CN101163969B - 用于对肾癌中mtor抑制剂疗法的敏感性的生物标记物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供检验和/或量化在例如癌症的病状中失调的生物化学途径的方法及适于执行所述方法的试剂和试剂盒。例如，揭示在人类肾癌细胞中VHL丢失与对mTOR抑制剂的敏感性之间的相关性，指出VHL丢失给予所述细胞自主性和血管生成竞争优势。
Description
政府支持的声明
本发明是在由军队授予的专用拨款第DAMD17-02-1-0027号的政府支持下进行。政府对本发明具有某些权利。
相关申请案
本申请案要求2005年3月17日申请的美国临时申请案第60/662,649号的部分119(e)的优先权。本申请案与为2003年11月5日申请的美国专利申请案第10/701,490的部分接续申请案的国际申请案第PCT/US2004/037288号相关，国际申请案第PCT/US2004/037288号要求2002年11月5日申请的美国临时申请案第60/423,777号的权益，各案均以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明提供检验被证明是例如癌症的病理学失调的生物化学途径的方法及适于执行这些方法的试剂。
背景技术
癌症在美国是第二大普遍死亡原因，每年导致450,000人死亡。三分之一美国人将发展为癌症，且五分之一死于癌症。虽然在鉴别癌症的可能环境和遗传原因方面已取得了长足进展，但仍需要以癌症及相关疾病和病症为目标的额外诊断和治疗方式。详细来说，需要更大程度地了解涉及例如癌症的失调细胞生长的多种生物化学途径，因为这将允许发展用于鉴别和治疗与所述生长失调相联的病理学综合征的改善的诊断和治疗方法。
在每年32,000新病例(代表年增长率为2％)和12,000例与癌症相关的死亡(参见，例如Jemal，A.等人，Cancer statistics，2004.CA Cancer J Clin 54，8-29(2004))的情况下，肾癌代表主要的肿瘤治疗挑战。标准化疗剂已没用，且例如白介素-2和干扰素的生物剂由于其毒性概况和低有意义的响应率而具有缺点。全身性化疗在患有转移性(即晚期)肾癌的患者中产生少数且仅仅暂时的响应。考虑到这些有限的治疗选择，使用CCI-779对患有晚期肾癌的患者进行临床II期试验的发现取得7％的客观响应率和约50％的疾病稳定率的结果是令人迷惑的，特别因为当前对这些具有mTOR依赖性肿瘤的患者组没有分子级的洞识(参见，例如Atkins等人，J Clin Oncol 22，909-18(2004))。在未经选择的肺癌患者中平行进行最新EGFR抑制剂试验的结果是惊人的。EGFR抑制剂(易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva))在难治性肺癌中具有低但一致的单药剂客观响应率。
激酶抑制剂化合物从实验室到临床的成功转化取决于鉴别最可能受益于这些化合物的患者子集。对于此的关键因素是鉴别激酶依赖性肿瘤(参见，例如Sawyers等人，GenesDev 17，2998-3010(2003))。目前临床实践中大多数激酶抑制剂以直接靶向导致下游信号传输分子构成性活化的激酶突变(例如BCR-ABL和受体酪氨酸激酶(RTK)突变/配体过度表达)的模式工作。这些途径也可通过导致激酶活化的负调节剂丢失(即PTEN丢失)和随后的PI3K/AKT/mTOR级联活化而间接活化(参见，例如Neshat等人，Proc NatlAcad Sci USA 98，10314-9(2001))。具有最高PTEN突变率的前列腺和脑肿瘤表现对mTOR抑制剂增加的敏感性，巩固了观念的证据。对这种信号转导途径的致癌依赖性以及随后的mTOR抑制并列“综合致命性”作用方式。受人关注地，CCI-779、mTOR抑制剂在晚期肾癌中展示有前途的抗癌活性，其中约7％的患者展示客观响应率且约50％的患者展示疾病稳定性。(参见，例如Atkins等人，J Clin Oncol 22，909-18(2004))。根据在前列腺且脑肿瘤中产生的临床前数据，这种增加的敏感性可能应解释为PTEN肿瘤抑制基因丢失。然而，这种假设的潜在缺点是肾癌中体细胞PTEN突变的低发生率。另外，在肾癌中没有已知的mTOR突变。
如上文所指出，虽然研究者已鉴别出涉及例如癌症的病理学的多种基因和途径，但是此项技术中需要额外工具来促进涉及失调细胞生长的调节过程的分析。此外，需要对于涉及失调细胞生长的基因产品如何在较大范围内相互作用的了解以便于发展用于鉴别和治疗与生长失调相联的病理学综合征的改善的诊断和治疗方法。详细来说，仍然需要鉴别推动肿瘤形成的信号转导事件和鉴别可用于评定致癌表型的进展或抑制的标记物。
发明内容
分子靶向疗法的临床成果迄今已在癌症中用活化激酶突变或相反在这些激酶的负调节剂丢失时取得。受人关注地，具有mTOR抑制剂的实体肿瘤中可见的临床响应率暗示存在其他可确定对这类分子靶向药物的敏感性的因素。例如，mTOR抑制剂CCT-779已展示出对肾癌的选择性抗癌性质，尽管并不知道对于此的机制。本揭示内容展示VonHippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因的丢失在确定这些临床响应中如何起作用。肾癌中最常见的突变是VHL肿瘤抑制基因丢失，占病例的约55-70％。VHL丢失导致转录调节剂缺氧诱导因子复合体(HIF)稳定化。使用稳定的shRNAi靶向构筑体，我们鉴定了VHL的原型功能敲除。VHL的敲除导致HIF上调并且我们展示了用CCI-779进行的处理降低这些细胞中的HIF蛋白含量。我们展示在活体外与活体内人类肾癌细胞中VHL丢失与CCI-779敏感性之间的相关性，指出VHL丢失给予细胞自主性和血管生成竞争优势。我们利用糖酵解途径的HIF依赖性调控执行F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描(positron emission tomography)(FDG-PET)并且展示这在临床上可用以选择患者和监控治疗功效。我们通过过度表现HIF1α和HIF2α的突变体形式(其不再由VHL调节)进行拯救实验，这导致对CCI-779的敏感性逆转。这个发现暗示一种激酶依赖性的新颖机制，其视负责推动肿瘤转录组程序的分子的转化而定。在这种情况下的转译变阻器是mTOR和致癌分子HIF并且预示着高治疗指数。这些数据说明效应分子的转化如何促进对导致激酶依赖性的特殊致癌途径的依赖，并且提供加宽激酶抑制剂治疗范围的新机会。例如，对这种相互关系的了解临床上可用以选择患者和监控治疗功效。本发明的某些方面揭示在Sawyers等人，Nat Med.2006，Jan；12(1)：122-7.，Epub 2005 Dec 11中，其内容以引用的方式并入。
VHL/HIF途径的所有先前知识都是以目前不可用作临床筛选工具的生物化学资料和基因组分析为基础。本文揭示的本发明提供一种新颖的免疫组织化学、免疫印迹和正电子发射断层扫描(PET)试剂组，其可充当用以鉴别VHL丢失和HIF途径的随后活化的生物标记物。目前，在此项技术中没有描述允许技术人员鉴别来自患有肾癌的患者的常规加工样品(包括血液、血清、组织)中这种途径的活化的分析。这些试剂鉴别响应VHL肿瘤抑制基因丢失的VHL/HIF-1α/HIF-2α/GLUT-1/CA-IX(CA9)和VEGF活化的协同调节作用。因为靶向这种途径的特异性激酶抑制剂当前处于发展中且因为这种突变在肾癌中常见，所以其为选择患者进行适当疗法的极其重要的临床工具。
当前，在此项技术中没有允许人评定常规加工(福尔马林固定、石蜡包埋)患者活组织检查和切除样品以及PBMC和血清中这种途径的活化状态的可用分析。因此，所揭示的检测系统的实用性是：(i)其可用以测定包括血清、周围血液单核白细胞(pbmc)和组织样品的VHL的丢失和HIF-1α和HIF-2α及其下游目标、GLUT-1、CA-IX(CA9)和VEGF的随后活化；(ii)这种途径的活化可使用F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描(FDG-PET)检测；和(iii)这种信息可用以选择适于用靶向途径抑制剂的疗法的患者。
本发明可例如通过以下方式实施：i)对常规加工的患者活组织检查样品执行免疫组织化学分析；ii)对PBMC执行免疫印迹分析和对血清样品执行ELISA；和iii)对患者执行FDG-PET扫描。这些分析的结果可用作包括在临床试验中的标准且用以评定这种途径失调的患者的后果差异。本发明的机制已在人类癌细胞系、人类癌细胞小球和小鼠异种移植(带有人类癌细胞系)肿瘤中得到检验。这些结果表明HIF-1α和HIF-2α p以及GLUT-1、CA-IX(CA9)和VEGF的明确协同调节作用及其与VHL丢失的关联。
VHL在大部分肾癌以及某些肾上腺、脑及眼科癌症中丢失。另外，HIF-1α及HIF-2α途径在许多其他癌症中失调。因此，鉴别这种途径的活化状态、选择将最受益于靶向这种途径的抑制剂的患者及监控治疗功效的能力是对于肾癌以及其他以VHL丢失相联失调细胞生长为特征的癌症的重要诊断测试。这对于将来分析靶向这种途径的新抑制剂也极其重要。
本文揭示的本发明具有许多实施例。本发明的一个实施例为一种鉴别有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤细胞(例如肾癌细胞)的方法，所述方法包含检验与所述哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比，所述哺乳动物肿瘤细胞中VonHippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白表达减少至少50％的哺乳动物肿瘤细胞；其中VonHippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白表达减少至少50％鉴别哺乳动物肿瘤细胞有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂。
本发明的另一实施例为一种鉴别有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤细胞的方法，所述方法包含检验表达具有缺失、替代或插入突变的Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白的哺乳动物肿瘤细胞；其中Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白中的这些突变类型鉴别哺乳动物肿瘤细胞有可能响应或响应mTOR抑制剂。
本发明的又一实施例为一种监控mTOR多肽抑制剂在治疗具有Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)表达减少的哺乳动物肿瘤中的功效的方法，所述方法包含检验与来自未暴露于mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤的细胞相比，来自已暴露于mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤的测试细胞中HIF-1α和/或HIF-2α多肽含量减少至少10％量的生物样品中的细胞；其中测试细胞中HIF-1α和/或HIF-2α多肽含量减少至少10％量提供所述mTOR多肽抑制剂在治疗所述哺乳动物肿瘤中有效的证据。
本发明的实施例也提供了制造包括探针、装置和试剂盒的制品的方法。在本发明的一个这样的实施例中，提供了一种含有可用于感测HIF-1和/或Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因多核苷酸或多肽的探针的试剂盒。所述试剂盒通常包括容器、标签和如上所述的探针。典型实施例为一种包括容器和在所述容器内的至少一个探针和使用这类分析物感测物质的使用说明书的试剂盒。
