CN101138558A - 喷他脒及死亡结构域受体配体联合应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域，特别涉及喷他脒联合死亡结构域受体配体治疗肿瘤及白血病的药物。本发明指的死亡结构域受体配体包括TRAIL，TNF－alpha或其类似物，是与喷他脒或其代谢物或类似物的联合。本发明的有益之处在于：喷他脒可增强白血病细胞对死亡结构域受体配体的敏感性，临床可达治疗药物浓度的喷他脒作用死亡结构域受体配体耐受性白血病细胞后，诱导了细胞凋亡的发生，从而达到治疗白血病目的。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及喷他脒联合死亡结构域受体配体治疗肿瘤及白血病的药物。
技术背景：
白血病属造血系统恶性肿瘤。自1947年首例白血病患者化疗获临床缓解以来，白血病治疗方法已从单纯的化疗方发展为造血干细胞移植，生物治疗(包括细胞因子，免疫治疗等)等多种治疗策略的综合应用，但至今白血病治疗效果仍不理想。因此如何建立新的低毒高效的白血病治疗相关策略仍然是研究者关注的重点。在正常人体造血系统中，细胞生长保持着一种稳态，由细胞增殖与更新和细胞死亡之间的平衡来决定。当这种稳态的失衡被破坏后，人体可发生白血病等相关疾病。为此，白血病治疗策略之一就是特异性诱导白血病细胞凋亡的发生。
细胞凋亡是细胞的一种自杀行为，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡的发生常分为两步，即细胞凋亡的决定和执行。细胞凋亡的决定，主要由Bcl-2家族成员的抗凋亡和促凋亡蛋白表达和功能改变进行。细胞凋亡的执行，主要通过caspases酶活性的级联放大效应水解参与细胞稳态的酶底物如PARP实现。细胞凋亡调控方式同细胞类型相关，因此利用肿瘤细胞凋亡信号途径与正常细胞的差异，可设计出特异性诱导肿瘤细胞凋亡药物。肿瘤坏死因子(TNFs)家族属细胞因子类成员，主要是通过与相应受体相互作用后发挥不同的细胞生物学效应。部分死亡受体家族成员，被命名为死亡受体，蛋白结构上主要含死亡结构域(death domain)，传递细胞死亡信号。如TNF-R1，Fas(CD95)，TRAMP(wsl/Apo-3/DR-3)，TRAIL-R1(DR-4)and TRAIL-R2(DR-5，TRICK2，KILLER)等。由于TNF，Fas ligand or lymphotoxin可导致体内正常组织的急性毒性作用，其潜在的应用价值受到限制。人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand(Apo2L/TRAIL)为TNF超家族成员，在诱导多种组织来源的肿瘤细胞凋亡的同时对体外正常细胞和动物实验的正常组织没有影响。因此，TRAIL被认为是一种理想的抗肿瘤药物。但临床上虽然发现部分肿瘤细胞对TRAIL敏感，但多种造血系统肿瘤，特别是原代培养的白血病细胞对TRAIL诱导细胞凋亡耐受。既往有研究表明化疗药物和放射线作用细胞后可提高白血病细胞对TRAIL的敏感性。另外，报道可抑制NF-.kappa.B化合物具有增强肿瘤细胞TRAIL敏感性作用，如美国专利US6329148中所述的化合物diterpenoid triepoxides。
喷他脒是一种临床抗寄生虫药物。可用与治疗黑热病艾滋病卡式肺囊虫感染等疾病。有报道喷他脒可抑制酪氨酸磷酸酶PRLs酶活性，并在体外可抑制肿瘤细胞增殖。但对喷他脒增强白血病细胞对死亡结构域配体诱导凋亡敏感性的研究尚未见报道以及专利的申请。
发明内容：
本发明的目的是提供喷他脒及死亡结构域受体配体组合的联合应用。
本发明的目的是这样实现的：.喷他脒及死亡结构域受体配体组合在制备治疗白血病药物的联合应用。
本发明的技术方案包括：其中所说的喷他脒是指具有下列结构式I的喷他脒、或其代谢物或类似物
其中Y和Z相互独立，各自为O或N；R11和R12相互独立，各自为H、CI、Br、OH、OCH3、OCF3、NO2及NH2；n是2至6的整数；且R13和R14各自独立选自以下的基团：
本发明的技术方案包括：所指的死亡结构域受体配体是一种可以和动物细胞的死亡结构域受体结合的活性肽片段，以及类似蛋白质。
本发明的技术方案包括：所说的死亡结构域受体配体是人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)多肽，或人肿瘤坏死因子(TNF-alpha)多肽。
