CN101144073A - 一种新型烟叶发酵酶制剂生产方法 - Google Patents
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Abstract
“一种新型烟叶发酵酶制剂生产方法”目的是解决烟叶自然发酵领域中如何改善烟叶发酵品质及实现烟叶发酵酶制剂活性保护技术问题。该酶制剂由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱降解酶组成。新鲜烟叶经细胞破碎后,先用(NH4)2SO4进行二次分级沉淀获得粗酶液,酶分子采用Ca2+和Mg2+进行金属离子置换,完成分子修饰;大分子结合修饰采用0.01%蔗糖低聚物完成,由此延长酶制剂的半衰期及显著提高其耐高温能力。该酶制剂施用的试验结果表明,烟碱下降9.3%,总氮下降5.7%,蛋白质下降7.1%;烟气总粒相物下降8.4%,焦油量下降5.1%,烟气烟碱量下降28.0%,一氧化碳下降1.6%。该酶制剂在烟叶打叶复烤前的二润时施用。
Description
技术领域
烟叶自然发酵。
背景技术
在烟叶调制过程中,对经初烤和复烤后的烟叶在合适的温度和湿度条件下进行充分的发酵是提高和改善烟叶品质极为重要的技术环节。因此,对发酵机理的研究多年来一直是国内外相关学者和卷烟生产商们关注的焦点。其中一个重要研究领域就是烟叶发酵的酶机理的阐释和应用。早在1950年(Frankenburg,W. G)就有学者提出了烟叶发酵由酶催化的理论框架。随着研究的深入和积累,现在普遍认为烟叶本身所含的氧化还原酶类主导发酵作用,而且这种发酵过程是多种酶联合作用的结果,从而促使底物向多种香气物质成分的有效转化。这些酶促反应过程主要包括以下几个方面:1、萜烯类化合物降解过程。类胡萝卜素是烟叶中最重要的一类萜烯化合物,其是50多种烟叶特有香气成分的前体;2、Mailard反应。该反应过程是还原糖和氨基酸经分子重排后生成56种杂环化合物一类黑素,类黑素的形成使烟叶表现陈烟香气。尽管Mailard反应本身不是由酶催化的反应,但其底物一还原糖和氨基酸是酶促反应的产物。蛋白质在蛋白酶的作用下水解成氨基酸,淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等还原糖。因此,促进多糖和蛋白质的转化将有利于Mailard反应的进行;3、叶绿素的降解反应。烟叶中残存的叶绿素是卷烟制品在吸食过程中产生青杂气的根源,应在调制过程中加以控制。尽管烟叶叶绿素绝大部分已经在烟叶烘烤过程中被降解,但残存的叶绿素仍然会对卷烟制品带来不良影响;4、游离烟碱降解,消除强烈刺激性和不良余味;5、酰胺与易分解氨氮化合物的脱氨挥发作用。烟叶氨氮化合物在发酵过程中脱去氨基生成有机酸和氨气,有机酸积累与氨气自然挥发可提高发酵效果。这五个方面是烟叶发酵过程中主要的酶促反应过程,其它还包括一些小分子物质的缓慢物理挥发过程及次要的烟叶内含物转化反应。然而,烟叶在烘烤过程中的干燥脱水使烟叶内酶群绝大部分失活,因此不利于上述酶促反应的进行。基于这些认识,在烟叶发酵过程中添加专一性酶系或复合酶种促进烟叶发酵、加速烟叶内含物转化已经成为增加烟叶香气、加速发酵过程的一条途径。
张立昌报道了一种适合在打叶复烤时添加的酶制剂,对自然醇化和人工发酵烟叶的质量有明显的改善作用。该酶制剂可明显增加卷烟香气,减轻青杂气和刺激性,改善卷烟吸味品质。赵铭钦等利用4种具有生物活性的α-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的烟草发酵增质剂进行烟叶发酵,试验表明烟叶香气质改善、香气量增加、烟叶固有杂气和刺激性减轻,烟叶内部的糖、氮、碱等主要化学成分及其比值趋于协调、平衡。在这些研究过程中所用的酶主要为糖化酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶。
阮祥稳等申请的中国专利CN200510042773.7公开了一种由多种外源生物酶(纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉组成的复合酶制剂,其特征在于多种生物酶及酵母粉按照特定的比例直接进行组配。专利CN03114578.7公开了由纤维素酶、蛋白酶、转化酶、麦芽糖酶、溶菌酶组成的酶制剂。专利CN87101362.2公开了由纤维素酶、果胶酶、木质酶及蛋白酶的多种酶系的微生物复合酶。