所属领域的技术人员自以下具体实施方式将显而易见本发明的实施例的其他目标、细节和优势。然而，应了解虽然指出本发明的实施例，但所述具体实施方式和特殊实例是通过说明而非限制的方式给出。在不背离本发明的精神的情况下，可在本发明的范畴内进行许多变化和修改，且本发明包括所有这些修改。
附图说明
图1A-1E.VHL敲除对于对CCI-779的敏感性的影响。(a)使用对于VHL(检测两种异构体)、HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1、CA-IX和β-肌动蛋白(作为负载对照物)的抗体免疫印迹源自SN12C中的shRNA和对照物(空载体，V)的溶胞物。(b)将SN12C-CSCG和SN12C-VHLshRNA细胞(1×105)在存在媒剂1或10nM CCI-779的10％富血清培养基中培养5天。细胞生长通过细胞计数测量(n＝3)。用ACHN-CSCG和ACHN-VHLshRNA细胞可见了类似结果，(c)将SN12C CSCG(C1)和SN12C-CSCG shVHL RNA(C2)细胞以每小鼠1×106个细胞的剂量注入SCID小鼠中(n＝30)。当肿瘤体积达到150mm3时，随机选择小鼠每日用媒剂或0.1mg/kg CCI-779处理。将肿瘤体积的变化绘图。在用媒剂或0.1mg/kg CCI-779处理的SN12C-CSCG和SN12C-VHL shRNA异种移植肿瘤中的磷酸化-S6蛋白通过免疫印迹C3和C4测量。相等负载量通过肌动蛋白免疫印迹验证。(d)ACHN细胞中稳定VHL敲除导致类似的HIF-1α上调和对CCI-779增加的敏感性。(e)shRNA-表达慢病毒的简图针对pCSCG载体中的VHL。
图2A-2C.VHL敲除对于血管生成的影响。(a)微血管密度通过在异种移植肿瘤中的CD-31免疫标记(箭头)和量化CCI-779处理小鼠(+)与媒剂处理小鼠(-)(各组中n＝6)之间的差异来量化。与仅载体(参见蓝条)相比，计算VHL shRNA中微血管密度的P＜0.0033，(b)将类似数目的细胞涂板且将其保持在存在(+)或不存在(-)10nMCCI-779的10％富血清培养基中。36小时后，通过抗-VEGF ELISA和准备用于蛋白量化的细胞提取物分析条件培养基。将VEGF值标准化为总细胞蛋白。误差条等于一个标准偏差(n＝3)。(c)对来自媒剂和CCI-779处理的小鼠的石蜡包埋肿瘤异种移植物进行VEGF蛋白的免疫组织化学。
图3A-3B.HIF转译由CCI-779经5′TOP序列的抑制。
(a)将SN12C-CSCG和SN12C-VHLshRNA细胞用媒剂1nM或10nM CCI-779处理且随后溶解24小时。使溶胞物经受HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1、CA-IX、p-eIF4G、p-S6核糖体蛋白的免疫印迹。相等蛋白负载量使用抗-β-肌动蛋白抗体验证，(b)用媒剂1nM或10nM CCI-77924小时后，HIF-1α表达通过在SN12C-MSCV-5′TOP-HIF-1αcDNA(左屏)和SN12C-MSCV-HIF-1αcDNA(右屏)的免疫印迹探测。
图4A-4C.CCI-779生长抑制通过HIF-1α和HIF-2α脯氨酰基羟化酶突变体拯救。将用脯氨酰基羟化缺损cDNA突变体p-Babe-puro-HA-HIF-1α(P564A)、HIF-2α(P405A；P531A)或骨架载体固定感染的SN12C-CSCG-VHLshRNA细胞用CCI-779或媒剂处理且24小时后收获，(a)使溶胞物经受HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1、CA-IX、p-eIF4G、p-S6和β-肌动蛋白作为负载对照物的免疫印迹。(b)将SN12C-VHLshRNA、SN12C-VHLshRNA-HIF-1α突变体、SN12C-VHLshRNA-HIF-2α突变体细胞(1×105)在存在媒剂1或10nM CCI-779的10％富血清培养基中培养5天。细胞生长通过细胞计数测量(n＝3)。(c)将SN12C-VHLshRNA-HIF-2α突变体细胞以每小鼠1×106个细胞的剂量注入SCID小鼠中(n＝16)。当肿瘤体积达到150mm3时，随机选择小鼠每日用媒剂或0.1mg/kg CCI-779治疗。将肿瘤体积的倍数变化绘图。
图5A-5B.MicroPET影像展示VHL和mTOR依赖性葡萄糖吸收量，(a)右侧在用两剂量CCI-799(0.1mg/kg)前后两只带有等基因ACHN-异种移植肿瘤的SCID-小鼠的代表性影像。箭头指出皮下异种移植肿瘤的部位(在所述小鼠的胸部和颅骨中观察到由于腹部褐色脂肪和神经胶质组织，信号强度先天增加)，(b)量化在带有ACHN-载体或ACHN-CSCG VHL shRNA皮下异种移植物的SCID-小鼠中FDG吸收量(+/-SEM)。使FDG-肿瘤吸收量标准化为对每只小鼠(每组n＝3)的肝FDG-吸收量且用相同结果重复两次实验。在SN12C-CSCG和SN12C-CSCG VHL shRNA异种移植物中可见类似结果。
图6.在调整VHL丢失中mTOR调节HIF-1α和HIF-2α的转译。
图7.血管生成对肿瘤生长的影响(使用微血管密度来记分血管生成)。当与亲代肿瘤相比时，VHL敲除肿瘤有更加多的血管，暗示血管生成依赖因素在这些肿瘤进展中起作用。用CCI-779处理引起血管生成客观减少(如由微血管密度所测量)，(右屏和右条形图)。对这些肿瘤执行VEGF免疫组织化学展示在VHL敲除异种移植物中蛋白表达增加，其通过用CCI-779处理而降低。
具体实施方式
本文所述或提及的技术和步骤通常由所属领域的技术人员使用传统方法(例如描述于Ausubel等人，Current Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Publishers，(1995)中的广泛使用的分子克隆方法)来更透彻地了解且一般使用。视情况而定，除非另外指出，否则涉及使用市售试剂盒和试剂的步骤通常根据制造商规定的协议和/或参数进行。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、注释及其他科学术语意欲具有本发明所属领域的技术人员通常了解的含义。有时，为了清楚和/或以供参考，本文定义具有通常了解意义的术语，且本文中所述定义的内涵不应一定解释为表示与此项技术中通常所了解的意义的实质差异。
出于治疗或疗法的目的，“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、驯养及农场动物及动物园、运动或玩赏动物，例如犬、马、猫、奶牛等。所述哺乳动物优选为人类。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述通常以无限制细胞生长为特征的哺乳动物生理情况。癌症的实例包括(但不限于)星形细胞瘤、胚细胞瘤、癌瘤、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤及肉瘤。所述癌症的更特定实例包括肾上腺及眼科癌症、脑癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、扁平细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、何杰金氏及非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、睾丸癌、食道癌、肠胃癌、肾脏癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、肝癌、膀胱癌、肝瘤、子宫内膜癌、唾腺癌瘤、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝瘤及各种类型的头颈部癌。
在本文中使用时，“生长抑制”是指细胞的活体外和/或活体内生长抑制。细胞生长的抑制作用可通过此项技术中的多种方法测量。在本文中使用时，“生长抑制剂”是指抑制细胞活体外和/或活体内生长的化合物或组合物。因此，所述生长抑制剂可为显著降低S期细胞百分数的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在除S期外的地方)的试剂，例如诱导G1停滞及M期停滞的试剂。传统的M期阻断剂包括长春花属(长春新碱和长春花碱)、TAXOL
和topo II抑制剂，例如羟道诺红霉素(doxorubicin)、表阿比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)及博莱霉素(bleomycin)。那些停滞G1的试剂也溢出到S期停滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲胺喋呤(methotrexate)、5-氟脲嘧啶和阿糖胞苷(ara-C)。所述试剂进一步包括例如PI3K/Akt途径的与失调细胞生长相联的细胞途径的抑制剂。其他信息可见于The Molecular Basis of Cancer.Mendelsohn和Israel编，第1章，Murakami等人的题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”(WB Saunders：Philadelphia，1995)中。
“治疗”或“疗法”是指治疗与预防或预防措施。术语“治疗有效剂量”是指药物有效治疗哺乳动物的疾病或病症的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效剂量可减少癌细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即在某种程度上减缓且优选终止)癌细胞至周边器官的渗透；抑制(即在某种程度上减缓且优选终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻一或多种与所述病症相联的症状。在一定程度上，所述药物可防止现存癌细胞的生长和/或杀死存在癌细胞，其可具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症疗法来说，活体内功效可(例如)通过评定肿瘤负荷或体积、疾病进展(TTP)时间和/或确定响应率(RR)来测量。
术语“抗体”在广义上使用且具体来说涵盖单一单克隆抗体和具有多表位特异性的抗体组合物(例如多克隆抗体)以及只要保留其免疫特异性识别目标多肽抗原决定基的能力的抗体片段。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指自实质均匀的抗体群体获得的抗体，即构成群体的个别抗体除了可能可以微小量存在的天然存在的突变外为相同的。单克隆抗体具有针对单一抗原位点的高度特异性。此外，与通常包括针对不同定子(抗原决定基)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂形成对比，各单克隆抗体是针对抗原上的单一定子。除单克隆抗体的特异性之外，单克隆抗体的优势在于其由未经其他免疫球蛋白污染的杂交瘤培养物合成。修饰成分“单克隆”指出自抗体的实质均匀群体获得的抗体的特性，并且并不将其解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制造或可由重组DNA方法(参见，例如美国专利第4,816,567号)制造。“单克隆抗体”也可使用例如在Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597 (1991)中描述的技术自噬菌体抗体库分离。
