CN101144085A - 蒽环类抗生素产生菌dnrX基因片段及由其制得的基因阻断工程菌和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于蒽环类抗生素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的dnrX基因的部分基因dnrX′、以及dnrX′的基因片段dnrX″的核苷酸序列，以及含有这些序列的表达载体。本发明还公开了一种利用这些表达载体通过交换和同源重组方法阻断了dnrX基因的天蓝淡红链霉菌的基因阻断工程菌。该基因阻断工程菌用于生产蒽环类抗生素时，无需酸化处理，并可以产生野生菌不能产生的阿霉素，且可大大提高阿霉素及柔红霉素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种蒽环类抗生素产生菌dnrX基因片段、以及由该基因片段制得的基因阻断工程菌和其应用。
背景技术
蒽环类抗生素，如柔红霉素(DNR)和阿霉素(DXR)在临床上作为一线抗肿瘤药物使用，阿霉素是柔红霉素C-14位羟化的衍生产物，比柔红霉素抗肿瘤谱更广，毒副作用更低。目前工业上采用化学半合成法生产阿霉素，从由微生物产生的柔红霉素出发经过七步反应获得阿霉素。工艺复杂、转化率低，而且造成环境污染。
国外对柔红霉素产生菌生物合成途径的研究表明，在柔红霉素和阿霉素的生物合成中，dnrX基因位于上游推测的聚酮生物合成酶基因dpsY和下游自身抗性基因drrD之间。DnrX蛋白的具体功能尚不完全清楚，但会将DNR和DXR进一步代谢生成未知的产物，而这些产物中的一部分经过酸化会重新水解成这两种产物。有报道称波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC29050中dnrX基因的阻断突变会导致DXR产量增加3倍。
然而，是否所有的蒽环类抗生素产生菌，特别是不同属的链霉菌是否也有类似现象，还需进一步试验证明。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是上述课题，提供一种蒽环类抗生素产生菌——天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)dnrX基因的部分基因，构建了含有这些基因序列的表达载体，并提供了一种利用这些表达载体通过交换和同源重组方法阻断了dnrX基因的天蓝淡红链霉菌的基因阻断工程菌。
本发明根据GenBank中已经公布的波赛链霉菌(S.peucetius)ATCC29050菌株dnrX基因的序列(登录号为AF048833)，设计了PCR扩增引物，从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)SIPI-1482中扩增出不完整的dnrX基因1080bp的序列，简称为部分基因dnrX′，测定的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，与Genbank报道的S.peu ATCC29050来源的dnrX基因进行序列比对(如图3所示)，S.peu ATCC29050中dnrX基因的相应片断与本发明部分基因dnrX′的序列同源性为94.8％，距离起始密码和终止密码各63bp和69bp。该基因dnrX′编码的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供含有上述部分基因dnrX′的核苷酸序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的dnrX′基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)等，但不是仅限于这些载体。
较佳地，是将dnrX′基因的核苷酸序列与载体pUCm-T连接构建质粒pYG957。
更佳地，为更好地阻断dnrX基因，将含有上述部分基因dnrX′的核苷酸序列的表达载体用Nco I单酶切，回收大片段自身连接，得到中间载体，其中含有部分基因dnrX′的基因片段dnrX″。例如将质粒pYG957单酶切后自身连接得到质粒pYG962，对含有的基因片段dnrX″进行测序，得到的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，其相应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
本发明还构建了含有基因片段dnrX″的核苷酸序列的表达载体，用于破坏dnrX基因的交换阻断突变载体。为便于筛选，该表达载体还本身带有或引入筛选标记，比如抗生素抗性，如安普霉素抗性(apr)、硫链丝菌素抗性(tsr)、红霉素抗性(erm)、潮霉素抗性(hyg)、紫霉素抗性(vph)基因等。在本发明一较佳实施例中，将上述基因片段dnrX″与安普霉素抗性基因的核苷酸序列连接于质粒pBlu2KSM得到阻断突变载体质粒pYG963。
而本发明的蒽环类抗生素产生菌天蓝淡红链霉菌的基因阻断工程菌，可以是通过同源重组方法将该天蓝淡红链霉菌野生菌的dnrX基因，由含有上述部分基因dnrX′或其基因片段，如dnrX″的表达载体交换阻断而制得。