以上文献和专利的一个共同特征是直接采用外源(微)生物酶经特定比例混合后直接进行手工操作施用,对如何保护酶活性及如何满足卷烟企业批量生产的要求没有进行描述。
发明内容
本发明提出一种烟叶发酵酶制剂的制备及生产工艺。该酶制剂的复合酶群来自于新鲜烟叶,经组织匀浆、酶群纯化、辅基置换分子修饰及蔗糖低聚物保护后得到由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱降解酶五类酶组成的复合酶制剂。具体生产工艺如下(图1):
1、取鲜活烟叶或顶权破碎细胞,测其体积,加缓冲液A(体积比V汁液∶V缓冲液=1∶9);
2、于4℃,2600g离心20min,取上清液并测体积,缓慢加入(NH4)2SO4(144g/L)至含25%(NH4)2SO4(W/V);
3、4 ℃缓慢混合30min,4℃15000g离心40min;
4、取上清液并测体积,加入(NH4)2SO4(390g/L)至含80%(NH4)2SO4(W/V);
5、缓慢混合2h或过夜,4℃15000g离心2h,收集沉淀,加缓冲液A至沉淀充分溶解;
6、试液按1∶0.1体积比加入缓冲液B于4℃沉淀20min,8000g离心10min,获上清,弃沉淀;
7、等体积加入0.1%EDTA缓冲液(pH8.0),于1-5℃进行10-20min螯合,过滤弃沉淀;
8、上清液按1∶0.001体积比先后加入0.3%Ca(NO3)2·4H2O和MgSO4溶液,充分混匀,于1-5℃冷室静置8-12hr或过夜;
9、按1∶0.01体积比加入0.01%蔗糖低聚物溶液,于1-5℃静置10-15hr;
10、溶液样品于-8℃干燥浓缩至原体积的1/8时停止,4℃解冻分装。
缓冲液A
0.1M Tris-HCLpH7.7,0.1M PMSF
缓冲液B
0.1M Tris-HCL,pH7.7,0.1%EDTA(W/W)
成品酶制剂在施用前用水稀释至0.4%,于打叶复烤前的二润时均匀喷施,用量200ml/50kg烟叶。见图2。
酶制剂总蛋白含量与酶比活力测定
酶制剂产品总蛋白含量采用菲林一酚测定法,定义为每100毫升酶制剂中的蛋白含量(mg/100ml);五种酶的比活力采用分光光度法进行定量。酶比活力定义为每毫升酶制剂中酶的单位量(U/ml)。测定结果表1:
表1酶制剂蛋白含量与酶比活力
样品编号 | 总蛋白(mg/100ml) | 酶比活力(U/ml) | ||||
葡萄糖氧化酶 | 叶绿素氧化酶 | 类胡萝卜素氧化酶 | 蛋白酶 | 烟碱降解酶 | ||
1 | 53 | 12168 | 382 | 258 | 31680 | 219 |
2 | 4.8 | 10298 | 298 | 196 | 34260 | 187 |
3 | 5.5 | 9846 | 368 | 210 | 41058 | 156 |
4 | 6.0 | 15830 | 420 | 284 | 38721 | 192 |
5 | 4.6 | 13630 | 376 | 21 1 | 35834 | 176 |
平均 | 5.24±0.6 | 12354.4±2462.9 | 368.8±44.3 | 231.8±37.4 | 36310.6±3681.8 | 186.0±23.1 |
分子修饰与低聚物保护对酶活性的影响
与现有烟叶发酵酶制剂相比,经分子修饰和低聚物保护的新型烟叶发酵酶制剂具有一定耐复烤线高温特性,有效保护酶活性,极大改善酶制剂应用效果。
为比较天然酶(不经Ca(NO3)2·4H2O和MgSO4与0.01%蔗糖低聚物修饰和保护)与修饰酶活力特性,特进行如下试验:
将酶制剂产品用缓冲液B稀释9倍后精确量取1ml,盛于1.5ml离心管,取1ml发明内容中1~6步得到的天然酶群溶液,盛于1.5ml离心管,两管同时于75℃水浴锅中温浴15min,相应的对照样品置-20℃冰箱,5次重复。测定比较不同酶种酶活,结果见表2。
表2酶制剂修饰酶与天然酶热稳定性对比
酶种 | 残留酶活(%) | |
天然酶 | 修饰酶 | |
葡萄糖氧化酶 | 0±0.0 | 0±10.6 |
叶绿素氧化酶 | 20±8.2 | 80±14.8 |
类胡萝卜素氧化酶 | 41±12.5 | 82±10.2 |