如本文所用，术语“多核苷酸”意谓长度为至少10个碱基和碱基对的核苷酸的多聚形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，且意欲包括DNA和/或RNA的单股和双股形式。在此项技术中，这个术语经常可与“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可包含本文揭示的核苷酸序列，其中胸苷(T)也可为尿嘧啶(U)；这个定义关于DNA与RNA的化学结构的差异，详细来说观察到RNA中的4个主要碱基中的一个为尿嘧啶(U)而不是胸苷(T)。
如本文所用，术语“多肽”意谓至少约10个氨基酸的聚合物。贯穿本说明书，使用标准3个字母或单个字母指定氨基酸。在此项技术中，这个术语经常可与“蛋白”互换使用。
关于本发明的生理学过程
肾癌中最常见的突变是Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因丢失，占病例的约55-70％(参见，例如Gnarra等人，Urol Clin North Am 20，207-16(1993)，Gnarra等人，Nat Genet 7，85-90(1994)，Herman等人，Proc Natl Acad Sci USA 91，9700-4(1994))。VHL充当E3连接酶，其泛素化且随后靶向目标缺氧诱导因子-α次单位(HIF-1α、-2α和-3α)至26S蛋白体以便降解。HIF复合体(由HIFα次单位和HIF-1β的杂二聚体组成)为负责对于血管生成、葡萄糖代谢、pH调控、细胞增殖、侵袭和转移编码的基因活化的主管转录因子(参见，例如Seagroves等人，Cancer Cell 1，211-3(2002))。尚不明确如何抑制mTOR可得出癌症中的这些临床响应，其中显著转化事件既不是激酶突变又不是磷酸酯酶缺乏。
我们假设VHL肿瘤抑制基因的丢失在限定这些临床响应中起作用。虽然VHL丢失的发生频率与对mTOR抑制剂的已知客观响应率不对应，但50％的疾病稳定率更紧密地接近VHL失活和mTOR抑制剂的已知细胞抑制效应。mTOR的主要目标是转译机制的组份(参见，例如Hay等人，Genes Dev 18，1926-45(2004))。生长因子RTK经由帽依赖性转译(即经由4E-BP1的失活和eIF-4e的随后活化)或核糖体生命起源(其增加在5′端(5′TOP)含有末端寡嘧啶区的mRNA转录产物的转译效率)募集PI3K/AKT途径，引发导致mTOR构成性活化的信号转导级联，最终推动蛋白合成。显著地，HIF-αmRNA含有对S6K敏感的5′TOP序列。
VHL综合征患者在VHL基因的一种样板中具有胚系突变，且这些患者发展的肿瘤具有剩余等位基因的突变或缺失。体细胞、双等位基因VHL失活也极其经常地发生在RCC的非遗传性病例中，占病例的高达55-70％(参见，例如Gnarra等人，Urol Clin NorthAm 20，207-16(1993)，Gnarra等人，Nat Genet 7，85-90(1994)，Herman等人，Proc Nad AcadSci USA 91，9700-4(1994))。这种突变率更接近于我们在CCI-779治疗的患者中可见的50％疾病稳定率。VHL充当HIF家族转录因子(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)的E3连接酶(参见，例如Ivan，等人，Curr Opin Genet Dev 11，27-34(2001)，Kondo等人，Exp Cell Res264，117-25(2001))。至少HIF-1α和HIF-2α充当负责对于血管生成、新陈代谢、细胞增殖和侵袭/转移编码的基因的活化的主管转录因子。若干实验系列针对mTOR在调控HIF-1α蛋白表达中的作用，其多半通过增加含有对mTOR效应因子S6K敏感的5′TOP序列的HIF-1αmRNA的转译起作用(参见，例如Laughner等人，Mol Cell Biol 21，3995-4004(2001))。HIF-1α与HIF-2α的5′UTR的检验显示存在TOP序列(HIF-1α来说，分数为8、9和17且对HIF-2α来说，分数为8、10、11、15)。这与VHL形成对比，其转译后调节HIF-1α和HIF-2α(图6)。使用通过VHL的稳定敲除产生的等基因系，我们看到HIF-1α和HIF-2α蛋白表达增加。用CCI-779处理这类细胞导致HIF-1α和HIF-2α蛋白含量减少，而不对转录发挥任何作用。
我们假设这些肿瘤细胞现在已变得依赖于过量HIF且上调转录机制(可能经由涉及例如TGF-α、PDGF-B、IGF-2和VEGF的HIF调节生长因子基因的自分泌反馈回路(参见，例如Harris，A.L.Nat Rev Cancer 2，38-47(2002))，随后经由PI3K路径传输信号。我们进一步假定这种对所述途径的依赖性使得这些细胞对mTOR抑制剂更敏感/易受影响。由于其在含氧量正常的条件下具有极其短的半衰期，所以HIF蛋白合成可能对合成速率的变化尤其敏感。有利于蛋白质生产和缺少降解的正平衡将确保在含氧量正常的情况下HIF恒定过量。其机制取决于HIF转译，因为其通过添加无5′TOP序列的脯氨酰基羟化缺损突变体HIF cDNA而完全逆转。我们还注意到这些细胞展示对CCI-779的活体内与活体外敏感性。活体内组份可通过允许肿瘤起始和生长的显著血管生成更加容易地说明。活体外组份向我们提出这些肿瘤细胞能够引发推动增殖程序的独特生长因子。两种组份的动力学通过抑制mTOR而废止。我们的模型系统使我们能够梳理这些组份中的每一种的相对贡献且探究靶向这些特别在转移性肾癌中有效的组份的组合方案。
这种研究还第一次利用FDG PET以供肾癌使用。FDG信号预示着患者VHL丢失程度较高且因此支持这些生物影像方式用以选择最受益于分子靶向疗法的适当患者的实用性。另外，可使用连续FDG PET扫描来监控治疗功效。
我们的结果提供对mTOR抑制和随后激酶依赖性的新了解。在此，活化突变为E3连接酶，VHL。在HIF推动基因表达通过VHL(例如透明细胞RCC、血管母细胞瘤和嗜铬细胞瘤子集)调节的肿瘤中，HIF复合体的这种负调节剂的丢失导致其稳定化和累积。近来资料显示经由PI3K/AKT/mTOR途径的信号传输有利于经由调变转译而致癌转化(参见，例如Rajasekhar等人，Mol Cell 12，889-901(2003))。在调整VHL丢失中的净效应是HIF蛋白的连续转译，其随后经由其肿瘤转录组程序推动肿瘤。通过抑制转译效应因子mTOR，我们随后能够降低HIF的产生且具有不管延续稳定化的净蛋白丢失。
这种激酶依赖性的新颖机制(其中效应分子的转译决定对特殊致癌途径的依赖)说明治疗其他癌症引发类似程序的可能性。明显出发点将是考察致癌基因通过例如细胞周期素D1的mTOR转译调节(参见，例如Schmelzle等人，Cell 103，253-62(2000))。这种细胞周期调节剂的蛋白过度表达已在结皮细胞淋巴瘤以及乳癌和卵巢癌中见到。靶向过度表达细胞周期素D1的这些癌症的子集中的mTOR(即，现在为生物标记物)将促进使分子靶向疗法各不相同。
展示VHL丢失的揭示内容经由HIF复合体确定对MTOR抑制剂的敏感性
VHL的功能敲除导致HIF稳定化
为了确定肾癌中CCI-779作用的分子机制，我们利用NCI60数据库来鉴别合适的细胞系。我们鉴别出两种VHL野生型肾细胞癌瘤(RCC)细胞系：SN12C和ACHN(参见，例如Scherf等人，Nat Genet 24，236-44(2000))。已经报导了这些细胞系的VHL状况(参见，例如Maxwell等人，Nature 399，271-5(1999))。除了含有功能VHL基因以外，两种系均为PTEN野生型，因此移除任何混淆PTEN裸细胞对mTOR抑制剂的已知敏感性的变量。我们决定产生稳定RNA干扰的系以解决在限定的等基因系统内VHL状况对CCI-779的敏感性的问题。VHL敲除是使用相对于VHL表达短发夹RNA(shRNA)、与绿色荧光蛋白(GFP)表达盒顺式相关的慢病毒载体来实现(图1E)。VHL的稳定敲除用过西方印迹确认且随后见到HIF-1α和HIF-2α上调。随后，我们通过考察HIF转译目标的蛋白含量测试这种敲除的功能性。分析先前已证明涉及肿瘤糖分解、代谢和血管生成程序的具有典型缺氧响应要素的目标，即葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)、碳酸酐酶-9(CA-IX)和血管内皮生长因子(VEGF)。通过免疫印迹和ELISA证实这种蛋白的增加与HIF-1α和HIF-2α上调有关(图1A；图2B，白条)且谈到VHL的这种原型功能敲除的效率。
MTOR调节HIF的转译
用1和10nM CCI-779进行处理足以引起VHL敲除的RCC细胞系中HIF-1α和HIF-2α蛋白含量的减少。同时检验p-S6和p-EIF4g的溶胞物展示在亲代细胞与敲除细胞中用CCI-779处理的磷酸化减少。这意味着mTOR活性的抑制。HIF-1α和HIF-2α蛋白含量的降低紧密跟随GLUT-1、CA-IX和VEGF表达的降低(图3A、3B)。
为了确定这些效应是否受转译调节，我们平行执行实时PCR实验。由于CCI-779处理，我们没有见到HIF-1α转录产物含量的任何变化。为了检验5′TOP序列在限定HIF-1α转译中的重要性，我们过度表达有和没有5′TOP序列的HIF-1α cDNA。5′TOP序列的表达导致在暴露于CCI-779时HIF-1α蛋白含量降低。这种结果指出HIF-1α转译具mTOR依赖性。考虑到在HIF-2αmRNA的5′未转译区存在5′TOP序列，认为类似机制调节其转译。
VHL SHRNA RCC细胞对CCI-779处理的活体外和活体内敏感性增加
为了评定mTOR在由VHL敲除介导的增殖中的作用，我们使用先前实验所说明的剂量范围暴露人类肾肿瘤细胞系的等基因对于CCI-779中。与我们的假设一致，表达空载体的亲代细胞对这些剂量的CCI-779不敏感。值得注意的是，我们发现VHL shRNAi细胞活体外生长较快，其符合先前公开的报告：VHL零状况导致活体外生长增加(参见，例如Gunaratnam等人，J Biol Chem 278，44966-74(2003)，Datta等人，Cancer Res 61，1768-75(2001)，Chen等人，Cancer Res 55，4804-7(1995))。明显地，与亲代细胞形成对比，SN12C-VHL shRNAi细胞展示对CCI-779增加的敏感性(图1B)。这暗示着在调整VHL丢失的过程中，对mTOR抑制剂的敏感性的动力学至少部分地归因于细胞自主机制。
随后，我们在两种分离的等基因RCC异种移植物中测试CCI-779的活体内活性。用SN12C-CSCG(载体对照物)、SN12C-shVHL RNAi、ACHN-CSCG和ACHN-shVHL RNAi细胞皮下注射SCID小鼠。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，分配小鼠进行用0.1mg/kgCCI-779的治疗，与媒剂对照物比较。在此剂量下，CCI-779对亲代肿瘤生长没有影响。相反，这种剂量完全阻断了VHL shRNAi肿瘤的生长(图1)。类似数据对于两细胞系均见到。我们通过测量在用0.1mg/kg剂量治疗第5天收获的肿瘤中的S6含量和磷酸化检验CCI-779对S6激酶抑制的影响。在来自亲代细胞与敲除细胞的异种移植肿瘤中，存在S6磷酸化的降低，指出mTOR的有效抑制作用(图1)。
血管生成的目标抑制作用
随后我们检验血管生成对肿瘤生长的影响(使用微血管密度来记分血管生成)。当与亲代肿瘤相比时，VHL敲除肿瘤有更加多的血管，暗示血管生成依赖因素在这些肿瘤进展中起作用。用CCI-779的处理引起血管生成客观减少(如由微血管密度所测量，图7；右屏和右条形图)。对这些肿瘤执行VEGF免疫组织化学展示在VHL敲除异种移植物中蛋白表达增加，其通过用CCI-779处理而降低(图7)。
