CN101153281A - 一种dna在线分离的微流控芯片及其分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA分离技术，具体地说是一种用于在线DNA预浓缩和分离的微流控芯片。芯片由前导缓冲液池、样品池、样品废液池、缓冲液废液池、尾随缓冲液池以及之间的通道构成。其中，尾随缓冲液池在样品池外侧，前导缓冲液池设置于样品池和缓冲液废液池之间。邻近于缓冲液废液池内侧设有分离检测点，于前导缓冲液池的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点。本发明将DNA样品在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离结合在微流控芯片，该微流控芯片设计灵活、加工简单；操作简便，灵敏度高，适用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分离技术，具体地说是一种在微流控芯片平台上，采用在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离方法实现DNA在线分离的微流控芯片及其分析方法。
背景技术
DNA的分离和检测是基因研究所涉及的重要技术手段。检测的DNA可以是扩增或非扩增的样品。对于非扩增样品，由于拷贝有限，往往需要大量的组织或细胞；对于扩增样品，由于实际生物样品中的DNA的浓度一般较低，即使经过聚合酶链反应(PCR)扩增后，亦不能保证达到足够的检测灵敏度，解决这个问题方法是增加聚合酶链反应次数，其代价是更多的试剂和时间消耗。对于传统的芯片电泳和毛细管电泳分析方法，虽然增加进样量可以提高检测灵敏度，但同时也造成分离效率的降低。等速电泳预浓缩是一种通过增加进样量来提高检测灵敏度而不影响分离效率的有效方法。由于基于传统毛细管电泳平台的等速电泳预浓缩-分离结合方法所需设备接口非常复杂，同时造成较大的死体积而影响了其实际应用价值，而使用微流控芯片平台可以方便地实现这种等速电泳预浓缩-分离结合方法。先前的分离方法并未在微流控制芯片上将预浓缩和浓缩后电泳分离结合，这种实现在线DNA预浓缩-分离的微流控芯片及其分析方法并未具有相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种设计灵活、加工简单、分析更加灵敏、快速和分离高效的微流控芯片DNA分离及分析方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
芯片由前导缓冲液池、样品池、样品废液池、缓冲液废液池、尾随缓冲液池以及之间的通道构成。其中，尾随缓冲液池在样品池外侧，前导缓冲液池设置于样品池和缓冲液废液池之间。邻近于缓冲液废液池内侧设有分离检测点，于前导缓冲液池的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点。
在尾随缓冲液池和前导缓冲液之间设置有样品废液池；所述样品废液池和样品池之间的有效样品区域为0.5-20cm。
当样品废液池处于样品池和前导缓冲液之间时，前导缓冲液和样品废液池之间有效区域为0.5-15cm；
或当样品池处于样品废液池和前导缓冲液之间时，前导缓冲液和样品池之间有效区域为0.5-15cm。
DNA在线分离微流控芯片的微流分析方法：
1)当样品废液池处于样品池和前导缓冲液之间时，样品废液池和缓冲液废液池之间注入前导缓冲液，在样品废液池和样品池之间注入所要分析的样品，在样品池和尾随缓冲液池之间注入尾随缓冲液；
或当样品池处于样品废液池和前导缓冲液之间时，样品池和缓冲液废液池之间注入前导缓冲液，在样品废液池和样品池之间注入所要分析的样品，在样品废液池和尾随缓冲液池之间注入尾随缓冲液；
2)此时尾随缓冲液池接地，前导缓冲液池接高压(电压为100-5000伏)，使前导液、样品、尾随液沿通道迁移，此时通过预浓缩检测点即可以检测到样品，完成样品浓缩；最后分离，前导缓冲液池接地，缓冲液废液池接高压，此时通过分离检测点即可以检测到样品。
所述各盛液池与电极相连，所有在线电泳预浓缩分离分析步骤通过常规自动的电极切换来控制。
所述前导缓冲液中的阴离子的迁移速度快于样品中的阴离子，前导缓冲液可为：氯离子，磷酸根离子或硼酸根离子等。