蛋白酶 | 50±18.3 | 100±2.5 |
烟碱降解酶 | 25±6.4 | 74±8.1 |
表2显示,经辅基置换与蔗糖低聚物保护后可显著提高酶群的热稳定性,酶活损失均低于30%,具有满足烟叶发酵工业化生产的需求。
烟叶发酵酶制剂的特点与效果
该技术工艺满足了烟叶打叶复烤线的自动化要求,即酶群在二润回湿的高温条件下(75-80℃)酶活性的保持,从而保证酶群在烟叶发酵过程中切实发挥催化作用,加快底物转化。因此,该酶制剂可提高烟叶的可用性与安全性,增加烟叶纯正天然烟香,缩短发酵周期,改善烟叶品质。
与现有酶制剂相比,用本技术工艺生产的新型烟叶发酵酶制剂具有耐复烤线高温特性、加快底物转化、缩短自然发酵时间、提高烟叶品质的特点。具体表现如下:
1、耐高温。即使经受80℃叶面温度10-15min仍能保持酶活性;
2、施用方便,满足卷烟企业自动化的要求;
3、安全性高。所有酶种都来自于新鲜烟叶,在吸食安全性上有绝对保障;
4、降解烟叶残存叶绿素,消除青杂气;
5、催化分解烟叶内部萜烯类化合物,为香气物质的产生提供前体,达到增强烟叶天然香气,发挥烟叶潜在品质;
6、加速烟叶发酵的酸化过程。一般降低pH值一个单位;
7、加快氨氮化合物脱氨挥发,降低烟叶总氮含量,减少刺激性,改善吃味;
8、促进游离烟碱分解,提高烟叶食用安全性,协调化学组分;
9、缩短自然发酵时间5-6倍。常规2-3年缩短为夏季100-150天,冬季150-200天。
10、高回报率。每公斤烟叶施用量4ml(0.4%),成本约合0.40元,一般提高烟叶等级一个级,按市场价值计算增值2.0元,利润率为80%。
实施方式(见图3)
1、选取玉溪红塔地区有代表性的云85上部初烤烟叶B2F;
2、按照酶制剂说明配制0.4%溶液,常温条件下均匀喷施B2F烟样,置温度28℃,相对湿度65%下醇化;(A)
3、模拟复烤工艺条件(75±5℃),按1的方法处理烟样,分别存放于28℃(B1)和38℃(B2),相对湿度65%条件下进行醇化;
4、60天后对(A)、(B1)和(B2)烟样进行专业评吸、吸烟机分析与常规化学分析;
5、应用MATLAB统计分析软件进行数据分析。
感官评吸结果表明,(A)方法处理对烟叶品质有较明显改善,表现为劲头、刺激性减弱,香气质、口感得到改善;(B)方法主要表现与(A)类似,对香韵、香气质改善较明显,刺激有所减弱。三种处理方法差别不明显,说明该酶制剂能较好的保持高温条件下的酶活性(表3、4、5)。
表3酶制剂处理烟样评吸结果
等级 | 编号 | 香韵 | 香气量 | 香气质 | 浓度 | 刺激 | 劲头 | 杂气 | 干净度 | 湿润度 | 回味 | 合计 |
B2F | 对照CKA1 | 7.67 | 12 | 12.33 | 7.5 | 12.58 | 4.5 | 7.33 | 7.33 | 3.33 | 3.58 | 78.15 |
B2F | 7-A1 | 7.7 | 12.3 | 12.2 | 7.7 | 12.2 | 4.33 | 7.5 | 7.4 | 3.6 | 3.4 | 78.33 |
B2F | 对照CKB1 | 7.4 | 12.3 | 12.1 | 7.5 | 12.6 | 4.5 | 7.3 | 7.6 | 3.6 | 3.3 | 78.2 |
B2F | 7-B1 | 7.5 | 12.4 | 12.4 | 7.6 | 12.8 | 4.4 | 7.5 | 7.3 | 3.9 | 3.7 | 79.5 |
B2F | 对照CKB2 | 7.5 | 12 | 11.8 | 7.7 | 12.5 | 4.7 | 7.5 | 7.7 | 3.8 | 3.7 | 78.9 |
B2F | 7-B2 | 7.6 | 12 | 12.2 | 7.7 | 2.4 | 4.7 | 7.5 | 7.5 | 3.8 | 3.6 | 79 |
吸烟机分析结果显示烟气总粒相物平均下降了8.4%,焦油量下降了5.1%,烟气烟碱量下降了28.0%,一氧化碳下降了1.6%,十分有利于卷烟产品降焦减害(表4)。
表4吸烟机烟气分析结果
等级 | 编号 | 平均重量(g/支) | 燃吸口数(口) | 总粒相物(mg) | 焦油量(mg) | 烟气碱量(mg) | —氧化碳(mg) |