有氧糖酵解的目标抑制作用
FDG PET扫描展示FDG在VHL K/D细胞中的基准含量增加且响应CCI。参见图5。
HIF依赖性敏感性表型
为了确定VHL敲除细胞的敏感性增加能通过HIF-1α和HIF-2α转译来解释，我们过度表达脯氨酰基-羟化缺损HIF-1α(P564A)和HIF-2α(P531A)cDNA，即，没有5′TOP且其另外逃脱VHL对照物。这些构筑体的稳定表达将不管VHL含量而确保构成性HIF表达。这些突变体的过度表达导致HIF-1α和HIF-2α蛋白含量增加。如由GLUT-1和CA-IX产量增加看出，这些突变体保留转译功能性(图4)。与VHL敲除细胞形成直接对比，这些蛋白的含量不受用CCI-779的处理影响，因为5′TOP序列不存在(图4)。如由S6和e-IF4G的磷酸化减少指出，这不管是否有效抑制mTOR活性而发生。随后，我们询问HIF-1α和HIF-2α突变体的稳定过度表达是否给予对CCI-779的抗增殖效应的抵抗性。这些VHL不敏感突变体的表达导致对CCI-779活体外敏感性与活体内敏感性的逆转(图4)。
本发明的典型方法
如上文所指出，VHL丢失导致缺氧诱导因子复合体(例如HIF-1α和HIF-2α)(负责对于血管生成、葡萄糖代谢、pH调控、细胞增殖、侵袭和转移编码的基因的活化的主管转录因子)，即GLUT-1、CA-IX(CA9)和VEGF的稳定化。mTOR途径的活化导致S6K上调和4E-BP1失活，最终推动蛋白合成，包括HIF-1α和HIF-2α的蛋白合成。认为这些机制经由S6K发生，其增加在5′端(5′TOP)含有末端寡嘧啶区的mRNA转录产物的转译效率。HIF-1α和HIF-2α mRNA含有对S6K敏感的5′TOP序列。在我们的临床前资料中，我们发现具有VHL丢失的肾肿瘤对mTOR的抑制剂极其敏感。当前，在此项技术中没有用于检测常规加工福尔马林固定、石蜡包埋的患者活组织检查和肾切除术样品中这种途径的活化状态以及测量周围血液单核白细胞(PBMC)和血清中含量的方法。第一步是表明这些抗体可检测这种途径的协同调节作用。我们已经表明了这个。另外，我们已展示FDG-PET在检测这种途径的活化方面的实用性。第二步将是测试HIF途径的当前抑制剂在这些患者中的有效性且发展这种途径的新抑制剂。因此，这些试剂将具有直接临床应用和重大意义。
本揭示内容展示VHL肿瘤抑制基因的丢失如何通过稳定转录调节剂-缺氧诱导因子复合体在限定对肾癌中M-TOR抑制剂的临床响应方面起作用。例如，用CCI-779处理降低这些细胞中的HIF蛋白含量并且我们展示在活体外与活体内人类肾癌细胞中VHL丢失与CCI-779敏感性之间的相关性，指出VHL丢失给予细胞自主性和血管生成竞争优势。在不受特殊理论限制的情况下，资料提供这种机制经由S6K发生的证据，其增加在5′端(5′TOP)含有末端寡嘧啶区的mRNA转录产物的转译效率。如本文所揭示，对这种VHL与HIF之间相互关系的了解临床上可用以选择患者和监控治疗功效。
通常，本发明的方法用于评价在与mTOR抑制剂接触时例如肾癌的肿瘤是否有可能作出响应(即，有可能表现生长抑制)。在所述实施例中，检验与途径活化(例如VHL丢失和/或HIF复合体上调或稳定化)相联的生物标记物多肽的状况以确定在所述肿瘤中所述途径是否失调且因此是否易受对由已知靶向所述途径的抑制剂(例如CCI-779或其类似物)引起的抑制作用影响。在所述实施例中，在将肿瘤暴露于抑制剂之前对其进行检验。或者，所述方法评价例如肾癌的肿瘤对mTOR抑制剂是否有响应(即，表现生长抑制)。在所述实施例中，在将肿瘤暴露于抑制剂之后，检验与所述途径活化(例如VHL丢失和/或HIF复合体上调或稳定化)相联的生物标记物多肽的活性以确定途径中所述生物标记物是否对暴露于抑制剂有响应。
另外，此项技术教导这种生长相关的途径为在多种人类癌症中失调的常见途径。因此，技术人员了解本文揭示的方法和材料可普遍用于检验观察到VHL丢失和/或HIF复合体上调或稳定化的所有癌症中的这种途径。在本文中，虽然在检验肾癌中使用所揭示的方法和材料代表本发明的优选实施例，但技术人员了解这些是说明性实施例且这些方法和材料可用于多种人类癌症。所述癌症包括(但不限于)成血管细胞瘤(参见，例如Lemeta等人，J Neuropathol Exp Neurol.2004 Oct；63(10)：1072-9)、卵泡甲状腺瘤(参见，例如Hunt等人，Surgery.2003 Dec；134(6)：1043-7；discussion 1047-8)、胰腺癌(参见，例如Kim等人，Mod Pathol.2003 Nov；16(11)：1086-94)和嗜铬细胞瘤(参见，例如Veglio等人，Minerva Med.2003 Aug；94(4)：267-71)。
本发明的一个说明性实施例为一种鉴别有可能响应和响应mTOR多肽抑制剂(例如雷帕霉素、SDZ-RAD、CCI-779、RAD 001或AP23573)的哺乳动物肿瘤的方法，所述方法包含检验Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因产物表达降低和/或HIF复合体(包含HIFα次单位HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α和HIF-1β)的稳定化或上调的生物样品中的细胞；本文中，在对照细胞中Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因产物(例如VHL mRNA或蛋白)的表达降低或HIF复合体的稳定化或上调鉴别生物样品中的细胞有可能响应或响应mTOR抑制剂。任选地，所述哺乳动物肿瘤为肾癌。多种方法可用于这些检验。在一个实施例中，所述方法使用F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描。在另一实施例中，所述方法使用结合Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因或HIF-1α、HIF-2a、HIF-3α和HIF-1β的抗体。在又一实施例中，所述方法使用杂交Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因或HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α和HIF-1β的多核苷酸。
如本文所述，在遭受或怀疑遭受肾癌的患者细胞中VHL和/或HIF复合体多肽和/或多核苷酸的状况可通过此项技术熟知的多种方法评价。VHL和/或HIF复合体的状况的评价提供对于诊断和预测协议有用的信息以评定可能具有失调生长的细胞的状况。在优选的实施例中，本发明由检测例如怀疑为癌性细胞的细胞中失调生长的证据的方法组成。在这些方法中，VHL和/或HIF复合体基因的状况通过任何许多技术上接受的协议检验，例如基因组Southern，以评价基因组DNA的总混乱；Northern和PCR分析，以评价VHL和/或HIF复合体mRNA含量；或免疫学方法，以检验VHL和/或HIF复合体蛋白。所述协议用于检验VHL含量和/或HIF复合体表达以及在VHL和/或HIF复合体mRNA或蛋白内突变是否存在。在本文中，这些方法用以比较测试细胞中VHL和/或HIF复合体的状况与相应正常细胞中VHL和/或HIF复合体基因的状况或与特殊已知标准，其中测试细胞中VHL和/或HIF复合体基因的状况相对于正常细胞的改变提供测试细胞内失调生长的证据。
在这些方法的特殊说明性实施例中，VHL和/或HIF复合体基因的状况通过选自由南方杂交、北方杂交、西方印迹、聚合酶链式反应和多核苷酸定序组成之群组的协议确定。在这种方法的一个优选实施例中，VHL和/或HIF复合体基因的状况通过评价所述细胞内mRNA转录产物的含量来检验。在另一优选的实施例中，在这种方法中分析的细胞来自活组织检查组织样品。在这种方法的一个特殊实施例中，所述测试细胞为人类细胞。在这种方法的一个更特殊实施例中，所述测试细胞怀疑为肿瘤细胞。在高度优选的实施例中，怀疑为肿瘤的测试细胞选自由肾细胞或例如肾上腺癌、脑癌或眼科癌的另一观察到具有VHL丢失的癌症组成的群组。
如本文所详细论述，患者样品中VHL和/或HIF复合体基因产物的状况可通过此项技术熟知的多种协议分析，包括F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描、免疫组织化学分析、包括原位杂交的多种北方印迹技术、RT-PCR分析(例如激光俘获微解剖的样品)、西方印迹分析和组织阵列分析。更特定来说，本发明提供评价例如肾及其他组织、细胞制剂及其类似物的生物样品中VHL和/或HIF复合体多核苷酸的分析。可评价的VHL和/或HIF多核苷酸包括(例如)VHL和/或HIF基因或其片段及VHL和/或HIF mRNA。放大和/或检测VHL和/或HIF复合体多核苷酸存在的许多方法在此项技术中熟知且可用于实施本发明的这个方面。
在一个实施例中，检测生物样品中VHL和/或HIF复合体mRNA的方法包含使用至少一种引子通过反转录由样品产生cDNA；使用VHL和/或HIF复合体多核苷酸作为用以扩增其中的VHL和/或HIF复合体cDNA的正义和反义引子扩增如此产生的cDNA；和检测扩增的VHL和/或HIF复合体cDNA的存在。任选地，可确定扩增的VHL和/或HIF复合体cDNA的定序。
在另一实施例中，检测生物样品中的VHL和/或HIF复合体基因的方法包含首先自样品中分离基因组DNA；使用VHL和/或HIF多核苷酸作为正义和反义引子扩增所述分离的基因组DNA；和检测扩增的VHL和/或HIF基因的存在。许多适当的正义和反义探针组合可由VHL和/或HIF的核苷酸序列来设计且用于此目的。
本发明也提供检测例如肾及其他组织及其类似物的组织或其他生物样品中VHL和/或HIF复合体蛋白的存在的分析。检测VHL和/或HIF复合体蛋白的方法也熟知且包括(例如)免疫沉淀、免疫组织化学分析、西方印迹分析、分子结合分析、ELISA、ELIFA及其类似方法。例如，生物样品中VHL和/或HIF蛋白的存在的方法包含首先使所述样品与VHL和/或HIF复合体抗体、其VHL和/或HIF-反应性片段或含有VHL和/或HIF复合体抗体的抗原结合域的重组蛋白接触；且随后检测所述样品中VHL和/或HIF相关蛋白的结合。