本发明的技术方案包括：先给予患者临床可达到的治疗药物剂量的喷他脒20-24小时，再给予临床可达到的治疗药物剂量的死亡结构域受体配体。
本发明的优益之处在于：喷他脒可增强白血病细胞对死亡结构域受体配体的敏感性，临床可达治疗药物浓度的喷他脒作用死亡结构域受体配体耐受性白血病细胞后，诱导了细胞凋亡的发生，从而达到治疗白血病目的。
附图说明
图1白血病细胞生长与喷他脒浓度的关系图；
图210μg/ml喷他脒24小时或200ng/mlTRAIL4小时或先用10μg/ml喷他脒20小时后继用200ng/ml TRAIL 4小时的光镜形态学观察示意图；
图35、10μg/ml喷他脒24小时或200ng/mlTRAIL4小时或先用5、10μg/ml喷他脒20小时后继用200ng/ml TRAIL 4小时的流式细胞仪Annexin V FITC/PI双标记的凋亡细胞计数；
图410μg/ml喷他脒作用细胞0、5、10、15、20小时后分别继用200ng/ml TRAIL 4小时以及10μg/ml喷他脒20小时后继用0、50、100、150、200ng/ml TRAIL4h PARP剪切图；
图51、5、10μg/ml喷他脒作用20小时后，用200ng/ml TRAIL处理细胞4小时后PARP、Caspase-3，Caspase-8剪切图以及XIAP与Bcl-2家族蛋白BcL-XL和bax蛋白表达图；
具体实施方式
本发明的目的在于提供可增强TNF家族死亡结构域配体如TRAIL，TNF，Fas ligand，lymphotoxin等诱导白血病细胞凋亡的敏感性以提高其对白血病细胞杀伤力，治疗治疗肿瘤和白血病。
本发明的技术要点是：喷他脒联合死亡结构域受体配体治疗肿瘤和白血病。其特征在于：喷他脒预先处理或同时与死亡结构域受体配体联合，增强了死亡结构域受体配体诱导白血病细胞凋亡的作用。
本发明喷他脒组分包括Lomidine、Pentacarinat、Pentam及盐形式，是粉状白色固体，可用注射用水配置为注射针剂，也可以添加适量(如5-10％)淀粉浆制备成胶囊、片剂、粉剂、栓剂等剂型。根据不同剂型由静脉或肌肉、口服、吸入或直肠等方式给予白血病或肿瘤患者。
死亡结构域受体配体组分本质是生物肽或蛋白质，需要冷藏。可制备成冷冻干燥品针剂，临用前生理盐水或注射用水经静脉或肌肉给予白血病或肿瘤患者。
本专利的创新点为喷他脒组分与死亡结构域受体配体组分组合为一种新的药物成分组合，应用在临床治疗白血病为代表的肿瘤(癌症)疾病。具体的应用方法为先给予患者喷他脒组分20-24小时(根据情况可调整时间)，再给予死亡结构域受体配体组分。喷他脒组分及死亡结构域受体配体组分分别制备，组合应用。临床运用时在医生指导下，根据情况，在用药安全前提下，合理使用。
喷他脒的使用范围为非毒性剂量，最优范围为1-10μg/ml，TRAIL的使用剂量为200ng。
所述白血病细胞指K562细胞或各型急性髓性白血病(AML)细胞等。
本发明可制备的药可以白血病以及其他肿瘤(癌症)。
实施例1喷他脒和TRAIL的配制与细胞培养
用ddH20配置浓度为1mg/ml来源于Sigma的喷他脒和浓度为1mg/ml来源于PeproTech EC的TRAIL的储存液。K562采用常规细胞培养，含10％小牛血清，青、链霉素各100u/ml的RPMI-1640培养液，在37℃，饱和湿度，5％CO2孵箱中培养，每3～4天换液传代。收集对数生长期细胞，调节细胞数为1×105/ml，取10mL至培养皿中，分别加入终浓度分别为0.5、1、2、5、10μg/ml的的喷他脒作用K562细胞48或72小时，对照组除不加喷他脒外，其余条件完全一致。37℃培养，收集细胞。
实施例2喷他脒抑制细胞增殖活性
四甲基偶氮唑盐(MTT)购置Sigma公司。用去离子水配制成5mg/ml储存液，置-20℃备用。取实施例1所述各组细胞100ul分别置96孔酶标板中，然后每孔加入10ulMTT储存液，在37℃细胞培养箱中孵育4小时后取出，加入含HCI的异丙醇100ul，混匀，用570nM波长的酶标仪测定光密度值(OD)。用(对照OD-处理OD)/对照OD×％计算出细胞增殖抑制率。喷他脒在2ug/ml浓度以上对细胞有一定的增殖抑制作用。为此，选用范围为2-10μg/ml喷他脒与TRAIL联用。
实施例3喷他脒增强细胞对TRAIL敏感性诱导凋亡
预先用10μg/ml喷他脒作用细胞20小时后继用200ng/ml TRAIL4小时，另外设置相应对照，如未加药物，10μg/ml喷他脒24小时，200ng/ml TRAIL4小时。用光学显微镜观察细胞形态学改变。单独使用喷他脒或TRAIL无细胞明显改变，预先用喷他脒作用后细胞形态上出现细胞凋亡特征。