所述含有dnrX″的表达载体优选阻断突变载体质粒pYG963。本发明可通过将pYG963的DNA按常规碱变性方法预处理后，转化现有天蓝淡红链霉菌野生菌，如SIPI-1482原生质体进行同源重组，经单交换使环形质粒整合到染色体上，使原来的dnrX基因缺失了部分碱基，从而丧失了DnrX蛋白的功能，双交换阻断突变会发生两次交换，用含有抗性基因的加长片段替代原来基因组DNA中dnrX基因，而成功发生交换的工程菌具有安普霉素抗性，可以通过安普霉素抗性筛选转化子。本发明通过pYG963单交换得到了dnrX基因的基因阻断菌SIPI-1482-Q1。
将本发明的基因阻断工程菌SIPI-1482-Q1用于生产蒽环类抗生素时，无需酸化处理，而且出乎意料地可以产生野生菌SIPI-1482不能产生的阿霉素，且较野生菌大大提高了柔红霉素的产量。
附图说明
图1为质粒pYG957的构建示意图。
图2为质粒pYG957酶切验证电泳图谱，其中，1：pYG957EcoRI酶切后；2：pYG957SalI酶切后；M：DL2000标记。
图3为波赛链霉菌(S.peucetius)ATCC29050来源的dnrX基因[dnrX(S.peu)]与本发明dnrX′基因序列[dnrX(SIPI-1482PCR)]的比对图。
图4为质粒pYG962的构建示意图。
图5为pYG962酶切验证电泳图谱，其中，1：pYG957；2：pYG962；M：DL2000标记。
图6为质粒pYG963的构建示意图。
图7为质粒pYG963的PCR验证(A)和酶切验证(B)，其中，1～2：pYG957和pYG963作为模板；3：pYG963用Sal I进行酶切；M：标记。
图8为pYG963单交换原理示意图。
图9为本发明阻断突变工程菌株PCR验证图，其中1、3和4：突变株基因组DNA为模板，2、5和6：质粒pYG963为模板，7and8：SIPI-1482基因组DNA为模板；1-2and7：dnrX1+apr1为引物，3、5and8：apr1+apr2为引物，4and6：dnrX1+dnrX2为引物，M：DL2000标记。
图10A为野生菌SIPI-1482发酵产物未酸化样品HPLC图谱，图10B为野生菌SIPI-1482发酵产物酸化样品HPLC图谱，图10C为基因阻断菌SIPI-1482-Q1发酵产物未酸化样品HPLC图谱，图10D为基因阻断菌SIPI-1482-Q1发酵产物酸化样品HPLC图谱，图10E为柔红霉素和阿霉素标准品HPLC图谱。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
下列实施例中的材料为：
所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。
下面的质粒和大肠杆菌株用于DNA文库构建和基因克隆：
pUCm-T、pBlu2KSM(分别可购自生工和Stratagene)，
大肠杆菌E.coliDH5a(Hanahan D.J.Mol.Biol.，1983，166，557-580)。
天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)SIPI-1482(中国医药工业杂志，2000，31(5)：200)，可从上海医药工业研究院获得。
实施例1PCR扩增dnrX′基因
由于GenBank中只发表了来源于柔红霉素产生菌波赛链霉菌ATCC29050的dnrX基因序列(登录号为AF048833)，而且终密码外侧的基因序列无相关报道。鉴于扩增该基因目的是阻断突变，可以扩增不完整的基因。由此设计了引物dnrX1和dnrX2。
dnrX1序列：5’-GGCCGCCAGCCGCTGTCCGA-3’(SEQ ID No.5)
dnrX2序列：5’-GTGGTTCCAGGCGAAGAGCAGCGCATAGTC-3’(SEQ ID No.6)
以天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)SIPI-1482基因组为模板进行PCR扩增，反应体系如表1所示：
表1PCR反应体系组成
| 组分 | 终浓度 | 用量(μl) |
| 10×反应缓冲液MgCl2(15mmol/L)5’-引物(10μmol/L)3’-引物(10μmol/L)模板DNA(100μg/ml)dNTP(10mmol/L each)DMSOTaq DNA聚合酶(3U/μl)dd H2O总量 | 1×0.2μmol/L0.2μmol/L100ng0.2mmol/L5％3U | 2.00.40.41.00.41.01.013.820.0 |
反应条件为：97℃预变性5min，95℃变性0.5min，60℃退火1min，72℃延伸1min，总共循环运行30次，最后于72℃延伸10min。扩增出和目的扩增片断大小相近大于1kb的条带。
将从SIPI-1482中扩增出的PCR产物回收，与载体pUCm-T连接后转化DH5a感受态细胞，构建质粒pYG957(如图1所示)，在含IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)+X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)+Amp(氨苄青霉素)的LB平板(LB固体培养基灭菌后加入Amp至终浓度为100μg/ml，并倒平板，待培养基凝固后在表面涂布40μl20％X-Gal和7μl20％IPTG)上随机挑取阳性的白色单菌落，提取质粒并进行酶切电泳鉴定，结果如图2所示。将含有正确质粒的转化子交英骏公司测序。英骏公司对SIPI-1482的扩增片段采用T7启动子引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)测序一个反应，获得完整的扩增片段序列，整个片段长度为1,080bp，其序列如序列表中SEQID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