所述尾随缓冲液中的阴离子的迁移速度慢于样品中的阴离子，尾随缓冲液可为：3-(N-吗啡啉)丙磺酸、N-(乙-羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸等阴离子等。
样品用荧光染料标记并加入筛分介质，所述筛分介质可以为无胶筛分的羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺或琼脂糖；所述荧光染料可为共价标记染料或非共价标记染料，共价标记染料可为：FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、罗丹明系列、Alexa Fluor系列、DABCYL、HEX、JOX、NAP、Oregon Green 488、Pyrene、ROX、TAMARA、TET或Texas red；非共价标记染料可为：SYBR系列、Cyanine系列、SYTOX系列、Thiazole系列或溴乙锭。
本发明具有如下优点：
1.本发明将在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离结合在同一微流控芯片，该微流控芯片设计灵活、加工简单。
2.操作简便，灵敏度高。采用本发明电泳快速分离的分析方法，整个分析过程时间小于500秒，灵敏度比常规的十字进样方法提高。
3.适用广泛。本发明适用于扩增和非扩增产物，包括基因组DNA、各种体液中的DNA，合成DNA以及PCR扩增产物。由于DNA研究广泛用于临床和生物医学研究，因此本发明具有广阔的实用范围，至少包括各种基于PCR的检测、各种基于杂交的生物样品中特定DNA片段的检测以及基因组DNA的分析。
4.本发明芯片包括两个基本功能单元构成：一是DNA的在线电泳预浓缩，二是DNA浓缩后的电泳分离分析。所有在线电泳预浓缩以及分离分析步骤通过自动的电极切换来控制，该集成式微流控芯片增加了样品进样量，在预浓缩过程使用不连续电泳缓冲液完成等速电泳预浓缩过程，在显著改善了检测灵敏度的同时不损失分离度。
附图说明：
图1为本发明集成微流控芯片结构图；
图2为本发明等速电泳在线预浓缩-无胶筛分分离DNA的分析步骤图；
图3为本发明无胶筛分分离DNA的电泳图谱(微流控芯片分析样品为：PCR产物所标注数字为：DNA样品的碱基对数目)；
图4为本发明等速电泳在线预浓缩-无胶筛分分离和单纯无胶筛分分离DNA的电泳比较图谱(图中所标注数字为DNA标准样品的碱基对数目)；
图5为本发明连续5次运行谱图；
图中标号为：1.前导缓冲液池，2.样品废液池，3.样品池，4.尾随缓冲液池，5.缓冲液废液池，6.分离检测点，7.预浓缩检测点。
具体实施方式
本发明DNA在线分离的微流控芯片可以获得较长的有效样品区带，具体结构形式如附图1所示；整个在线电泳预浓缩分离分析过程用电极进行自动控制，其中不存在人为干扰。供DNA分析用微流控芯片材料可以为石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；内表面可以是修饰或未修饰过的：
(1)对于石英、玻璃芯片选用静态修饰、动态修饰对芯片进行预处理(本领域中采用的常规方法)：
静态修饰方法为：通过偶联剂将有机聚合物、DNA键合在微流控芯片通道的表面，有机聚合物是聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖，DNA是牛血清白蛋白。
动态修饰方法为：在缓冲液中加入以表面活性剂为主要成分的添加剂，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。
(2)对于塑料芯片可以修饰(本领域中采用的常规方法)或不修饰。
塑料芯片表面修饰选用化学、物理两大类方法：物理方法是等离子体处理、光照射处理；化学方法是亲水、疏水性处理的。
对于石英、玻璃芯片，其内表面采用静态修饰，通过偶联剂将有机聚合物键合在微流控芯片通道的表面；对于塑料芯片，其内表面采用注塑过程化学物质添加方法进行表面修饰。
DNA在线分离微流控芯片的微流分析方法：DNA的在线电泳预浓缩方法包括：场放大进样、样品堆积、等速电泳；
DNA预浓缩后的电泳分离方法包括：区带电泳法、胶束电动色谱法、毛细管筛分电泳法、毛细管等电聚焦。
本发明DNA的在线电泳预浓缩方法是：等速电泳；DNA预浓缩后的电泳分离方法是：毛细管筛分电泳。