本发明的一个说明性实施例为鉴别有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤细胞(例如肾癌细胞)的方法，所述方法包含检验与所述哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比，所述哺乳动物肿瘤细胞中Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白表达减少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的哺乳动物肿瘤细胞；其中Von HippelLindau(VHL)肿瘤抑制蛋白表达减少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％(即，所观察的VHL蛋白含量相对减少)鉴别哺乳动物肿瘤细胞有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂。多种mTOR抑制剂在此项技术中已知(参见，例如Mita等人，Cancer Biol Ther.2003 Jul-Aug；2(4增刊1)：S169-77；Rowinsky Curr Opin Oncol.2004 Nov；16(6)：564-75；Kristof等人，J Pharmacol Exp Ther.2005 Sep；314(3)：1134-43.Epub 2005 May 27；Giles等人，Curr Mol Med.2005 Nov；5(7)：653-61)。通常，所述mTOR多肽抑制剂为雷帕霉素、SDZ-RAD、CCI-779、RAD 001、AP23573或其类似物。多种检测Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白的含量(例如，观察表达减少)的方法在此项技术中已知(参见，例如Palayoor等人，Clin Cancer Res.2004 Jun 15；10(12 Pt 1)：4158-64；Na等人，J Urol.2003 Aug；170(2 Pt1)：588-92；Le等人，Clin Cancer Res.2003 Jan；9(1)：59-67)。如本文所揭示，所述方法可为直接的(即，通过直接考察所述蛋白)或间接的(即，通过考察可与VHL蛋白表达含量相关的因素)。例如，在本发明的一些实施例中，Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)的表达使用结合所述Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白的抗体检验。另外，因为观察到Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白含量与Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因mRNA含量(即，编码所述蛋白的mRNA)相关，所以VHL蛋白表达可通过包含观察编码Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)的mRNA的表达减少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的方法来检验。在特殊方法中，VHL mRNA表达使用例如聚合酶链式反应(PCR)方法或北方印迹方法的杂交编码Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)的mRNA的多核苷酸检验。在本发明的又一实施例中，Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白的存在和/或含量通过包含使用F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描的方法检验。在本发明的又一实施例中，Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白的存在和/或含量通过观察与哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比，所述哺乳动物肿瘤细胞中HIF-1α(SEQ ID NO：2)或HIF-2α(SEQ ID NO：3)多肽的含量增加至少10％、20％、30％、40％或50％的方法检验Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因表达的减少来检验。
本发明的又一实施例为鉴别有可能响应或响应mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤细胞(例如肾细胞)的方法，所述方法包含检验表达如可通过比较SEQ ID NO：1中所示的VHL多肽序列与自肿瘤细胞获得的VHL多肽序列观察到的缺失、替代或插入突变的VonHippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)的哺乳动物肿瘤细胞；其中Von HippelLindau(VHL)肿瘤抑制蛋白中的缺失、替代或插入突变鉴别哺乳动物肿瘤细胞有可能响应或响应mTOR抑制剂。这个实施例的典型方法使用例如北方印迹和/或聚合酶链式反应(PCR)方法中的杂交编码Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)的mRNA的多核苷酸。或者，Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)中的缺失、替代或插入突变通过包含观察与哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比，所述哺乳动物肿瘤细胞中HIF-1α(SEQ ID NO：2)或HIF-2α(SEQ ID NO：3)多肽的含量增加至少10％、20％、30％、40％或50％的方法检验。
本发明的又一实施例为一种监控mTOR多肽抑制剂在治疗具有Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白(SEQ ID NO：1)表达减少的哺乳动物肿瘤中的功效，所述方法包含检验与来自未暴露于mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤的细胞相比，来自已暴露于mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤的测试细胞中HIF-1α(SEQ ID NO：2)和/或HIF-2α(SEQ ID NO：3)多肽含量减少至少10％、20％、30％、40％或50％的生物样品中的细胞；其中测试细胞中HIF-1α(SEQ ID NO：2)和/或HIF-2α(SEQ ID NO：3)多肽含量的这种减少提供所述mTOR多肽抑制剂在治疗所述哺乳动物肿瘤中有效的证据。任选地，所述方法包含使用F-18氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描或使用结合HIF-1α(SEQ ID NO：2)或HIF-2α(SEQ ID NO：3)多肽的抗体。
通常，本发明的分析包括免疫组织化学技术。如本文所用的免疫组织化学技术涵盖使用检测细胞特异性标记物的试剂，所述试剂包括(例如)抗体。包括单克隆抗体、多克隆抗体及其片段的抗体经常用来鉴别样品中所关注的蛋白或多肽。根据免疫组织化学技术利用许多技术来标记所关注的目标。所述技术在Molecular Biology，第14单元以及下列等等，Ausubel等人编，John Wiley & Sons，1995中的当前协议中论述，其揭示内容以引用的方式并入本文中。典型协议包括将根据常规步骤制备的石蜡包埋组织切片染色(参见，例如美国专利第6,631,203号)。
重要地，所揭示用于检测这种生物标记物的方法可与包括福尔马林固定、石蜡包埋的活组织检查样品的多种组织样品一起使用。如本文所揭示，这些标记物可使用例如磷酸基特异性抗体的抗体的群体来检验。在这些方法中，例如来源于福尔马林固定、石蜡包埋的活组织检查样品的细胞的哺乳动物细胞可通过检验含有这种细胞的组织样品中本文所揭示的多种目标分子的存在来检验证明途径的活化。本发明的某些实施例鉴别和/或评定例如雷帕霉素或其类似物的可用来治疗肾癌的治疗剂。
本发明的制品
本发明的实施例也包括经设计用来促进本发明的方法的制品和/或试剂盒。通常，所述试剂盒包括根据本发明的方法使用其中的要素的使用说明书。所述试剂盒可包含经划分以容纳紧密限制的一或多个例如小瓶、管及其类似物的容器构件的载体构件，每一容器构件包含用于所述方法中的单独要素中的一种。例如，容器构件中的一个可包含一或多种用或可用标记物可检测地标记的本文所揭示的抗体(VHL和/或HIF抗体)。对于利用免疫学方法(例如免疫组织化学及西方印迹)检测目标蛋白的试剂盒来说，所述试剂盒也可具有含有用于这些方法的缓冲剂的容器和/或包含用例如发色团或放射性分子的报导基因方式标记的抗体的容器。
在本发明的一个典型实施例中，提供含有可用于检验如上所述的病症的物质的制品。所述制品包含容器和标签。合适的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器和试管。所述容器可由例如玻璃或塑料的多种材料形成。所述容器可容纳有效检验哺乳动物细胞(例如肾癌细胞)的组合物(例如，多核苷酸探针和/或抗体组合物)。在所述容器上或与所述容器相联的标签指出所述组合物用于检验细胞多肽。所述制品可进一步包含第二容器，所述第二容器包含缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和右旋糖溶液。其可进一步包括就工业和使用者立场来说合意的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装说明书。
贯穿本申请案，参考多个公开案。这些公开案的揭示内容全文以引用的方式并入本文中。
实例
以下实例提供可用于实施本发明的说明性方法和材料。
实例1：对于实施本发明的实施例的说明性方法和材料
DNA构筑体和PCR引子。
pCSUVCG(U6-shRNA-VHL-CMV-GFP)通过连接pCSCG的BamHI/EcoRI消化物与U6-shRNA-VHL PCR产物构筑。所述U6-shRNA-VHL PCR使用含hU6质体在60℃的退火温度下用引子5′-xyz-3′和5′-pqr-3′执行。p-Babe-puro-HA-HIF-1α(P564A)和HIF-2α(P405A；P531A)的脯氨酰基羟化缺损突变体为Dr.W.G.Kaelin的慷慨赠品(参见，例如Aprelikova等人，J Cell Biochem 92，491-501(2004)，Kondo等人，Cancer Cell 1，237-46(2002)，Kondo等人，PLoS Biol 1，E83(2003))。
免疫印迹分析和VEGF ELISA。
将细胞和异种移植肿瘤溶解于分别用完全蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂混合物(Calbiochem)补充的ECB溶解缓冲液(参见，例如Kondo等人，Cancer Cell 1，237-46(2002))或高清洁剂缓冲剂(2％SDS)(参见，例如Chen等人，Nat Med 10，33-9(2004))中。蛋白提取物通过SDS-PAGE解析且将其转移至硝化纤维膜。在于具有5％脱脂乳的Tris-缓冲盐水(TBS)中阻断之后，所述膜用于具有4％BSA的TBS中稀释的以下各物探测：抗-VHL小鼠单克隆抗体(1∶400，Oncogene Research Sciences)、抗-HIF1α小鼠单克隆抗体(1∶250，BD Pharmingen)、抗-HIF-2α小鼠单克隆抗体(1∶500，Novus Biologicals)、抗-GLUT-1兔多克隆抗体(1∶1000，Alpha Diagnostic)、抗-CA-IX兔多克隆抗体(1∶500，Novus Biologicals)、抗-磷酸基-eIF4G-S1108兔多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling)、抗-磷酸基-S6核糖体蛋白S235/236兔多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling)或抗-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体(1∶5000，Sigma)。结合抗体使用增强的化学发光(ECL，Amersham)检测。对于VEGF ELISA量化，将细胞涂于6孔板上(1×105/孔)。三次重复执行实验。所述细胞一旦附著，则改变培养基或添加10nM CCI-779或媒剂(100％乙醇)。36小时后，使用费希尔板读数器(Fisher Plate reader)根据厂家使用说明书执行VEGF ELISA(R&D Systems)。为了标准化，将VEGF蛋白含量除以各样品内的细胞内蛋白浓度。
活体外和活体内生长实验。