B2F | 对照CKA1 | 1.06 | 10.6 | 19.76 | 14.85 | 2.40 | 14.8 |
B2F | 7-A1 | 1.04 | 10.7 | 18.20 | 14.30 | 1.86 | 14.5 |
B2F | 对照CKB1 | 1.04 | 11.2 | 19.96 | 15.0 | 2.32 | 14.9 |
B2F | 7-B1 | 1.04 | 10 6 | 18.22 | 14.0 | 1.84 | 14.7 |
B2F | 对照CKB2 | 1.05 | 11 | 19.66 | 15.0 | 2.32 | 15.6 |
B2F | 7-B2 | 1.02 | 11 | 18.38 | 14.4 | 1.80 | 15.4 |
常规化学成分分析表明,烟碱下降9.3%,总氮下降5.7%,蛋白质下降7.1%,烟叶的化学成分协调(表5)。
表5烟叶常规分析部分结果
等级 | 编号 | 总糖量 | 还原糖 | 烟碱量 | 总氮量 | 烟碱氮 | 蛋白质 | 氮碱比 |
B2F | 对照CKA1 | 29.7 | 24.35 | 4.19 | 2.62 | 0.29 | 6 | 0.94 |
B2F | 7-A1 | 24.54 | 22.77 | 3.72 | 2.46 | 0.24 | 5.62 | 0.99 |
B2F | 对照CKB1 | 29.18 | 26.37 | .23 | 2.56 | 0.31 | 5.9 | 0.92 |
B2F | 7-B1 | 26.41 | 25.60 | 3.88 | 2.37 | 0.22 | 5.55 | 0.96 |
B2F | 对照CKB2 | 30.4 | 27.3 | 4.2 | 2.7 | 0.26 | 6.1 | 0.93 |
B2F | 7-B2 | 28.1 | 24.2 | 3.95 | 2.63 | 0.2 | 5.64 | 0.96 |
Claims (4)
1.一种用于烟叶发酵的专用复合酶制剂,该酶制剂由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱降解酶五类酶组成,其各组分的酶活比为:葡萄糖氧化酶12354,叶绿素氧化酶368,类胡萝卜素氧化酶231,蛋白酶36310,烟碱降解酶186;其制备方法如下:选取新鲜烟叶,组织匀浆,酶群经两次(NH4)2SO4分级沉淀纯化后得到粗酶液;该粗酶液用含0.1%EDTA的缓冲液进行酶金属离子螯合,螯合条件pH8.0,1-5℃,螯合时间10-20min;然后用0.3%Ca(NO3)2·4H2O和MgSO4进行离子置换,置换条件按粗酶液:置换溶液1∶0.001体积比反应,1-5℃,置换时间8-12hr或过夜,完成酶分子修饰;经修饰的酶分子,于1-5℃条件下用0.01%蔗糖低聚物进行二次修饰保护,反应时间至少10hr以上;经过这样处理,即可获得所述的用于烟叶发酵的耐高温专用复合酶制剂。
2.权利要求1所述的复合酶制剂的生产方法,其特征在于:该酶制剂由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱降解酶五类酶组成,其各组分的酶活比为:葡萄糖氧化酶12354,叶绿素氧化酶368,类胡萝卜素氧化酶231,蛋白酶36310,烟碱降解酶186;其制备方法如下:选取新鲜烟叶,组织匀浆,酶群经两次(NH4)2SO4分级沉淀纯化后得到粗酶液;将该粗酶液用含0.1%EDTA的缓冲液进行酶金属离子螯合,螯合条件pH8.0,1-5℃,螯合时间10-20min;;然后用0.3%Ca(NO3)2·4H2O和MgSO4进行离子置换,置换条件按粗酶液:置换溶液1∶0.001体积比反应,1-5℃,置换时间8-12hr或过夜,完成酶分子修饰;经修饰的酶分子,于1-5℃条件下用0.01%蔗糖低聚物进行二次修饰保护,反应时间至少10hr以上;经过这样处理,即可获得所述的用于烟叶发酵的耐高温专用复合酶制剂。
3.权利要求1所述复合酶制剂的使用方法是,成品酶制剂在用蒸馏水稀释为0.4%后,在烟叶打叶复烤前进行二润时均匀喷施,用量200ml/50kg烟叶。
4.权利要求1所述复合酶制剂的用途,其特征是,将权利要求1所述复合酶制剂应用于烟叶发酵。
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