等速电泳过程使用不连续电泳缓冲液。前导离子可以是氯离子，磷酸根离子，硼酸根离子等阴离子，尾随离子可以是3-(N-吗啡啉)丙磺酸、N-(乙-羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸等阴离子；无胶筛分的筛分介质为各种形式的高分子化合物，如羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、琼脂糖等。
本发明前导离子为氯离子，尾随离子为N-(乙-羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES).筛分介质为羟丙基甲基纤维素.DNA用荧光染料FITC或SYBRGreen进行标记，浓缩分离后用激光诱导荧光检测。
用荧光染料对DNA进行标记，所用荧光染料是共价标记染料、非共价标记染料：
DNA共价标记的荧光染料选自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、罗丹明系列、Alexa Fluor系列、DABCYL、HEX、JOX、NAP、Oregon Green488、Pyrene、ROX、TAMARA、TET和Texas red；
DNA非共价标记的荧光染料选自SYBR系列、Cyanine系列、SYTOX系列、Thiazole系列和溴乙锭。
DNA在线电泳预浓缩-电泳分离分析集成微流控芯片按图1所示，材料为石英、玻璃、不同的有机材料如PMMA、PDMS等。图1中1至5号孔分别用以加载前导缓冲液、样品废液、样品、尾随缓冲液和缓冲液废液。
集成微流控芯片的通道内充满无胶筛分分离缓冲液，而在1通道内充满尾随电解质，在1和4通道之间形成一个不同电泳淌度电解质的界面，DNA样品进样后进行等速电泳浓缩，浓缩后实现无胶筛分分离。在分离通道内进行DNA的分离分析，需要进行各种形式的表面修饰，以防止DNA在通道内壁的吸附。修饰过程可以是任何形式的物理或者化学修饰。对于石英和玻璃芯片修饰方法主要有静态和动态两种修饰方法，静态修饰通常是指将一些有机聚合物或者某些DNA通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等。动态修饰重要是指在缓冲液中加一些添加剂，主要是一些表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂等。对于塑料芯片的表面修饰，主要是物理或者化学方法，物理方法有等离子体处理、光照射处理等，化学方法主要是根据材料的不同对通道表面进行亲水或者疏水性处理。
分离步骤如图2所示：
i进样：3号电极接地，2号电极输出；
ii尾随电介质灌注：4号电极接地，2号电极输出；
iii样品浓缩：4号电极接地，1号电极输出；
iv分离：1号电极接地，5号电极输出；
实施例1
集成式微流控芯片(参见图1)由前导缓冲液池1、样品池3、缓冲液废液池5以及贴近于缓冲液废液池5内侧设置的分离检测点6组成，在样品池3外侧设置有尾随缓冲液池4；前导缓冲液1设置于样品池3和缓冲液废液池5；于前导缓冲液池1的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点7。
在尾随缓冲液池4和前导缓冲液1之间设置有样品废液池2。
所述样品废液池2和样品池3之间的有效样品区域为20cm。
当样品废液池2处于样品池3和前导缓冲液1之间时，前导缓冲液1和样品废液池2之间有效区域为15cm；
所述各盛液池与自动电机相连，所有在线电泳预浓缩分离分析步骤通过常规自动的电极切换来控制。所用集成微流控芯片以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，管道尺寸为80μm×30μm，管道用线性聚丙烯酰胺进行修饰。
DNA在线分离的微流分析方法：
1)前导缓冲液1加入前导缓冲液，施加正压使前导缓冲液充满通道所有区域，之后在样品池3中加入样品，在尾随缓冲液池4中加入尾随缓冲液，在前导缓冲液1和缓冲液废液池5加入前导缓冲液；
2)当电压加于样品废液池2和样品池3之间时，在样品废液池2和样品池3之间注入所要分析的样品；
3)当电压加于样品池3和尾随缓冲液池4之间时，在样品池3和尾随缓冲液池4之间注入尾随缓冲液；
4)当电压加于前导缓冲液1和尾随缓冲液池4之间时，此时尾随缓冲液池4接地，前导缓冲液池1接高压(电压为500伏)，使前导离子、样品、尾随离子沿通道迁移，由于前导液中的阴离子和尾随液中的阴离子的迁移速度分别快于和慢于样品中的阴离子，使样品在前导缓冲液池1和尾随缓冲液池4之间的通道内被浓缩，此时通过预浓缩检测点7即可以检测到样品，完成样品浓缩。