将从PCR扩增到的序列的测序结果和Genbank报道的S.peu ATCC29050来源的dnrX基因进行序列比对(如图3)，发现以上述引物只扩增得到1080bp的片段，是dnrX基因的部分序列，故称为部分基因dnrX′。S.peuATCC29050中dnrX基因的相应片断与部分基因dnrX′的序列同源性为94.8％，距离起始密码和终止密码各63bp和69bp。
实施例2dnrX′的基因片段dnrX″的制备及测序
将质粒pYG957用Nco I单酶切，回收大片段自身连接，转化DH5α感受态细胞，构建中间质粒pYG962(如图4所示)。将中间质粒pYG962进行Kpn I和HindIII双酶切验证，以pYG957用KpnI和HindIII双酶切结果为对照。如图5所示，pYG962双酶切得到1203bp和2651bp的两条带，pYG957双酶切得到1080bp和2651bp两条带，二者正好相差Nco I酶切位点之间的123bp，与预期结果相符，证明质粒正确。
再从质粒pYG962中用KpnI+HindIII酶切得到dnrX″，测得的序列如序列表中SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例3破坏dnrX用单交换阻断突变质粒pYG963的构建和验证
将从质粒pYG962中用KpnI+HindIII酶切得到的dnrX″基因片段以及安普霉素抗性基因apr(GenBank登录号：AJ566337，由英骏公司商业合成)连接于载体pBluescript2KSM并构建成重组质粒pYG963(如图6所示)，转化DH5α感受态细胞，以安普霉素和氨苄青霉素抗性筛选转化子。提取质粒进行PCR验证和酶切验证，如图7所示。以dnrX1和dnrX2为引物PCR，以质粒pYG957为模板能够扩增到dnrX基因的部分基因dnrX′(1080bp)，而以pYG963则不能，如图7(A)所示，与预期结果相符。用原载体和插入片断上共有的酶切位点Sal I进行pYG963酶切验证，得到4689bp和617bp的条带如图7(B)，与预期结果相符，验证通过。
实施例4dnrX基因阻断突变工程菌的构建
对pYG963DNA进行如下前处理：
(1)将在DH5α中构建的敲除质粒pYG963转化大肠杆菌JM110去甲基化修饰，
(2)提取质粒，用适量的TE缓冲液溶解，
(3)取10μl质粒DNA加水稀释至100μl，加入等体积0.4mol/L的NaOH溶液，37℃保温10min，碱变性单链化，冰浴1min，
(4)加入1/10体积的pH4.8的3mol/L的NaAc溶液和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min，
(5)离心弃上清，沉淀用适量70％乙醇洗涤，回收DNA。
按上述方法对阻断突变质粒pYG963DNA进行预处理，并转化SIPI-1482原生质体进行同源重组。单交换阻断突变原理如图8。通过同源重组和单交换使环形质粒整合到染色体上，使原来的dnrX基因缺失了部分碱基，成功发生交换的工程菌具有安普霉素抗性，可以通过安普霉素抗性筛选转化子(重组子)。
在含有安普霉素(30μg/ml)的再生平板上挑选重组子。重组子传斜面后取孢子接种YEME培养基，30℃培养2天，提取基因组DNA进行PCR验证。如图9所示，以上述dnrX1和dnrX2为引物，以重组子基因组DNA为模板能够扩增到部分基因dnrX′序列(1080bp)，而以质粒pYG963为模板不能扩增到；以apr1(5’-GATGCAGGAAGATCAACG-3’)和apr2(5’-AGGTCTGGACGACGAGC-3’)为引物，以重组子基因组DNA和质粒pYG963为模板，均能够扩增到533bp的安普霉素抗性基因apr的部分序列，而以野生菌S.coeruleorubidus SIPI-1482基因组DNA为模板不能扩增到；以dnrX1和apr1为引物，以重组子基因组DNA为模板，能够扩增到dnrX′+apr的加长片段，而质粒pYG963和SIPI-1482基因组DNA都不能扩增到。这些结果均与预期相符，证明已经发生同源重组。通过pYG963单交换得到dnrX基因的阻断突变株命名为SIPI-1482-Q1。
实施例5dnrX基因阻断突变工程菌发酵试验
将上述重组子，即dnrX阻断突变株SIPI-1482-Q1和SIPI-1482野生菌株的斜面孢子分别接种至种子及发酵培养基(参见蒋世春等，中国抗生素杂志，2000，25(6)：409-411)中，28℃，230r/min培养两天后10％转接发酵培养基。相同条件培养5天后，放瓶提取产物(参见叶逢春等，中国医药工业杂志，1996，27(7)：293-294)。HPLC分析方法中流动相∶甲醇∶水(v/v)＝56∶44，含1％的冰醋酸，0.3％的三乙胺；样品用孔径0.22μm的偏氟膜过滤；流速：1ml/min，检测波长：254nm。HPLC分析结果显示：如图10A-10D和表2所示，dnrX阻断突变工程菌与野生菌相比发酵结果有以下差别：(1)阻断突变工程菌中紫红霉酮(保留时间35min左右)积累量大大降低；(2)阻断突变工程菌发酵产生原来的野生菌中不能检测到的产物(保留时间6.891min)，经验证该产物为阿霉素(如图10E所示)；(3)野生菌未经酸化的样品中几乎检测不到柔红霉素，阻断突变工程菌样品不经酸化即有大量柔红霉素产生；(4)酸化处理使野生菌柔红霉素的产量大大增加，保留时间21min左右的峰面积减小，但使阻断突变工程菌柔红霉素的产量降低12％，阿霉素产量降低24％，并在8.326min和14.456min各出现一个杂峰，可能是阿霉素和柔红霉素酸化分解的产物。可见，本发明阻断突变工程菌发酵产物中对酸敏感的产物积累量减少，柔红霉素和阿霉素产量大大提高。