使SN12C和ACHN(NCI60，DTP)维持于补充有10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。在无选择的情况下，SN12C-CSCG、ACHN-CSCG、SN12C-CSCG-VHLshRNAi和ACHN-CSCG-VHLshRNAi通过分别用pCSCG或pCSUVCG慢病毒感染而得到(＞90％感染)。根据厂家使用说明书，将含有HIF1和HIF-2突变体的反向病毒(即p-Babe-puro-HA-HIF-1α(P564A)和HIF-2α(P405A；P531A))或骨架载体使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染至Phoenix包装细胞系中。48小时后收获组织培养上清液，使其穿过0.45μ过滤器且在4μg/ml聚凝胺存在下将其添加至SN12C-CSCG-VHLshRNAi细胞中。受感染细胞通过在嘌呤霉素(puromycin)(1.5μg/ml)存在下生长而选择。
对于活体外实验，将细胞(5×104)涂板且用1和10nM CCI-779(J.Gibbons，Wyeth的友好增品)或媒剂(乙醇)处理。处理5天后，使细胞胰蛋白酶化，将其再悬浮于具有10％FBS的DMEM中且根据厂家使用说明书使用VI细胞计数器(Beckman Coulter)计数。细胞计数三次重复进行且在至少3个独立时刻重复。活体内致肿瘤性通过将于100μl Matrigel(Collaborative Biomedical)中的5×105个SN12C-CSCG、ACHN-CSCG、SN12C-CSCG-VHLshRNAi、ACHN-CSCG-VHLshRNAi、SN12C-CSCG-VHLshRNAi-pBABE、SN12C-CSCG-VHLshRNAi-pBABE-HA-HIF-2α(P405A；P531A)细胞皮下注射到SCID小鼠胁腹中来测量。如所述，肿瘤尺寸每周使用测径器对三个尺寸测量(Klein，K.A.等人，Nat Med 3，402-8(1997))。当肿瘤达到200mm3时，所有肿瘤每日接受0.1mg/kg CCI-779或媒剂。所有小鼠实验按照洛杉矶加利福尼亚大学的动物研究委员会的指导方针执行。
免疫组织化学。
将异种移植肿瘤样品固定在10％缓冲的福尔马林中且包埋在石蜡中。根据标准协议，将薄切片(4μm)用苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)染色。CD-31(XYZ，1∶500，Santa Cruz)、抗-磷酸基-S6核糖体蛋白S235/236兔多克隆抗体(XYZ，1∶1000，CellSignaling)和抗-VEGF兔多克隆抗体(XYZ，1∶1000，Santa Cruz)的检测通过标准抗生物素蛋白-生物素免疫过氧化物酶方法进行，其中二氨基联苯胺用作色原且苏木精用作复染剂。微血管密度如先前所述进行量化(Weidner，N.等人，J Natl Cancer Inst 84，1875-87(1992))。简要来说，微血管密度通过光学显微术在每个区域含有最高数量毛细管和微小静脉(微血管)的异种移植肿瘤区域(即，新生血管性“热点区”)通过在低功率(40x和100x)下扫描肿瘤部分测定。认为对于CD-31为阳性且明显与邻近群分开的任何内皮细胞或内皮细胞群为单一可计数的微血管且结果表示为在任何单一200x场内鉴别的最高微血管数。
本发明的范畴不受本文所揭示的实施例限制，所述实施例意味着本发明的个别方面的单一说明，且功能上相等的任一者都在本发明的范畴内。除本文所述的那些之外，对于所属领域的技术人员来说，对本发明的模型和方法进行的多种修改将从上述描述和教导中显而易见且类似地意欲属于本发明的范畴。可在不背离本发明的真实范畴和精神的情况下实施所述修改或其他实施例。
实例2：对于实施本发明的实施例的说明性方法和材料
mTOR抑制剂在癌症试验中展示散发活性，导致关于适当临床情形对于其使用的混乱。在此，我们展示活体外或在小鼠模型中，Von Hippel Lindau(VHL)肿瘤抑制基因丢失使肾癌细胞对mTOR抑制剂CCI-779敏感。在转译缺氧诱导因子(HIF)mRNA中，由CCI-779引起的生长停滞与阻断相关，且其由表达给予mTOR调控的缺乏5′末转译区的VHL-抗性HIF cDNA拯救。VHL-不足肿瘤以mTOR依赖性方式展示正电子发射断层扫描(PET)追踪物氟去氧葡萄糖(FDG)吸收量增加。我们的发现对于肾癌中mTOR抑制剂的预期生物标记物推动临床研究提供临床前理论且暗示FDG-PET扫描可在这种情形用作药效标记物。
mTOR(雷帕霉素的哺乳动物目标)激酶抑制剂CCI-779诱导约10％具有转移性肾癌瘤的患者的客观响应和约50％具有转移性肾癌瘤的患者的疾病稳定化(参见，例如Atkins，M.B.等人，J Clin Oncol 22，909-18(2004))。在患者子集中这种选择性活性的发现提出响应者共有致使这些肿瘤生长和/或存活的mTOR依赖性的常见分子表型的可能性。在肺中用EGFR抑制剂的类似现象已用EGFR激酶结构域突变与临床响应相联的最新发现解决(参见，例如Paez，J.G.等人，Science 304(5676)：1497-500(2004)，Lynch，T.J.等人，N Engl J Med 350，2129-39(2004)和Pao，W.等人，Proc Natl Acad Sci USA 101，13306-11(2004))。肾细胞癌瘤中最常见的分子异常为VHL丢失，其在约50-70％散发性病例中见到(参见，例如Kim等人，J Clin Oncol 22，4991-5004(2004))。VHL编码促进缺氧诱导转录因子HIF-1、HIF-2和HIF-3的α次单位泛素化的E3连接酶，导致其通过蛋白体降解。因此，具有VHL突变的肾癌瘤具有HIF蛋白表达的高稳态水平。功能研究表明HIF足以满足由VHL丢失引起的转化，因而确立在这些癌症中HIF为主要致癌推动者(参见，例如Seagroves等人，Cancer Cell 1，237-46(2002)；Kondo，K等人，Cancer Cell 1，237-46(2002)；和Maranchie，J.K.等人，Cancer Cell 1，247-55(2002))。
值得注意地，HIF蛋白表达在某些细胞范围内具有mTOR依赖性(参见，例如Hudson，C.C.等人，Mol Cell Biol 22，7004-7014(2002)，Zhong，H.等人，Cancer Res 60，1541-5(2000)和Semenza，G.L.Nat Rev Cancer 3，721-32(2003))。与肾细胞癌瘤最相关的是HIF1α和HIF2α mRNA的5′未转译区含有可调节响应S6激酶活化的转译的5′末端寡聚嘧啶(TOP)区(参见，例如Laughner等人，Mol Cell Biol 21，3995-4004(2001))。带有5′-TOP序列的mRNA的转译具有mTOR依赖性，因为mTOR调节涉及S6激酶及其底物S6核糖体蛋白的激酶级联，其为有效转译这些信息所需。HIF转译和mTOR之间的这种关系提出mTOR抑制剂在肾细胞癌瘤子集中的临床活性可部分地通过VHL丢失解释的可能性。
我们通过使用通过慢病毒转移VHL特异性shRNA的稳定RNA敲除构筑仅在VHL表达水平方面不同的人类肾癌瘤细胞系等基因双来评估这种可能性。除具有野生型VHL之外，我们选择表达野生型PTEN的两种独立亲本系(SN12C和ACHN)以移除PTEN丢失的任何混淆影响，已知其通过活化AKT使细胞对mTOR抑制作用敏感(参见，例如Neshat，M.S.等人，Proc Natl Acad Sci USA 98，10314-9(2001)，Podsypanina，K.等人，Proc Natl Acad Sci USA 98，10320-5(2001)和Houghton等人，Curr Top Microbiol Immunol279，339-59(2004))。正如所料，在稳定表达敲除构筑体的细胞中，VHL蛋白含量减少且HIF-1和HIF-2α蛋白含量增加(图1A)，而仅载体的对照物没有效果。类似地，靶向雄激素受体的shRNA没有得到效果。另外，HIF目标基因、葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)、碳酸酐酶-9(CA-IX)且VEGF的蛋白含量在VHL敲除细胞中均增加(图1A和2B)(参见，例如Houghton等人，Curr Top Microbiol Immunol 279，339-59(2004)；和Chen，F.等人，Cancer Res 55，4804-7(1995))。我们还注意到VHL shRNA细胞比其等基因亲代对应物增殖更迅速，这与先前关于VHL反向添加引起生长抑制的报导一致(图1B)(参见，例如Houghton等人，Curr Top Microbiol Immunol 279，339-59(2004)。
为了评定mTOR在由VHL敲除介导的增殖中的作用，我们将等基因人类肾肿瘤细胞系对暴露于mTOR抑制剂CCI-779中。表达空载体的亲代细胞SN12C-CSCG(和ACHN-CSCG)生长不受10nM CCI-779影响，而SN12C-VHL shRNA细胞(和ACHN-VHLshRNA)的生长以剂量依赖性方式减少70％。当等基因系作为皮下异种移植物在SCID小鼠中生长时获得类似结果(图1C、1D)。值得注意地，如由S6磷酸化减少所测量，CCI-779在亲代和VHL敲除异种移植物中阻断mTOR活性。
除细胞自主影响之外，根据内皮细胞生长在某些情形中具有mTOR依赖性，mTOR抑制剂可具有直接抗血管生成活性(参见，例如Guba，M.等人，Nat Med 8，128-35(2002))。因为血管生成为肾癌瘤的中心组织特征，所以mTOR抑制剂也可经由对肿瘤脉管结构影响而削弱肿瘤生长。实际上，如由CD-31免疫组织化学染色所测量(p＜0.0033)，当与亲代肿瘤相比时来自VHL敲除细胞系的异种移植物具有更多血管，且用CCI-779处理引起微血管密度减少大于50％(图2A)。然而，因为原血管生成基因VEGF为HIF目标，所以在这种情形中CCI-779的抗血管生成性质也可产生药物对肿瘤细胞的直接效应。实际上，分泌VEGF水平在VHL敲除细胞中增加且通过活体外用CCI-779处理减少2倍(图2B)。来自VHL敲除细胞的异种移植肿瘤也表达升高含量的VEGF蛋白，所述升高含量通过CCI-779疗法逆转(图2C)。
总起来说，这些实验确立VHL丢失使肾癌瘤细胞对通过mTOR抑制剂引起的生长抑制敏感。此外，这种敏感有可能主要经由药物对肿瘤细胞的直接作用而出现，因为活体外和活体内观察到生长抑制。这个结论与5′TOP-依赖性HIF转译和mTOR之间的已知关系一致，且引出若干预测。第一，CCI-779处理将降低VHL敲除细胞中HIF-1α、HIF-2α蛋白含量。第二，这种效应将取决于HIF-1α、HIF-2α mRNA中的未转译区中的5′TOP序列。第三，CCI-779的生长抑制效应将通过表达缺乏5′TOP序列的HIF cDNA和抵抗由VHL引起的降解而拯救。
为了解决第一个问题，我们测量暴露于CCI-779后VHL敲除细胞的HIF蛋白含量。HIF-1α和HIF-2α的表达在24小时内显著减少。另外，HIF目标基因GLUT-1、CA-IX和VEGF的表达类似地减少。如通过下游底物eIF4G和S6的磷酸化减少所测量，这些变化与mTOR的抑制作用精密相关(图3A)。值得注意地，CCI-779处理对HIF1αmRNA没有效果，这与转译中蛋白含量减少由阻断引起的假设一致。这种假设也由使用异种表达的HIF-1α的研究支持，其中末转译mRNA的天然5′TOP序列被保留或从HIF-1αcDNA表达构筑体中缺失。类似于在VHL敲除细胞的内源HIF上可见的影响，CCI779处理引起用保留有5′TOP序列的cDNA转染的VHL野生型细胞中HIF-1α蛋白含量减少。相反，当移除5′TOP序列时，HIF-1α含量基本上不受CCI-779处理影响(图3B)。