5)最后是分离，前导缓冲液池1接地，缓冲液废液池5接高压，这时前导缓冲液池1和缓冲液废液池5之间的通道内均为前导缓冲液，DNA样片在分离缓冲液中依据片段大小而得到分离。此时通过分离检测点6即可以检测到样品(参见图3分离DNA电泳图)；所述分离过程使用激光诱导荧光对样品进行检测。
所述前导缓冲液成分为：15mM HCL/36mM咪唑，pH值7.0，并含有1μmol/L SYBR Green作为插入式标记染料和2％HPMC作为筛分介质，SYBR Green标记染料激光激发波长为473nm，前导离子为氯离子；
尾随缓冲液成份为20mM HEPES/40mM咪唑，pH值7.2，尾随离子为HEPES；
样品为：一个120碱基对的PCR产物，参照为：DNA标准样品，DNA标准样品包含100，250，500，750，1000，2000bp片段。
实施例2
集成式微流控芯片(参见图1)由前导缓冲液池1、样品池3、缓冲液废液池5以及贴近于缓冲液废液池5内侧设置的分离检测点6组成，在样品池3外侧设置有尾随缓冲液池4；前导缓冲液1设置于样品池3和缓冲液废液池5之间；于前导缓冲液池1的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点7。
在尾随缓冲液池4和前导缓冲液1之间设置有样品废液池2。
所述样品废液池2和样品池3之间的有效样品区域为2.2cm。
当样品池3处于样品废液池2和前导缓冲液1之间时，前导缓冲液1和样品池3之间有效区域为3cm。
样品池3处于样品废液池2和前导缓冲液1之间时，样品池3和缓冲液废液池5之间注入前导缓冲液，在样品废液池2和样品池3之间注入所要分析的样品，在样品废液池2和尾随缓冲液池4之间注入尾随缓冲液；
所用微流控芯片为本实验室自行设计，以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，构型如图1所示，通道尺寸为80μm×30μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰。分离缓冲液前导离子为氯离子，尾随离子为N-(乙-羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)。筛分介质为羟丙基甲基纤维素。DNA标准样品为72至1382碱基对的11个片段。作为对照，采用相同通道尺寸的十字架式芯片进行常规的十字进样无胶筛分分离。激光诱导荧光检测，标记DNA的染料是SYBR Green，激光激发波长为473nm，得到的微流控芯片等速电泳浓缩-无胶筛分分离和十字进样无胶筛分分离DNA的电泳比较图谱如图4所示。与传统十字架式芯片相比，该集成式微流控芯片并未因进样量增加而损失分离度，除271/281碱基对片段外，其它片段都达到基线分离，其分离度与十字架式芯片相似。通过表1的计算，与传统十字架式芯片相比，该集成式微流控芯片检测限降低了300倍。
表1有无等速电泳预浓缩微流控芯片检测限的比较
| DNA片段 | 集成等速电泳预浓缩微流控芯片总DNA：2.5pg/μL | 无预浓缩功能微流控芯片总DNA：500pg/μL | ||||
| 浓度pg/μL | 信噪比 | 检测限pg/μL | 浓度pg/μL | 信噪比 | 检测限pg/μL | |
| 72 | 0.03 | 32.33 | 0.003101 | 6.7 | 33.5 | 0.5985 |
| 118 | 0.05 | 73.535 | 0.002235 | 10.9 | 64 | 0.5134 |
| 194 | 0.09 | 165.235 | 0.001635 | 18.0 | 83.5 | 0.6470 |
| 234 | 0.11 | 196.975 | 0.001654 | 21.7 | 91.5 | 0.7122 |
| 310 | 0.14 | 142.155 | 0.003037 | 28.8 | 95.5 | 0.9040 |
| 603 | 0.28 | 479.015 | 0.001753 | 55.9 | 252 | 0.6664 |
| 872 | 0.40 | 807.235 | 0.001504 | 80.9 | 433 | 0.5608 |
| 1078 | 0.50 | 901.405 | 0.001665 | 100.1 | 498 | 0.6028 |