预先用5、10μg/ml喷他脒作用细胞20小时后继用200ng/ml TRAIL 4小时，另外设置相应对照，如未加药物，5、10ug/ml喷他脒24小时，200ng/ml TRAIL4小时，采用AnnexinV凋亡试剂盒(凯基公司)，Annexin V FITC/PI双标记的凋亡细胞的流式细胞仪(FACS)测定凋亡细胞数。10μg/ml喷他脒作用细胞0、5、10、15、20小时后分别继用200ng/ml TRAIL 4小时以及10μg/ml喷他脒20小时后继用0、50、100、150、200ng/ml TRAIL4小时后提取细胞总蛋白提取用与蛋白印迹方法检测细胞凋亡的特征性的PARP剪切。喷他脒增强细胞的TRAIL的敏感性随作用时间的延长或随TRAIL浓度的增加，细胞凋亡诱导作用增加。1、5、10μg/ml作用细胞20小时后继用200ng/mlTRAIL4小时后，出现PARP剪切和Caspase-3与Caspase-8的剪切增加。1、5、10μg/ml喷他脒作用细胞后对X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)抑制随浓度增加而增强。
细胞总蛋白提取与蛋白印迹：采用4℃，1000g离心3分钟收集各组细胞，分别加入蛋白提取液200μl[1％Triton，150mM NaCL，25mMTris-HCL(PH7.2)，0.5mM EDTA，0.5mM Na3VO4及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(每50ml/一片，购自Roche公司)]，震荡混匀，冰上放置30分钟，4℃，10,000g离心10分钟，取上清，用BCA蛋白定量法测定各标本蛋白含量，加5×上样缓冲液，95℃5分钟，置-20℃保存备用。每泳道取上述各标本60μg进行常规12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭，然后依次进行一抗和二抗反应(PARP，Caspase-3，Caspase-8，bcL-X1，bax和XIAP，抗体购自Cell signaling公司，抗β-Actin抗体与二抗购自BD公司)，ECL显色(ECL试剂盒为Amersham ECL-plus)。β-Actin作为上样量的内对照。
采用其他白血病细胞系可以类似证明用K562细胞证实的喷他脒可增强细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性和其协同效应。例如原代培养急性髓性白血病(AML)细胞等，试验其特异性。
本发明所述方法和系统在不脱离本发明之范围和实质下的多种调整和变化对本领域内的技术人员是显而易见的。尽管本发明已经描述的相关的具体的优选方案，但应当理解本发明之权利要求不应当受到这些特定实施方案的限制。事实上，为分子生物学或相关领域内的技术人员所显而易见的对本发明的所述方法的调整均在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.喷他脒及死亡结构域受体配体组合在制备治疗肿瘤及白血病药物的联合应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所说的喷他脒是指具有下列结构式I的喷他脒、或其代谢物或类似物
其中Y和Z相互独立，各自为O或N；R11和R12相互独立，各自为H、CI、Br、OH、OCH3、OCF3、NO2及NH2；n是2至6的整数；包括2和6；且R13和R14各自独立选自以下的基团：
3.根据权利要求1所述的应用，其中所指的死亡结构域受体配体是一种可以和动物细胞的死亡结构域受体结合的活性肽片段，以及类似蛋白质。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所指的活性肽片段，以及类似蛋白质是指人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体多肽，或人肿瘤坏死因子多肽。
5.根据权利要求1所述的应用，是指先给予患者临床可达到的治疗药物剂量的喷他脒20-24小时，再给予临床可达到的治疗药物剂量的死亡结构域受体配体。
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