并由实施例17-18的结果可知，欧前胡素及香柠檬烯可能是经由增加BMP-2的量而促进骨细胞的分化。 

18.分析欧前胡素及香柠檬烯对SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影响

将细胞培养在6井的培养皿之中分别以10μM的欧前胡素及香柠檬烯处理1、3、6、12、24小时后，将培养基吸走，加入适当的溶解缓冲液(lysisbuffer)(含50mM HEPES(PH 7.4)，150mM NaCl，4mM EDTA，10mM Na₄P₂O₇，100mM NaF，2mM Na₃VO₄，1％(v/v)Triton X-100，0.25％(w/v)氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，50mM的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(4-(2-aminoethyl)benzene sulfonylfluoride)，50μg/ml leupeptin，和20μg/ml抑肽酶(aprotinin))，将细胞用刮杓刮下，当完全萃取后吸至离心管，以13,000rpm离心15分钟。将30μg的等量蛋白质加入5倍Laemmli buffer，在95℃煮5分钟，以8％SDS-PAGE分离蛋白质后，转印至PVDF membrane，然后加入含有4％ BSA于室温下1小时后，用含有0.1％ Tween-20的PBS(PBST)清洗三次，加入一次抗体(分别为p-SMAD、p-ERK、P-38)在室温反应1小时，经PBST清洗三次后，加入标记山葵过氧化酶的山羊抗老鼠或山羊抗兔子的二次抗体，于室温反应1小时，最后以PBST清洗3次后，即用ECL试剂侦测进行酵联结素冷光分析。以加入α-tubuline做为对照组。参照第10图，欧前胡素及香柠檬烯均可促进SMADs、p38及EPK蛋白的磷酸化。 

19.分析p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)对p38及EPK蛋白磷酸化的影响

所有步骤与实施例17相同，仅在以欧前胡素及香柠檬烯处理前，先以10μM的p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)处理30分钟。以加入未磷酸化p38或ERK做为对照组。结果如第11A-11B图所示，p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)均可抑制由欧前胡素及香柠檬烯所促进的磷酸化。 

20.分析p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)对骨细胞ALP活性的影响

将上述成骨细胞分别以(1)10μM的SB203580、(2)10μM的PD98059、(3)10μM的欧前胡素及(4)10μM的香柠檬烯、(5)10μM的欧前胡素+SB203580、(6)10μM的香柠檬烯+SB203580、(7)10μM的香柠檬烯+PD98059及(8)10μM PD98059处理48小时后，加入0.2％ NP-40将细胞溶解，溶解液经过振荡再离心1500×g五分钟，利用ALP kit测量上清液中ALP的活性。以加入0.1％DMSO做为对照组，并以对照组的ALP活性定为100％。结果如第11D图所示，p38抑制剂(SB203580)及ERK抑制剂(PD98059)均可抑制由欧前胡素及香柠檬烯所促进的骨细胞ALP活性。 

21.分析p38突变株(DN-p38)及ERK突变株(DN-ERK)对骨细胞ALP活性的影响

所有步骤与实施例19相同，仅将部份实验组的细胞材料改为p38突变株(DN-p38，由Dr.J.Han(Scripps Research Institute，San Diego，CA)提供)及ERK突变株(DN-ERK，由Dr.M.Cobb(South-Western Medical Center，Dallas，TX)提供)，如下所示：(1)DN-p38细胞株、(2)DN-ERK细胞株、(3)DN-p38细胞株+10μM的欧前胡素、(4)DN-p38细胞株+10μM的香柠檬烯、(5)DN-ERK细胞株+10μM的欧前胡素(6)DN-ERK细胞株+10μM的香柠檬烯(7)正常骨细胞+10μM的欧前胡素(8)正常骨细胞+10μM的香柠檬烯。以0.1％DMSO做为对照组，并以对照组的ALP活性定为100％。结果如第11D图所示，p38突变株(DN-p38)及ERK突变株(DN-ERK)可抑制由欧前胡素及香柠檬烯所促进的骨细胞ALP活性，并可由实施例18-20的结果发现，欧前胡素及香柠檬烯是经由SMADs、p38及EPK蛋白来增加骨细胞的作用。 

22.以欧前胡素及香柠檬烯进行动物实验

取三周大雄性幼鼠(Sprague-Dawley)，体重范围78至90克，以400mg/ml的单水三氯乙醛(trichloroacetaldehyde monohydrate)麻醉，将22G针头尖端取下，针头消毒后将其埋入胫骨接近膝盖处，隔日，针头外端便会被外皮覆盖过去，利用30G针头所做成的软管进行注射，每次注射量为10μl，分别给予生理食盐水、30μM的欧前胡素或香柠檬烯，连续施打一周后，休息一周，将小鼠处死取出胫骨，去除肌肉及结缔组织，使用DEXA测量BMD及BMC，完成上述过程后将胫骨利用石蜡包埋切片染色。由表三可知，欧前胡素及香柠檬烯均可增加胫骨的BMD及BMC，且第12图切片染色结果可知，欧前胡素及香柠檬烯均可促进骨质的合成。

表三、欧前胡素及香柠檬烯对BMD及BMC的影响 

本发明的医药组合物可增加股骨及胫骨的重量、骨密度，并在其它的生化测试中证实，其可增加ALP的活性及胶原蛋白的含量，进而达到预防及/或治疗骨质流失。 

虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟知此的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视附上的权利要求所界定的范围为准。 

Claims (8)

1.一种预防及/或治疗骨质流失的医药组合物， 其中有效成分由有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角组成，且其中各成份的重量比为甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角＝1-10∶2-10∶1-10∶1-10。

2.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该各成份的重量比为甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角＝2-4∶4-6∶1-3∶1-3。

3.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该蛇床子包含蛇床子素。

4.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该蛇床子包含欧前胡素。

5.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该蛇床子包含香柠檬烯。

6.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该骨质流失包括骨质疏松症或骨质疏松性骨折。

7.根据权利要求1所述的预防及/或治疗骨质流失的医药组合物，其中该医药组合物的型态选自：锭剂、胶囊、颗粒、粉末、液体制剂或丸剂。

8.一种预防及或治疗骨质流失的医药组合物，其由下述重量配比的原料制成，所述原料为甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，其中各成份的重量比为甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角为1-10∶2-10∶1-10∶1-10。

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