这些实验确立CCI-779对VHL不足肾癌瘤细胞系的生长抑制效应与HIF蛋白的转译减少相关。先前工作已表明VHL介导的肿瘤抑制的拯救由对VHL介导的降解具有抗性的HIF突变体予以。为了提供HIF含量减少引起CCI-779处理的细胞生长降低的功能证据，我们转换具有缺乏5′TOP序列的类似HIF-1α或HIF-2α突变cDNA(对于HIF-1α为P564A；对于HIF-2α为P351A)的SN12C VHL敲除细胞系(参见，例如Kondo，K等人，Cancer Cell 1，237-46(2002)；Aprelikova，O.等人，J Cell Biochem 92，491-501(2004))。正如所料，如由eIF4E和S6磷酸化所测量，不管mTOR抑制作用的明确生物化学证据，HIF突变以及下游目标基因在存在或不存在CCI-779的情况下均稳定表达(图4A)。明显地，突变体的表达因活体外(图4B)和异种移植实验(图4C)中CCI-779处理的生长抑制效应而完全拯救VHL敲除细胞。这些实验确立mTOR抑制剂在VHL裸肾癌细胞中的抗增殖活性经由其对HIF转译的影响介导。
这些结果对于在肾癌瘤中CCI-779的进行中临床试验具有重要意义且证明VHL状况可充当患者选择的生物标记物。VHL数据不是从肾癌的完成II期研究中收集，但可比较这些试验的响应率与类似患者中VHL突变的预期频率。自相矛盾的是，客观响应率(约10％)显著低于预期的VHL突变率(约50％)。然而，这些试验报导非常高的疾病稳定率(约50％)。不仅这个数目与所预期的VHL突变率匹配，而且稳定的疾病可为mTOR抑制作用的预期临床后果，因为在我们的临床前模型中观察到生长停滞(没有肿瘤退缩)。或者，例如Bcl-2表达的额外分子损害可减少对mTOR抑制作用的响应(参见，例如Majumder，P.K.et al.Nat Med(2004))。两种情况都将对未来试验中将VHL状况与临床响应相关联具有重要性，以确定此处观察到的临床前关系是否可引导未来患者选择。
除VHL状况的组织标记物之外，将极其有用的是以非侵袭性工具监控VHL状况且响应mTOR抑制作用。受人关注地，近来在AKT推动前列腺癌模型中鉴别出的HIF活化的转录标记包括糖酵解途径中的许多基因(参见，例如Majumder，P.K.et al.Nat Med(2004))。另外，我们注意到在我们的VHL敲除细胞中HIF目标基因Glut1的表达增加(图1A)。这些发现提出HIF推动的肿瘤可积聚正电子发射断层扫描中广泛使用的临床追踪物-氟去氧葡萄糖(FDG)的可能性。因此，我们比较F-FDG在VHL敲除异种移植模型相对于F-FDG在亲代细胞中的吸收量(参见，例如Kaelin等人，Trends Genet 14，423-6(1998))。在三个独立实验中，两个模型中随皮下胁腹块生长的VHL敲除肿瘤可再现地展示FDG吸收量增加至少2倍，在用CCI-779 24小时内其降低到基准(图5)。值得注意地，对肾癌患者的临床PET研究指出显著比例(约50-70％)的这些肿瘤为FDG贪求的(参见，例如Hain等人，BJU Int 92，159-64(2003)。这些结果提出FDG-PET扫描可在用mTOR抑制剂疗法之前或开始后不久用于非侵袭性记录肾癌瘤患者中的mTOR抑制作用的可能性，这类似于在用伊马替尼(imatinib)治疗的胃肠基质肿瘤(GIST)患者中使用所述扫描(参见，例如Joensuu，H.Med Klin(Munich)97增刊1，28-30(2002)和Gayed，I.等人，J Nucl Med 45，17-21(2004))。
类似于CCI-779，临床活性已在使用靶向VEGF(贝法滋美(Bevacizumab))或其受体VEGFR(SU11248，Bay 43-9006)的若干抗血管生成剂中的任一者的肾癌瘤子集报导(参见，例如Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov 3，391-400(2004))。尽管mTOR抑制剂也具有抗血管生成性质(参见，例如Guba，M.等人，Nat Med 8，128-35(2002))，但我们展示的在小鼠中HIF拯救由CCI-779处理引起的生长抑制的结果证明肾癌瘤中mTOR抑制剂的抗血管生成效应主要经由对肿瘤细胞的直接效应介导。这种机制了解提供探究在肾癌中使用mTOR和VEGF/VEGFR途径抑制剂的组合疗法以在不同临床节点处阻断HIF途径的理论(图6)。
先前工作已展示PI3激酶/AKT途径驱动的转化具mTOR依赖性，因为mTOR为下游激酶级联的关键组份。这个结果与“途径嗜好”的广泛概念一致，以解释与正常细胞相比，当面临途径特异性激酶抑制剂时肿瘤细胞为什么可具有竞争劣势(参见，例如Weinstein，LB.Science 297，63-4(2002))。在此，我们提供激酶依赖于概念上不同的机制的证据。在由VHL丢失引起的肾细胞癌瘤中，mTOR的关键作用不是由于经HIF介导的致癌信号的下游转导。更确切来说，HIF mRNA的转译由于在5′末转译区存在上游调节信号而具TOR依赖性。这种模型预测高度有利的治疗指数，因为正常组织中HIF转译的减少应不合逻辑，因为HIF蛋白已经由VHL快速降解。类似的机制也可引起CCI-779在驱动致癌病变拟定为细胞周期素D1的套细胞淋巴瘤中的临床活性。细胞周期素D1mRNA的转译(由于限定这些肿瘤的Bcl-1移位，其以增加量产生)也在某些系统中展示mTOR依赖性(参见，例如Rowinsky，E.K.Curr Opin Oncol 16，564-75(2004))。mTOR抑制剂的未来临床试验可受益于这些概念上不同的mTOR依赖性的机制。
方法
DNA构筑体和PCR引子。pCSUVCG(U6-shRNA-VHL-CMV-GFP)通过连接pCSCG的BamHI/EedRI消化物与U6-shRNA-VHL PCR产物构筑(参见，例如Chen，CD.等人，Nat Med 10，33-9(2004))。所述U6-shRNA-VHL PCR使用含hU6质体在60℃的退火温度下用引子5′abc 3′和5′xyz 3′执行。HIF-1α的天然5′UTR使用Genebrowser鉴别，其含有先前鉴别出的TOP序列(参见，例如Laughner等人，Mol Cell Biol 21，3995-4004(2001))。使用人类胎儿脑cDNA(Marathon，Invitrogen)作为模板，含有268个5′UTR碱基对和119个编码区碱基对的387-bp片段使用引子5′GGGAGATCTGGGGACAGGAGGATCGCC-3′(SEQ ID NO：4)和5′-GGGAAGCTCATAAAAAACTTTAGATTC-3′(SEQ ID NO：5)产生。将PCR产物次克隆到PCR 2.1 TA克隆载体中，通过定序证实且随后用Bgl II分解且连接到MSCV-puro-HIF-1αcDNA的Bgl II位点中，以产生HIF-1α 5′TOP嵌合基因。p-Babe-puro-HA-HIF-1α(P564A)和HIF-2α(P405A；P531A)的脯氨酰基羟化缺损突变体为Dr.W.G.Kaelin的慷慨赠品。
免疫印迹分析和VEGF ELISA。将细胞和异种移植肿瘤分别溶解于补充有完全蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂混合物(Calbiochem)的ECB溶解缓冲液或高清洁剂缓冲剂(2％SDS)中。蛋白提取物通过SDS-PAGE解析且转移至硝化纤维膜。在于具有5％脱脂乳的Tris-缓冲盐水(TBS)中阻断之后，所述膜用于具有4％BSA的TBS中稀释的以下各物探测：抗-VHL小鼠单克隆抗体(1∶400，Oncogene Research Sciences)、抗-HIF1α小鼠单克隆抗体(1∶250，BD Pharmingen)、抗-HIF-2α小鼠单克隆抗体(1∶500，Novus Biologicals)、抗-GLUT-1兔多克隆抗体(1∶1000，Alpha Diagnostic)、抗-CA-IX兔多克隆抗体(1∶500，Novus Biologicals)、抗-磷酸基-eIF4G-S1108兔多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling)、抗-磷酸基-S6核糖体蛋白S235/236兔多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling)或抗-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体(1∶5000，Sigma)。结合抗体使用增加的化学发光(ECL，Amersham)检测。对于VEGF ELISA量化，将细胞涂于6孔板(1×105/孔)。三次重复执行实验。所述细胞一旦附著，则改变培养基或添加10nM CCI-779或媒剂(100％乙醇)。36小时后，使用费希尔板读数器根据厂家使用说明书执行VEGF ELISA(R&D Systems)。为了标准化，将VEGF蛋白含量除以各样品内的细胞内蛋白浓度。
活体外和活体内生长实验。使SN12C和ACHN(NCI60，DTP)维持于补充有10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。在无选择的情况下，SN12C-CSCG、ACHN-CSCG、SN12C-CSCG-VHLshRNAi和ACHN-CSCG-VHL shRNAi通过分别用pCSCG或pCSUVCG慢病毒感染细胞系而得到(＞90％感染)。根据厂家使用说明书，将含有HIF1和HIF-2突变体的反向病毒(即p-Babe-puro-HA-HIF-1α(P564A)和HIF-2α(P405A；P531A))或骨架载体使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染至Phoenix包装细胞系中。48小时后收获组织培养上清液，使其穿过0.45μ过滤器且在4μg/ml聚凝胺存在下将其添加至SN12C-CSCG-VHL shRNAi细胞中。受感染细胞通过在嘌呤霉素(1.5μg/ml)存在下生长而选择。对于活体外实验，将细胞(5×104)涂板且用1和10nM CCI-779(J.Gibbons，Wyeth的友好增品)或媒剂(乙醇)处理。处理5天后，使细胞胰蛋白酶化，将其再悬浮于具有10％FBS的DMEM中且使用VI细胞XR自动细胞生存力分析器(Beckman Coulter)计数。细胞计数三次重复进行且在至少3个独立时刻重复。活体内致肿瘤性通过将于100μl Matrigel(Collaborative Biomedical)中的5×105个SN12C-CSCG、ACHN-CSCG、SN12C-CSCG-VHL shRNAi、ACHN-CSCG-VHL shRNAi、SN12C-CSCG-VHL shRNAi-pBABE、SN12C-CSCG-VHL shRNAi-pBABE-HA-HIF-2α(P405A；P531A)细胞皮下注射到SCID小鼠胁腹中来测量。如所述，肿瘤尺寸每周使用测径器对三个尺寸测量。当肿瘤达到200mm3时，所有肿瘤每日接受0.1mg/kg CCI-779或媒剂。所有小鼠实验按照洛杉矶加利福尼亚大学的动物研究委员会的指导方针执行。
免疫组织化学。将异种移植肿瘤样品固定在10％缓冲的福尔马林中且包埋在石蜡中。根据标准协议，将薄切片(4μm)用苏木精和曙红染色。CD-31(1∶500，Santa Cruz)和抗-VEGF兔多克隆抗体(1∶1000，Santa Cruz)的检测通过标准抗生物素蛋白-生物素免疫过氧化物酶方法进行，其中二氨基联苯胺用作色原且苏木精用作复染剂。微血管密度通过光学显微术在每个区域含有最高数量毛细管和微小静脉(微血管)的异种移植肿瘤区域(即，新生血管性“热点区”)通过在低功率(40x和100x)下扫描肿瘤部分测定(参见，例如Weidner，N.等人，J Nad Cancer Inst 84，1875-87(1992))。认为对于CD-31为阳性且明显与邻近群分开的任何内皮细胞或内皮细胞群为单一可计数的微血管且结果表示为在任何单一200x场内鉴别的最高微血管数。统计分析使用Microsoft Excel学生t检验执行。