| 1353 | 0.63 | 824.835 | 0.002284 | 125.6 | 567.5 | 0.6639 |
| 平均值 | 0.0021 | 0.6521 | ||||
实施例3
集成微流控芯片(参见图1)由前导缓冲液池1、样品池3、缓冲液废液池5以及贴近于缓冲液废液池5内侧设置的分离检测点6组成，在样品池3外侧设置有尾随缓冲液池4；前导缓冲液1设置于样品池3和缓冲液废液池3；于前导缓冲液池3的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点3。
在尾随缓冲液池4和前导缓冲液1之间设置有样品废液池2。
所述样品废液池2和样品池3之间的有效样品区域为10cm。
当样品废液池2处于样品池3和前导缓冲液1之间时，前导缓冲液1和样品废液池2之间有效区域为7cm；
所用微流控芯片为本实验室自行设计，以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，构型如图1所示，通道尺寸为80μm×30μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰，分离缓冲液前导离子为氯离子，尾随离子为N-(乙-羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)。激光诱导荧光检测，标记DNA的染料是SYBR Green，激光激发波长为473nm。对总DNA含量为2.5pg/μL包含11个片段的标准样品进行连续5次分析，电泳谱图如图5所示。迁移时间的相对标准偏差(RSD)小于3％，峰高相对标准偏差(RSD)小于10％。
Claims (7)
1.一种用于DNA在线预浓缩和分离的微流控芯片，具有前导缓冲液池(1)、样品池(3)、缓冲液废液池(5)以及邻近于缓冲液废液池(5)内侧设置的分离检测点(6)，其特征在于：在样品池(3)外侧设置有尾随缓冲液池(4)；前导缓冲液(1)设置于样品池(3)和缓冲液废液池(5)之间；于前导缓冲液池(1)的延伸通道与分离通道的交叉点处设置有预浓缩检测点(7)。
2.按权利要求1所述的DNA在线分离的微流控芯片，其特征在于：在尾随缓冲液池(4)和前导缓冲液(1)之间设置有样品池(3)和样品废液池(2)。
3.按权利要求2所述的DNA在线分离的微流控芯片，其特征在于：所述样品废液池(2)和样品池(3)之间的有效样品区域为0.5-20cm。
4.按权利要求2所述的DNA在线分离的微流控芯片，其特征在于：当样品废液池(2)处于样品池(3)和前导缓冲液(1)之间时，前导缓冲液(1)和样品废液池(2)之间有效区域为0.5-15cm；
或当样品池(3)处于样品废液池(2)和前导缓冲液(1)之间时，前导缓冲液(1)和样品池(3)之间有效区域为0.5-15cm。
5.一种应用权利要求1所述DNA在线分离微流控芯片的微流分析方法，其特征在于：1)当样品废液池(2)处于样品池(3)和前导缓冲液(1)之间时，样品废液池(2)和缓冲液废液池(5)之间注入前导缓冲液，在样品废液池(2)和样品池(3)之间注入所要分析的样品，在样品池(3)和尾随缓冲液池(4)之间注入尾随缓冲液；
或当样品池(3)处于样品废液池(2)和前导缓冲液(1)之间时，样品池(3)和缓冲液废液池(5)之间注入前导缓冲液，在样品废液池(2)和样品池(3)之间注入所要分析的样品，在样品废液池(2)和尾随缓冲液池(4)之间注入尾随缓冲液；
2)此时尾随缓冲液池(4)接地，前导缓冲液池(1)接高压，使前导离子、样品、尾随离子沿通道迁移，此时通过预浓缩检测点(7)即可以检测到样品，完成样品浓缩；最后分离，前导缓冲液池(1)接地，缓冲液废液池(5)接高压，此时通过分离检测点(6)即可以检测到样品。
6.按权利要求5所述的微流分析方法，其特征在于：所述各盛液池与电极相连，所有在线电泳预浓缩分离分析步骤通过常规自动的电极切换来控制。
7.按权利要求5所述的微流分析方法，其特征在于：样品预浓缩-分离过程使用包括前导缓冲液和尾随缓冲液的不连续缓冲液体系；前导缓冲液位于样品区带之前，其中的阴离子迁移速率高于DNA样品中所有组份；尾随缓冲液位于样品区带之后，其中的阴离子迁移速率低于DNA样品中所有组份。
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