表2SIPI-1482和SIPI-1482-Q1的DNR and DXR含量
| 摇瓶号号 | 菌株号 | 特性 | DXR(μg/ml) | DNR(μg/ml) | ||
| 平均 | 平均 | |||||
| 1 | SIPI-1482-Q1 | 未酸化 | 5.598 | 8.257 | 21.240 | 27.315 |
| 2 | 8.127 | 26.284 | ||||
| 3 | 7.707 | 19.905 | ||||
| 4 | 9.767 | 21.770 | ||||
| 5 | 10.633 | 27.866 | ||||
| 6 | 10.265 | 28.339 | ||||
| 7 | 7.840 | 28.293 | ||||
| 8 | 10.642 | 33.151 | ||||
| 9 | 8.843 | 32.612 | ||||
| 10 | 8.146 | 30.285 | ||||
| 11 | 6.971 | 23.635 | ||||
| 12 | 7.039 | 21.851 | ||||
| 13 | 7.601 | 25.259 | ||||
| 14 | 7.761 | 47.860 | ||||
| 15 | 7.456 | 41.079 | ||||
| 16 | 7.717 | 35.909 | ||||
| 17 | SIPI-1482 | 酸化 | 0.018 | 0.088 | 10.095 | 10.944 |
| 18 | 0.023 | 11.618 | ||||
| 19 | 0.222 | 11.118 | ||||
序列表
<110>上海医药工业研究院
<120>葸环类抗生素产生菌dnrX基因片段及由其制得的基因阻断工程菌和应用
<130>061720C
<160>6
<170>PatentIn versiOn 3.3
<210>1
<21l>1080
<212>DNA
<213>天蓝淡红链霉菌(Stl‘eptomyces coeruleorubidus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1080)
<400>1
<210>2
<211>360
<212>PRT
<213>天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)
<400>2
<210> 3
<211> 986
<212> DNA
<213> 天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)
<400> 3
<210> 4
<211> 328
<212> PRT
<213> 天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
Claims (10)
1.一种蒽环类抗生素产生菌dnrX基因的部分基因dnrX′，是下列核苷酸序列之一：
1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；
2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.含有权利要求1所述的部分基因dnrX′的核苷酸序列的表达载体。
3.一种如权利要求1所述的部分基因dnrX′的基因片段dnrX″，是下列核苷酸序列之一：
1)其具有序列表中SEQ ID No.3所示的碱基序列；
2)编码由序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.含有权利要求3所述的基因片段dnrX″的核苷酸序列的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其是将权利要求2所述的表达载体用Nco I单酶切，回收大片段自身连接而成的表达载体。
6.如权利要求4所述的表达载体，其是将权利要求3所述的基因片段dnrX″与安普霉素抗性基因的核苷酸序列连接于质粒pBlu2KSM得到的质粒pYG963。
7.一种蒽环类抗生素产生菌天蓝淡红链霉菌的基因阻断工程菌，其是通过同源重组方法将该天蓝淡红链霉菌野生菌的dnrX基因，由含有如权利要求1所述的部分基因dnrX′或其基因片段的表达载体交换阻断而制得。
8.如权利要求7所述的基因阻断工程菌，其特征在于所述的含有部分基因dnrX′基因片段的表达载体如权利要求4-6任一项所述，其为破坏dnrX基因的单交换阻断突变质粒。
9.如权利要求8所述的基因阻断工程菌，其特征在于所述天蓝淡红链霉菌为天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482菌株，制得的基因阻断工程菌为SIPI-1482-Q1。
10.如权利要求7所述的基因阻断工程菌在制备蒽环类抗生素阿霉素和柔红霉素中的应用。
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