实时定量反转录酶-聚合酶链式反应。总RNA使用RNeasy试剂盒(Qiagen)自用媒剂或10nM CCI-779处理的SN12C-CSCG、ACHN-CSCG、SN12C-CSCG-VHL shRNA和ACHN-CSCG-VHL shRNA细胞系提取。2μg总RNA用作经由反转录产生cDNA的模板。反应是以25μl最终体积组合如下各物：1μM引子(无规六聚物；Invitrogen)、10mM DTT、1X Superscript II缓冲剂、0.5μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、10U RNasin、200单位Superscript II反转录酶。将各RNA模板、引子和核酸酶自由水组合且培育10分钟，随后置于冰浴中。添加剩余反应组份且将各反应在25℃下培育10分钟，随后在42℃下培育60分钟，且最后在70℃下培育15分钟。也组合负对照反应(其不含RT酶)。实时PCR在ABI Prism 7700序列检测器(Applied Biosystems)上执行。HIF-1α和18S的引子和特异性探针自Assays-on Demand基因表达产品(Applied Biosystems)获得。PCR反应以如下方式执行：在50℃下执行2分钟，在95℃下执行10分钟且两步PCR(95℃下15秒和60℃下1分钟)循环40次。记录RT样品的阈限循环数(Ct′s)。对各样品两次重复执行。
微-PET影像2-((Kaelin等人，Trends Genet 14，423-6(1998))F)氟-2-脱氧右旋葡萄糖(FDG)使用标准方法合成(参见，例如Satyamurthy等人，Imaging Biol 4，65-70(2002))。如先前所述，用microPET灵长类动物4-环系统(P4；Concorde Microsystems，Knoxville，TN)进行PET扫描。将CCI-779以每12小时0.1mg/kg的剂量腹膜内投与。将小鼠用FDG(7.4 MBq)静脉内注射且使其在用追踪物注射15分钟后成像1小时。为了影像再现，首先将列表形式数据分成三维(3D)正弦图，随后傅立叶重组(Fourierrebinning)且使用用奈奎斯特频率(Nyquist frequency)的一半作为截止频率的Ramp滤器使2D滤波反投影(FBP)再现。再现的空间影像解析为约2.2mm。对于影像分析，将受关注区域(ROI)围绕肿瘤和肝受控置于轴面影像上。肿瘤ROI限定在具有最大追踪物吸收量的部分；肝ROI处于具有肝血池的最大横截面积的部分。肿瘤的追踪物吸收量表示为最大肿瘤内计数/像素与平均肝计数/像素之间的比率。所有数值均以平均值±标准平均误差报导(SEM)。
表
以下所提供的包括通过登录号所鉴别的序列的信息以引用的方式并入本文中。
Von Hippel-Lindau疾病肿瘤抑制基因(pVHL)(G7蛋白)。
LOCUS P40337 213 aa线性
ACCES SION P40337
NCBI INFORMATION：LOCUS AF010238 14543 bp DNA线性PRI24-NOV-2000DEFINITION
智人von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制基因，完全编码序列。ACCESSION AF010238U19763 U49746 U68055 U68176
MPRRAENWDEAEVGAEEAGVEEYGPEEDGGEESGAEESGPEESGPEELGAE
EEMEAGRPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPVWLNFDGEPQPYPTLPPGT
GRRIHSYRGHLWLFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPIFANITLPVYTL
KERCLQVVRSLVKPENYRRLDIVRSLYEDLEDHPNVQKDLERLTQERIAHQR
MGD(SEQ ID NO：1)
缺氧诱导因子1α(HIF-1α)(HIF1α)(ARNT相互作用蛋白)(PAS蛋白1成员)(MOP1)。
LOCUS Q16665 826 aa线性
ACCESSION Q16665
MEGAGGANDKKKISSERRKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSH
LDKASVMRLTISYLRVRKLLDAGDLDIEDDMKAQMNCFYLKALDGFVMVLTD
DGDMIYISDNVNKYMGLTQFELTGHSVFDFTHPCDHEEMREMLTHRNGLVK
KGKEQNTQRSFFLRMKCTLTSRGRTMNIKSATWKVLHCTGHIHVYDTNSNQP
QCGYKKPPMTCLVLICEPIPHPSNIEIPLDSKTFLSRHSLDMKFSYCDERITELM
GYEPEELLGRSIYEYYHALDSDHLTKTHHDMFTKGQVTTGQYRMLAKRGGY
VWVETQATVIYNTKNSQPQCIVCVNYVVSGIIQHDLIFSLQQTECVLKPVESSD
MKMTQLFTKVESEDTSSLFDKLKKEPDALTLLAPAAGDTIISLDFGSNDTETD
DQQLEEVPLYNDVMLPSPNEKLQNINLAMSPLPTAETPKPLRSSADPALNQEV
ALKLEPNPESLELSFTMPQIQDQTPSPSDGSTRQSSPEPNSPSEYCFYVDSDMVN
EFKLELVEKLFAEDTEAKNPFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSP
LESSSASPESASPQSTVTVFQQTQIQEPTANATTTTATTDELKTVTKDRMEDIKI
LIASPSPTHIHKETTSATSSPYRDTQSRTASPNRAGKGVIEQTEKSHPRSPNVLSV
ALSQRTTVPEEELNPKILALQNAQRKRKMEHDGSLFQAVGIGTLLQQPDDHA
ATTSLSWKRVKGCKSSEQNGMEQKTIILIPSDLACRLLGQSMDESGLPQLTSYD
CEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN(SEQ ID NO：2)
LOCUS NP_851397 735 aa线性PRI 27-OCT-2004 DEFINITION缺氧诱导因子1，α次单位异构体2(智人)。ACCESSION NP_851397
MEGAGGANDKKKISSERRKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSH
LDKASVMRLTISYLRVRKLLDAGDLDIEDDMKAQMNCFYLKALDGFVMVLTD
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ALSQRTTVPEEELNPKILALQNAQRKRKMEHDGSLFQAVGII(SEQ ID NO：3)
Claims (10)
1.一种试剂用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于鉴别可能响应或会迅速响应mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤细胞，所述试剂用于出于证实以下事实的目的而检验所述哺乳动物肿瘤细胞：
与所述哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比，所述哺乳动物肿瘤细胞中SEQ ID NO：1的Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的表达减少至少50％；
其中所述Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的表达减少至少50％验明所述哺乳动物肿瘤细胞可能响应或会迅速响应mTOR多肽抑制剂；且
其中所述哺乳动物肿瘤细胞为肾细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂为结合所述Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的抗体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的表达的减少通过包含观察与所述哺乳动物肿瘤细胞相同的细胞系的对照细胞相比所述哺乳动物肿瘤细胞中SEQ ID NO：2的HIF-1α或SEQ ID NO：3的HIF-2α多肽的含量增加至少10％的方法检验。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述SEQ ID NO：1的Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的表达的减少通过包含观察编码所述SEQ ID NO：1的Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白的mRNA的表达减少至少50％的方法检验。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述试剂为与编码所述SEQ ID NO：1的VonHippel Lindau肿瘤抑制蛋白的mRNA杂交的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述方法包含聚合酶链式反应方法或北方印迹方法。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、SDZ-RAD、CCI-779、RAD 001或AP23573。
8.一种试剂用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于鉴别mTOR多肽抑制剂是否可有效治疗具有SEQ ID NO：1的Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白表达减少的哺乳动物肿瘤，所述试剂用于出于证实以下事实的目的而检验生物样品中的细胞：
与来自未暴露于mTOR多肽抑制剂的哺乳动物肿瘤的细胞相比，来自已暴露于mTOR多肽抑制剂的所述哺乳动物肿瘤的测试细胞中SEQ ID NO：2的HIF-1α和/或SEQ ID NO：3的HIF-2α多肽含量减少至少10％的量；
其中所述测试细胞中SEQ ID NO：2的HIF-1α和/或SEQ ID NO：3的HIF-2α多肽含量减少至少10％的量提供所述mTOR多肽抑制剂在治疗所述哺乳动物肿瘤中有效的证据；且
其中所述哺乳动物肿瘤细胞为肾细胞。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述试剂为结合SEQ ID NO：2的HIF-1α或SEQ IDNO：3的HIF-2α多肽的抗体。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、SDZ-RAD、CCI-779、RAD 001或AP23573。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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